用于降解黄曲霉毒素B1的微杆菌及其应用

用于降解黄曲霉毒素b1的微杆菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于降解黄曲霉毒素b1的微杆菌及其应用。


背景技术：

2.黄曲霉菌(aspergillus flauvs)是一种世界范围常见的许多重要农作物以及动物的共同致病菌。黄曲霉菌产生的次级代谢产物黄曲霉毒素b1(afb1)是目前发现毒性和致癌性最强的天然化合物之一。黄曲霉菌能够感染许多重要的农作物，例如，花生、玉米、棉花等，均可对收获前后的农作物进行污染，给世界各地的农业生产造成巨大的经济损失。根据联合国粮农组织统计，，给农业造成了巨大经济损失。在多个抽样的酱油以及水产饲料等加工产品中都检出afb1由于黄曲霉毒素b1具有较稳定的理化性质，很难被降解，一旦污染的饲料被禽畜食用，afb1将在动物体内经羟基化代谢形成和afb1毒性和致癌性基本相似的衍生物afm1，一部分的afb1的衍生物会随尿液和乳汁排出，而很大一部分会出现在奶制品和肉制品中。
3.综上，黄曲霉毒素b1对农业生产以及人们的身体健康都带来不同程度的危害，亟待研发一种可用于降解黄曲霉毒素b1的菌剂。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供用于降解黄曲霉毒素b1的微杆菌及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明实施例一方面提供菌株，所述菌株为微杆菌microbacterium proteolyticum b204，其在于广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmcc no：62022。
7.本发明另一方面提供一种菌剂，其活性成分为上述所述的菌株和/或该菌株的代谢物。
8.本发明还提供上述所述的菌株或所述的菌剂在如下(a1)或(a2)或(a3)中的应用：(a1)降解黄曲霉素b1；(a2)制备用于降解黄曲霉素b1的产品；(a3)制备用于食品脱毒的产品。
9.本发明的一个实施例中，所述微杆菌microbacterium proteolyticum b204中菌株的16s rdna序列如seq id no：1所示。
10.本发明的一个实施例中，所述微杆菌microbacterium proteolyticum b204中菌株对黄曲霉素b1的降解率为87％。
11.本发明的一个实施例中，所述微杆菌microbacterium proteolyticum b204中菌株采用香豆素选择培养基筛选培养。
12.本发明的一个实施例中，所述豆素选择培养基制备方法为：称取kh2po40.25g，nh4no
3 1g，mgso
4 0.001g，feso
4 0.001g，20g琼脂，加入500ml去离子水后灭菌制得。
13.菌种保藏说明：本发明的微杆菌microbacterium proteolyticum b204，于2021年
11月01日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为gdmcc no：62022。
14.本发明具有如下优点：
15.试验证明：本发明的微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解黄曲霉毒素b1效果显著，其制备成本低、工艺简单，便于大规模生产。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
17.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
18.图1为本发明1提供的微杆菌microbacterium proteolyticum b204菌落形态照片图；
19.图2为本发明提供的基于16s构建的菌株b204系统发育进化树；
20.图3为本发明提供的温度对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的影响的曲线图；
21.图4为本发明提供的ph对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的影响的曲线图；
22.图5为本发明提供的接种量对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的影响的曲线图；
23.图6为本发明提供的转速对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的影响的曲线图；
24.图7为本发明的微杆菌microbacterium proteolyticum b204对不同样品的脱毒效果柱状图。
具体实施方式
25.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1、微杆菌microbacterium proteolyticum b204的分离与鉴定
27.1、初筛培养基配置
28.香豆素选择培养基：称取kh2po
4 0.25g，nh4no
3 1g，mgso
4 0.001g，feso
4 0.001g，20g琼脂，加入500ml去离子水后，放入高压蒸汽灭菌锅中，设置程序为121℃，20min，待灭菌结束后置于超净台中打开，将称量好的香豆素加入到初筛培养基中，轻轻震荡至香豆素完
全溶解。同时配置实验所需的lb液体培养基和lb固体培养基作为活化、纯化培养基使用。
29.afb1储备液：将1mg afb1标准品(c
17
h
12
o6，纯度≥98％)溶解在色谱级乙腈中，容量瓶定容至10ml，终浓度为100mg/l，过0.22μm滤膜，溶液转移至试剂瓶中密封后避光
‑
20℃保存。
30.2、降解afb1菌株的筛选
