抗体介导的切昆贡亚热病毒的中和

抗体介导的切昆贡亚热病毒的中和
1.本技术是申请号为201680034592.6(申请日：2016年4月14，发明名称： 抗体介导的切昆贡亚热病毒的中和)的中国专利申请的分案申请。
2.本技术要求于2015年4月14日提交的美国临时申请系列no.62/147,354的 优先权的权益，其全部内容在此通过引用并入。
[0003][0004][0005]
发明背景
1.技术领域
[0006]
本公开一般涉及医药、传染疾病和免疫学领域。更具体地，本公开涉及 中和切昆贡亚热病毒的抗体。政府对本发明享有特定的权益。
2.

背景技术：

[0007]
切昆贡亚热病毒(chikungunya virus，chikv)是披膜病毒科(togaviridae) 甲病毒属(alphavirus)中的包膜的正义rna病毒，由伊蚊(aedes)蚊子传播。成 熟的chikv病毒体含有两种糖蛋白，e1和e2，它们是由前体多聚蛋白p62-e1 通过蛋白水解切割产生的。e2在病毒附着中起作用，而e1介导膜融合以允许 病毒进入(kielian等,2010)。在人类中，chikv感染引起发热和关节疼痛，这 可能是严重的并且在某些情况下持续多年(schilte等,2013；sissoko等,2009； staples等,2009)。chikv在撒哈拉以南非洲大部分地区以及亚洲、欧洲、印 度洋和太平洋的部分地区引起爆发。2013年12月，在西半球发生了chikv 的第一次传播，在圣马丁(cdc 2013)鉴定了本地病例(autochthonous case)。 该病毒迅速蔓延到加勒比地区的所有岛屿以及中美洲、南美洲和北美洲。在 不到一年的时间里，西半球就有超过一百万的chikv疑似病例被报道，包括 美国在内的40多个国家的流行传播被记录在案(cdc，2014)。目前，没有获 得许可的疫苗或抗病毒治疗来预防或治疗chikv感染。
[0008]
尽管对人类chikv感染的保护性免疫机制尚未完全了解，但体液应答控 制感染并限制组织损伤(chu等,2013；hallengard等,2014；hawman等,2013； kam等,2012b；lum等,2013；pal等,2013)。免疫人γ-球蛋白中和培养细胞 中的感染性，并当在病毒接种后24小时内施用时预防小鼠发病(couderc等, 2009)。已经描述了几种中和chikv感染的鼠单克隆抗体(mab)(brehin等, 2008；goh等,2013；masrinoul等,2014；pal等,2013；pal等,2014)，包括一 些当联合使用以治疗chikv攻击后的小鼠或非人灵长类动物时具有功效的 (pal等,2013；pal等,2014)。相比之下，已经报道了有限数量的人chikv mab， 其中绝大多数显示出适度的中和活性(fong等,2014；fric等,2013；lee等, 2011；selvarajah等,2013；warter等,2011)。


技术实现要素：

[0009]
因此，根据本公开，提供了一种检测受试者中的切昆贡亚热病毒感染的 方法，其
包括(a)使来自所述受试者的样品与具有分别来自表3和4的克隆配 对重链和轻链cdr序列的抗体或抗体片段接触；和(b)通过所述抗体或抗体 片段与所述样品中的e2的结合检测所述样品中的切昆贡亚热病毒糖蛋白e2。 所述样品可以是体液，如血液、痰液、眼泪、唾液、粘液或血清、尿液或粪 便。检测可包括elisa、ria或蛋白质印迹。所述方法可进一步包括第二次 进行步骤(a)和(b)，和确定与第一次测定相比e2水平的变化。所述抗体可以 通过如表1所示的克隆配对可变序列编码，或通过与如表1所示的克隆配对可 变序列具有70％、80％、90％或95％同一性的轻链和重链可变序列编码，或 具有由如表2所示的克隆配对序列表征的轻链和重链可变序列，或与来自表2 的克隆配对序列具有70％、80％、90％或95％同一性。所述抗体片段可以是 重组scfv(单链片段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。所述抗体 可以是igg和/或嵌合抗体。
[0010]
在另一个实施方式中，提供了一种治疗感染有切昆贡亚热病毒的受试 者，或降低处于感染(contracting)切昆贡亚热病毒风险的受试者的感染可能性 的方法，其包括向所述受试者递送抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具 有分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链cdr序列。所述抗体可以通过如表1所示的克隆配对可变序列编码，或通过与如表1所示的克隆配对可变序列具 有70％、80％、90％或95％同一性的轻链和重链可变序列编码，或具有由如 表2所示的克隆配对序列表征的轻链和重链可变序列，或与来自表2的克隆配 对序列具有70％、80％、90％或95％同一性。所述抗体片段可以是重组scfv(单 链片段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。所述抗体可以是igg和/ 或嵌合抗体。所述抗体和抗体片段可以在感染前或感染后施用。递送可包括 抗体或抗体片段施用，或使用编码所述抗体或抗体片段的rna或dna序列或 者载体进行遗传递送。
[0011]
在又一个实施方式中，提供了一种单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体 片段的特征在于分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链cdr序列。所述抗体 可以通过如表1所示的克隆配对可变序列编码，或通过与如表1所示的克隆配 对可变序列具有70％、80％、90％或95％同一性的轻链和重链可变序列编码， 或具有由如表2所示的克隆配对序列表征的轻链和重链可变序列，或与来自 表2的克隆配对序列具有70％、80％、90％或95％同一性。所述抗体片段可以 是重组scfv(单链片段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。所述抗 体可以是嵌合抗体，或靶向除糖蛋白之外的切昆贡亚热病毒抗原的双特异性 抗体。所述抗体可以是igg。所述抗体或抗体片段进一步包含细胞穿透肽和/ 或是内抗体。
[0012]
还提供的是编码抗体或抗体片段的杂交瘤或工程细胞，其中所述抗体或 抗体片段的特征在于分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链cdr序列。所述 抗体可以通过如表1所示的克隆配对可变序列编码，或通过与如表1所示的克 隆配对可变序列具有70％、80％、90％或95％同一性的轻链和重链可变序列 编码，或具有由如表2所示的克隆配对序列表征的轻链和重链可变序列，或 与来自表2的克隆配对序列具有70％、80％、90％或95％同一性。所述抗体片 段可以是重组scfv(单链片段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。 所述抗体可以是嵌合抗体和/或igg。所述抗体或抗体片段可进一步包含细胞 穿透肽和/或是内抗体。
[0013]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链和轻链可变序列对：seq idno:53/54、55/56、57/58、59/60、61/62、63/64、65/66、67/68、70/71、72/73、 74/75、76/77、81/82、83/84、85/86、
87/88、89/90、91/92、93/94、95/96和97/98。
[0014]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:103、104和105的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:187、188和189的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0015]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:106、107和108的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:190、191和192的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0016]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:109、110和111的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:193、194和195的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0017]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:112、113和114的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:196、197和198的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0018]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:115、116和117的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:199、200和201的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0019]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:118、119和120的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:202、203和204的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0020]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:121、122和123的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:205、206和207的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0021]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:124、125和126的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:208、209和210的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0022]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:130、131和132的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:211、212和213的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0023]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:133、134和135的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:214、215和216的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0024]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:136、137和138的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:217、218和219的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0025]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:139、140和141的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:220、221和222的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0026]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:151、152和153的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序
