一种基于苏云金芽孢杆菌的纳米氧化锌复合材料及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种基于苏云金芽孢杆菌的纳米氧化锌复合材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.氧化锌纳米颗粒（zno nps）具有抗菌，抗真菌，紫外线过滤特性，高催化活性和光化学活性，因此被广泛使用，成为近年来的热门发展材料之一。传统上，制备zno nps材料多是物理或化学方法，生产工艺成熟易于工业化生产，但是存在工艺流程复杂、成本较高且伴随着环境污染、操作风险较高等问题。在此情况下，生物合成纳米材料得到蓬勃发展。生物合成纳米材料技术是指利用天然材料如微生物酶，多糖和可生物降解的聚合物来合成 nps。其中，利用微生物合成纳米材料已显示出巨大的潜力，得到广泛关注。
3.目前研究已发现，可以用来制备纳米氧化锌材料的微生物有乳杆菌属（lactobacillus）、酵母菌（yeast）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，简称bt)、绿脓杆菌（pseudomonas aeruginosa）等。其中，bt是近年来应用最广的微生物杀虫剂，其分泌的cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目等害虫有较高的毒性，然而昆虫已表现出较高抗性，给这种微生物杀虫剂的应用带来了挑战。为了保护这种生物杀虫剂资源，利用bt合成金属氧化物如氧化锌纳米材料是非常有效的渠道之一，并且合成的纳米氧化锌复合材料即bt-zno nps较传统纳米氧化锌杀虫效果好。bt-zno nps在害虫防治领域表现出广阔的发展前景。但是在制备、实际应用等方面仍不完善，关于制备过程的技术优化，不同条件下得出的 bt-zno nps 的产量、性质差异等还有空缺，所以在 bt-zno nps 制备仍需在已有研究的基础上继续讨论分析。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，以下简称“bt”)的纳米氧化锌复合材料（bt-zno nps）及其制备方法与应用，该方法制备的纳米氧化锌复合材料主要有锌(zn)、氧(o)、碳(c)等元素构成，粒型为六方纤锌矿结构，粒径为19-25 nm，带负电，分散性好且杀虫效果显著；另外，本发明方法过程简单，易操作，且无化学试剂残留。
5.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种基于苏云金芽孢杆菌的纳米氧化锌复合材料的制备方法，包括以下步骤：步骤1，lb液体培养基制备按照质量比为1：2：200称取酵母提取物、胰蛋白胨和质量分数0.9%氯化钠溶液混合，搅拌至溶解，0.08-0.15 mpa、115-125℃下，高压灭菌10-30 min，灭菌结束后，冷却至室温，备用；步骤2，苏云金芽孢杆菌的培养
在无菌条件下，将苏云金芽孢杆菌接种到装有lb液体培养基的培养皿中，并于30-35℃下培养12-48h，得苏云金芽孢杆菌菌种；步骤3，在无菌条件下将苏云金芽孢杆菌菌种接种至斜面培养基中，在35-38℃，转速120-180rpm下，扩大培养16-30h，得苏云金芽孢杆菌培养液；步骤4，稀释步骤3得到的苏云金芽孢杆菌培养液，调节ph至6-8，继续培养24h，得菌浓度为2
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10
8-3.2
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108cfu/ml的苏云金芽孢杆菌制备液；步骤5，将0.1-0.6mol/l锌盐溶液与等体积的苏云金芽孢杆菌制备液混合，并调节ph至7-8，再在70-80℃水浴中反应10-20min，当反应器皿的底部出现白色沉淀时，即得氧化锌转化物；步骤6，将反应器皿转移至培养箱中32-38℃下孵育12-24h，取出后过滤，收集沉淀，并用去离子水洗涤2-3次，再烘干即得纳米氧化锌复合材料，记为bt-znonps，可收集密封保存备用。
6.作为改进的是，步骤4中稀释所用的溶剂为质量分数为0.9%氯化钠溶液，稀释倍数为3-5倍。
