一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用的制作方法

1.本发明属于乳制品质量检测技术领域，涉及一种引物组合及应用，具体地说是一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。


背景技术：

2.阪崎克罗诺杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身分布着有动力的鞭毛，多数产黄色素，是乳制品中的一种污染菌，能够快速且大量在婴儿配方奶粉及其它乳制品中繁殖。它对早产、出生体重轻及患病婴儿等免疫能力较弱的婴儿具有较大威胁，能引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎，低浓度的阪崎克罗诺杆菌感染即可导致婴幼儿患病。因此，加强对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测力度极其重要。
3.对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测离不开基因扩增。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术是一种新型核酸扩增技术，其原理是针对靶基因的6个区域设计4条或6条引物，利用置换链dna聚合酶在等温条件下保持1h左右，即可完成扩增，可通过观察扩增产物的荧光颜色或浊度变化进行结果判读。实时荧光环介导等温扩增(realamp)是在lamp反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号来实时监控lamp反应的进程，具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。
4.传统的食品中阪崎克罗诺杆菌的检测步骤复杂且周期较长，一般需要5天以上才能得到结果，且结果准确性和特异性都不高，易产生假阳性结果，需要反复验证，而目前没有特异性强且检出极限低的阪崎克罗诺杆菌realamp检测体系。