31.菌种的初筛：在无菌环境下，称取牛粪、土壤、酒药、酒醪、酒曲、糯米、燕麦样品1g，加入到一个无菌离心管中，加入10ml无菌水后将样品涡旋3min混匀后即成10
‑1稀释液，并按实验操作规范依次稀释成10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5和l0
‑6的稀释液。然后分别吸取100μl 10
‑4、10
‑5和l0
‑6的稀释液，用涂布器将菌液均匀地涂布在香豆素选择培养基表面，然后将板倒置放于30℃恒温培养箱中培养1
‑
21天，每隔24小时查看培养皿中是否生长新的菌落，选择生长良好的单个菌落，接种于新的培养基，重复纯化3次以上，扩大培养后，在超低温冰箱保存菌株。
32.3、降解afb1菌株的复筛
33.挑取出待检验的菌株，在活化纯化培养基上活化数次后，用将菌株接种于15ml液体培养基后在180r/min，30℃条件下中进行培养12h。在超净工作台内，取出发酵培养基945ml加入15ml无菌洁净离心管，随后加入50μl的菌液，最后加入5μl的afb1标准品(10μg/ml)，离心管置于30℃、200r/mim条件下的震荡摇床中避光孵育12h，在8000r/mim，20min的条件下离心处理，收集的上清液经浓缩仪浓缩后用1ml乙腈重新复溶，上机检测前用0.22μm的滤膜过滤。用hplc检测各个组分的峰值，从而计算得出微杆菌microbacterium proteolyticum b204株对afb1的降解率。
34.afb1降解率(％)＝[(空白组afb1含量
‑
处理组afb1含量)]/空白组afb1含量
×
100％。
[0035]
hplc检测条件：色谱柱选用waters的c18(250mm
×
4.6 0.5m,waters)，流动相a为超纯水，流动相b为甲醇:乙腈＝1:1的混合物；流速0.6ml/min；选择荧光检测器检测，激发波长350nm，检测波长450nm；进样量为10μl。
[0036]
标准曲线的绘制：将配置好的标准液分别稀释成100、70、50、10、1μg/ml的溶液，用仪器分析后，以横坐标为标准品浓度，纵坐标为峰面积，作出回归曲线。
[0037]
4、微杆菌microbacterium proteolyticum b204的鉴定
[0038]
(1)菌株的细胞形态及生理生化特征检测
[0039]
如图1所示，微杆菌microbacterium proteolyticum b204显微镜下细胞呈细长、不规则的杆状，在na培养基上呈乳黄色菌落，边缘整齐，菌落湿润，为革兰氏阳性菌，最适生长温度30℃，最适ph＝7，最佳nacl浓度为0.5mg/ml，可溶性淀粉作为碳源，大豆蛋白或酵母浸粉作为氮源时细菌生长较好。
[0040]
(2)微杆菌microbacterium proteolyticum b204 16s rdna序列测定及同源性分析
[0041]
按照购买的基因组提取试剂盒(上海生工)的说明进行基因组提取。16srdna扩增与序列测定：细菌dna的pcr扩增选择通用引物扩增16srdna序列。扩增的核苷酸序列如seq id no:1所示，通过序列比对测序得到的b204基因序列，使用blast算法将序列与ncbi数据库中的序列进行比对，采用软件mega 6中采用邻接法将比对的序列构建成一个系统发育进
化树，标尺0.002表示每个核酸位点的频率替换。如图2所示，可知b204与微杆菌属(microbacterium sp.)的16s rdna同源性，根据菌株的遗传距离、形态、以及特征可确定b204为微杆菌属(microbacterium sp.)，将获得的菌株b204进行保藏。
[0042]
菌种保藏说明：本发明的微杆菌microbacterium proteolyticum b204，于2021年11月01日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为gdmcc no：62022。
[0043]
(3)api zym实验
[0044]
api试剂条有很多种，可以根据实验需要选择合适的试剂条，api20ne可以测定微生物利用的碳源；api20e可以测定微生物发酵/氧化的各种糖类物质；api zym可以测定各种酶学特征。生理生化特征不能单独作为微生物分类的依据，需要结合基因型特征、化学成分特征等进行整体的判断。
[0045]
使用5ml的0.85％无杂质生理盐水，从分离物的平板上挑取培养的单个纯菌落至生理盐水中，使溶液混合均匀，其浊度在mcfarland no.5和no.6之间，按照api zym试剂条的说明用吸管将菌悬液充满不同的管或部，4h后加入a、b液判读实验结果。如表1所示，菌株microbacterium proteolyticum b204的zym实验结果。
[0046]
表1
[0047]
[0048][0049]
实施例2、不同温度对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解黄曲霉毒素b1的影响
[0050]
将纯化的微杆菌microbacterium proteolyticum b204接入15ml lb培养基中，然后加入1.5μl afb1(1mg/ml)，以不同的温度(14℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)，起始ph为7，摇床转速180r/min，发酵12h同时以无菌的15ml lb培养基加1.5μl afb1作为空白对照，分别在不同温度下培养12h后测afb1的降解量。
[0051]
结果如图3所示为温度对菌株b204降解afb1的影响。从10℃到30℃时，微杆菌microbacterium proteolyticum b204对afb1的降解都呈现逐渐上升的状态，在30℃时都达到了对afb1的最大降解率。
[0052]
实施例3、不同ph对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解黄曲霉毒素b1的影响