7.作为改进的是，步骤6中烘干的温度为35-45℃，烘干时间为4-6h。
8.基于上述方法制备得到的纳米氧化锌复合材料bt-znonps。
9.上述纳米氧化锌复合材料bt-znonps在农业防虫害或食品抗菌上的应用。
10.作为改进的是，所述应用包括制备抗菌剂或杀虫剂。
11.有益效果：与现有技术相比，本发明一种基于苏云金芽孢杆菌的纳米氧化锌复合材料及其制备方法与应用，具有如下优势：1.本发明与传统方法相比，制备过程中只需要利用bt富集制备，因此，具有操作简单、安全、无有毒试剂残留、成本低且无有毒、有害有机试剂添加等特点；2.本发明纳米氧化锌复合材料bt-znonps，粒径小、颗粒均一、分散性好；3.该材料具有具备cry蛋白和znonps的杀虫、抗菌特性，病虫害防治效果，可以作为杀虫、抗菌剂防治各种病虫害，在农业、食品领域具有潜在的应用。
附图说明
12.图1为本发明实施例1制备纳米氧化锌复合材料bt-znonps的x射线衍射图；图2为本发明实施例1制备纳米氧化锌复合材料bt-znonps的sem扫描图；图3为本发明实施例1制备纳米氧化锌复合材料bt-znonps的sem扫描图；图4为本发明实施例1制备纳米氧化锌复合材料bt-znonps的抗虫结果图。
具体实施方式
13.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
14.实施例1（1）lb液体培养基制备：分别将1g酵母提取物（购自美国sigma公司,cas:8013-01-2）、2g胰蛋白胨加入200ml0.9%氯化钠溶液，搅拌均匀至溶解，高压灭菌锅灭菌，灭菌条件是：0.15mpa、125℃，30min，冷却后至室温；
（2）bt培养：将bt菌株（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc 1.7882）于在无菌条件下，接种到含有（1）培养皿中，进行菌种培养，培养条件是：温度 35℃，24h，得到bt菌种；（3） 将步骤（2）bt菌种在无菌条件下接种至斜面培养基中，在扩大培养，培养箱条件是：温度37℃，150 rpm，24 h，得到bt种液；（4）利用质量分数为0.9%氯化钠溶液将步骤 （3）bt种液稀释4倍后，调节ph为7，继续培养24 h，得到bt培养液；（5）将0.1 m 醋酸锌溶液加入100 ml，用0.9% 氯化钠将步骤（3）bt制备液稀释4倍，并调节ph为7.5，在75℃条件下，加热15 min，当烧瓶底部出现白色沉淀后，得到bt-zno nps中间产物；（6）将步骤（5）烧瓶转移至培养箱中孵育，孵育条件是37℃，24 h，过滤，收集沉淀部分， 并用去离子水洗涤，在40 ℃鼓风干燥箱里干燥4 h干燥得到终产物bt-zno nps。该产品平均粒径为19.1 nm,zeta电位为-16.1 mv,带负电，颗粒分散性好。
15.实施例2（1）lb液体培养基制备：分别将1 g酵母提取物（购自美国sigma公司,cas:8013-01-2）、2 g胰蛋白胨加入200 ml 0.9%氯化钠溶液，搅拌均匀至溶解，高压灭菌锅灭菌，灭菌条件是： 0.15 mpa、125 ℃，30 min，冷却后至室温；（2）bt培养：将bt菌株（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc 1.7882）于在无菌条件下，接种到含有（1）培养皿中，进行菌种培养，培养条件是：温度 35℃，24 h，得到bt菌种；（3） 将步骤（2）bt菌种在无菌条件下接种至斜面培养基中，在扩大培养，培养箱条件是：温度37℃，150 rpm，24 h，得到bt种液；（4）利用质量分数为0.9% 氯化钠溶液将步骤 （3）bt菌液稀释4倍后，调节ph为7，继续培养24 h，得到bt培养液；（5）将0.1 m 醋酸锌溶液加入100 ml，用0.9% 氯化钠将（3）bt制备液稀释4倍，并调节ph为8，在75℃条件下，加热20 min，当烧瓶底部出现白色沉淀后，得到bt-zno nps中间产物；（6）将步骤（5）烧瓶转移至培养箱中孵育，孵育条件是37℃，24 h，过滤，收集沉淀部分， 并用去离子水洗涤，在40 ℃鼓风干燥箱里干燥4 h干燥得到终产物bt-zno nps。该产品平均粒径为25.3 nm,zeta电位为-10.6 mv,带负电，颗粒分散性较好。
