一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用

一种脂肪酶calbgold及其制备方法、应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种脂肪酶calbgold及其制备方法、应用。


背景技术：

2.脂肪酶即甘油酯水解酶，是一类水解油酯的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。另一方面，在非水相体系中，脂肪酶具有酯化、转酯等活力，是合成酯和脂肪酸酯(生物柴油)的优良、绿色的催化剂。在众多脂肪酶中，来源于南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶b(calb)是用途最为广泛的酶之一。calb是一种优良的脂肪酶，在水相、有机相中均具有很强的催化活性。calb具有特殊的活性中心结构，有较为优良的酯化和转酯能力，具有广谱的底物接受性。因此与其他脂肪酶相比，calb的用途最为广泛。比如在酯化、转酯、水解、手性化合物拆分、有机物合成等方面都具有较高的反应速率和立体选择性，拥有较好的催化性能。
3.但目前，calb在ph稳定性和热稳定性等方面能力相对较弱。当脂肪酶calb处在低ph值环境中时，如当反应体系中游离脂肪酸含量高时，calb的活性衰失较快。在酯化和转酯的正常体系条件下，在温度大约在50-60℃之间时calb的失活较快，且它的失活速度随温度升高会加快。因此，实现高产、高酯化活性和高转酯活性的表达是实现脂肪酶calb的工业化应用的前提。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种脂肪酶calbgold及其制备方法、应用，旨在提供一种高产、高酯化活性和高转酯活性的脂肪酶。
5.为实现上述目的，本发明提出一种脂肪酶calbgold，所述脂肪酶calbgold的氨基酸序列如seq id no：1所示。
6.本发明还提出一种脂肪酶基因calbgold，用于编码如上所述的脂肪酶calbgold，所述脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列与seq id no：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。
7.本发明还提出一种重组表达载体，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold。
8.本发明还提出一种如上所述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
9.将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
10.将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。
11.本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold。
12.可选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。
13.本发明还提出一种如上所述的重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
14.将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶
切的脂肪酶基因片段；
15.将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
16.将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
17.本发明还提出一种如上所述的脂肪酶calbgold的制备方法，包括以下步骤：
18.将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
19.将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
20.将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株；
21.培养所述重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶calbgold。
22.本发明还提出一种合成酯的制备方法，在酯化反应中加入如上所述的脂肪酶calbgold。
23.本发明还提出一种脂肪酸酯的制备方法，在转酯反应中加入如上所述的脂肪酶calbgold。
24.本发明提供的脂肪酶calbgold是在原南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶calb(genbank：z30645.1)的基础上，通过人工的理性设计对脂肪酶calb进行了定点突变改造，通过对脂肪酶calb上的第105位、第110位、第154位、第173位、第188位及第260位等六个位点上的氨基酸进行了突变，大幅度增加了脂肪酶calbgold的酯化和转酯活力及稳定性，通过人工定向改造，显著提高了脂肪酶calbgold的表达水平和活性，与原始脂肪酶calb相比，脂肪酶calbgold的活性提高了约20倍，使得脂肪酶calbgold具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，适于工业化生产。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
26.图1为本发明实施例1中原始脂肪酶calb的三维结构图；
27.图2为本发明实施例1中改造后的脂肪酶calbgold的三维结构图；
28.图3为本发明实施例1中原始脂肪酶基因calb的密码子使用频率图；
