一种抑制肝癌细胞生长的活性多肽及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制肝癌细胞生长的活性多肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，肝炎一直是全球性重要公共卫生问题之一，世卫组织最新数据显示，全球共有20亿人感染肝炎病毒，其中约有5亿人感染了慢性肝炎，每年约有100万人因此而死亡。肝脏相关的疾病，包括各种肝炎以及肝硬化、肝纤维化，是困扰人类健康的重大疾病，肝炎、肝硬化及肝纤维化均会有大量的肝细胞坏死，致肝衰竭甚至危及生命。
3.活性多肽作为一种新型的蛋白药物引发了学者的强烈兴趣。活性多肽其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性，使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。近年来，多肽类药物治疗肝脏疾病已经取得了不少进步，但是，到目前为止，治疗肝脏疾病仍旧缺乏有效的治疗策略和有效药物。
4.因此，提供一种活性多肽，能抑制癌细胞的dna合成，尤其是抑制肝癌细胞再生是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明目的在于为克服现有的技术缺陷，提供了一种抑制肝癌细胞生长的活性多肽及其制备方法和应用，本发明的活性多肽可以靶向肝脏器官，抑制肝癌细的增殖生长，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
7.第一方面，提供了一种抑制肝癌细胞生长的活性多肽，所述活性多肽的氨基酸序列为vnnssliglgytqtlkpgik。
8.第二方面，提供了一种如第一方面所述的活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)以氯三苯甲基氯树脂为起始原料，由9
‑
芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体进行合成反应，将氯三苯甲基氯树脂接上氨基酸以合成多肽溶液；
10.(2)合成反应完毕后，加入切割液，将多肽溶液从氯三苯甲基氯树脂上切割下来；
11.(3)使用乙醚沉淀多肽溶液和/或用氮气吹干多肽溶液，并采用制备型hplc进行纯化，得到所述活性多肽。
12.进一步地，所述合成反应的合成方向为：从c端向n端按照所述活性多肽的氨基酸序列依次缩合。
13.进一步地，按质量百分比计，所述切割液包括以下组分：tfa95％，水1％，edt 2％和tis 2％。
14.第三方面，提供了一种如第一方面所述的活性多肽在制备预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化药物中的应用。
15.如上所述，本发明的药物能预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化，通常，可将本发明的活性多肽作为活性成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物可以通过常规途径进行给药，包括但并不限口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
16.当药物的剂型为用于口服施用的药物时，其含有安全有效量的本发明的活性多肽以及药学上可接受的载体和/或辅剂，口服施用的药物可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素中的至少一种；崩解剂可以为交联聚乙烯比咯烷酮、羧甲基淀粉钠中的至少一种；粘合剂可以为明胶、聚乙二醇中的至少一种。用于口服施用的药物除上述剂型外，还可以制成乳剂、糖浆剂等。
17.本发明的药物还可以被制成注射剂，可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，上述注射剂可通过常规方法进行制备。
18.此外，本发明的活性多肽还可以与其他治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化的药物联用。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明提供的的活性多肽，可以靶向肝脏器官，明显抑制肿瘤细胞的dna合成，抑制肝癌细胞的增殖生长，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能。
21.本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
22.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
23.图1为本发明提供的活性多肽的高效液相色谱图；
24.图2为本发明提供的活性多肽的质谱图；
25.图3为本发明提供的活性多肽对smmc
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7721、lo
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2、chang liver、hepg
‑
2和huh
‑
7细胞生长的抑制作用图。
具体实施方式
26.为为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图以及具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
28.除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总重量计算的。本文术语“重量含量”可用符号“％”表示。
29.本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任
选的成分、组分、步骤或限制项组成。
30.在本发明的方案中，dcm为二氯甲烷；hbtu为苯并三氮唑
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n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐；diea为n,n
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二异丙基乙胺；dmf为n,n