16.实施例3（1）lb液体培养基制备：分别将1 g酵母提取物（购自美国sigma公司,cas:8013-01-2）、2 g胰蛋白胨加入200 ml 0.9%氯化钠溶液，搅拌均匀至溶解，高压灭菌锅灭菌，灭菌条件是： 0.15 mpa、125 ℃，30 min，冷却后至室温；（2）bt培养：将bt菌株（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc 1.7882）于在无菌条件下，接种到含有（1）培养皿中，进行菌种培养，培养条件是：温度 35℃，24 h，得到bt菌种；（3） 将步骤（2）bt菌种在无菌条件下接种至斜面培养基中，在扩大培养，培养箱条件是：温度37℃，150 rpm，24 h，得到bt种液；
（4）利用质量分数为0.9% 氯化钠溶液将步骤 （3）bt菌液稀释4倍后，调节ph为7，继续培养24 h，得到bt培养液；（5）将0.1 m 醋酸锌溶液加入100 ml，用0.9% 氯化钠将（3）bt制备液稀释4倍，并调节ph为7，在75℃条件下，加热20 min，当烧瓶底部出现白色沉淀后，得到bt-zno nps中间产物；（6）将步骤（5）烧瓶转移至培养箱中孵育，孵育条件是37℃，24 h，过滤，收集沉淀部分，并用去离子水洗涤，在40 ℃鼓风干燥箱里干燥4 h干燥得到终产物bt-zno nps。该产品平均粒径为24.3 nm,zeta电位为-15.2 mv,带负电，颗粒分散性较好。
17.实施例4（1）lb液体培养基制备：分别将1 g酵母提取物（购自美国sigma公司,cas:8013-01-2）、2 g胰蛋白胨加入200 ml 0.9%氯化钠溶液，搅拌均匀至溶解，高压灭菌锅灭菌，灭菌条件是： 0.15 mpa、125 ℃，30 min，冷却后至室温；（2）bt培养：将bt菌株（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc 1.7882）于在无菌条件下，接种到含有（1）培养皿中，进行菌种培养，培养条件是：温度 35℃，24 h，得到bt菌种；（3） 将步骤（2）bt菌种在无菌条件下接种至斜面培养基中，在扩大培养，培养箱条件是：温度37℃，150 rpm，24 h，得到bt种液；（4）利用质量分数为0.9% 氯化钠溶液将步骤 （3）bt菌液稀释4倍后，调节ph为7，继续培养24 h，得到bt培养液；（5）将0.1 m 醋酸锌溶液加入100 ml，用0.9% 氯化钠将（3）bt制备液稀释4倍，并调节ph为7.5，在70℃条件下，加热20 min，当烧瓶底部出现白色沉淀后，得到bt-zno nps中间产物；（6）将步骤（5）烧瓶转移至培养箱中孵育，孵育条件是37℃，24 h，过滤，收集沉淀部分， 并用去离子水洗涤，在40 ℃鼓风干燥箱里干燥4 h干燥得到终产物bt-zno nps。该产品平均粒径为21.5 nm,zeta电位为-8.8 mv,带负电，分散性较好，但是相对实施例1的产品而言，粒径稍大、分散性相对差一些。
18.为测试本发明抗虫特性，挑选15 头新羽化2 d赤拟谷盗成虫，分别放入混有杀虫剂（由中科行采购的zno nps、实施例1制备的bt-zno nps和浓度为2
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3.2
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10
8 cfu/ml bt发酵液）、面粉为饲料的饲养瓶中，其中，以上杀虫剂占饲料的质量分数为6%。生物学实验重复三次，并设置空白对照组，连续观察直至某一处理组昆虫全部死亡，并记录赤拟谷盗死亡率。试验结果如附图4。
19.如图可见，本发明纳米氧化锌复合材料bt-zno的抗虫效果优于bt与zno nps。当药剂处理35 d后，bt-zno nps处理组赤拟谷盗成虫死亡率为100%，bt、zno nps处理组昆虫死亡率分别为93.82%、89.24%。这表明，本发明的bt-zno nps具备性能稳定，杀虫特性好，安全性较高等特点。若要进一步提高该材料杀虫特性，可以通过调整施药方式与浓度来实现。
20.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。