列，以及分别为seq id no:223、224和225的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0027]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:154、155和156的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:226、227和228的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0028]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:157、158和159的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:229、230和231的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0029]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:160、161和162的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:232、233和234的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0030]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:163、164和165的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:235、236和237的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0031]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:166、167和168的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:238、239和240的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0032]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:169、170和171的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:241、242和243的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0033]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:172、173和174的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:244、245和246的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0034]
在一个实施方式中，分离的特异性结合切昆贡亚热病毒糖蛋白e2的单克 隆抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:175、176和177的cdrh1、 cdrh2和cdrh3氨基酸序列，以及分别为seq id no:247、248和249的 cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0035]
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，使用单词“一
”ꢀ
或“一个”可指“一个”，但是还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或不只一 个”的含义一致。术语“约”指确定的数加或减5％。
[0036]
预期的是，本文所述的任何方法或组合物可以相对于本文所述的任何其 他方法或组合物实施。本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述变 得显而易见。然而，应当理解的是，给出详细描述和具体实例虽然表明了本 发明的具体实施方式，但仅作为示例，因为从该详细描述中，在本公开的精 神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员来说变得显而易见。
附图说明
[0037]
以下附图形成本说明书的一部分并被包括以进一步说明本公开的某些 方面。本公开可以通过结合本文给出的具体实施方式的详细描述参考这些附 图中的一个或多个来更好的理解。
[0038]
图1a-c.对mab结合重要的e2残基的结构分析。(图1a)来自用于本研究 的chikv毒
株的e2的序列比对。毒株名称显示在左侧(s27,seq id no:1， 登录号af369024.2；sl15649，登录号gu189061；lr2006_opy1，登录号 dq443544.2；99659，登录号kj451624；rsu1，登录号hm045797.1；ni 64ibh35，登录号hm045786.1)。序列上方的编号对应于成熟e2蛋白质的氨基 酸位置。与毒株s27相同的氨基酸通过短划线表示。从chikv e2/e1异二聚 体(voss等,2010)的结晶结构确定的e2的结构域在序列比对上方的图中描绘 并且是颜色编码的(青色：结构域a，紫色：β-带状连接物，绿色：结构域b， 粉红色：结构域c，灰褐色阴影：晶体结构中不存在的区域)。通过丙氨酸扫 描诱变所确定的丙氨酸取代扰乱mab结合的残基位置通过每种特定抗体的 比对上方的颜色编码点指明。影响多个抗体结合的残基通过有灰色阴影的正 方形表示，随着灰色的阴影越暗，在该残基处受到丙氨酸取代影响的抗体数 量越大。(图1b)映射在成熟包膜糖蛋白复合物(pdb id 3n41)的晶体结构上的 mab结合需要的残基的位置。e1/e2的单个异二聚体的带状迹线的侧视图显 示e1为浅青色且e2的结构域为如小图a中的颜色。抗体结合需要的氨基酸的 侧链显示为空间填充形式并根据小图a中的图例针对20个单个抗体的每一种 进行颜色编码。影响多个抗体结合的残基以灰色阴影描绘，随着阴影越暗， 在该残基处受到丙氨酸取代影响的抗体数量越大(图例显示在左侧)。(图 1c)e1/e2异二聚体的顶视图，其从图1b的结构旋转90
°
。
[0039]
图2a-b.通过人抗chikv mab中和的机制。(图2a)连接前和连接后中 和测定。sl15649 vrp(i)在加入预冷的vero细胞前在4℃与所示mab(包括 chk-152,阳性对照mab)一同培养一小时，接着通过三次洗涤(连接前；实 心圆圈)除去未结合的病毒或(ii)允许在4℃吸附到预冷的vero细胞1小时，接 着在4℃加入所示mab 1小时(连接后；实心圆圈)。(图2b)ffwo测定。将 sl15649 vrp在4℃下吸附到预先冷冻的vero细胞1小时，接着加入所示 mab(包括chk-152,阳性对照鼠mab)1小时。除去未结合的病毒，并且将细 胞在37℃暴露于低ph培养基(ph 5.5；实心圆圈)2分钟以触发质膜处的病毒融 合。作为阴性对照，将细胞在37℃暴露于中性ph培养基(ph 7.4；空心圆圈)2 分钟。针对图2a和图2b二者，将细胞在37℃培养直到感染后18小时，并且 使用荧光显微镜定量gfp阳性细胞。数据由两个独立实验结合，每个一式三 份进行。
[0040]
图3a-d.针对ifnar-/-小鼠中的致死chikv感染的人mab疗法。(图3a)在 chikv(n＝每个测试的mab 3至6只小鼠)的致死攻击前24小时小鼠通过腹 膜内注射施用50μg所示chikv特异性或对照mab。(图3b)在chikv(n＝每 个测试的mab 4至6只小鼠)的致死攻击后24小时小鼠通过腹膜内注射施用50 μg所示chikv特异性或对照mab。(图3c)在chikv(n＝每个测试的mab 7 至10只小鼠)的致死攻击后48小时小鼠通过腹膜内注射施用250μg所示 chikv特异性或对照mab。(图3d)在chikv(除n＝3的4j21+2h1之外，n＝ 每个测试的抗体组合8只小鼠)的致死攻击后60小时小鼠通过腹膜内注射施 用250μg所示chikv特异性mab对或一个对照mab。对于使用4j21或4n12 的单一疗法，给予500μg单次剂量(n＝每个测试的mab 4-5只小鼠)。
[0041]
图4.急性发作时的丘疹性皮疹。受试者向初级护理医师提呈持续三天的 发热(102
°
f)，同时发生肘部和手指的双侧关节疼痛以及皮疹。供应商注意到 横跨背部、胸部和腹部的增加的、非瘙痒性、变白的(blanching)、丘疹性皮 疹(图中所示的照片)。
[0042]
图5.鉴定mab竞争组。使用基于octet的生物膜层表面干涉技术的定量 竞争结合用于将mab分配到竞争组。将覆盖有固定chikv-lr2006 e2外功能 区的抗penta-his生物传
感器顶端浸入含有初级mab的孔，接着浸入含有竞争 mab的孔。显示的数值是在第一mab的存在下竞争mab的百分比结合(通过 比较在第一mab复合物之后应用的竞争mab的最大信号与单独的竞争mab 的最大信号来确定)。如果最大竞争mab结合降低至《其非竞争结合(黑色正方 形)的30％，则判断mab与同一位点的结合充分竞争，或如果竞争mab结合降 低至《其非竞争结合(灰色正方形)的70％，则显示部分竞争。如果最大竞争 mab结合》其非竞争结合(白色正方形)的70％，则mab被认为是非竞争性的。 鉴定四个竞争结合组，通过带颜色的方框表示。通过丙氨酸扫描诱变发现的 mab的相应主要抗原位点(表1和图1a-c)总结在竞争矩阵右侧的列中。da表 示结构域a；db表示结构域b，e表示两个拱1和2；nt表示未经测试的；notreact表示mab针对野生型包膜蛋白不反应；noreduct表示mab不结合野 生型e蛋白，但是对于任何突变体没有注意到可重复的减少。数据从一个实 验结合得到，其中每种mab有多个读数，并且mab与各竞争抗体组合有单一 读数。
[0043]
图6a-d.chikv mab的高分辨率表位映射。(a)构建包含910个e2/e1 突变的chikv包膜蛋白的丙氨酸扫描突变文库，其中每个氨基酸单独突变为 丙氨酸。每个突变阵列板的每个孔含有一个具有确定取代的突变体。显示了 反应性结果的代表性的384孔板。每个平板上包括8个阳性(野生型e2/e1)和8 个阴性(模拟转染的)对照孔。(b)对于表位映射，测试表达chikv包膜突变 文库的人hek-293t细胞与感兴趣的mab(这里显示的mab 4g20)的免疫反 应性，并使用intellicyt高通量流式细胞仪测量。相对于野生型chikv e2/e1 的反应性《30％但对于不同的chikv e2/e1 mab具有》70％的反应性的克隆 最初被鉴定为对mab结合至关重要。(c)四个单独残基的突变减少了4g20 结合(红色条)，但不会大大影响其他构象依赖性mab(灰色条)或兔多克隆抗 体(rpab，来自ibt bioservices的礼物)的结合。条代表至少两个重复数据点的 平均值和范围。(d)prnt50《1,000ng/ml的中和mab的表位被映射到e2/e1 的三聚体晶体结构(pdb entry 2xfc)上。所有中和表位都映射到e2/e1的充分 暴露的膜-远端结构域。为了清楚，每个单独e2/e1异二聚体亚基以不同的颜 色显示。含有多个mab的关键表位残基的e2结构域a和b中的高度免疫原性 区域在e2的单个亚基上以红色标出。
[0044]
图7.对映射到竞争组的抗体的mab结合重要的e2残基的结构分析。映 射到e1/e2晶体结构(pdb id 2xfb)上的来自不同竞争组(图1a-c)的人或小 鼠mab结合所需的残基位置。e1/e2三聚体的空间填充模型，e1为白色，e2 单体各自为浅灰色、深灰色或黑色。将抗体结合所需的残基根据它们所属的 竞争组进行颜色编码。红色表示残基d117和i121，它们是结合5n23所需的， 并且属于竞争组1。蓝色表示残基r80和g253，它们是i06或5m16结合所需的， 属于竞争组2。绿色表示残基q184、s185、i190、v197、r198、y199、g209、 l210、t212和i217，它们是chk-285、chk-88或3a2结合所需的，并且属于 竞争组3。橙色表示残基h18，这是5f19结合所需的，并且属于竞争组4。紫 色表示残基e24、a33、l34、r36、v50、d63、f100、t155，它们是5n23、 chk-84或chk-141结合所需的，并且属于竞争组1和2。青色表示残基t58、d59、d60、r68、i74、d77、t191、n193和k234，它们是1h12结合所需的， 并且属于竞争组2和3。棕色表示残基d71，这是chk-84和1h12结合所需的， 并且属于竞争组1、2和3。黄色表示包含推定的受体结合结构域(rbd)的残基 (t58、d71、n72、i74、p75、a76、d77、s118和r119)，除了残基d71之外， 它们属于竞争组1、2和3。上面的小图显示三聚体的鸟瞰图，中间的小图显 示三聚体的带角度侧视图，其在x轴上从上面的小图中的结构旋转45
