本专利申请涉及一种快速纯化rna药物的方法，特别是涉及一种快速纯化mrna药物的方法，以及实施所述方法的纯化装置。
背景技术：
：：1、dna是存储人体遗传信息的载体。人体内绝大部分细胞都带有dna。但是dna本身无法直接对人体产生影响，根据dna遗传信息转化而来的各类蛋白质例如抗原、激素才是直接对人体产生影响的物质。dna转化为蛋白质的过程分为两大步，第一步：dna转化为mrna，这一步骤发生在细胞核内；第二步：mrna转化为蛋白质，这一步骤发生在细胞质中。2、信使rna(又称mrna)疫苗自被美国食品药品监督管理局及世界其他有关当局授权紧急使用以来，就受到了全世界的关注。mrna疫苗是一种新型疫苗，它通过将编码病毒抗原的人工合成mrna转染到人体细胞中来触发免疫反应，参见mauger,d.m.；cabral,b.j.；presnyak,v.；su,s.v.；reid,d.w.；goodman,b.；link,k.；khatwani,n.；reynders,j.；moore,m.j.；mcfadyen,i.j.,mrna structure regulates protein expression throughchanges in functional half-life.proc natl acad sci u s a 2019,116(48),24075-24083，以及chomczynski,p.；sacchi,n.,the single-step method of rnaisolation byacid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction:twenty-somethingyears on.nat protoc 2006,1(2),581-585。与传统疫苗相比，mrna疫苗具有多种优势。例如可以快速开发和生产基于mrna的疫苗。3、裸露的mrna会被细胞外的核糖核酸酶(rnases)迅速降解，并且具有免疫原性，参见dagan,n.；barda,n.；kepten,e.；miron,o.；perchik,s.；katz,m.a.；hernan,m.a.；lipsitch,m.；reis,b.；balicer,r.d.,bnt162b2 mrna covid-19 vaccine in anationwide mass vaccination setting.new england journal of medicine 2021,384(15),1412-1423。它不能穿透细胞膜从而在细胞质中转化成对应的蛋白质。因此，细胞内的递送对于促进mrna的细胞摄取和保护其免受rnase降解至关重要，参见zhang,h.,a brightfuture for lipid nanoparticles in gene therapy.cell and gene therapy insights2021,7(6),755-758.以及stewart,m.p.；sharei,a.；ding,x.；sahay,g.；langer,r.；jensen,k.f.,in vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery.nature2016,538(7624),183-192。4、mrna递送系统有两大职责：一是有效包裹和保护mrna在到达靶点前维持稳定，二是帮助mrna进入细胞，并且在内含体与溶酶体结合前将mrna释放进入细胞质中。脂质纳米粒(lipid nanoparticle，缩写为lnp)是目前最有效和最常用的递送载体。lnp与细胞膜的组成成分相似，均由脂质分子构成。脂质分子的两条长尾通常呈平行状态，在此状态下，脂质形成的双分子层稳定。在进入细胞质酸性环境后，部分脂质的头部质子化，呈现阳离子形态，与其他阴性离子态的脂质分子相吸引，尾部张开。原本双分子层的形式被破坏，形成头部聚集在一起的环状。此时包裹在lnp中的mrna便可逃逸出内含体，进入细胞质等待转译。lnp通常由四种成分组成：(1)阳离子或可离子化的脂类；(2)连接在脂类上的聚乙二醇(peg)；(3)胆固醇；(4)磷脂，参见akinc,a.；zumbuehl,a.；goldberg,m.；leshchiner,e.s.；busini,v.；hossain,n.；bacallado,s.a.；nguyen,d.n.；fuller,j.；alvarez,r.；borodovsky,a.；borland,t.；constien,r.；de fougerolles,a.；dorkin,j.r.；narayanannair jayaprakash,k.