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二甲基甲酰胺；tfa为三氟乙酸；edt为1,2
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乙二硫醇；fmoc为9
‑
芴甲氧羰基；tis为三异丙基硅烷。
31.实施例1
32.本实施例提供一种活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
33.(1)将3g氯三苯甲基氯树脂(取代度为1.03mmol/g)放入反应管中，加入45ml dcm，震荡30min；
34.(2)接第一个氨基酸
35.通过砂芯抽滤掉溶剂，加入10mmol的fmoc
‑
gly氨基酸，加入dmf溶解，再加入30mmol的diea，震荡60min；
36.(3)脱保护
37.去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液45ml，反应5min；去掉再加20％哌啶dmf溶液，15min；
38.(4)洗
39.加入30ml的dmf清洗两次，再加入30ml的dcm清洗两次，最后加入30ml的dmf清洗两次；
40.(5)缩合
41.取保护氨基酸12mmol，hbtu 13mmol，使用15ml的dmf进行溶解，加入反应管，并立刻加入diea13mmol，反应30min；
42.(6)洗
43.加入30ml的dmf清洗一次，加入30ml的dcm清洗两次，加入30ml的dmf清洗两次；
44.7)重复步骤3
‑
6，从右到左依次接入序列中的氨基酸直至结束；
45.8)清洗树脂
46.待树脂接入序列中的全部氨基酸后，抽干，加入30ml的dmf清洗两次，加入30ml的甲醇清洗两次，加入30ml的dmf清洗两次；加入30ml的dcm清洗两次，抽干10min；
47.9)从树脂上切割多肽得到多肽液
48.配制切割液：tfa95％，水1％，edt 2％，tis 2％；
49.用量：30ml；切割时间：120min；
50.10)纯化
51.将切割后的多肽液用氮气吹干，用乙醚洗涤6
‑
8次，常温干燥，用制备型hplc色谱将粗品提纯，得到活性多肽。
52.上述活性多肽的氨基酸序列为vnnssliglgytqtlkpgik。
53.实施例2
54.将实施例1得到的活性多肽进行液相色谱分析，其条件为：
55.流动相a：0.1％的tfa水溶液；流动相b：0.1％的tfa乙腈溶液；
56.梯度：20％
‑
35％流动相b，10min；
57.色谱柱：kromasil 100
‑
5c18 4.6
×
300mm(5um)；
58.波长：220nm；
59.流速：1.0ml/min。
60.其高效液相色谱图如图1所示；测得样品纯度为98.42％。
61.质谱(esi)：质谱图如图2所示；活性多肽的分子离子峰为2103.47。
62.实施例3
63.本实施例进一步验证实施例1的活性多肽对smmc
‑
7721细胞生长的抑制作用，具体操作步骤如下：
64.取实施例1制备的活性多肽，用rpmi
‑
1640培养液制成每1ml中含活性多肽100μg的溶液。用10％的小牛血清培养液培养smmc
‑
7721细胞至对数增长期，其中smmc
‑
7721细胞为商品化购买的细胞；用0.25％胰蛋白酶
‑
乙二胺四醋酸二钠消化液，消化对数增长期的smmc
‑
7721细胞，加10％小牛血清培养液，稀释至每1ml中含2.5
×
104～5
×
104个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞板上铺板，每孔100μl，。
65.供试品组，每孔加供试品溶液100μl，每批供试品均做3个孔，细胞对照组每孔分别加rpmi
‑
1640培养液100μl，置于37℃，含5％二氧化碳饱和水汽的培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.3)洗一次，然后在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(ph7.3)100μl和mtt溶液20μl，继续培养。
66.培养结束后，吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸收度，测试结果如图3所示。
67.结果：细胞对照组为0.0631
±
0.0003，供试品组为0.0203
±
0.0009值，供试品组和细胞对照组之间有显著性差异，p≤0.01。
68.结论：本发明的多肽对smmc
‑
7721肝细胞的生长具有明显的促进作用。
69.实施例4
70.在实施例3的基础上，本实施例进一步验证了实施例1的活性多肽对lo
‑
2、chang liver、hepg
‑
2和huh
‑
7细胞生长的抑制作用。
71.按照实施例3中的方法，以lo
‑
2、chang liver、hepg
‑
2和huh
‑
7细胞替代smmc
‑
7721细胞，并测定其吸收度；其中lo
‑
2、chang liver、hepg
‑
2和huh
‑
7均为商品化购买的细胞。
72.测试结果如图3所示，由图3的测试结果可得，供试品组和细胞对照组之间有显著性差异，p≤0.01。
73.结合实施例3和实施例4的测试结果可得：本发明的活性多肽对smmc
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7721、lo
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2、chang liver、hepg
‑
2和huh
‑
7肝细胞的生长均具有明显的抑制作用。
74.本发明中的活性多肽，可以靶向肝脏器官，明显抑制肿瘤细胞的dna合成，抑制肝癌细胞的增殖生长，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能。
75.此外，根据上述测试结果可以得出，本发明的活性多肽可用于预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化药物的研发。
76.值得注意的是，本发明所述的药物，该药物以实施例1的活性多肽为主要活性成分，不排除配制体系和给药方式的变动、对该活性多肽进行简单化学修饰调整后的衍生物以及多活性物质合用等情况。
77.以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。