技术实现要素：

5.本发明的目的，是提供一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用，基于阪崎克罗诺杆菌gyrb基因设计特异性引物组合及realamp反应体系，达到通过应用于realamp技术，实现特异性强、检出限低且能快速检测乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌的目的。
6.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种引物组合，由外引物、内引物和环引物组合而成，所述外引物、内引物和环引物及其序列分别为：
8.外引物f3：5
’‑
ccgttaaagtgcc-3’、
9.外引物b3：5
’‑
gctttacgtgccgc-3’、
10.内引物fip：5
’‑
tgctgctcaaccgccgatttctcctcccagaccaaagaca-3’、
11.内引物bip：5
’‑
gatgaacgagctgctggccgtcgataattttgccga-3’、
12.环引物lf：5
’‑
cacctcggaggagacc-3’和
13.环引物lb：5
’‑
ctgctggagaaccc-3’。
14.本发明还提供了一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。
15.作为一种限定，所述一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法，
是以模板为待测乳制品中的dna、引物为所述的一种引物组合的realamp反应体系进行反应，实时监测荧光强度，反应结果呈阳性则待测样品中含阪崎克罗诺杆菌，反应结果呈阴性则待测样品中不含阪崎克罗诺杆菌。
16.作为进一步限定，所述realamp反应体系，以物质的量份数计，包括0.1-0.4份所述外引物f3、0.1-0.4份所述外引物b3、1.1-1.5份所述内引物fip、1.1-1.5份所述内引物bip、0.5-1.2份所述环引物lf、0.5-1.2份所述环引物lb，还包括0.4
×
10
3-2
×
103份dntps和0.2
×
10
6-0.5
×
106份甜菜碱。
17.所述realamp反应体系还包括灭菌蒸馏水，在realamp反应体系加入灭菌蒸馏水至总体积为25体积份；体系中还包括终浓度为4mmol/l的硫酸镁、0.5-1.5体积份模板、1.3体积份bst dna聚合酶大片段(8u)、2.5体积份10
×
bst dna聚合酶反应缓冲液和0.3体积份1:300的sybrgreenl。
18.作为第二种限定，所述外引物、所述内引物和所述环引物的终浓度比为1:7:3。
19.作为第三种限定，所述反应的温度为50-70℃。
20.由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
21.本发明的引物组合是基于gyrb基因，通过分析阪崎克罗诺杆菌菌种特征，设计所得的特异性引物组合，将所设计引物应用于实时荧光环介导等温扩增(realamp)技术，实现对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测；该引物特异性强、检出限仅4.3
×
101cfu/ml，表明灵敏度极高，该方法能够特异、灵敏且快速检测乳制品中是否阪崎克罗诺杆菌；
22.本发明的检测方法中，通过调整体系中各组分的浓度，尤其优化外引物、内引物和环引物的终浓度比例为1：7：3，显著提高检测结果精确度，相较于荧光定量pcr的1-1.5h扩增程序及realamp的0.5-0.6h反应时间，本发明的方法更高效。
23.综上所述，本发明的引物适用于实时荧光环介导等温扩增(realamp)技术，本发明的方法适于在乳制品工业生产中，检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌。
24.下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
25.图1为实施例3中realamp反应荧光强度结果图；
26.图2为实施例3中realamp反应解离温度验证结果图；
27.图3为实施例3中realamp反应外引物和内引物终浓度比例验证结果图；
28.图4为实施例3中realamp反应外引物和环引物终浓度比例验证结果图；
29.图5为实施例9中realamp反应检测极限结果图。
具体实施方式
30.实施例1一种引物组合
31.(一)引物设计
32.gyrb基因序列为阪崎克罗诺杆菌保守序列，根据gyrb基因序列设计引物，可特异性扩增阪崎克罗诺杆菌，而不会出现对其它菌的非特异性扩增。
33.根据genebank中的阪崎克罗诺杆菌基因序列，进行比对，确定阪崎克罗诺杆菌(该菌购自美国模式培养物保藏所，编号为：atcc29544)在genbank中(基因号为jx983606.1)
gyrb基因序列为保守序列。利用软件v5基于gyrb基因进行在线设计(网址为：http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)，最终设计出外引物、内引物和环引物共3组的6条realamp引物组合：外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip和环引物lf、环引物lb。该引物组合由上海生物技术有限公司合成，具体序列见表1。
34.表1引物组合序列表
[0035][0036]
实施例2一种检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法
[0037]
一)待测样品制备
[0038]
1)10％脱脂奶粉溶液制备。
[0039]
在三角形瓶中加入10g脱脂奶粉加入90g的55℃水，经搅拌，使其溶解均匀，高压蒸汽灭菌于115℃、15min后，将所得的10％脱脂奶粉溶液分装入9ml的无菌试管中备用。
[0040]
2)待测菌培养。
[0041]
取阪崎克罗诺杆菌(该菌购自美国模式培养物保藏所，编号为：atcc29544)，在上述10％脱脂奶粉溶液中按最适条件培养18小时。
[0042]
3)待测样品制备。
[0043]
取上述菌培养后的菌悬液1.5ml，作为待测样品，用于提取dna。
[0044]
二)检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法
[0045]
按照如下的步骤依次进行：
[0046]
s1.提取待测样品的dna作为模板：
[0047]
采用天南普细菌dna试剂盒(tiangen生物技术(北京)有限公司)提取待测样品中的dna。收集dna并重新悬浮在100μl的te(tris edta)缓冲液中；使用纳米滴2000分光光度计量化dna样本，测得的dna浓度为55.9ng/μl，所得dna储存于-20℃分别作为模板，备用。