°
，而下 面的小图
显示三聚物的侧视图，其在x轴上从中间的小图中的结构旋转45
°
。
[0045]
图8.通过两种人抗chikv mab，2h1或4n12中和的机制。连接前和连 接后中和测定。将chikv毒株sl15649病毒复制子颗粒(vrp)(1)在加入预冷 的vero细胞(2h1或4n12)前与所示mab(2h1或4n12)一起温育，随后通过三次 洗涤除去未结合的病毒(连接前；实心圆圈)或(2)使其吸附到预冷的vero细胞 上，然后加入所示的mab(连接后；空心圆圈)。这些mab在连接之前或之后 添加时被中和。
[0046]
图9.b6小鼠急性疾病模型。在第1天给予产生重组抗体的cho细胞与在 d+3的对照抗体处理相比减少脚踝中的病毒。在皮下接种chikv-lr的10
3 ffu后，在4周龄wt小鼠中进行了实验。在d+1给予抗体，在d+3收获组织 以通过病灶形成测定(focus-forming assay)进行滴定。
[0047]
图10.b6小鼠急性疾病模型。在第3天全身给予cho细胞中产生的chkvmab 4n12，降低脚踝中的病毒滴度。在皮下接种chikv-lr的10e3 ffu后， 在4周龄wt小鼠中进行了实验。在d+3给予抗体，在d+5收获组织以通过病 灶形成测定进行滴定。
[0048]
图11.b6小鼠慢性疾病模型。在第3天全身给予cho细胞中产生的chkvmab，在第28天降低脚踝中的病毒基因组当量。接种chikv-lr的10e3 ffu 后，在4周龄wt小鼠中进行了实验。在d+3给予抗体(300μg)，在d+28收获 组织以通过qrt-pcr分析。
[0049]
图12.ifnar敲除致死疾病小鼠模型。在感染后60小时全身给予cho细 胞中产生的chkv mab，提高存活率。在皮下接种chikv-lr的10e3 ffu后 在4-5周龄ifnar-/-小鼠中进行了实验。感染后60小时给予抗体，持续21天追 踪死亡率。
[0050]
图13.杂交瘤产生的('旧的')或重组('新的')chikv特异性mab的中和曲 线。在bhk21细胞中进行中和曲线。在加入bhk21细胞之前，将chikv-lr 的100ffu与指定的mab在37℃混合1小时。通过病灶形成测定来确定感染。
[0051]
图14.杂交瘤产生的抗体对比重组cho细胞产生的抗体的半数最大有 效抑制浓度(ec 50；ng/ml)。杂交瘤产生的对比重组的数据相似。
[0052]
图15.e1和e2蛋白质按照氨基酸的比对，以及编码蛋白质的基因的核苷 酸的比对。列出病毒株的蛋白质的genbank登录号。提供了来自原型组的病 毒的三个毒株：东非中非南非(ecsa)、两个亚洲和一个西非毒株。这些抗体 在所有毒株之间有交叉反应。
具体实施方式
[0053]
本发明的发明人分离了大型群体的人mab，其在细胞培养中中和chikv 感染性，并且即使当感染后最晚60小时施用时，仍成功治疗了接种有致死剂 量chikv的ifnar-/-小鼠(缺乏i型干扰素受体)。他们鉴定了e2的a结构域作为 由mab识别的主要抗原位点，所述mab以超强活性广泛地中和chikv感染， 并显示出抑制的主要机制是防止融合。以下详细描述本公开的这些和其他方 面。
[0054]
i.切昆贡亚热和切昆贡亚热病毒
[0055]
切昆贡亚热是由切昆贡亚热病毒引起的感染。其特征在于突然开始通常 持续2至7天的发热，和通常持续数周或数月而有时数年的关节疼痛。死亡率 略低于千分之一，年级较大者最有可能死亡。病毒通过伊蚊属的两种蚊子传 至人类：白纹伊蚊(a.albopictus)和埃及伊蚊(a.aegypti)。病毒的动物贮主 (animal reservoir)包括猴、鸟、牛和啮齿动物。
这与仅灵长类动物是宿主的 登革热相反。
[0056]
预防的最佳方法是控制全部蚊子，和避免被任何感染的蚊子叮咬。没有 已知的具体治疗，但是药物可以用于减少症状。休息和输液也可能是有用的。
[0057]
切昆贡亚热病的潜伏期范围是2-12天，通常是3-7天。那些被感染者的 72～97％将产生症状。症状包括突然开始、有时是两阶段的发热(biphasicfever)，其通常持续数天至一周，有时多达10天，通常高于39℃(102
°
f)并 且有时达到41℃(104
°
f)，和强烈的关节疼痛或僵硬，其通常时序数周或数 月而有时持续数年。还可能表现出皮疹(通常是斑丘疹)、肌肉疼痛、头痛、 疲劳、恶心或呕吐。眼睛炎症可能表现为虹膜睫状体炎或葡萄膜炎，并且可 能发生视网膜损伤。通常，发热持续2天然后突然结束。然而，头痛、失眠 和极度虚脱持续时间多变，通常约5-7天。
[0058]
最近流行期间的观察已经表明切昆贡亚热可造成急性感染后的长期症 状。在2006年的留尼旺岛(la reunion)爆发期间，超过50％的年龄超过45岁的 受试者报告了长期肌肉骨骼疼痛，超过60％的人报告最初感染后三年持续的 关节疼痛。法国的输入案例的研究报道了在急性感染后两年59％的人仍忍受 关节疼痛。在意大利的切昆贡亚热的地方流行之后，在急性感染后1年66％ 的人报告了肌肉疼痛、关节疼痛或乏力。长期症状不是全新的观察发现；在 1979年爆发后观察到长期关节炎。长期症状的常见预测因子是年龄增加和以 前的风湿病。这些慢性症状的原因目前尚未完全知道。自身免疫或风湿疾病 的标志物在报告慢性症状的人中尚未发现。然而，一些来自人和动物模型的 证据表明切昆贡亚热可能能够在宿主中建立慢性感染。在最初发病后三个 月，在遭受疾病复发经历的人的肌肉活检中检测到病毒抗原。此外，在最初 感染后18个月，在肌肉骨骼疾病的复发期间的人的滑膜巨噬细胞中发现病毒 抗原和rna。一些动物模型也已经表明切昆贡亚热病毒可建立持续感染。在 小鼠模型中，在接种后至少16周，在关节相关组织中特异性地检测到病毒 rna，并且其与慢性滑膜炎相关。类似地，另一个研究报道了，在接种后数 周，在小鼠的关节组织中检测到病毒报告基因。在非人灵长类动物模型中， 发现切昆贡亚热病毒在脾脏中持续至少6周。
[0059]
切昆贡亚热病毒属于甲病毒属，具有约11.6kb的正义单链rna基因组。 它是西门利克森林病毒(semliki forest viru)复合物的成员，并且与罗斯河病 毒(ross river viru)、奥绒绒病毒(o'nyong'nyong viru)和西门利克森林病毒密 切相关。在美国，它被分为c类优先病原体，并且工作需要生物安全iii级预 防措施。人上皮和内皮细胞、初级成纤维细胞和源于单核细胞的巨噬细胞在 体外允许切昆贡亚热病毒，并且病毒复制是高度细胞病变的，但是易受i型 和ii型干扰素影响。在体内，切昆贡亚热病毒似乎在成纤维细胞、骨骼肌祖 细胞和肌纤维中复制。
[0060]
切昆贡亚热病毒属于甲病毒属，也是引起东方马脑炎和西方马脑炎的病 毒。切昆贡亚热通常通过来自埃及伊蚊蚊子的叮咬传播，但是巴黎巴斯德研 究所进行的最新研究已经表明，在2005-2006年留尼旺岛爆发中的切昆贡亚 热病毒毒株引起了通过亚洲虎蚊(白纹伊蚊)促进传播的突变。
[0061]
白纹伊蚊的切昆贡亚热病毒感染由一种病毒包膜基因(e1)中的点突变引 起。白纹伊蚊传播切昆贡亚热病毒增加可能意味着在其他亚洲虎蚊出现的地 区爆发的风险增加。最近意大利的流行可能由白纹伊蚊继续(perpetuate)。在 非洲，切昆贡亚热是由一种
在人类暴发之间病毒大量存在于其他灵长类动物 中的森林循环(sylvatic cycle)传播的。
[0062]
当被切昆贡亚热感染时，宿主的成纤维细胞产生1型(α和β)干扰素。当暴 露于102切昆贡亚热pfu时，缺乏干扰素α受体的小鼠在2-3天死亡，而即使 当暴露于多达病毒的106pfu时，野生型小鼠仍存活。与此同时，部分1型缺 乏(ifnα/β+/-)的小鼠受到轻微的影响并表现如肌无力和嗜睡的症状。 partidos等(2011)用减毒活毒株chikv181/25看到了类似的结果。然而，1型 干扰素缺乏(ifnα/β-/-)小鼠暂时丧失能力，而不是死亡，并且部分1型干扰 素缺乏小鼠没有任何问题。
[0063]
一些研究已经尝试寻找参与宿主对切昆贡亚热感染的应答的1型干扰素 途径的上游组分。至今，没有人知晓切昆贡亚热特异性病原体相关分子模式。 虽然如此，已经发现ips-1，也称为cardif、mavs和visa，为重要因子。在 2011年，white等人发现ips-1的干扰降低了干扰素调控因子3(irf3)磷酸化和 ifn-β的产生。其他研究发现了irf3和irf7以年龄依赖的方式具有重要性。 缺乏这些调控因子的成年小鼠在感染切昆贡亚热时死亡。另一方面，新生儿 如果他们缺乏这些因子这一则死于该病毒。
[0064]
切昆贡亚热通过产生ns2，一种降解rbp1并关闭宿主细胞转录dna的 能力的非结构蛋白来对抗i型干扰素反应。ns2干扰jak-stat信号传导通路， 并阻止stat变为磷酸化的。
[0065]
切昆贡亚热的一般实验室测试包括rt-pcr、病毒分离和血清学测试。 病毒分离提供最明确的诊断，但是花费1-2周完成，并且必须在生物安全iii 级实验室中进行。技术涉及将特定的细胞系暴露于来自全血的样品，和鉴定 切昆贡亚热病毒特异性反应。使用嵌套引物对(nested primer pair)的rt-pcr 用来扩增来自全血的几个切昆贡亚热特异性基因。结果可以在1-2天内确定。
[0066]
血清学诊断与其他方法相比需要大量血液，并且使用elisa测定来测量 切昆贡亚热特异性igm水平。结果需要2-3天，并且经由其他相关病毒，如奥 绒绒病毒和西门利克森林病毒感染，可能发生假阳性。
[0067]
差示诊断可包括其他蚊子携带病毒的感染，如登革热，和流感。感染一 年后，慢性复发性多关节痛发生在至少20％的切昆贡亚热患者中，而这种症 状在登革热中不常见。
[0068]
目前，没有具体治疗可用。尝试缓解症状包括使用nsaid，如萘普生 (naproxen)或扑热息痛(paracetamol)(对乙酰氨基酚)和输液。不推荐阿司匹林 (aspirin)。在具有超过两周关节炎的人中，利巴韦林(ribavirin)可能是有用的。 氯喹(chloroquine)的效果不清楚。它似乎对急性疾病没有帮助，但是实验证 据表明它可能帮助那些具有慢性关节炎的人。胰岛素也没有表现出有用。
[0069]
切昆贡亚热大部分存在于发展中国家。切昆贡亚热的流行病学与蚊子、 其环境和人类行为有关。大约5000年前蚊子对北非气候改变的适应使得它们 寻找出人类储存水的环境。然后人类居住地和蚊子的环境非常密切的联系。 在流行期间，人类是病毒的贮主。其他时间，猴、鸟和其他脊椎动物用作贮 主。
[0070]
已经描述了病毒的三种基因型：西非、东非/中非/南非和亚洲基因型。 2005年印度洋和2011年太平洋岛屿以及现在美国的爆炸性流行继续改变基 因型的分布。
[0071]
2009年5月28日在病毒流行的泰国董里府(changwat trang)，省医院决定 通过从
他被切昆贡亚热感染的母亲，khwanruethai sutmueang，28岁，trang 本地人，剖腹产男婴分娩来阻止母胎病毒传播。然而，在分娩婴儿后，医师 发现婴儿已经感染了病毒，并且将他置于重症监护中，因为感染使婴儿不能 自己呼吸或喝奶。医师推测病毒可能能从母亲传播到她的胎儿中，但是没有 实验室证实。
[0072]
2013年12月，在圣马丁加勒比岛证实切昆贡亚热有66例确诊病例和约 181例疑似病例。这次爆发是西半球的第一次，疾病从感染的蚊子群体传播 至人。到2014年1月，加拿大的公共卫生机构报道了在英属维尔京群岛、圣 巴泰勒米、瓜德罗普岛、多米尼加、马提尼克岛和法属圭亚那确诊的病例。 2014年4月，在多米尼加共和国通过疾病控制和预防中心(cdc)也证实了切昆 贡亚热。到四月末，其已经传播到全部的14个国家，其包括牙买加、圣卢西 亚、圣基茨岛和尼维斯岛和宣布流行的海地。
[0073]
截至2014年5月末，在美国报道了从病毒流行地区到佛罗里达旅行的人 的10多个输入的病毒案例。从加勒比海传播到美国的切昆贡亚热毒株最容易 通过埃及伊蚊传播。存在这种切昆贡亚热毒株可突变使得白纹伊蚊载体更有 效的担忧。如果这种突变发生，则切昆贡亚热对美国对来说会变得更是一个 公共健康问题，因为白纹伊蚊或亚洲虎纹在美国更广泛的传播，并且比埃及 伊蚊更有侵略性。
[0074]
2014年6月，在巴西证实了病毒的6例案例，2例在圣保罗州的坎皮纳斯 市。6例是最近从海地返回的巴西军队士兵，在海地他们作为联合国海地稳 定特派团的成员参与重建工作。信息由认为已经做出适当行动的坎皮纳斯市 正式发布。
[0075]
2014年6月16日，佛罗里达已经累计总共42例案例。截至2014年9月11日， 当年在波多黎各报道的案例数量是1,636。截至10月28日，该数量已经增加到 2,974例确诊病例，10,000例疑似病例。2014年6月17日，美国密西西比州的 卫生部官员证实，他们正在调查最近前往海地的密西西比州居民的首例潜在 病例。2014年6月19日，该病毒已经传播到美国佐治亚州。2014年6月24日， 美国佛罗里达州波尔克县poinciana市报道了一例病例。2014年6月25日，美 国阿肯色州卫生部门证实，来自该州的人正携带切昆贡亚热。2014年6月26 日，墨西哥哈利斯科州报道了一例病例。