；jayaraman,m.；john,m.；koteliansky,v.；manoharan,m.；nechev,l.；qin,j.；racie,t.；raitcheva,d.；rajeev,k.g.；sah,d.w.；soutschek,j.；toudjarska,i.；vornlocher,h.p.；zimmermann,t.s.；langer,r.；anderson,d.g.,acombinatorial library of lipid-like materials for delivery of rnaitherapeutics.nat biotechnol 2008,26(5),561-569。5、为了将mrna组装成mrna-lnp，可以使用微流控混合技术，参见buschmann,m.d.；carrasco,m.j.；alishetty,s.；paige,m.；alameh,m.g.；weissman,d.,nanomaterialdelivery systems for mrnavaccines.vaccines 2021,9(1)，以及cheng,q.；wei,t.；farbiak,l.；johnson,l.t.；dilliard,s.a.；siegwart,d.j.,selective organ targeting(sort)nanoparticles for tissue-specific mrna delivery and crispr-cas geneediting.nat nanotechnol 2020,15(4),313-320。在这种方法中，如图1所示，将含有mrna的水性溶液a和溶解有脂类和其他lnp成分的有机溶剂b分别注入与微流控通道呈t型连接的两个入口。两种形式的溶液在通道中完全混合以触发匀质的自组装。组装后，混合物通过纯化以去除多余的有机溶剂和游离分子，包括没有组装的mrna、脂质和其他未组装成纳米颗粒的成分，参见sakurai,y.；hada,t.；harashima,h.,scalable preparation of poly(ethylene glycol)-grafted sirna-loaded lipid nanoparticles using acommercially available fluidic device and tangential flow filtration.jbiomater sci polym ed 2017,28(10-12),1086-1096，以及weiss,m.；frohnmayer,j.p.；benk,l.t.；haller,b.；janiesch,j.-w.；heitkamp,t.；borsch,m.；lira,r.b.；dimova,r.；lipowsky,r.；bodenschatz,e.；baret,j.-c.；vidakovic-koch,t.；sundmacher,k.；platzman,i.；spatz,j.p.,sequential bottom-up assembly of mechanicallystabilized synthetic cells by microfluidics.nature materials 2018,17(1),89-90。6、按照当前mrna疫苗制造策略，mrna-lnp需要保留在水溶液中，导致它们很容易降解。为防止它们降解，需要将疫苗溶液保持在-20到-80℃，从而导致冷链物流和储存的巨大成本和不便，参见inzel,d.w.；li,x.；burns,n.；khan,e.；lee,w.-j.；chen,l.-c.；ellipilli,s.；miles,w.；ho,y.s.；guo,p.,thermostability,tunability,and tenacityof rna as rubbery anionic polymeric materials in nanotechnology andnanomedicine-specific cancer targeting with undetectable toxicity.chemicalreviews 2021,121(13),7398-7467。美国tff公司结合了微流控技术的薄膜冻干工艺可以使蛋白质多肽等生物或活性大分子液体50到2000毫秒之间的任何时间，使其表面液体完全冻结，最大程度上的减少了冷冻速度不够快造成的活性分子失活。薄膜冻干工艺的专利持有者ut-austin药学院分子药物与递药系主任robert o.(“bill”)williams iii博士说经由薄膜冻干工艺制成的mrna干粉在25℃下保存6个月时，依然具备活性药物成分的活性和稳定性。