[0048]
s2.混合制得realamp反应体系：
[0049]
基于实施例1的引物组合，具体反应体系中各组分终浓度为4mmol/l mgso4，1.2mmol/l dntps，0.2μmol/l外引物f3、0.2μmol/l外引物b3，0.6μmol/l环引物lf，0.6μmol/l环引物lb，1.4μmol/l内引物fip，1.4μmol/l内引物bip；另取1.3μlbstdna聚合酶(8u)，2.5μl 10
×
bst dna聚合酶反应缓冲液，0.4mol/l甜菜碱，0.3μl 1:300sybr greenⅰ，采用s1.中的dna 1μl作模板；将上述组成混合，以灭菌蒸馏水补充至总体积为25μl，得realamp反应体系。
[0050]
s3.进行realamp反应，实时监测荧光强度，得反应结果：
[0051]
将realamp反应体系用20μl的矿物油覆盖和绝缘，以防止可能导致假阳性问题的污染。使用applied biosystems quantstudio 3，将反应体系置于62℃下反应，实时监测荧
光放大曲线40min。
[0052]
s4.结果判定：realamp反应在40min内出现扩增曲线，为阳性结果。表明本实施例的方法能够用于检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌。
[0053]
实施例3引物组合物特异性及检测效果的验证
[0054]
i)引物特异性
[0055]
按照实施例2的方法，以8株阪崎克罗诺杆菌atcc29544的近似菌株(如表2所示)和灭菌蒸馏水代替阪崎克罗诺杆菌制备模板，混合制得9组realamp反应体系，体系中其它组分与实施例2相同，其中由灭菌蒸馏水制备模板的realamp反应体系用作空白对照组。
[0056]
表2待测菌株信息表
[0057][0058]
上述菌株均为已公开菌株，可从市场购得或从君乐宝研发管理中心实验室获取。
[0059]
按照实施例2的方法分别进行realamp反应，结果如图1所示，检测结果仅阪崎克罗诺杆菌组的结果为阳性，其他8株近似菌株组和空白对照组均为阴性。实验结果表明，这组实施例1的引物组合物对阪崎克罗诺杆菌具有物种特异性，本发明的引物灵敏度高，结果准确。
[0060]
ii)解离温度验证
[0061]
检测上述模板分别为阪崎克罗诺杆菌、8株非阪崎克罗诺杆菌和空白对照组共10组realamp反应过程中阪崎克罗诺杆菌扩增产物的解离温度。
[0062]
结果如图2所示，仅崎克罗诺杆菌组出现87.0℃的解离温度，其他8株非阪崎克罗诺杆菌和空白对照组均没有解离温度，表明realamp反应中没有非特异性扩增反应，表明本发明的引物组合对阪崎克罗诺杆菌具有物种特异性，本发明的引物组合，能够特异性识别阪崎克罗诺杆菌，未出现非特异性扩增。
[0063]
iii)引物组合终浓度比例验证
[0064]
按照实施例2的方法，混合realamp反应体系，将外引物浓度设为固定值，改变内引物浓度，使外引物和内引物浓度比例分别为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8及1:9，其它组分比例、浓
度和检测方法均与实施例2相同。
[0065]
检测各组realamp反应结果，如图3所示，结果表明，随着外引物和内引物浓度比例的增多，realamp出峰时间呈现先降低后升高的趋势，当比例增加至1:6时，出峰时间最短，而其随着检测时间的延长，扩增曲线未出现平滑的“s”曲线，其荧光强度一直上升，而比例为1:7时，与比例为1:6时的出峰时间基本相同，且出现平滑的“s”曲线，因此，选用1:7的外引物和内引物浓度比例最为最佳比例。
[0066]
按照实施例2的方法，混合realamp反应体系，将外引物浓度设为固定值，改变环引物浓度，使外引物和环引物浓度比例分别为1:2、1:3及1:4，其它组分比例、浓度和检测方法均与实施例2相同。
[0067]
检测各组realamp反应结果，如图4所示，结果表明，外引物和环引物浓度比例为1:3时，扩增曲线出峰时间最短，且出现平滑的“s”曲线，对于乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测效果最好。
[0068]
综上所述，外引物、内引物和环引物在realamp反应体系中的终浓度比为1:7:3时，乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测效果最好。
[0069]
实施例4-8检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法
[0070]
实施例4-8分别为一种检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法，其步骤与实施例2相似，不同之处仅在于s2中用于混合realamp反应体系的原料参数不同，具体见表3，其它部分工艺参数与实施例2相同。
[0071]
表3实施例4-8s2中所混合realamp反应体系参数表
[0072][0073][0074]
其中，其它步骤和参数均与实施例2相同。
[0075]
实施例9检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法检测极限
[0076]
本实施例为实施例2中检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的方法，在10％脱脂奶粉溶
液检测极限的测定，具体测定方法为：
[0077]
将阪崎克罗诺杆菌接种在bhi肉液中，30℃，培养18h。取3ml细菌悬浮液以12000rpm离心2min。弃上清，1ml无菌水重悬，并加入9ml10％无菌脱脂奶粉溶液中。接种的10％脱脂奶粉溶液的细菌浓度从4.3
×
10-1
cfu/ml至4.3
×
107cfu/ml不等。离心收集1ml接种的10％脱脂奶粉溶液中菌体。提取dna，溶解于100μlte缓冲液中。
[0078]
dna在te缓冲液中连续稀释10倍。dna稀释液的浓度范围为0.0559fg/μl到5.59ng/μl。通过测试用阪崎克罗诺杆菌接种的10％脱脂奶粉溶液的连续稀释液，获得本发明检测方法的检测极限。
[0079]
结果如图5所示，检测极限越低则检测精度越高，结果表明，随着细菌浓度的降低，其dna浓度降低，检测的出峰时间随之增长，当10％脱脂奶粉溶液中阪崎克罗诺杆菌为4.3
×
100cfu/ml时，未出现扩增曲线，因此，在10％脱脂奶粉培养溶液中检测阪崎克罗诺杆菌的realamp的检测极限为4.3
×
101cfu/ml。
[0080]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。