白杨素桥连吲哚类衍生物合成方法及其抗肿瘤方向应用

1.本发明属于药物化学技术领域，涉及天然产物白杨素，桥连氮杂-吲哚类衍生物、其制备方法及在抗肿瘤方向应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病，一直是科研工作者的研究重点之一。而天然黄酮及其衍生物具有多种生理活性，尤其在抗肿瘤生长方面具有独特的生物活性。
3.白杨素，又称白杨黄素，是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，其具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等广泛生理活性，而且该类化合物在植物中分布广泛，毒性较低，且对某些癌细胞生长有抑制作用，因此是新药开发研究中一个非常重要的资源。
4.吲哚类衍生物，特别是氮杂-吲哚类衍生物具有特定的生理活性，在抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及治疗高血压等方面具有很好的疗效。将氮杂-吲哚衍生物作为先导化合物,采用桥连方式，与天然产物白杨树进行结构对接，制备出新的、未见文献报道的，可用于研制抗肿瘤新药物的化合物，对我国拥有自主知识产权的1.1类新药的开发，具有积极的推动作用。
5.本发明利用烷基作为桥连基团，将氮杂-吲哚类化合物和天然产物白杨素键合在一起，制备了一系列新型的未见文献报的的化合物。本发明采用mtt研究法对该类化合物进行了抗肿瘤活性研究，实验结果显示，该类化合物对于多种肿瘤细胞的生长均具有良好的抑制效果，显示该类化合物具有进一步开发成1.1 类新型抗肿瘤药物的价值。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于，提供一种天然产物白杨素桥连-氮杂吲哚类衍生物的制备方法、及其抗肿瘤方向应用。
7.本发明提供了一种白杨素桥连-氮杂吲哚类衍生物，如式(ⅰ)所示：
[0008][0009]
优选的，如式(
ⅰ‑
1)～式(
ⅰ‑
4)所示：
[0010][0011][0012]
本发明还提供了一种天然产物白杨素桥连-氮杂吲哚类衍生物的制备方法，包括：
[0013]
步骤一：将白杨素与1,4-二溴丁烷在碱性催化环境中反应，得到式(ⅱ)所示的化
合物中间体：
[0014]
步骤二：将所述式(ⅱ)化合物与不同的氮杂-吲哚衍生物反应，得到式(
ⅰ‑
1～i.4)所示的化合物：
[0015]
本发明还提供了天然产物白杨素，桥连吲哚类衍生物在抗肿瘤药物中的应用。
[0016]
本发明提供的天然产物白杨素桥连-氮杂吲哚类衍生物，如式(
ⅰ‑
1～
ⅰ‑
4)所示。它们都显现出对多种肿瘤细胞具有良好的生长抑制作用，尤其是(
ⅰ‑
4)式化合物，它对于a549细胞、hela细胞、mcf-7 细胞、sh-sy5y细胞与hepg2细胞五类肿瘤细胞具有较高的抑制生长活性。
附图说明
[0017]
在说明书附图中：
[0018]
图1为本发明合成化合物结构通式；
[0019]
图2为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和白杨素在不同浓度下对hela细胞的生长抑制率评价图；
[0020]
图3为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和白杨素在不同浓度下对hepg2细胞的生长抑制率评价图；
[0021]
图4为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和白杨素在不同浓度下对a549细胞的生长抑制率评价图；
[0022]
图5为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和白杨素在不同浓度下对sh-sy5y细胞的生长抑制率评价图；
[0023]
图6为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和白杨素在不同浓度下对mcf-7细胞的生长抑制率评价图。
具体实施方式
[0024]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