避免冷链物流和储存的高额成本的一种方法是运输粉末形式的mrna，参见zhang,n.n.；li,x.f.；deng,y.q.；zhao,h.；huang,y.j.；yang,g.；huang,w.j.；gao,p.；zhou,c.；zhang,r.r.；guo,y.；sun,s.h.；fan,h.；zu,s.l.；chen,q.；he,q.；cao,t.s.；huang,x.y.；qiu,h.y.；nie,j.h.；jiang,y.；yan,h.y.；ye,q.；zhong,x.；xue,x.l.；zha,z.y.；zhou,d.；yang,x.；wang,y.c.；ying,b.；qin,c.f.,a thermostable mrna vaccine against covid-19.cell 2020,182(5),1271-1283，从而不需要使用冷链物流。到达疫苗接种点后，将mrna粉末溶解在水性溶液中，然后在接种现场组装成lnp，经纯化后使用。这种方案的主要障碍是组装成mrna-lnp颗粒后，由于纯化过程复杂、耗时，不适合现场制备。7、为了解决该问题，本发明提出了一种快速纯化rna药物特别是mrna疫苗的方法，同时涉及一种快速纯化的装置，可以实现在疫苗接种现场快速、统一地组装和纯化mrna-lnp。技术实现思路1、本发明的目的是为了解决现有技术中的不足，目的之一是提供一种纯化rna药物特别是mrna药物的方法，包括如下步骤：2、(1)将微流体渗透组件的一部分或者全部浸没在渗透缓冲液中，所述微流体渗透组件是柔性层状结构，包括粘结在一起的三层膜，中间层上设有微流体通道，中间层的两侧分别是渗透膜层和支撑层，或者中间层的两侧都是渗透膜层；所述微流体渗透组件有且仅有一个入口，用于输入需要纯化的rna药物，以及一个或多个出口，用于输出经过纯化的rna药物；3、(2)将需要纯化的rna药物注入所述微流体渗透组件的入口，所述rna药物以mrna-lnp的形式存在；4、(3)在从所述入口到所述出口的流动过程中，rna药物中的杂质通过微流体渗透组件中的渗透膜渗透到渗透缓冲液中，以mrna-lnp的形式存在的rna药物保留在微流体渗透组件中；5、(4)通过所述微流体渗透组件的出口收集经过纯化的rna药物。6、在步骤(1)中，优选的方案是所述微流体渗透组件经过折叠，比如折叠成卷轴形状或者其他形状，从而显著减小其体积。为了提高渗透效率，优选方案是将全部微流体渗透组件浸没在渗透缓冲液中。为了确保rna药物的ph值和人体体液ph值的基本一致，渗透缓冲液的ph值优选在7.4-7.8。7、本专利中所述的微流体/微流控，其通道/流道的尺寸可以相同也可以不同。本专利中所述的微流体渗透组件中间层的通道/流道的尺寸控制在在3000微米以下，比如1～3000微米、1～2000微米、1～1500微米、1～1000微米、1～800微米、1～600微米、1～300微米，或者10-～3000微米、10～2000微米、10～1500微米、10～1000微米、10～800微米、10～600微米、10～300微米；也可以将通道/流道的尺寸控制在300微米以下、200微米以下、100微米以下、50微米以下、10微米以下或者1微米以下；比如通道/流道的尺寸在0.1～1微米、0.1～10微米、0.1～100微米、0.1～500微米或者0.5～300微米。8、所述的渗透膜是一种亲水膜，其主要功能是阻挡已经组装的mrna-lnp颗粒脱离微流体通道，但是允许其中的杂质比如多余的有机溶剂和游离分子、没有组装的mrna、脂质和其他未形成纳米颗粒的成分等等渗透到缓冲液中，起到了净化药物的作用。其中渗透膜的材料有很多种，例如商业化的醋酸纤维素(ca)、混合纤维素酯(mce)、聚醚砜(pes)、尼龙(ny)、聚四氟乙烯(ptfe)、再生纤维素(rc)、聚偏氟乙烯(pvdf)、聚丙烯(pp)、聚碳酸酯轨道蚀刻膜(pcte)、聚酯轨道蚀刻膜(pete)和玻璃纤维膜。渗透膜的厚度通常在10-100μm之间。需要说明的是，这里的亲水性膜包括材料本身亲水的膜，也包括膜材料本身疏水但外侧经过亲水性修饰或者亲水性处理的膜，例如在聚碳酸酯这种疏水膜表面用亲水性的聚乙烯吡咯烷酮做表面修饰后亦可被认定为亲水性渗透膜。渗透膜的截流量需要根据mrna-lnp颗粒的尺寸进行设置。通常情况下，截流量为500～500kda。为了确保渗透膜的两侧溶液置换速度，提高纯化效率，在确保mrna-lnp不渗漏出去的前提下，渗透膜的孔径尽可能的大一些。通常情况下，可以根据mrna-lnp内部所包被的rna的分子量去进行设置。当采购的渗透膜的截流量不明确时，若膜孔粒径在20-300nm的范围内，通常情况下也是可以适用的。