[0076]
2014年7月17日，疾病控制和预防中心在佛罗里达报道了美国第一例获 得性切昆贡亚热的病例。自2006年以来，美国已经报道了200多例案例，但 仅报道了前往过其他国家的人。这是第一次病毒通过蚊子传播给美国大陆的 人。2014年9月2日，疾病控制和预防中心报道了，在美国在当地得了这种疾 病的人中已有7例切昆贡亚热确诊病例。
[0077]
2014年9月25日，萨尔瓦多官方当局报道了3万多例新疫情确诊病例。牙 买加和巴巴多斯的新疫情也呈上升趋势。具有这些国家的游客有可能将病毒 带到他们自己的国家的风险。2014年11月：巴西报道了不同切昆贡亚热毒株 (基因型)的本地传播，这在美洲从未有记载。这是一种非洲的基因型，但是 如果是南非的或西非的，则奇怪地是没有解释。新基因型(在美洲)比目前传 播遍及整个美洲的亚洲基因型更严重，对一种基因型的免疫性不赋予其他基 因型的免疫性。法属波利尼西亚等地正在经历持续的暴发。
[0078]
2014年11月7日，墨西哥报道了南部恰帕斯州爆发通过本地传播获得的 切昆贡亚热。爆发横跨海岸线从危地马拉边界延伸到邻近的瓦哈卡州。卫生 当局已经报道了39个实验室确诊病例的累计负荷(截止到第48周结束)。没有 报道疑似病例。2015年1月，哥伦比亚共报道了90,481例切昆贡亚热病例。
[0079]
ii.单克隆抗体及其生成
[0080]
a.一般方法
[0081]
将理解的是结合切昆贡亚热病毒的单克隆抗体将具有几种应用。这些包 括用于检测和诊断切昆贡亚热病毒感染的诊断试剂盒的制备，以及用于治疗 切昆贡亚热病毒感染的试剂盒的制备。在这些情况下，可以将这些抗体与诊 断剂或治疗剂联系起来，在竞争性测定中用它们作为捕获剂或竞争剂，或单 独使用它们而无需附加其他试剂。如下进一步描述的，抗体可以是突变的或 经修饰的。制备和表征抗体的方法是本领域中众所周知的(见,例如, antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,1988；美国专 利4,196,265)。
[0082]
产生单克隆抗体(mab)的方法通常沿着与制备多克隆抗体相同的线路开 始。这两种方法的第一步都是免疫适当的宿主，或鉴定由于事先的天然感染 而有免疫力的受试者。如本领域众所周知的，用于免疫的给定组合物的免疫 原性可能不同。因此经常有必要通过肽或多肽免疫原与载体偶联来实现加强 宿主免疫系统。示例性和优选的载体是钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)(klh)和牛血清白蛋白(bsa)。其他白蛋白，如卵清白蛋白、小 鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于将多肽与载体蛋白缀合 的方法是本领域中众所周知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺和双偶氮化联苯胺。同样在本领域中众所周知 的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的免疫反应的非特 异性刺激物来增强。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结 核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis)的免疫反应的非特异性刺激物)、不 完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
[0083]
用于制备多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于 免疫的动物变化。各种途径可以用来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉 内和腹膜内)。多克隆抗体的制备可以通过在免疫后的各个点取样免疫动物 的血液来监测。还可以给予第二、加强注射。重复加强和效价测定的过程直 到达到适合效价。当获得所需免疫原性的水平时，免疫动物可以被放血，并 且可以使用分离并储存的血清和/或动物产生mab。
[0084]
免疫后，选择具有制备抗体的潜力的体细胞，具体而言b淋巴细胞(b细 胞)用于mab产生方案。这些细胞可以从作活检的脾脏或淋巴结，或从循环 血液中获得。然后，来自免疫动物的抗体生成b淋巴细胞与永生的骨髓瘤细 胞融合，所述永生的骨髓瘤细胞通常属于与被免疫的动物或人或者人/小鼠嵌 合细胞相同的物种之一。适用于产生杂交瘤的融合过程的骨髓瘤细胞系优选 是非抗体产生型，具有高融合效率和酶缺陷，然后这使得不能够在某些仅支 持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基中生长。如本领域技术人员已知 的(goding,pp.65-66,1986；campbell,pp.75-83,1984)，可以使用多种骨髓瘤 细胞中的任何一种。
[0085]
用于形成抗体生成脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂种的方法通 常包括在促进细胞膜融合的一种试剂或多种试剂(化学的或电的)的存在下， 将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，尽管比例可以分别从约20:1变为约 1:1。使用仙台病毒(sendai viru)的融合法由kohler和milstein(1975；1976)描 述，并且使用聚乙二醇(peg)，如37％(v/v)peg的那些方法由gefter等(1977) 描述。电学上诱导融合的方法的使用也是适合的(goding,pp.71-74,1986)。 融合过程通常在低频产生可存活的杂种，约1x10-6
至1x10-8
。然
而，这不能 造成问题，因为可存活的融合杂种通过在选择培养基中培养从亲代输注细胞 (特别是，一般会无限期继续分裂的输注的骨髓瘤细胞)分化。选择培养基通 常是在组织培养基内含有阻止核苷酸从新合成的试剂的一种。示例性和优选 的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻止嘌呤 和嘧啶两者的从新合成，而重氮丝氨酸仅阻止嘌呤合成。使用氨基蝶呤和甲 氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸腺嘧啶作为核苷酸来源(hat培养基)。 使用重氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果b细胞来源是转化了人类 疱疹病毒第四型(epstein barr viru)(ebv)的人b细胞系，则加入哇巴因 (ouabain)，以便排除不与骨髓瘤融合的转化了ebv的系。
[0086]
优选的选择培养基是hat或带有哇巴因的hat。只有能够实施核苷酸回 收利用途径的细胞能够在hat培养中存活。骨髓瘤细胞缺乏回收利用途径的 关键酶，例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)，并且它们不能存活。b 细胞可以实施该途径，但是它们在培养中寿命有限，并且通常在约2周内死 亡。因此，只有能够在选择培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和b细胞形成的 那些杂种。当用于融合的b细胞的来源是ebv转化的b细胞系时，如这里的 情况，哇巴因还可以用于杂种的药物选择，因为ebv转化的b细胞对药物杀 伤敏感，而选择使用的骨髓瘤伙伴(partner)是哇巴因抗性的。
[0087]
培养提供了选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。典型地，杂交瘤的选择如下 进行，在微量滴定板中通过单个克隆稀释来培养细胞，然后针对所需的反应 性测试单个克隆上清液(大约两周到三周后)。该测定应该是敏感的、简单和 快速的，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、斑点测定法、 斑点免疫结合测定法等。然后将选择的杂交瘤系列稀释或通过流式细胞分选 单细胞分选，并克隆入单个抗体生成细胞系，然后将克隆无限制地增殖以提 供mab。细胞系可以以两种基本方式应用于mab生成。可以将杂交瘤样品(通 常进入腹腔)注入动物(例如小鼠)中。可选地，在注射之前用碳氢化合物，特 别是如降植烷(pristane)(四甲基十五烷)的油使动物准备好(aminials areprimed)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫受损的小鼠如scid小鼠 以防止肿瘤排斥是最佳的。注射的动物出现分泌由融合细胞杂种产生的特异 性单克隆抗体的肿瘤。然后可以汲取动物的体液，如血清或腹水，以提供高 浓度的mab。也可以在体外培养单个细胞系，其中mab天然分泌到培养基中， 从培养基中可以容易地以高浓度获得它们。或者，人杂交瘤细胞系可以在体 外用于在细胞上清液中生成免疫球蛋白。细胞系可以适应在无血清培养基中 生长以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
[0088]
如果需要，通过任一方法产生的mab可以使用过滤、离心和各种层析方 法如fplc或亲和层析进一步纯化。本公开的单克隆抗体的片段可以通过包 括用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原断裂二硫键的方法 从纯化的单克隆抗体获得。或者，可以使用自动肽合成仪合成由本公开涵盖 的单克隆抗体片段。
[0089]
也考虑到可以使用分子克隆方法来生成单克隆。为此，可从杂交瘤细胞 系中分离rna，并通过rt-pcr获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表 达载体中。或者，从分离自细胞系的rna制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库， 并通过使用病毒抗原进行淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。与传统的杂交 瘤技术相比，这种方法的优点是可以在单轮中生产和筛选约104倍的抗体， 并且通过h和l链组合产生新的特异性，这进一步增加了找到合适的抗体的 机会。
[0090]
教导可用于本公开的抗体生成的其它美国专利(每篇引入本文作为参考) 包括描述使用组合方法生成嵌合抗体的美国专利5,565,332；描述重组免疫球 蛋白制剂的美国专利4,816,567；和描述抗体-治疗剂缀合物的美国专利4,867,973。
[0091]
b.本公开的抗体
[0092]
首先，根据本公开的抗体可以通过它们的结合特异性定义，在这种情况 下其针对切昆贡亚热病毒糖蛋白(gp)。本领域中的技术人员，通过使用本领 域技术人员众所周知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，可确定这种 抗体是否落入本权利要求范围内。一方面，提供了具有分别来自表3和4所示 的重量和轻链的克隆配对cdr的单克隆抗体。所述抗体可以使用本文所述的 方法通过以下实施例部分所述的克隆生成。
[0093]
第二方面，抗体可以通过它们的可变序列定义，所述可变序列包括附加 的“框架”区。这些在表1和2中提供，其编码或表示整个可变区。此外，抗体 序列可以不同于这些序列，可选地使用下面更详细讨论的方法。例如，核酸 序列可以不同于上述的那些，其中(a)可变区可以与轻链和重链的恒定区分 离，(b)核酸可以不同于上述的那些，而不影响由此编码的残基，(c)由于给定 的百分比例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同源性，核酸可以不同于上述的那些，(d)由于在高 度严格条件下杂交的能力，如低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃的 温度由约0.02m至约0.15m nacl提供的条件，核酸可以不同于上述的那些， (e)由于给定的百分比例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同源性，氨基酸序列可以不同于上述的那些，或者(f) 由于允许保守取代(以下讨论的)，氨基酸序列可以不同于上述的那些。前述 各项均适用于表1所示的核酸序列和表2的氨基酸序列。
[0094]
c.抗体序列的工程化
[0095]
在不同的实施方式中，出于各种原因，例如改善的表达、改善的交叉反 应性或减少的脱靶结合，可以选择工程化鉴定的抗体的序列。以下是抗体工 程相关技术的一般性讨论。
[0096]
可以培养杂交瘤，然后裂解细胞，提取总rna。随机六聚体可与rt一 起使用以产生rna的cdna拷贝，然后使用期望扩增所有人可变基因序列的 pcr引物的多重混合物进行pcr。可以将pcr产物克隆到pgem-t easy载体 中，然后使用标准载体引物通过自动化dna测序进行测序。结合和中和的测 定可以使用从杂交瘤上清液收集的抗体进行，并使用g蛋白柱通过fplc纯 化。
