一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法

1.本发明属于干细胞应用领域，尤其是涉及一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法。


背景技术：

2.人造肉，即细胞培养肉（cell-based meat/cbm），近几年来得到全球舆论和市场的广泛关注。由于人口增长，个人和社会经济需求的增长，全球肉类生产和消费在继续激增。2012年，联合国粮食及农业组织（fao）预测，到2050年，全球肉类需求将达到4.55亿吨（比2005年增长76％）。由于当前的大型畜牧业的生产方法与公共卫生问题的复杂性，以及肉类生产相关的温室效应、环境退化和动物福利等问题，全球的不断增长的肉类需求引起了越来越多的担忧和负面后果。畜牧业的大规模发展与食源性疾病、抗生素抗性和传染性疾病的规模化流行相互关联，密切影响了人类的身体健康。畜牧业也加剧了环境问题，包括温室气体排放，以及土地和水资源利用。还有动物福利和伦理问题，每年有数十亿动物被人类食品系统的运转所直接或间接消灭。
3.而这些肉类生产所伴随着的各种负面问题，和干细胞技术这些年的迅速发展，催生了人们对人造肉这一类新型产品的热烈讨论和研究。基于植物的肉类（pbm）和基于细胞的肉类（cbm）方法可从非动物来源生产食物。传统的pbm（例如豆腐）已经存在了几个世纪，但具有增强感官特性更像肉类的新型pbm替代品最近已商业化。近几年人们开始了cbm细胞农业的新领域的发展, 即从细胞而不是整个生物或动物生产人造肉商品的策略。cbm技术基于最初用于医学应用的干细胞生物学（例如，诱导性多能干细胞）和组织工程（例如，体外骨骼肌移植）的进步。与传统肉类生产相比，cbm的生产一旦优化，预计将需要更少的能量和资源并减少浪费。cbm可以取代一些集约化畜牧业来改善农场动物的福利。动物供体只是用于提供细胞的初始来源，随后可在体外扩增细胞。供体动物通常是较年轻的动物，具有更多的健康干细胞，将由兽医麻醉，收取小量的组织。细胞就可以被设法无限增殖，消除了对动物捐赠者的需求。cbm的生产一般涉及四个主要组成部分：（1）肌肉干细胞的分离和培养；（2）高效培养基的配方；（3）细胞培养支架的选择；（4）细胞培养装置的设计。新技术的发展已经催生了一些致力于将cbm产品推向市场的全球公司。cbm现在已经从科幻小说中的想象变成了现实有形的实物。但是如何实现高效的培养和分化缺乏相应的技术，尤其是起始时高活性肌肉干细胞的筛选，以及细胞在体外快速大量扩增和成肌分化这两个过程的时间和空间上的协调问题。