将不同位点的氮杂吲哚与式(ⅱ)所示化合物反应；所述氮杂吲哚与式(ⅱ)所示的化合物的摩尔比优选为1:(1～10),更优选为1:(1～5)，再优选为1:2；所述碱性催化条件优选加入强碱弱酸盐提高；所述强碱弱酸盐为本领域技术人员熟知的强碱弱酸盐即可，并无特殊限制，本发明中优选为碳酸钾；在本发明中该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶
剂为本领域技术人员熟知的质子化试剂即可，并无特殊限制，本发明中优选为乙腈；所述乙腈与白杨素的比例优选为(20～100)ml:1g，更优选为(30～80)ml:1g，再优选为42ml:1g；所述反应的温度优选为25℃～100℃，更优选为50℃～100℃，再优选为80℃；所述反应的时间优选为3～48h，更优选为5～24h，再优选为8h。
[0026]
反应结束后，将产物从反应体系中分离，所述分离的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制，分离后，得到产物。
[0027]
此步骤的反应式如下：
[0028][0029]
其中r1、r2、r3、r4＝ch or n
[0030]
本发明还提供了一种上述式(ⅰ)所示的白杨素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0031]
本发明目标化合物的抗肿瘤活性，可以采用mtt研究法，通过目标化合物与各种肿瘤细胞的相互作用，研究其在不同浓度条件下，抑制肿瘤生长的效果作为评价手段之一，用肿瘤细胞的抑制率予以表现。在活细胞的线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，它能使外源性mtt还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死亡后的细胞无此功能。mtt与细胞作用后，用二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒，利用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映肿瘤细胞生长的抑制情况。在一定细胞数范围内，mtt结晶甲瓒形成的量与活细胞数成正比。
[0032]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的白杨素衍生物、其制备方法及应用进行详细描述。
[0033]
以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0034]
实施例1
[0035]
步骤一：式(
ⅰ‑
1)所示化合物的制备
[0036][0037]
将2.54g(10mmol)白杨素、5.52g(40mmol)无水k2co3、150ml丙酮和10ml 1,4-二溴丁烷加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至回流。反应8h后，停止反应，旋蒸除去溶剂，用石油醚洗3次后，减压抽滤，再用蒸馏水洗3次，烘干。用洗脱液ch2cl2柱层析纯化粗产品,得黄色针状纯中间产物式(ⅱ)，产率89％。
[0038]
再将388mg(1mmol)中间产物、590mg(5mmol)4-氮杂吲哚和50ml乙腈加入100ml圆底烧瓶中，在80℃下搅拌回流8h后，停止反应，冷至室温后放入-20℃冰箱，析出橙黄色固体，过滤得纯产品 211.8mg，产率49.72％。
[0039]
对中间产物进行测定：
[0040]
利用核磁共振对得到的橙黄色固体进行检测，得到1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.81(d,j＝6.1hz,1h), 8.56(d,j＝8.2hz,1h),8.31(s,1h),8.06(d,j＝7.6hz,2h),7.68(dd,j＝8.2,6.1hz,1h),7.59
–
7.52(m,3h),7.18 (s,1h),7.00(s,1h),6.76(d,j＝1.1hz,1h),6.33(d,j＝1.1hz,1h),4.83(t,j＝7.2hz,2h),4.13(t,j＝6.3hz,2h), 2.14
–
2.05(m,2h),1.81
–
1.74(m,2h).