[0097]
通过将来自克隆载体的重链和轻链fv dna亚克隆到igg质粒载体中，转 染293freestyle细胞或cho细胞，并从293或cho细胞上清液中收集纯化的抗 体，从而产生重组全长igg抗体。
[0098]
在与最终cgmp制造过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体 的快速可用性有可能减少过程开发程序的持续时间。lonza开发了一种通用 的方法，使用在cdacf培养基中生长的汇集的转染子，用于在cho细胞中 快速生产少量(高达50g)的抗体。虽然比真正的瞬时系统稍慢，但其优点包括 较高的产品浓度和使用与生产细胞系相同的宿主和过程。表达模型抗体的 gs-cho汇集物在一次性生物反应器中的生长和生产力的实例：在以分批进 料模式操作的一次性袋生物反应器培养物(5l工作体积)中，2g/l的收获抗体 浓度在转染后9周内实现。
[0099]
抗体分子将包含例如通过mab的蛋白水解裂解产生的片段(例如f(ab’)、 f(ab’)2)，或者例如可通过重组手段产生的单链免疫球蛋白。这样的抗体衍生 物是单价的。在一个实施方式中，这些片段可以彼此组合，或与其他抗体片 段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。重要的是，这样的嵌合分子可含 有能够结合相同分子的不同表位的取代基。
[0100]
在相关实施方式中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如包含与公开抗体 (例如嵌合或cdr移植抗体)相同的cdr序列的抗体。或者，可能希望进行修 饰，例如将保守变化引入抗体分子。在做这样的改变时，可以考虑氨基酸的 亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能上的重要 性在本领域中通常能够被理解(kyte and doolittle,1982)。可以接受的是，氨 基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其继而定义蛋白质与其 它分子(例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等)的相互作用。
[0101]
在本领域中还理解的是，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取 代。通过引用并入本文的美国专利4,554,101指出，由其相邻氨基酸的亲水性 决定的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专 利4,554,101所详述的，以下亲水性值已被分配给氨基酸残基：碱性氨基酸： 精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0
±
1)， 谷氨酸(+3.0
±
1)，天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸： 丝氨酸(+0.3)，天冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸： 半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)，亮 氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，脯氨酸(-0.5
±
1)，丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水 性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)，苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
[0102]
可以理解的是，氨基酸可被具有相似亲水性的另一氨基酸取代，并产生 生物学或免疫学修饰的蛋白质。在这样的变化中，优选亲水性值在
±
2内的氨 基酸的取代，特别优选
±
1以内的氨基酸，更特别优选
±
0.5以内的氨基酸。
[0103]
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如 其疏水性，亲水性，电荷，大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本 领域技术人员众所周知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸； 丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0104]
本公开还考虑了同种型修饰。通过修饰fc区以具有不同的同种型，可以 实现不同的功能。例如，改变为igg1可以增加抗体依赖性细胞毒性，转换至 a类可以改善组织分布，并且转换至m类可以改善化合价。
[0105]
修饰的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括通过 标准分子生物学技术进行表达，或者化学合成多肽。重组表达的方法在本文 中的其他地方提到。
[0106]
d.单链抗体
[0107]
单链可变片段(scfv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合物，其 与短的(通常是丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起。尽管移除了恒定区并且引 入了接头肽，但是该嵌合分子仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰 通常使特异性不变。历史上产生这些分子以促进噬菌体展示，其中将抗原结 合结构域表达为单肽非常方便。或者，可以从源自杂交瘤的亚克隆重链和轻 链直接产生scfv。单链可变片段缺少在完整抗体分子中发现的恒定fc区，并 且因此缺少用于纯化抗体的共同结合位点(例如蛋白a/g)。由于蛋白l与κ
轻 链可变区相互作用，这些片段通常可以使用蛋白l纯化/固定。
[0108]
柔性接头一般由螺旋和翻转促进氨基酸残基如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸 组成。但是，其他残基也可以起作用。tang等(1996)使用噬菌体展示作为 从蛋白质接头文库快速选择单链抗体(scfv)的定制接头的手段。构建随机接 头文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组成的18-氨基酸 多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scfv库(约5
×
106个不同成员)，并用 半抗原进行亲和选择。所选变体的群体表现出显著的结合活性增加，但保持 相当大的序列多样性。随后筛选1054个变体产生以可溶形式有效产生的催化 活性scfv。序列分析显示在v
h c末端之后两个残基在接头中有保守脯氨酸和 作为选定系绳(tether)的唯一共同特征的其他位置处的丰富精氨酸和脯氨酸。
[0109]
本公开的重组抗体还可以涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或基序。 这样的序列包括源自iga的序列，其允许与j链形成多聚体。另一个多聚化结 构域是gal4二聚化结构域。在其他实施方式中，可以用允许两种抗体组合的 试剂例如生物素/抗生物素蛋白对链进行修饰。
[0110]
在一个单独的实施方式中，可以通过使用非肽接头或化学单元连接受体 轻链和重链来产生单链抗体。通常，轻链和重链将在不同的细胞中产生，纯 化，并随后以适当的方式连接在一起(即，重链的n端通过合适的化学桥附接 到轻链的c末端)。
[0111]
使用交联试剂来形成将两种不同分子的官能团连接的分子桥，例如稳定 剂和凝结剂。然而，预期可以产生由不同类似物组成的相同类似物或异聚复 合物的二聚体或多聚体。为了以逐步的方式连接两种不同的化合物，可以使 用消除不希望的均聚物形成的异双功能交联剂。
[0112]
示例性的异双官能交联剂含有两个反应性基团：一个与伯胺基(例如n羟 基琥珀酰亚胺)反应，另一个与巯基(例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤 素等)反应。通过伯胺反应性基团，交联剂可以与一种蛋白质的赖氨酸残基(例 如，选择的抗体或片段)反应，并且通过硫醇反应性基团，已经绑到第一种 蛋白质上的交联剂与另一种蛋白质(例如选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基) 反应。
[0113]
优选采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。众多类型的含二硫键的接 头是已知的，其可成功用于缀合靶向剂和治疗剂/预防剂。含有受到空间位阻 的二硫键的接头可以证明在体内具有更高的稳定性，防止靶向肽在到达作用 位点之前释放。因此这些接头是一组连接剂。
[0114]
另一种交联剂是smpt，其是含有二硫键的双官能交联剂，其被相邻的 苯环和甲基“空间位阻”。认为二硫键的空间位阻起到保护键免受可能存在于 组织和血液中的硫醇盐阴离子如谷胱甘肽的攻击的作用，从而有助于防止缀 合物在递送粘合剂到目标位点之前解偶联。
[0115]
与许多其它已知的交联剂一样，smpt交联剂将其能力赋予交联官能团 例如半胱氨酸或伯胺的sh(例如赖氨酸的ε氨基)。另一种可能类型的交联剂 包括含有可裂解二硫键的杂双功能光反应性苯基叠氮化物，例如磺基琥珀酰 亚胺基-2-(对-叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。n-羟基-琥珀酰亚 胺基与伯氨基反应，而叠氮苯基(光解时)与任何氨基酸残基非选择性地反应。
[0116]
除受阻交联剂之外，还可以据此使用非受阻接头。其他有用的交联剂， 不认为含
有或产生受保护的二硫化物，包括sata、spdp和2-亚氨基硫醇 (wawrzynczak&thorpe，1987)。这些交联剂的使用在本领域中是很好理解的。 另一个实施方式涉及使用柔性接头。
[0117]
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的 缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记物等形成抗体缀合物 的双功能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在各种温和条件下 可裂解的不稳定键的可裂解缀合物。该接头特别有用，因为感兴趣的试剂可 以直接与接头键合，切割导致活性剂的释放。特定用途包括向蛋白质如抗体 或药物中加入游离氨基或游离巯基。
[0118]
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白例如单链 抗体的肽接头。接头长达约50个氨基酸，包含出现至少一次的带电荷的氨基 酸(优选精氨酸或赖氨酸)，接着是脯氨酸，并且其特征在于更高的稳定性和 减少的聚集。美国专利5,880,270公开了用于各种免疫诊断和分离技术的含有 氨氧基的接头。
[0119]
e.内抗体
[0120]
在具体的实施方式中，抗体是适合在细胞内作用的重组抗体-这种抗 体被称为“内抗体”。这些抗体可能通过多种机制，例如通过改变细胞内的蛋 白质运输，干扰酶的功能以及阻断蛋白质-蛋白质或蛋白质-dna的相互作用 来干扰靶功能。在许多方面，它们的结构模拟或平行上面讨论的单链和单结 构域抗体的结构。事实上，单一转录物/单链是允许在靶细胞中进行细胞内表 达的重要特征，并且也使蛋白质穿过细胞膜更加可行。但是，需要额外的特 征。
[0121]
影响内抗体治疗实施的两个主要问题是递送(包括细胞/组织靶向)和稳 定性。关于递送，已经采用多种方法，例如组织定向递送，使用细胞类型特 异性启动子，基于病毒的递送和使用细胞渗透性/膜易位肽。关于稳定性，该 方法通常是通过强力筛选，其包括涉及噬菌体展示的方法，并且可以包括序 列成熟或共有序列的开发，或者更有针对性的修饰，例如插入稳定化序列(例 如，fc区、伴侣蛋白质序列、亮氨酸拉链)和二硫键置换/修饰。
[0122]
内抗体可能需要的另一个特征是用于细胞内靶向的信号。已经设计了可 以将内抗体(或其他蛋白质)靶向亚细胞区如胞质、细胞核、线粒体和er的载 体并且可商购(invitrogen corp.；persic等,1997)。
[0123]
由于其进入细胞的能力，内抗体具有其他类型的抗体可能不能实现的额 外用途。在本发明抗体的情况下，与活细胞中muc1胞质结构域相互作用的 能力可能干扰与muc1 cd相关的功能，诸如信号传导功能(与其他分子的结 合)或寡聚物形成。具体而言，预期这样的抗体可以用于抑制muc1二聚体形 成。
[0124]
f.纯化
[0125]