29.图4为本发明实施例1中获得的脂肪酶基因calbgold的密码子使用频率图；
30.图5为本发明实施例2中构建的重组表达载体ppiczαa-calbgold和ppiczαa-calb的单酶切检验结果图；
31.图6为本发明实施例2中构建的重组表达载体ppiczαa-calbgold和ppiczαa-calb的双酶切检验结果图；
32.图7为本发明实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的sds-page测试结果图；
33.图8为本发明实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的酶活测试结果图；
34.图9为本发明实施例4中改造后的脂肪酶calbgold和原始脂肪酶calb的酯化率随时间变化图；
35.图10为本发明实施5中改造后的脂肪酶calbgold和原始脂肪酶calb的转酯化率随时间变化图。
36.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
37.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
38.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本发明提出一种脂肪酶calbgold，所述脂肪酶calbgold的氨基酸序列如seq id no：1所示。
40.本发明提供的脂肪酶calbgold是在原南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶calb(genbank：z30645.1)的基础上，通过人工的理性设计对脂肪酶calb进行了定点突变改造，具体改造过程包括：通过定点突变的方法将原始脂肪酶calb第105位的苏氨酸(thr，t)突变为丙氨酸(ala，a)，第110位的天冬酰胺(asn，n)突变为酪氨酸(tyr，y)，第154位的甲硫氨酸(met，m)突变为缬氨酸(val，v)，第173位的丙氨酸(ala，a)突变为甘氨酸(gly，g)，第188位的亮氨酸(leu，l)突变为苯丙氨酸(phe，f)，第260位的缬氨酸(val，v)突变为丙氨酸(ala，a)，得到改造后的脂肪酶calbgold氨基酸序列。通过对脂肪酶calb上的第105位、第110位、第154位、第173位、第188位及第260位等六个位点上的氨基酸进行了突变，大幅度增加了脂肪酶calbgold的酯化和转酯活力及稳定性，通过人工定向改造，显著提高了脂肪酶calbgold的表达水平和活性，与原始脂肪酶calb相比，脂肪酶calbgold的活性提高了约20倍，使得脂肪酶calbgold具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，适于工业化生产。
41.本发明还提出一种脂肪酶基因calbgold，用于编码如上所述的脂肪酶calbgold，所述脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列与seq id no：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。优选地，所述脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列如seq id no：2所示。
42.获得脂肪酶基因calbgold的方法具体如下：得到改造后的脂肪酶calbgold氨基酸序列之后，人工重新设计脂肪酶基因的核苷酸序列，适配表达宿主。采用使用频率高的密码子替换使用频率低的密码子，平衡基因核苷酸序列中gc的含量及分布，从而提高脂肪酶calbgold的表达量，然后通过人工合成的方法获得脂肪酶基因calbgold片段。脂肪酶基因calbgold以脂肪酶calbgold的氨基酸序列为基础，以酵母密码子使用频率为参考，适配表达宿主，采用氨基酸的简并密码子中的高频密码子来翻译对应的氨基酸，进一步提高了人
工定向改造后的脂肪酶calbgold在酵母细胞中的表达量。
43.需要说明的是，定点突变技术以及人工合成基因的技术为本领域常规的方法，具体操作步骤为本领域技术人员所公知，在此不做赘述。原始脂肪酶calb的氨基酸序列如seq id no：3所示，原始脂肪酶基因calb的核苷酸序列如seq id no：4所示。
44.本发明还提出一种重组表达载体，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold。在脂肪酶calbgold的氨基酸序列和脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列确定的情况下，可以选择合适的表达载体或其他功能单位。对于重组表达载体的制备方法采用基因工程常规手段即可实现，在本发明具体实施时，例如可采用毕赤酵母表达载体ppiczαa，也可以选用其他毕赤酵母表达载体。
45.本发明还提出一种如上所述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
46.步骤s11、将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
47.步骤s12、将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。
48.具体地，在本发明的一实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体ppiczαa，对应地，所述重组表达载体的制备方法包括：将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；然后将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入到毕赤酵母表达载体ppiczαa，获得脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold。