技术实现要素：

4.针对现阶段细胞培养肉存在的问题，采用在水凝胶细胞支架中预先结合jagged1的多肽片段，有效激活干细胞的notch信号通道，从而保持干细胞的特性（干性和生长分化潜力）。添加的follistatin可以抑制myostatin的活性，从而让肌肉细胞的体积、生长和分化都更有潜力，而分化成的肌肉纤维更粗壮。而这些更成熟粗壮的肌肉纤维将增强细胞培
养肉的质感和口感，并且产生更多的成熟肌细胞特有的营养因子。其同时采用将生长了肌肉细胞的水凝胶薄层多层叠加来形成立体肌肉组织而继续进行低血清条件下的细胞成肌纤维的分化，从而更合理安排了肌肉干细胞生长和分化的时间和空间优势。
5.而且，细胞分化阶段电刺激的使用可以增强肌肉纤维的分化效率和成熟度。
6.本发明的方案如下：一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法，包括以下步骤：（1）筛选高活性肌肉干细胞；（2）采用水凝胶单层细胞的方法获得高活性肌肉干细胞：利用加入follistatin的细胞培养基质进行大规模的细胞扩增；水凝胶中结合有jagged1蛋白的多肽片段；（3）获得肌肉干细胞水凝胶薄层的立体多层结构；（4）高效获得分化为成熟肌肉纤维细胞的立体结构组织，即细胞培养肉。
7.进一步地，所述步骤（1）的过程为：提取并培养来自健康年轻动物个体的肌肉干细胞mpc，运用流式细胞仪对有较高的aldh1酶活性的细胞进行筛选，并进行常规2d表面的培养来初步扩增。
8.进一步地，所述步骤（2）的过程为：将处于对数生长期的第4到6代的aldh1高表达肌肉干细胞导入胶原蛋白形成的水凝胶薄层结构，利用加入follistatin的细胞培养基质进行大规模的细胞扩增；水凝胶中结合有jagged1蛋白的多肽片段，来刺激肌肉干细胞notch1信号通道的激活，从而诱导肌肉干细胞保持干细胞特性和加快生长如此培养5-7天。
9.进一步地，所述步骤（3）的过程为：用细胞铲将肌肉干细胞的水凝胶单层从培养液中取出，铺于新的培养盘中，层层叠加将4-6层的细胞单层摞在一起，加入含有follistatin的细胞培养液继续静置培养。
10.进一步地，所述步骤（4）的过程为：将肌肉细胞的立体多层结构换成肌肉细胞成肌分化培养液继续培养6-10天，所述培养液中加入follistatin；同时在培养体系中施加间歇性的低频率的电刺激，来促进肌肉干细胞分化为成熟肌肉纤维细胞。
11.更进一步地，所述的步骤（1）还包括将来自动物的原代的肌肉干细胞初步培养扩增到约5x104细胞数量后，根据其aldh1的活性进行分离筛选，分离出约15%的aldh1活性最高的细胞，即1x104细胞。
12.更进一步地，所述的步骤（2）中水凝胶薄层结构的厚度为1.5-2.5mm厚度；水凝胶中jagged1蛋白的多肽片段的浓度为0.2-1.0mg/ml；加入follistatin的3d细胞培养基质中follistatin为follistatin 344，浓度为100-200ng/ml。
13.更进一步地，所述步骤（3）中培养3-6天。
14.更进一步地，所述步骤（4）中培养液中的follistatin为follistatin 344，浓度为100-200ng/ml；电刺激：频率20 hz，时间：30-50 分钟，每天两次；所述的培养液是dmem细胞培养基，添加剂包括胎牛血清最终体积分数为1-3%、鸡胚胎精华提取物最终体积分数为0.5-2%；细胞培养基的总体积是10ml培养液/cm3细胞骨架。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：这里的高活性肌肉干细胞做为一种来自年轻动物个体的aldh1高活性的干细胞，比常规的肌肉干细胞具有更强大抗氧化抗凋亡能力和生长分化功能。因此aldh1+细胞可以更高效的在体外迅速生长。
16.水凝胶细胞支架中预先结合了jagged1的多肽片段，可以有效激活干细胞的notch信号通道，从而更好的保持干细胞的特性（干性和生长分化潜力）。
17.培养液中添加的follistatin是可以抑制myostatin的活性，从而让肌肉细胞的体积、生长和分化都更有潜力，而分化成的肌肉纤维更粗壮。而这些更成熟粗壮的肌肉纤维将增强细胞培养肉的质感和口感，并且产生更多的成熟肌细胞特有的营养因子。
18.采用将生长了肌肉细胞的水凝胶薄层多层叠加来形成立体肌肉组织而继续进行低血清条件下的细胞成肌纤维的分化，从而更好地合理安排了肌肉干细胞生长和分化的时间和空间优势。此外，肌肉细胞分化过程中我们在培养体系中施加间歇性的低频率的电刺激，可以更有效促进肌纤维的形成。
19.说明书附图图1：实施例1的从狗的腿部肌肉分离筛选的aldh+肌肉干细胞在2d平面可迅速生长和分化为肌肉纤维细胞。用肌肉干细胞生长培养基培养5天后，换成肌肉细胞分化培养基继续培养4天。可证实这些细胞具有良好的生长和分化为肌管(肌肉纤维细胞)的能力。
20.图2：实施例1的从狗的腿部肌肉分离筛选的aldh+肌肉干细胞在3d培养体系中快速生长。 gfp标记的肌肉干细胞转入水凝胶薄层后，用肌肉干细胞生长培养基培养3天。
21.图3. 实施例1的aldh+肌肉干细胞生长的水凝胶薄层的多层叠加形成立体多层结构。用肌肉干细胞生长培养基培养3天后，换成肌肉细胞分化培养基继续培养6天 （a，b）。可见立体结构中成熟的肌管(肌肉纤维细胞)的普遍形成 （c）。