在某些实施方式中，可以纯化本公开的抗体。如本文所使用的术语“纯 化的”意欲指可与其它组分分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得 的状态被纯化到任意程度。纯化的蛋白质因此也指不受其天然存在的环境影 响的蛋白质。当使用术语“基本纯化的”时，该名称将指其中蛋白质或肽形成 组合物的主要组分的组合物，例如构成组合物中约50％、约60％、约70％、 约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
[0126]
蛋白质纯化技术为本领域技术人员所众所周知的。这些技术在一个水平 上涉及细胞环境粗分离为多肽和非多肽部分。将多肽与其他蛋白质分离后， 可以使用色谱和电泳技术进一步纯化感兴趣的多肽以实现部分或完全纯化 (或纯化至均质)。特别适用于制备
纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻 色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。其他用于蛋白质纯化的方法包括 用硫酸铵、peg、抗体等沉淀或通过热变性，然后离心；凝胶过滤，反相， 羟基磷灰石和亲和层析；以及这些和其他技术的组合。
[0127]
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽， 并使用变性条件提取蛋白质。可以使用亲和柱从其他细胞组分中纯化多肽， 所述亲和柱与多肽的标记部分结合。如本领域通常已知的，认为进行各种纯 化步骤的顺序可以改变，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生制备基本上 纯化的蛋白质或肽的合适方法。
[0128]
通常，使用结合抗体的fc部分的试剂(即蛋白a)分级完整的抗体。或者， 抗原可用于同时纯化和选择适当的抗体。这种方法通常利用与支持物，如柱、 过滤器或珠子结合的选择剂。将抗体与载体结合，除去污染物(例如洗掉)， 并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
[0129]
根据本公开，定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法将是本领域技术人 员已知的。这些包括例如确定活性部分的比活性或通过sds/page分析评估 级分内的多肽的量。评估级分纯度的另一种方法是计算级分的比活性，将其 与初始提取物的比活性进行比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的 实际单位将取决于选择遵循纯化的特定测定技术，以及所表达的蛋白质或肽 是否表现出可检测的活性。
[0130]
已知多肽的迁移有时可能显着地随sds/page的不同条件而变化 (capaldi等,1977)。因此将会理解的是，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯 化的表达产物的表观分子量可以变化。
[0131]
iii.主动/被动免疫和治疗/预防切昆贡亚热感染
[0132]
a.制剂和施用
[0133]
本公开提供了包含抗切昆贡亚热病毒抗体和用于产生抗切昆贡亚热病 毒的抗原的药物组合物。这样的组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片 段或肽免疫原，和药学上可接受的载体。在一个具体的实施方式中，术语“药 学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他 公认的药典中列出的用于动物，更具体地用于人类的。术语“载体”是指治疗 剂与之一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液 体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆 油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内施用时，水是特定的载体。盐 水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶 液。其它合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、 大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱 脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。
[0134]
如果需要，组合物也可以含有少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些 组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂 等形式。口服制剂可以包括标准载体，如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、 硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药剂的例子在“remington's pharmaceutical sciences”中有描述。这种组合物将含有预防或治疗有效量的 抗体或其片段，优选以纯化形式，连同适量的载体，以提供给患者适当的施 用。该制剂应适合于口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸 入或通过机械通气递送的施用方式。
[0135]
还设想了活性疫苗，其中如公开的那些抗体是在切昆贡亚热病毒感染风 险的受
试者体内产生的。e1和e2的序列列于所附序列表中的seq id no： 253-276。这样的疫苗可以配制用于肠胃外施用，例如配制用于通过皮内、 静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。预期通过皮内和肌内途径施用。 或者，疫苗可以通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通 过喷雾器施用。药学上可接受的盐，包括酸式盐以及与无机酸如盐酸或磷酸 或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐 也可以源自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，以及有机碱如异丙 胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
[0136]
称为人工获得被动免疫的抗体被动转移一般将涉及使用静脉内或肌内 注射。抗体形式可以是人或动物血浆或血清，作为用于静脉内(ivig)或肌内 (ig)使用的汇集的人免疫球蛋白，作为从免疫或从疾病中恢复的供体的高效 价人ivig或ig，以及作为单克隆抗体(mab)。这种免疫通常只持续很短的时 间，并且也有超敏反应和血清病(特别是来自非人源的γ球蛋白)的潜在风险。 但是，被动免疫提供了即时保护。抗体将被配制在适于注射的，即无菌的和 可注射的载体中。
[0137]
通常，本发明组合物的成分以单位剂量形式单独提供或混合在一起提 供，例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物在密封容器如指示活性剂的量的 安瓿或小囊。在通过输注施用组合物的情况下，可以使用含有无菌药物级水 或盐水的输液瓶来分配组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供 用于注射的无菌水或盐水的安瓿，使得可以在施用之前将成分混合。
[0138]
本公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴 离子如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与 如源自钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇，组 氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
[0139]
iv.抗体缀合物
[0140]
本公开的抗体可以与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了增加抗 体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规连接或共价结合或复合至少一个所 需分子或部分。这样的分子或部分可以是但不限于，至少一个效应分子或报 道分子。效应分子包含具有所需活性(例如细胞毒活性)的分子。已经与抗体 连接的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核 素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相反， 报道分子被定义为可以使用测定来检测的任何部分。已经与抗体缀合过的报 告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、 化学发光分子、发色团、光亲和性分子、有色粒子或配体如生物素。
[0141]
通常优选抗体缀合物用作诊断剂。抗体诊断通常落入两类，即用于体外 诊断的那些，例如各种免疫测定法，以及用于体内诊断方案的那些，通常称 为“抗体定向成像”。本领域已知许多合适的显像剂，它们与抗体连接的方法 也是已知的(参见例如美国专利5,021,236,4,938,948和4,472,509)。所使用的成 像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、nmr可检测物质和x 射线成像剂。
[0142]
在顺磁性离子的情况下，可以举出例如铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、 钴(ii)、镍(ii)、铜(ii)、钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝 (iii)、钬(iii)和/或铒(iii)，钆是特别优选的。在其他情况，如x射线成像下有 用的离子包括但不限于镧(iii)、金(iii)、铅(ii)，尤其是铋(iii)。
[0143]
在放射性同位素用于治疗和/或诊断应用的情况下，可以提到砹
211
、14 碳、
51
铬、
36
氯、
57
钴、
58
钴、铜
67
、
152
eu、镓
67
、3氢、碘
123
、碘
125
、碘
131
、铟 111
、
59
铁、
32
磷、铼
186
、铼
188
、
75
硒、
35
硫、锝
99m
和/或钇
90
。
125
i经常被优选用 于某些实施方式中，并且由于其低能量和长距离检测的适合性，常常优选锝 99m
和/或铟
111
。本公开的放射性标记单克隆抗体可以根据本领域公知的方法 来生产。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂如次 氯酸钠或酶促氧化剂如乳过氧化物酶接触来碘化。根据本公开的单克隆抗体 可以通过配体交换过程用锝
99m
标记，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将 还原锝螯合到葡聚糖凝胶柱上并将抗体施加到该柱。或者，可以使用直接标 记技术，例如通过温育高锝酸盐，还原剂如sncl2，缓冲溶液如邻苯二甲酸 钠钾溶液和抗体。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合 的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)。
[0144]
预期用作缀合物的荧光标记物包括alexa 350、alexa 430、amca、 bodipy 630/650、bodipy 650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、 bodipy-tmr、bodipy-trx、级联蓝、cy3、cy5、6-fam、异硫氰酸荧 光素、hex、6-joe、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、 reg、罗丹明绿、罗丹明红、renographin、rox、tamra、tet、四甲基 罗丹明和/或得克萨斯红。
[0145]
在本公开中预期的另一种类型的抗体缀合物是那些计划主要用于体外 使用的抗体偶联物，其中抗体与第二结合配体连接和/或连接到在与色原底物 接触时产生有色产物的酶(酶标签)。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、 (辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和抗生物 素蛋白和链霉亲和素化合物。这种标记的使用是本领域技术人员众所周知 的，并在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、 4,275,149和4,366,241中进行了描述。