[0053]
将纯化的解蛋白芽孢杆菌接入15ml lb培养基中，然后加入1.5μlafb1(1mg/ml)，以不同的起始ph值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，以培养温度30℃，摇床转速180r/min，发酵12h同时以无菌的15ml lb培养基加1.5μl afb1作为空白对照，分别在不同
的起始ph值下培养12h后测afb1的降解量。
[0054]
试验结果如图4所示，为ph对菌株b204降解afb1的影响，在ph 4.0时降解率很低，从ph 5.0上升到7.0时，微杆菌microbacterium proteolyticum b204的降解率都在逐渐上升，微杆菌microbacterium proteolyticum b204在ph7.0时对afb1的降解效果显著，随着ph继续升高，则对afb1的降解能力相对有所下降。
[0055]
实施例4、不同接种量对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解黄曲霉毒素b1的影响
[0056]
以不同的接种量(2％、4％、6％、8％、10％)的解蛋白芽孢杆菌接入15ml lb培养基中，然后加入5μl afb1(1mg/ml)，30℃、ph为7、摇床转速180r/min的条件下，发酵12h同时以无菌的15ml lb培养基加1.5μl afbi作为空白对照，分别在不同的起始ph值下培养12h后测afb1的降解量。
[0057]
试验结果如图5所示，为接种量对菌株b204降解afb1的影响。接种量的多少影响微杆菌microbacterium proteolyticum b204菌降解afb1的效果，随接种量的增加，降解效果持续增高，在8％的接种量下，微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的效果最好，在接种量超过8％后随着接种量的上升，微杆菌microbacterium proteolyticum b204对afb1的降解率反而下降。
[0058]
实施例5、不同转速对微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解黄曲霉毒素b1的影响
[0059]
将纯化的微杆菌microbacterium proteolyticum b204接入15ml lb培养基中，然后加入1.5μl afb1(1mg/ml)，以不同的起始转速(120r/min、150r/min、180r/min、200r/min、220r/min、250r/min)，以培养温度30℃，起始ph为7，发酵12h同时以无菌的15ml lb培养基加1.5μl afb1作为空白对照，分别在不同的转速下培养12h后测afb1的降解量。
[0060]
实验结果如图6所示，为转速对菌株b204降解afb1的影。转速在一定程度上影响微杆菌microbacterium proteolyticum b204菌降解afb1的效果，随转速的增加，降解效果持续增高，在200r/min的转速条件下，微杆菌microbacterium proteolyticum b204降解afb1的效果最好，在转速超过200r/min后随着接种量的上升，b204对afb1的降解率反而下降。
[0061]
实施例6、菌株b204在生物脱毒中的应用
[0062]
微杆菌microbacterium proteolyticum b204活化两次后挑取单菌落置于50ml灭菌nb中，置于30℃，200r/min中摇床里，过夜培养12小时，测定od值为0.6。
[0063]
准确称取玉米、花生、乳酪样品，每份10.0
±
0.03g，编号分别为ym204、hs204、rl204样品平铺于90mm培养皿中，用黑色马克笔在培养皿盖上画分出9个区域，每个区域约1cm2大小，取1ml afb1标准溶液(浓度为100μg/ml)，每个区域加入100μl afb1标准溶液(浓度为100μg/ml)。另取上述样品相同条件作为空白对照。
[0064]
取微杆菌microbacterium proteolyticum b204培养液450μl，按照上述编号加入不同培养平板，分10次加入上述9个区域，盖上盖子置于30℃恒温培养箱中培养16h，每3h重复一次上述加培养液的操作。
[0065]
培养结束后，10g样品中分2次加入10ml有机溶剂乙腈，完全转移到50ml离心管中，利用超声震荡30min后放入离心机中，设置离心调件为：温度为25℃，转速为8000r/min，时间为10min，移液枪吸取离心管中上清液，并将收集的有机层溶液集中于10ml离心管。将萃
取收集的溶液至于浓缩仪中，45℃浓缩2h，后加入1ml乙腈得到afb1乙腈溶液，用0.22μm滤膜过滤置于液相小瓶。hplc检测条件：色谱柱选用waters的c18(250mm
×
4.6 0.5m，waters)，流动相a为超纯水，流动相b为甲醇：乙腈＝1:1的混合物；流速0.6ml/min；选择荧光检测器检测，激发波长350nm，检测波长450nm；进样量为10μl。
[0066]
如图7所示，由玉米的降解效果最好，花生次之，最后是乳酪，可以看出样品颗粒较小时，降解afb1效果较好，这可能是由于样品颗粒较大时菌液难以喷洒均匀，导致的降解afb1效果下降。
[0067]
微杆菌microbacterium proteolyticum b204对黄曲霉毒素b1的最佳降解条件为：最适培养条件ph＝6.7，nacl＝0.48g/l，温度＝31.5℃，可溶性淀粉1％，大豆蛋白0.5％，发酵液中黄曲霉毒素b1 24h降解率为87％，玉米表面黄曲霉毒素b1 24h降解率为81％。
[0068]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0069]
[0070]