49.本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold，所述重组表达菌株的表达产物为氨基酸序列如seq id no：1所示的脂肪酶calbgold。所述重组表达菌株在构建时可以选用合适的宿主细胞，例如选择基因工程领域常用的宿主细胞均可，在本发明的一实施例中优选毕赤酵母作为宿主细胞，脂肪酶在重组菌株中具有更高的表达量。
50.本发明还提出一种如上所述的重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
51.步骤s21、将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
52.步骤s22、将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
53.步骤s23、将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
54.具体地，在本发明的一实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体ppiczαa，所述宿主细胞为毕赤酵母，对应地，所述重组表达菌株的制备方法包括：将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；然后将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入到毕赤酵母表达载体ppiczαa，获得脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold；然后用限制性内切酶bgl ii将脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold线性化，再通过电转化的方式将线性化后的脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold导入毕赤酵母中，并在含有zeocin抗性的ypd平板上筛选阳性克隆，即获得所述重组表达菌株。
55.本发明还提出一种如上所述的脂肪酶calbgold的制备方法，包括以下步骤：
56.步骤s31、将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
57.步骤s32、将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
58.步骤s33、将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株；
59.步骤s34、培养所述重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶calbgold。
60.具体地，在本发明的一实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体ppiczαa，所述宿主细胞为毕赤酵母，对应地，所述脂肪酶calbgold的制备方法包括：将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；然后将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入到毕赤酵母表达载体ppiczαa，获得脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold；然后用限制性内切酶bgl ii将脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold线性化，再通过电转化的方式将线性化后的脂肪酶重组表达载体ppiczαa-calbgold导入毕赤酵母中，并在含有zeocin抗性的ypd平板上筛选阳性克隆，即获得重组表达菌株；挑选重组表达菌株单菌落接种至ypd液体培养基中过夜培养后得种子液，再将种子液接种至bmgy发酵培养基中继续过夜培养，之后转移至bmmy培养基中继续培养，培养过程中添加甲醇诱导表达，发酵后取发酵上清液提纯获得脂肪酶calbgold。需要说明的是，在一些实施例中，也可以不经过提纯处理，直接将发酵上清液视为脂肪酶calbgold。
61.对于获得的脂肪酶calbgold，因其具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，可使用在需要高酯化活性的工业应用场景中，例如将脂肪酶calbgold与脂类和羟基类物料或含脂类和羟基类物料接触发生的酯化反应。鉴于此，本发明还提出一种合成酯的制备方法，在酯化反应中加入如上所述的脂肪酶calbgold。具体地，在本发明的一实施例中，使用油酸和甲醇，经脂肪酶calbgold催化酯化生成油酸甲酯。
62.对于获得的脂肪酶calbgold，还可使用在需要高转酯活性的工业应用场景中，例如将脂肪酶calbgold与脂类和羟基类物料或含脂类和羟基类物料接触发生的转酯反应。鉴于此，本发明还提出一种脂肪酸酯的制备方法，在转酯反应中加入如上所述的脂肪酶calbgold。具体地，在本发明的一实施例中，使用橄榄油和甲醇，经脂肪酶calbgold催化转酯化生成脂肪酸甲酯(又名生物柴油)。
63.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
64.实施例1脂肪酶calbgold的改造与脂肪酶基因calbgold的人工设计