[0146]
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括抗体与基于半抗 原的亲和标记的反应。基本上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的 氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有 利的，因为其导致抗体缀合物的抗原结合损失。
[0147]
含有叠氮基团的分子也可以用来通过由低强度紫外线产生的反应性氮 烯化合物中间体与蛋白质形成共价键(potter and haley,1983)。具体而言，嘌 呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已被用作定点光探针以鉴定粗细胞提取物中 的核苷酸结合蛋白(owens&haley,1987；atherton等,1985)。2-和8-叠氮基核 苷酸也被用于绘制纯化蛋白质的核苷酸结合结构域(khatoon等,1989；king 等,1989；dholakia等,1989)，并可用作抗体结合剂。
[0148]
本领域已知几种抗体与其缀合物部分连接或缀合的方法。一些连接方法 涉及使用金属螯合络合物，例如，有机螯合剂如二亚乙基三胺五乙酸酐 (dtpa)；亚乙基三胺四乙酸；n-氯-对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯
ꢀ‑
3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体也可以在 偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。在这些偶联剂的存在下或通过 与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标记物的缀合物。在美国专利4,938,948 中，使用单克隆抗体实现了乳腺肿瘤的成像，并且使用接头例如甲基对羟基 苯亚氨酸酯或n-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯将可检测的成像部分与 抗体结合。
[0149]
在其他实施方式中，预期通过使用不改变抗体组合位点的反应条件在免 疫球蛋
白的fc区中选择性引入巯基来衍生化免疫球蛋白。公开了根据该方法 制备的抗体缀合物以显示改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066， 通过引用并入本文)。文献(o’shannessy等,1987)中也公开了效应分子或报道 分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与fc区中的碳水化合物残 基缀合。据报道，这种方法产生了目前正在进行临床评估的诊断上和治疗上 有希望的抗体。
[0150]
v.免疫检测法
[0151]
在更进一步的实施方式中，本公开涉及用于结合、纯化、去除、量化和 以其他方式一般性检测切昆贡亚热病毒及其相关抗原的免疫检测方法。虽然 这样的方法可以以传统意义应用，但是另一个用途是质量控制和监测疫苗和 其他病毒库(virus stock)，其中可以使用根据本公开的抗体来评估病毒中的h1 抗原的数量或完整性(即长期稳定性)。或者，所述方法可用于筛选各种抗体 以获得合适的/所需的反应性概况。
[0152]
一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法 (ria)、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、化学发光测定法、生物发光测 定法和蛋白质印迹等。具体而言，还提供了针对样品中特定寄生虫表位的切 昆贡亚热病毒抗体的检测和定量的竞争性测定法。在科学文献中已经描述了 各种有用的免疫检测方法的步骤，例如doolittle and ben-zeev(1999)、gulbisand galand(1993)、de jager等(1993)和nakamura等(1987)。通常，免疫结 合方法包括获得怀疑含有切昆贡亚热病毒的样品，并根据情况在有效允许形 成免疫复合物的条件下可以使样品与根据本公开的第一抗体接触。
[0153]
这些方法包括从样品中纯化切昆贡亚热病毒或相关抗原的方法。优选将 抗体连接到固体支持物上，例如以柱基质的形式，并将怀疑含有切昆贡亚热 病毒或抗原性组分的样品应用于固定的抗体。不需要的组分将从柱中洗脱， 使切昆贡亚热病毒抗原免疫复合到固定的抗体上，然后通过从柱中除去生物 体或抗原来收集。
[0154]
免疫结合方法还包括检测和定量样品中切昆贡亚热病毒或相关成分的 量以及检测和定量结合过程中形成的任何免疫复合物的方法。这里，可以获 得怀疑含有切昆贡亚热病毒或其抗原的样品，并将样品与结合切昆贡亚热病 毒或其组分的抗体接触，随后检测和定量在特定条件下形成的免疫复合物的 量。就抗原检测而言，分析的生物样品可以是怀疑含有切昆贡亚热病毒或切 昆贡亚热病毒抗原的任何样品，如组织切片或样本、均质的组织提取物、包 括血液和血清的生物液体，或分泌物，如粪便或尿液。
[0155]
将所选生物样品与抗体在有效条件下接触足够的时间以允许形成免疫 复合物(初级免疫复合物)通常是简单地将抗体组合物添加至样品并将混合物 温育一段足够长的时间以与存在的切昆贡亚热病毒或抗原形成免疫复合物， 即与之结合。此后，通常会洗涤样品-抗体组合物，例如组织切片，elisa 板，斑点印迹或蛋白质印迹，以去除任何非特异性结合的抗体种类，仅允许 特异性结合于初级免疫复合物内的那些抗体被检测。
[0156]
通常，免疫复合物形成的检测在本领域中是公知的，并且可以通过应用 多种方法来实现。这些方法通常基于检测标记或标志物，例如那些放射性， 荧光，生物和酶标记中的任何一种。涉及使用这种标记的专利包括美国专利 3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。 当然，如本领域已知的，通过使用次级结合配体如第二抗体和/或生物素/抗 生物素蛋白配体结合排列，可以发现其他优点。
[0157]
检测中使用的抗体本身可以与可检测的标记连接，然后会简单地检测该 标记，由
此可以确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，可以通过对抗体 具有结合亲和力的第二结合配体来检测在初级疫复合物内结合的第一抗体。 在这些情况下，第二结合配体可以连接至可检测的标记。第二结合配体本身 通常是抗体，因此可以将其称为“第二”抗体。在有效的条件下，使初级免疫 复合物与标记的第二结合配体或抗体接触一段足以允许形成第二免疫复合 物的时间。然后通常洗涤次级免疫复合物以除去任何非特异性结合的标记的 二级抗体或配体，然后检测次级免疫复合物中剩余的标记。
[0158]
其他方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，使用第二结 合配体，例如对抗体具有结合亲和力的抗体以形成第二免疫复合物。洗涤后， 再次在有效条件下，使第二免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三 结合配体或抗体接触一段足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时 间。将第三配体或抗体连接至可检测的标记，从而允许检测由此形成的三级 免疫复合物。如果需要，该系统可以提供信号放大。
[0159]
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。使用第一种生物素化抗体检测 靶抗原，然后使用第二种抗体检测与复合生物素相连的生物素。在该方法中， 首先将待测样品在含有第一步抗体的溶液中温育。如果靶抗原存在，则一些 抗体与抗原结合形成生物素化抗体/抗原复合物。然后通过在连续的链霉亲和 素(或抗生物素蛋白)、生物素化dna和/或互补生物素化dna的溶液中温育， 每一步都向抗体/抗原复合物添加额外的生物素位点，以扩增抗体/抗原复合 物。重复扩增步骤直到达到合适的扩增水平，此时将样品在含有抗生物素的 第二步抗体的溶液中温育。将第二步抗体例如使用酶来标记，所述酶可以用 于通过使用色原底物的组织酶学来检测抗体/抗原复合物的存在。通过适当的 扩增，可以产生肉眼可见的缀合物。
[0160]
另一种已知的免疫检测方法利用了免疫pcr(聚合酶链式反应)方法。 pcr方法类似于cantor方法直到与生物素化dna一起温育，然而，代替使用 多轮链霉亲和素和生物素化dna温育，用低ph或高盐的释放抗体的缓冲液 洗脱dna/生物素/链霉亲和素/抗体复合物。然后将所得洗涤溶液用于用合适 的对照用合适的引物进行pcr反应。至少在理论上，pcr的巨大扩增能力和 特异性可用于检测单个抗原分子。
[0161]
a.elisa
[0162]
免疫分析最简单直接的意义是结合分析。某些优选的免疫测定是本领域 已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定(ria)。使用组 织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，将容易理解的是，检测 不限于这些技术，还可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、facs分析等。
[0163]
在一个示例性elisa中，将本公开的抗体固定在显示蛋白质亲和力的选 定表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将怀疑含有切昆贡亚热病 毒或切昆贡亚热病毒抗原的测试组合物添加到孔中。结合并洗涤以除去非特 异性结合的免疫复合物后，可以检测结合的抗原。可以通过加入与可检测标 记物连接的另一种抗切昆贡亚热病毒抗体来实现检测。这种类型的elisa是 简单的“夹心elisa”。检测也可以通过加入第二种抗切昆贡亚热病毒抗体， 然后加入对第二种抗体具有结合亲和性的第三种抗体来实现，其中第三种抗 体被链接到一个可检测的标记。
[0164]
在另一个示例性的elisa中，将怀疑含有切昆贡亚热病毒或切昆贡亚热 病毒抗原的样品固定在孔表面上，然后与本公开的抗切昆贡亚热病毒抗体接 触。结合并洗涤以去除
非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗切昆贡 亚热病毒抗体。当最初的抗切昆贡亚热病毒抗体与可检测标记连接时，可以 直接检测免疫复合物。此外，可以使用对第一种抗切昆贡亚热病毒抗体具有 结合亲和力的第二种抗体检测免疫复合物，其中第二种抗体被连接到可检测 的标记。
[0165]
无论使用何种形式，elisa都具有某些共同的特征，例如包被、温育和 结合、洗涤除去非特异性结合的物质，以及检测结合的免疫复合物。这些在 下面进行描述。
[0166]
在用抗原或抗体包被平板时，通常将平板的孔用抗原或抗体的溶液温育 过夜或特定的数小时的时间。然后将板的孔洗涤以除去不完全吸附的物质。 然后将任何剩余可用的孔表面用非特异性蛋白质“包被”，所述非特异性蛋白 质相对于测试抗血清抗原上是中性的。这些包括牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋 白或奶粉的溶液。该涂层允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，从而降 低由抗血清在表面上的非特异性结合引起的背景。
[0167]
在elisa中，可能更习惯于使用二级或三级检测手段而不是直接程序。 因此，在蛋白质或抗体与孔结合之后，用非反应性物质涂布以降低背景，并 洗涤以除去未结合的物质，使固定表面在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形 成的条件下与要测试的生物样品接触。然后检测免疫复合物需要标记的第二 结合配体或抗体，第二结合配体或抗体与标记的三级抗体或第三结合配体结 合。
[0168]“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”指条件优选地包括 使用诸如bsa、牛γ-球蛋白(bgg)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)/tween的溶液稀释 抗原和/或抗体。这些添加剂也倾向于帮助减少非特异性背景。
[0169]“合适的”条件也意味着温育处于足以允许有效结合的温度或一段时间。 温育步骤典型地从约1到2到4小时左右，优选在25℃到27℃的温度，或者可 以在约4℃左右过夜。
[0170]
在elisa中的所有温育步骤之后，洗涤接触的表面以除去未络合的物 质。优选的洗涤程序包括用诸如pbs/tween的溶液或硼酸盐缓冲液洗涤。在 测试样品和最初结合的物质之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤后，可确 定甚至微量免疫复合物的出现。