具体实施方式
22.下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1：一种利用狗的高活性肌肉干细胞产生细胞培养肉的方法，具体步骤如下：（1）筛选获得高功能活性的肌肉干细胞：来自实验用狗(golden retriever， 2岁)后肢的原代的肌肉干细胞初步培养扩增到约5x104细胞数量后，根据其aldh1的活性进行分离筛选，分离出约15%的aldh1活性最高的细胞 （~1x104细胞）；（2）高效的获得高活性肌肉干细胞的水凝胶单层细胞：aldh1高表达肌肉干细胞细胞经培养扩增至第4代时，将其导入胶原蛋白形成的水凝胶薄层结构（~2mm厚度），利用这种3d细胞培养基质进行大规模的细胞扩增。水凝胶中结合有0.5mg/ml jagged1蛋白的多肽片段，来刺激肌肉干细胞notch1信号通道的激活，从而诱导肌肉干细胞保持干细胞特性和加快生长。同时在培养液中加入一定量的follistatin（follistatin 344，150ng/ml）进一步促进肌肉干细胞的快速生长。基础培养液是dmem细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为20%、鸡胚胎精华提取物(chicken embryo essential extracts/cee) 最终体积分数为1%；如此继续培养5天；（3）获得肌肉干细胞水凝胶薄层的立体多层结构：用细胞铲将肌肉干细胞的水凝胶单层从培养液中取出，平铺于新的培养盘中，然后层层叠加将5层的细胞单层摞在一起，加入含有follistatin的细胞培养液继续静置培养 3天，形成稳定的肌肉细胞的立体多层
结构；（4）高效获得分化为成熟肌肉纤维细胞的立体结构组织（细胞培养肉）：将肌肉细胞的立体多层结构换成肌肉细胞成肌分化培养液继续培养6天，期间继续加入follistatin（follistatin 344，150ng/ml）促进肌肉细胞的成长增大和分化，同时在培养体系中施加间歇性的低频率的电刺激(频率20 hz; 时间长度: 40 分钟，每天两次) 来促进肌肉干细胞分化为成熟肌肉纤维细胞。基础培养液是dmem细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为2%、鸡胚胎精华提取物(chicken embryo essential extracts/cee) 最终体积分数为1%； 培养结束后收取产生的肌肉细胞组织进行形态和肌肉细胞分化程度的检测鉴定。
24.用实施例1所得肌肉细胞组织中长成了大量的成熟肌肉纤维，具有类似动物直接来源的肉类的外观。经过对肌肉干细胞成长分化过程和形成产物的观察和鉴定，有关结果如下图1-3；我们的发明可以在体外通过细胞培养比较高效地产生类似天然肉类的产品。将促进国内人造肉产业化的技术发展，和有效缓冲畜牧业过度发展相关的多种卫生、健康、环境、能源消耗和动物福利等问题。
25.实施例2一种利用牛的高活性肌肉干细胞产生细胞培养肉的方法，具体步骤如下：（1）筛选获得高功能活性的肌肉干细胞：来自牧场养牛（black angus）腿部的原代的肌肉干细胞初步培养扩增到约5x104细胞数量后，根据其aldh1的活性进行分离筛选，分离出约30%的aldh1活性最高的细胞 (~1.5x104细胞)；（2）高效的获得高活性肌肉干细胞的水凝胶单层细胞：aldh1高表达肌肉干细胞细胞经培养扩增至第6代时，将其导入胶原蛋白形成的水凝胶薄层结构（~2mm厚度），利用这种3d细胞培养基质进行大规模的细胞扩增。水凝胶中结合有0.5mg/ml jagged1蛋白的多肽片段。同时在培养液中加入follistatin 344(150ng/ml）进一步促进肌肉干细胞的快速生长。基础培养液是dmem细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为20%、鸡胚胎精华提取物(chicken embryo essential extracts/cee) 最终体积分数为1%；如此继续培养5天；（3）获得肌肉干细胞水凝胶薄层的立体多层结构：用细胞铲将肌肉干细胞的水凝胶单层从培养液中取出，平铺于新的培养盘中，然后层层叠加将5层的细胞单层摞在一起，加入含有follistatin的细胞培养液继续静置培养 3天，形成稳定的肌肉细胞的立体多层结构；（4）高效获得分化为成熟肌肉纤维细胞的立体结构组织（细胞培养肉）：将肌肉细胞的立体多层结构换成肌肉细胞成肌分化培养液继续培养6天，期间继续加入follistatin 344 (150ng/ml）促进肌肉细胞的成长增大和分化，同时在培养体系中施加间歇性的低频率的电刺激(频率20 hz；时间长度: 40 分钟，每天两次) 来促进肌肉干细胞分化为成熟肌肉纤维细胞。基础培养液是dmem细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为2%；培养结束后收取产生的肌肉细胞组织进行形态和肌肉细胞分化程度的检测鉴定。
26.用实施例2所得牛肌肉细胞组织中长成了大量的成熟肌肉纤维，具有类似肉类的外观。因此，我们的发明可以在体外通过细胞培养高效地产生类似天然肉类的产品。