65.脂肪酶calbgold的改造：在原南极假丝酵母(candida antarctica)的脂肪酶calb(genbank：z30645.1)的基础上，通过人工的理性设计对脂肪酶calb进行了定点突变改造，具体改造过程包括：通过定点突变的方法将原来源于南极假丝酵母的脂肪酶calb第105位的苏氨酸(thr，t)突变为丙氨酸(ala，a)，第110位的天冬酰胺(asn，n)突变为酪氨酸(tyr，y)，第154位的甲硫氨酸(met，m)突变为缬氨酸(val，v)，第173位的丙氨酸(ala，a)突变为甘氨酸(gly，g)，第188位的亮氨酸(leu，l)突变为苯丙氨酸(phe，f)，第260位的缬氨酸(val，v)突变为丙氨酸(ala，a)，得到改造后的脂肪酶calbgold氨基酸序列。
66.原始脂肪酶calb的氨基酸序列如seq id no：3所示，改造后的脂肪酶calbgold氨基酸序列如seq id no：1所示。通过对脂肪酶calb上的第105位、第110位、第154位、第173位、第188位及第260位等六个位点上的氨基酸进行了突变，大幅度增加了脂肪酶calbgold的酯化和转酯活力及稳定性，通过人工定向改造，显著提高了脂肪酶calbgold的表达水平和活性，与原南极假丝酵母的脂肪酶calb相比，脂肪酶calbgold的活性提高了约20倍，使得脂肪酶calbgold具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，适于工业化生产。
67.参照图1和图2，图1为本发明实施例1中原始脂肪酶calb的三维结构图，其中标示出用于改造的氨基酸在三维结构中的位置，图2为本发明实施例1中改造后的脂肪酶calbgold的三维结构图，其中标示出主要突变氨基酸在三维结构中的位置。
68.脂肪酶基因calbgold的人工设计：得到改造后的脂肪酶calbgold氨基酸序列之后，人工重新设计脂肪酶基因的核苷酸序列，适配表达宿主。采用使用频率高的密码子替换使用频率低的密码子，平衡基因核苷酸序列中gc的含量及分布，从而提高脂肪酶calbgold的表达量，然后通过人工合成的方法获得脂肪酶基因calbgold片段。
69.原始脂肪酶基因calb的核苷酸序列如seq id no：4所示，获得的脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列如seq id no：2所示。脂肪酶基因calbgold以脂肪酶calbgold的氨基酸序列为基础，以酵母密码子使用频率为参考，适配表达宿主，采用氨基酸的简并密码子中的高频密码子来翻译对应的氨基酸，进一步提高了人工定向改造后的脂肪酶calbgold在酵母细胞中的表达量。
70.参照图3和图4，图3为本发明实施例1中原始脂肪酶基因calb的密码子使用频率图，其中标示出前150个密码子的使用频率，图4为本发明实施例1中获得的脂肪酶基因calbgold的密码子使用频率图，其中标示出前150个密码子的使用频率，经图3和图4对比可见，本发明实施例1中获得的脂肪酶基因calbgold的密码子使用频率有明显的优化。
71.实施例2重组表达载体的构建
72.(1)将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段。具体而言，将含有脂肪酶基因calbgold的质粒同时由ecor i和xba i酶切，并收集酶切产物，其中，酶切体系为：40μldna、1.5μlecor i、1.5μlxba i、15μl的buffer m加水补齐至150μl体积，在37℃条件下酶切4h。
73.需要说明的是，在对脂肪酶基因calbgold进行酶切的同时，还进行表达载体的准备：将载体ppiczαa同时由ecor i和xba i酶切，并收集酶切产物，其酶切体系与上述酶切体系一致。
74.(2)将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。具体而言，将脂肪酶基因calbgold的酶切产物(作为双酶切的脂肪酶基因片段)和载体ppiczαa的酶切产物(作为表达载体)用t4 dna连接酶在16℃过夜连接，连接完成后得到重组表达载体ppiczαa-calbgold，其中，连接体系为：5μl的基因片段、1μl的ppiczαa片段、1μl的t4 buffer、0.5μl的t4 dna连接酶、加水补齐至10μl。
75.(3)采用如上所述的步骤(1)和(2)将原始脂肪酶基因calb进行重组表达载体的构建，得到重组表达载体ppiczαa-calb。
76.对本发明实施例2中构建的重组表达载体ppiczαa-calbgold和ppiczαa-calb进行酶切检验，参照图5和图6，图5为本发明实施例2中构建的重组表达载体ppiczαa-calbgold和ppiczαa-calb的单酶切检验结果图，图中，m为dl5000 dna marker，1泳道为重组表达载体ppiczαa-calbgold经ecor i单酶切验证，2泳道为重组表达载体ppiczαa-calb经ecor i单酶切验证，图6为本发明实施例2中构建的重组表达载体ppiczαa-calbgold和ppiczαa-calb的双酶切检验结果图，图中，m为dl5000 dna marker，1泳道为重组表达载体ppiczαa-calbgold经ecor i和xba i双酶切验证，2泳道为重组表达载体ppiczαa-calb经ecor i和xba i双酶切验证。由图5和图6可以看出，脂肪酶基因calbgold和原始脂肪酶基因calb均成
功连接至ppiczαa重组表达载体上。
77.实施例3重组表达菌株的构建及发酵培养生产脂肪酶
78.(1)将本发明实施例2获得的重组表达载体ppiczαa-calbgold通过电转化的方法转入巴斯德毕赤酵母中，电转化方法如下：(i)用bgl ii酶切ppiczαa-calbgold，使其线性化；(ii)取10μl上述重组表达质粒线性化产物与90μl新鲜毕赤酵母感受态细胞混合，放在冰上冰浴5min；(iii)打开电转仪，调节电击参数，电压1550v，电阻200ω，电容25μf，将冰浴的线性化产物与感受态细胞混合物转入冰上遇冷的电转杯进行电击；(iv)迅速向电转杯中加入1ml已在28℃预热的ypd，再转入1.5ml无菌离心管中，静置于28℃培养箱2h；(v)取100μl菌液涂布于含zeocin抗性的ypd平板，于28℃培养箱中静置培养3天，待长出单菌落后，即获得含脂肪酶基因calbgold的毕赤酵母重组表达菌株。