[0041]
利用质谱仪对得到的橙黄色固体进行检测，得到esi-ms m/z[m+h]
+
＝427.2968。
[0042]
利用熔点仪对得到的橙黄色固体进行检测，得到熔点255℃～257℃。
[0043]
将上述合成的本发明式(
ⅰ‑
1)所示的化合物，采用mtt实验研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic
50
值。
[0044]
实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem 培养基。
[0045]
目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30 μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。
[0046]
mtt法实验流程：以hela细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μl的pbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体吸出，随后每孔加入10μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml 的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μl的dmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入150μl dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490
–
空白组a490)
×
100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值，采用spss统计学软件计算得出。
[0047]
得到结果见表1与图1。
[0048]
表1式(
ⅰ‑
1)所示化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值
[0049][0050]
实施例2
[0051]
步骤一：式(
ⅰ‑
2)所示化合物的制备
[0052][0053]
将2.54g(10mmol)白杨素、5.52g(40mmol)无水k2co3、150ml丙酮和10ml 1,4-二溴丁烷加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至回流。反应8h后，停止反应，旋蒸除去溶剂，用石油醚洗3次后，减压抽滤，再用蒸馏水洗3次，烘干。用洗脱液ch2cl2柱层析纯化粗产品,得黄色针状纯中间产物式(ⅱ)，产率89％。
[0054]
再将388mg(1mmol)中间产物、590mg(5mmol)5-氮杂吲哚和50ml乙腈加入100ml圆底烧瓶中，在80℃下搅拌回流7h后，停止反应，吹打瓶内液体，析出淡黄色固体，过滤，用乙腈洗3次，得淡黄色粉末纯产品307.9mg，产率72.28％。
[0055]
对中间产物进行测定：
[0056]
利用核磁共振对得到的淡黄色固体进行检测，得到1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.40(s,1h),8.51(d,j ＝7.1hz,1h),8.06(d,j＝8.5hz,2h),7.98(d,j＝6.4hz,1h),7.93(s,1h),7.59
–
7.55(m,3h),7.01(s,1h),6.76(d, j＝2.1hz,1h),6.38
–
6.32(m,1h),4.63(t,j＝7.1hz,2h),4.13(t,j＝5.8hz,2h),2.08
–
2.05(m,2h),1.75
–
1.72 (m,2h),1.19(s,1h).
[0057]
利用质谱仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到esi-ms m/z[m+h]
+
＝427.3230。
[0058]
利用熔点仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到熔点268℃～278℃。
[0059]
将上述合成的本发明式(
ⅰ‑
2)所示的化合物，采用mtt实验研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic
50
值。
[0060]
实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem 培养基。
[0061]
目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30 μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。
[0062]
mtt法实验流程：以hela细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μl的pbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态
后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体吸出，随后每孔加入10μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml 的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μl的dmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入150μl dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490
–
空白组a490)
×
100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值，采用spss统计学软件计算得出。
[0063]
得到结果见表2与图2。
[0064]
表2式(
ⅰ‑
2)所示化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值
[0065][0066]
实施例3
[0067]
步骤一：式(
ⅰ‑
3)所示化合物的制备
[0068][0069]
将2.54g(10mmol)白杨素、5.52g(40mmol)无水k2co3、150ml丙酮和10ml 1,4-二溴丁烷加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至回流。反应8h后，停止反应，旋蒸除去溶剂，用石油醚洗3次后，减压抽滤，再用蒸馏水洗3次，烘干。用洗脱液ch2cl2柱层析纯化粗产品,得黄色针状纯中间产物式(ⅱ)，产率89％。
[0070]
再将388mg(1mmol)中间产物、590mg(5mmol)6-氮杂吲哚和50ml乙腈加入100ml圆底烧瓶中，在80℃下搅拌回流8h后，停止反应，冷至室温后放入-20℃冰箱，析出黄色固体，过滤，得黄色固体纯产品352mg，产率82.63％。
[0071]
对中间产物进行测定：
[0072]
利用核磁共振对得到的黄色固体进行检测，得到1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.30(s,1h),8.41(d,j＝ 6.7hz,1h),8.29(d,j＝2.8hz,1h),8.13(d,j＝6.7hz,1h),8.06(d,j＝6.7hz,2h),7.56(t,j＝7.2hz,3h),7.01(s, 1h),6.92(d,j＝2.8hz,1h),6.76(d,j＝2.0hz,1h),6.35(d,j＝2.0hz,1h),4.67(t,j＝7.2hz,2h),4.15
–
4.10(m, 2h),2.11
–
2.04(m,2h),1.75(q,j＝6.5hz,2h).