除截流量外，本发明对渗透膜的来源、颜色、形状、渗透速率、孔的分布密度以及孔径形状都没有特别要求。9、所述的中间层是一种层状的粘性材料，其选择有很多，只要中间层的粘性不受有机相和渗透液影响并且无毒无害即可。可以为本身具有一定黏附能力的例如胶带类型的丙烯酸酯类的聚合物。中间层不仅将渗透膜和支撑层(或另一渗透膜)粘结起来，保证微流体渗透组件的完整性，同时保证整个渗透组件可以承受流体冲击力。中间层上设置有微流体通道，可以通过例如光刻、热压、激光切割等技术来形成微流体通道。通常情况下，流道的直径大概在10-3000微米，长度为10-1000毫米。使用微流体通道的目的是显著增大流体环境的表面积/体积的比例，故对其几何形状没有特别的要求，常见的例如水平的、波浪的、锯齿的、展开的螺旋线等等都可以，用以提高渗透膜面积利用率，加速纯化过程，极大缩短纯化所需时间，用以达到高速纯化mrna药物的目的。10、所述的支撑层主要是起到支撑作用，保证结构的整体性，对其材质没有特别的要求，常用的材料如聚丙烯等无生物毒性的高分子有机材料，如二氧化硅、玻璃等的无机材料，如铝箔等的金属或合金材料都可以作为支撑层材料。需要说明的是，支撑层同带有微流体通道的中间层需要有较好的黏附性，以确保微流体渗透组件的完整性。如果渗透膜有一定的支撑作用，也可以通过另一渗透膜来代替支撑层，即中间层的两侧均为渗透膜，用以加快过滤速度，提高mrna药物净化效率。11、本发明另一个目的是提供一种实施上述方法的快速纯化rna药物的装置，所述装置包括柔性层状结构的微流体渗透组件，其包括粘结在一起的三层膜，中间层上设有微流体通道，中间层的两侧分别是渗透膜层和支撑层，或者中间层的两侧都是渗透膜层；所述微流体渗透组件的一部分或者全部浸没在渗透缓冲液。将需要进行纯化的rna药物注入所述微流体渗透组件的入口，在从入口到出口的流动过程中，rna药物中的杂质通过微流体渗透组件中的渗透膜渗透到渗透缓冲液中，而以mrna-lnp的形式存在的rna药物保留在微流体渗透组件中，从而达到对药物进行纯化的目的。通过所述微流体渗透组件的出口收集经过纯化的rna药物。12、本发明另一个目的是提供一种快速制备rna药物的方法，包括如下步骤：13、(1)将rna粉末溶解在水性溶液中；14、(2)将rna组装成脂质纳米粒(例如采用已知的微流控混合技术)；15、(3)按照前述的快速纯化rna药物的方法对脂质纳米粒进行纯化。具体包括如下步骤：16、(3.1)将微流体渗透组件一部分或者全部浸没在渗透缓冲液中，所述微流体渗透组件是柔性层状结构，包括粘结在一起的三层膜，中间层上设有微流体通道，中间层的两侧分别是渗透膜层和支撑层，或者中间层的两侧都是渗透膜层；所述微流体渗透组件有且仅有一个入口用于输入通过上述步骤(2)得到的需要纯化的rna药物，以及一个或多个出口，用于输出经过纯化的rna药物；17、(3.2)将通过上述步骤(2)得到的需要纯化的rna药物注入所述微流体渗透组件的入口，所述rna药物以mrna-lnp的形式存在；18、(3.3)在从所述入口到所述出口的流动过程中，rna药物中的杂质通过微流体渗透组件中的渗透膜渗透到渗透缓冲液中，以mrna-lnp的形式存在的rna药物保留在微流体渗透组件中；19、(3.4)通过所述微流体渗透组件的出口收集经过纯化的rna药物。20、本发明另一个目的是提供一种快速制备rna药物的装置，包括：微流控混合组件和快速纯化组件。在微流控混合组件之前，还可以包括一个或者多个注入组件，分别用来接受rna水溶液和组装rna脂质纳米粒的有机溶液。微流控混合组件是用来将rna组装成脂质纳米粒子，而快速纯化组件是用来对脂质纳米粒进行纯化。所述快速纯化组件包括柔性层状结构的微流体渗透组件，其包括粘结在一起的三层膜，中间层上设有微流体通道，中间层的两侧分别是渗透膜层和支撑层，或者中间层的两侧都是渗透膜层；所述微流体渗透组件的一部分或者全部浸没在渗透缓冲液。将通过微流控混合组件制得的rna药物粗产品(含有组装好的rna脂质纳米粒子和杂质)注入所述微流体渗透组件的入口，在从入口到出口的流动过程中，rna药物中的杂质通过微流体渗透组件中的渗透膜渗透到渗透缓冲液中，以mrna-lnp的形式存在rna药物保留在微流体渗透组件中。通过所述微流体渗透组件的出口收集经过纯化的rna药物。。21、本发明的有益效果是，通过使用微流控技术，增大流体环境的表面积/体积的比例，大大加速了纯化过程，极大缩短了rna药物的纯化所需时间，使mrna疫苗的活性成分能够以固体形式保存和运输，实现了在疫苗接种现场快速、统一地组装和纯化mrna-lnp，避免了高昂的冷链保存及物流成本。当前第1页12当前第1页12