79.(2)原始脂肪酶calb的重组表达菌株采用与步骤(1)相同的方式构建，得到含脂肪酶基因calb的毕赤酵母重组表达菌株。
80.(3)将上述步骤(1)和(2)得到的重组表达菌株接种于装有5ml ypd培养基中，28℃恒温振荡培养过夜后，获得种子液。将种子液接种至含25ml bmgy发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养。bmgy发酵培养基的配方为：1％酵母粉、2％蛋白胨、100mm磷酸缓冲液(ph 6.0)、1.34％酵母氮碱、0.004％生物素、1％甘油。培养过夜后，收集菌体并转移到25ml bmmy培养基中继续培养。bmmy培养基的配方为：1％酵母粉、2％蛋白胨、100mm磷酸缓冲液(ph 6.0)、1.34％酵母氮碱、0.004％生物素、0.5％甲醇。每24h补充0.25ml甲醇，至96h时停止发酵。取发酵上清液采用sds-page进行检测，请参照图7，图7为本发明实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的sds-page测试结果图，图中，m为蛋白质marker，泳道1-6为不同菌株。由图7说明脂肪酶基因calbgold的表达水平明显高于原始脂肪酶基因calb的表达水平。
81.(4)脂肪酶活性的测定：采用三丁酸甘油酯乳化液4ml为底物，tris-hcl(ph＝7.0，50mm)5ml为缓冲液，加入1ml发酵上清液。在40℃下反应10min，随后取出置冰上并加入15ml95％乙醇终止反应。样品组及对照组每瓶加入25μl酚酞作为指示剂，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定，当反应液显色红色时，以此判定为到达滴定终点；以样品组及对照组所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积差值计算脂肪酶活力。
82.其酶活计算公式为
83.其中，实验组消耗氢氧化钠标准溶液的体积为v2(ml)，空白组消耗氢氧化钠标准溶液的体积为v1(ml)，m为naoh标准溶液的浓度(mmol/l)，n为稀释倍数，t为反应时间(min)。
84.脂肪酶的活性定义为：为1ml液体酶在上述温度和ph条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位。
85.图8为本发明实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的酶活测试结果图，由图8可看出优化后的脂肪酶calbgold的活性，明显高于原始脂肪酶calb。
86.实施例4脂肪酶酯化率的测定
87.(1)配制油酸混合样品：按油酸(ar)+60％(wt基于油酸重量)叔丁醇(ar)+16％(wt基于油酸重量)无水甲醇(ar)摇匀待用。
88.(2)称取17.6g配好后油酸混合样品到50ml具塞三角瓶中，盖塞后放入40℃200rpm
摇床中预热15min。后停摇床，将上述50ml具塞三角瓶取出，打开瓶塞，将已经称好的0.5ml待测固酶样品(相当于基于油酸重量的5％的酶)小心加入具塞三角瓶中，盖好塞子，快速将具塞三角瓶放入摇床中，启动摇床开始降酸反应，定时取样测定酸值，其中，固酶样品为改造后的脂肪酶calbgold或原始脂肪酶calb。
89.(3)酸值的测定，根据国标gb/t5530-2005：动植物油脂酸值和酸度测定。具体步骤包括：配制中性乙醇(95％乙醇用0.05mol/l的氢氧化钠溶液滴至微红)，后称取待测油酸混合样约0.4g于100ml大口三角瓶中并记录好重量。倒入25ml左右的中性乙醇溶解摇匀。用标定好的0.05mol/l氢氧化钠标准溶液去滴定上述样品，滴定至微红即中性，记录所消耗的体积(ml)。
90.按公式计算出被测酸值：酸值(mg koh/g)＝56.11
×c×
v/m；c为氢氧化钠标准溶液标定浓度(mol/l)，v为氢氧化钠标准溶液滴定体积(ml)，m为被测油样的称量重量(g)。
91.(4)酯化率测定：在油酸与酶的反应体系下，测定固定化脂肪酶催化一定量的油酸后的酸值s1。然后测定油酸初始的酸值s，则酯化率为：酯化率％＝(s-s1)/s
×
100％。
92.图9为本发明实施例4中改造后的脂肪酶calbgold和原始脂肪酶calb的酯化率随时间变化图，由图9可知，脂肪酶calbgold的酯化率最终可达到94％，与原始脂肪酶calb相比有明显的提高。
93.实施例5脂肪酸甲酯的制备
94.(1)取9.0g橄榄油、1.7ml甲醇、1.0ml水和0.2ml液体脂肪酶(分别为改造后的脂肪酶calbgold或原始脂肪酶calb)进行混合，在40℃的摇床中摇晃20h，摇床的转速为200r/min，反应结束后于13000g条件下离心3min，提取上清液，即为生物柴油转酯反应的产物。定期取样品测定反应体系中脂肪酶甲酯的含量。
95.(2)取5μl的步骤(1)中的上清液与495μl的正己烷混合，测试产物中脂肪酸酯的含量及转化率。
96.图10为本发明实施5中改造后的脂肪酶calbgold和原始脂肪酶calb的转酯化率随时间变化图，由图10可知，脂肪酶calbgold转酯率可高达94％，明显高于原始脂肪酶calb。说明以改造后的脂肪酶calbgold作为生物柴油转酯反应的催化剂，显著提高了转酯反应的转酯率，进而提高了生物柴油的生产效率。
97.综上所述，本发明根据通过对脂肪酶的重新设计，并适配表达宿主获得了新型的高产、高酯化活性和高转酯活性的脂肪酶calbgold。提高了脂肪酶的酶活和表达量，且制备工艺简单、产量高；此外，当脂肪酶calbgold作为酯化和生物柴油转酯反应的催化剂使用时，酯化和转酯率高，降低了以脂肪酶催化生物柴油转酯反应的生产成本，能高效的催化生物柴油转酯反应。
98.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。