[0073]
利用质谱仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到esi-ms m/z[m+h]
+
＝427.3240。
[0074]
利用熔点仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到熔点238℃～247℃。
[0075]
将上述合成的本发明式(
ⅰ‑
3)所示的化合物，采用mtt实验研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic
50
值。
[0076]
实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem 培养基。
[0077]
目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30 μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。
[0078]
mtt法实验流程：以hela细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μl的pbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体吸出，随后每孔加入10μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml 的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μl的dmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入150μl dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490
–
空白组a490)
×
100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值，采用spss统计学软件计算得出。
[0079]
得到结果见表3与图3。
[0080]
表3式(
ⅰ‑
3)所示化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值
[0081][0082]
实施例4
[0083]
步骤一：式(
ⅰ‑
4)所示化合物的制备
[0084][0085]
将2.54g(10mmol)白杨素、5.52g(40mmol)无水k2co3、150ml丙酮和10ml 1,4-二溴丁烷加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至回流。反应8h后，停止反应，旋蒸除去溶剂，用石油醚洗3次后，减压抽滤，再用蒸馏水洗3次，烘干。用洗脱液ch2cl2柱层析纯化粗产品,得黄色针状纯中间产物式(ⅱ)，产率89％。
[0086]
再将388mg(1mmol)中间产物、1.18g(10mmol)7-氮杂吲哚和50ml乙腈加入100ml圆底烧瓶中，在80℃下搅拌回流8h后，停止反应，旋蒸除去溶剂，得黄色固体，用蒸馏水洗5次，烘干，用洗脱液甲醇：二氯甲烷＝1:8柱层析纯化产品，得橙色固体纯产品308.9mg，产率72.51％。
[0087]
对中间产物进行测定：
[0088]
利用核磁共振对得到的黄色固体进行检测，得到1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.89(s,1h),7.53(s, 2h),6.66(s,1h),6.49(d,j＝2.1hz,1h),6.35(d,j＝2.0hz,1h),4.05(s,1h),3.69(t,j＝5.2hz,3h),2.76(t,j＝ 5.3hz,3h),1.89
–
1.80(m,2h),1.75
–
1.68(m,2h),0.96
–
0.74(m,4h).
[0089]
利用质谱仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到esi-ms m/z[m+h]
+
＝427.2936。
[0090]
利用熔点仪对得到的淡黄色固体进行检测，得到熔点215℃～220℃。
[0091]
将上述合成的本发明式(
ⅰ‑
4)所示的化合物，采用mtt实验研究方法，评价目标化合物抑制不同肿瘤细胞生长的抑制率以及ic
50
值。
[0092]
实验采用的细胞培养均在37℃、5％co2的无菌培养箱环境下进行，培养基采用含10％fbs的dmem 培养基。
[0093]
目标化合物浓度设置：将本发明目标化合物配制成浓度梯度为5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30 μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l、80μmol/l的试验用样品。培养基作为空白对照，即化合物浓度为0。
[0094]
mtt法实验流程：以hela细胞系为例，细胞从液氨中复苏，经过3次传代后细胞处于正常贴壁生长状态。在96孔板最外一圈的孔中加入100μl的pbs，将细胞以6000个/孔的浓度种在96孔板剩余的孔中，最右一列作为空白组不种细胞。种板后24h待细胞处于贴壁状态后，再加入不同浓度梯度的样品，每种浓度设置为一列6个复孔。作用48h后，将孔内液体吸出，随后每孔加入10μl用pbs稀释的浓度为5mg/ml 的mtt溶液，该溶液已经透过滤膜除菌，同时每孔加入100μl的dmem。作用4h后，将含有mtt的液体吸出，加入150μl dmso，轻微摇晃5min使紫色结晶溶解至dmso中。利用酶标仪在490nm波长下测定每孔的吸光度a490，计算出样品对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率采用如下公式计算：细胞的生长抑制率＝(对照组a490-样品组a490)/(对照组a490
–
空白组a490)
×
100％，以及目标化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值，采用spss统计学软件计算得出。
[0095]
得到结果见表4与图4。
[0096]
表4式(
ⅰ‑
4)所示化合物对不同肿瘤细胞的ic
50
值
[0097][0098]
表5目标化合物、原料和5-氟尿嘧啶对5种肿瘤细胞的ic
50
值
[0099]