[0171]
为了提供检测手段，第二或第三抗体将具有相关标记以允许检测。优选 地，这将是与适当的显色底物温育时会产生显色的酶。因此，例如，希望将 第一和第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀 合的抗体接触或温育一段时间，并且在有利于进一步形成免疫复合物的条件 下(例如，在含有pbs的溶液如pbs-tween中在室温下温育2小时)。
[0172]
在与标记的抗体温育之后，并且在洗涤除去未结合的物质后，例如通过 与显色底物例如尿素或溴甲酚紫或2,2'-连氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺 酸(abts)或h2o2(在过氧化物酶作为酶标记的情况下)温育来定量标记的量。 然后通过测量产生的颜色的程度来实现量化，例如使用可见光谱分光光度 计。
[0173]
在另一个实施方式中，本公开考虑使用竞争性形式。这在检测样品中的 切昆贡亚热病毒抗体方面特别有用。在基于竞争的分析中，通过取代已知量 的标记抗体或分析物的能力来确定分析物或抗体的未知量。因此，信号的可 定量损失是样品中未知抗体或分析物的量的指示。
[0174]
在此，发明人提出使用标记的切昆贡亚热病毒单克隆抗体来确定样品中 切昆贡亚热病毒抗体的量。基本形式包括将已知量的切昆贡亚热病毒单克隆 抗体(与可检测标记
物连接)与切昆贡亚热病毒抗原或颗粒接触。切昆贡亚热 病毒抗原或生物体优选附着于载体上。在标记的单克隆抗体与载体结合之 后，加入样品并在允许样品中的任何未标记的抗体与标记的单克隆抗体竞争 并因此置换的条件下温育。通过测量丢失的标签或剩余的标签(并从原始量 的结合标签中减去)，可以确定有多少未标记的抗体与载体结合，因此样品 中存在多少抗体。
[0175]
b.蛋白质印迹
[0176]
蛋白质印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于检测组织匀浆或提取物的给 定样品中的特定蛋白质的分析技术。它使用凝胶电泳通过多肽的长度(变性 条件)或通过蛋白质的3-d结构(天然/非变性条件)分离天然或变性的蛋白质。 然后将蛋白质转移至膜(通常是硝酸纤维素或pvdf)，其中使用对靶蛋白质特 异性的抗体对其进行探查(检测)。
[0177]
样品可以从整个组织或细胞培养物中提取。在大多数情况下，固体组织 首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)，使用匀浆器(较小体积)或通过超声 处理机械地分解。细胞也可以通过上述机械方法之一打开。然而，应该注意 的是，细菌、病毒或环境样品可以是蛋白质的来源，因此蛋白质印迹不仅限 于细胞研究。可以使用各种洗涤剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解和溶解蛋白 质。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。通常在 低温下进行组织制备以避免蛋白质变性。
[0178]
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。蛋白质的分离可以通过等电点(pi)、 分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的性质取决于样品的处理和凝 胶的性质。这是一个非常有用的测定蛋白质的方法。也可以使用二维(2-d) 凝胶，其将来自单个样品的蛋白质以二维方式分散。根据第一维中的等电点 (其具有中性净电荷的ph)和根据它们在第二维中的分子量分离蛋白质。
[0179]
为了使蛋白质能够被抗体检测所接受，将它们从凝胶内移到由硝酸纤维 素或聚偏二氟乙烯(pvdf)制成的膜上。将膜置于凝胶的顶部，并在其上放置 一叠滤纸。将整叠放在缓冲溶液中，通过毛细管作用缓冲溶液带着蛋白质和 它一起沿纸张向上移动。另一种转移蛋白质的方法称为电印迹 (electroblotting)，并使用电流将蛋白质从凝胶中拉到pvdf或硝酸纤维素膜 上。蛋白质从凝胶内移动到膜上，同时保持它们在凝胶内的组织。作为这种 印迹过程的结果，蛋白质暴露在薄的表面层上用于检测(参见下文)。因为它 们的非特异性蛋白质结合性质(即，同样好地结合所有蛋白质)而选择了这两 种膜。蛋白质结合基于疏水性相互作用，以及膜和蛋白质之间的带电相互作 用。硝酸纤维素膜比pvdf便宜，但远比其脆弱，不能很好地重复探查。蛋 白质从凝胶转移到膜上的均匀性和整体有效性可以通过用考马斯亮蓝或者 ponceau s染料对膜进行染色来检查。一旦转移，使用标记的初级抗体或未标 记的初级抗体检测蛋白质，然后使用标记的蛋白质a或与初级抗体的fc区域 结合的二级标记的抗体进行间接检测。
[0180]
c.免疫组织化学
[0181]
本公开的抗体还可以与用于通过免疫组织化学(ihc)研究的新鲜冷冻和/ 或福尔马林固定的石蜡包埋的组织块结合使用。由这些颗粒标本制备组织块 的方法已被成功地用于以前各种预后因素的ihc研究中，并且是本领域技术 人员众所周知的(brown等,1990；abbondanzo等,1990；allred等,1990)。
[0182]
简而言之，可以通过在室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(pbs) 中将50ng
冷冻“粉碎”的组织重新水合来制备冷冻切片；通过离心造粒；将其 重悬于粘稠的包埋介质(oct)中；反转胶囊和/或通过离心重新造粒；在70℃ 的异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或移除冷冻的组织圆柱；将组织圆柱固定 在低温恒温器切片机夹盘上；和/或从胶囊切割25-50个连续切片。或者，整 个冷冻组织样品可以用于连续切片。
[0183]
可以通过类似方法来制备永久切片，所述方法涉及在塑料微量离心管中 使50mg样品再水合；造粒；在10％福尔马林中重悬4小时固定；洗涤/沉淀； 重悬在温热的2.5％琼脂中；造粒；在冰水中冷却以硬化琼脂；从管中取出组 织/琼脂块；将块浸润和/或包埋在石蜡中；和/或切割多达50个连续的永久切 片。再次，整个组织样品可以被替换。
[0184]
d.免疫检测试剂盒
[0185]
在更进一步的实施方式中，本公开涉及与上述免疫检测方法一起使用的 免疫检测试剂盒。由于所述抗体可用于检测切昆贡亚热病毒或切昆贡亚热病 毒抗原，因此所述抗体可包含在试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒将在合适 的容器装置中包含结合切昆贡亚热病毒或切昆贡亚热病毒抗原的第一抗体， 以及可选的免疫检测试剂。
[0186]
在某些实施方式中，切昆贡亚热病毒抗体可以预先结合到固体支持物， 例如柱基质和/或微量滴定板的孔中。试剂盒的免疫检测试剂可以采取多种形 式中的任何一种，包括那些与给定抗体相关或相连的可检测标记。也考虑了 与第二结合配体相关或连接的可检测标记。示例性的第二配体是那些对第一 抗体具有结合亲和力的第二抗体。
[0187]
用于本发明的试剂盒中的其它合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其 包含对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体，以及对第二抗体具有结合亲和 力的第三抗体，第三抗体与一个可检测的标签连接。如上所述，许多示例性 标签是本领域中已知的，并且可以在本公开中使用所有这样的标签。
[0188]
所述试剂盒可以进一步包含适当等分的切昆贡亚热病毒或切昆贡亚热 病毒抗原的组合物，无论是标记的还是未标记的，都可以用于制备用于检测 测定的标准曲线。所述试剂盒可以含有完全缀合形式、中间体形式或作为由 试剂盒使用者缀合的单独部分的抗体-标记物缀合物。试剂盒的组分可以以 水性介质或冻干形式包装。
[0189]
试剂盒的容器装置一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射 器或其他容器装置，其中可以放置抗体，或者优选合适地等分。本公开的试 剂盒通常还将包括用于将抗体、抗原和任何其他试剂容器密闭封闭以用于商 业销售的手段。这样的容器可以包括注入或吹塑的塑料容器，其中保留所需 的小瓶。
[0190]
vi.实施例
[0191]
包括以下实施例来说明优选实施方式。本领域技术人员应该理解的是， 以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在实施方案实践中发挥良好作 用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开本领域 的技术人员应理解的是，可以在公开的具体实施方式中做出许多变化，并且 仍然获得类似或相似结果，而不偏离本公开的精神和范围。
[0192]
实施例1：材料和方法
[0193]
分离人mab。从在斯里兰卡记录到症状性chkv感染之后的～5年的人获 得pbmc。b细胞在cpg存在下在具有ebv的384孔板中转化。使用活chikv 疫苗株181/25病毒作为抗原，通过elisa筛查来自所得b细胞成淋巴细胞系的 上清液中人chkv特异性结合抗体的存在。
收集转化的b细胞并融合到骨髓 瘤细胞系中，分配到培养板中并扩增，并通过在含有哇巴因的次黄嘌呤-氨 基蝶呤-胸苷培养基中生长来选择。通过单细胞分选克隆杂交瘤。收集来自 在无血清培养基中生长的克隆杂交瘤的上清液，通过蛋白g层析从澄清培养 基中纯化和浓缩。
[0194]
中和测定。使用chkv病毒复制子颗粒(vrp)或表示不同遗传和地理概 况的4种活切昆贡亚热病毒中的每种，测试纯化的igg mab蛋白的中和活性。 编码gfp的chikv vrp通过基于含有chikv毒株sl15649(genbank： gu189061.1)基因组序列的全长cdna的质粒开发三质粒chikv复制子辅助 系统使用基于pcr的克隆的方法产生。将vrp与mab在稀释液中温育，然后 接种到vero 81细胞单层18小时；用荧光成像系统鉴定感染的细胞和总细胞 (用核标记物鉴定)。为了确定mab的宽度和中和效价，本发明人使用了四种 代表性活病毒株，每种chikv基因型至少有一个代表，包括来自三种基因型 每种的一种原型病毒以及来自当前加勒比海地区爆发的毒株。在病灶减少中 和试验中测定中和活性。将纯化的人mab的连续稀释液与chikv的100个病 灶形成单位在37℃下温育1小时。将mab病毒复合物加入到96孔板中的vero 细胞中，然后在细胞固定后使用免疫过氧化物酶检测来检测噬菌斑，并使用 immunospot 5.0.37宏观分析仪(cellular technologies ltd)对其进行定量。在与 没有抗体的情况下接种chikv的孔比较后，使用非线性回归分析计算ec
50
值。
[0195]
e2 elisa。在大肠杆菌中产生重组chikv e2胞外域蛋白(对应于 chikv-lr2006毒株)并吸附到微量滴定板上。应用人mab，然后用生物素缀 合的山羊抗人igg检测结合的chkv特异性mab。
[0196]
竞争结合测定。本发明人鉴定了结合至相同主要抗原位点的抗体组，通 过使抗体对竞争结合至含有连接至一个octet红色生物传感器(fortebio)中的 抗五-his生物传感器尖端(fortebio#18-5077)的多聚组氨酸标签的 chikv-lr2006e2胞外域蛋白质。
[0197]
用于表位绘图的丙氨酸扫描诱变。将具有c末端v5标签的chikv包膜蛋 白表达构建体(毒株s27，uniprot reference#q8jux5)进行丙氨酸扫描诱变以 产生综合突变文库。设计引物以使包膜蛋白的e2、6k和e1区域内的每个残 基(结构多聚蛋白中的残基y326至h1248)突变为丙氨酸；丙氨酸密码子突变 为丝氨酸。总共产生了910个chikv包膜蛋白突变体。使用免疫荧光结合测 定，使用用高通量流式细胞仪检测的细胞荧光测试mab与每个构建体的结合 损失。
[0198]
中和机制。在附着于vero 81细胞之前或之后，将mab与vrp相互作用， 然后对细胞进行染色、成像和分析(如对于vrp中和测定法所述)，以确定在 哪个阶段mab发挥抗病毒作用。如在补充实验程序中详述的进行来自内部的 融合和不进行测定的融合。
[0199]
小鼠体内保护研究。在无病原体动物设施中繁殖ifnar-/-小鼠，并在 a-bsl3设备中进行感染实验。在麻醉下进行足垫注射。对于预防性研究， 在足垫中以10ffu的chikv-lr皮下接种前1天，将人mab通过腹膜内注射给 予6周龄ifnar-/-小鼠。对于治疗性研究，在以特定剂量施用单剂量的个体或人 mab的组合之前24、48或60小时递送10ffu的chikv-lr。
[0200]
人类受试者和外周血细胞分离。在其他方面都健康的成年受试者于2006 年10月呈现chikv感染。chikv感染的症状恰逢从对斯里兰卡进行为期一 年的访问返回之时，在这段时间内患者在城市(主要是科伦坡)和农村地区(包 括雨林和沿海地区)度过了一段时间。患者在访问过程中经历了多次昆虫叮 咬，但在整个逗留期间保持健康。在返回美国时，
向主要护理医师呈现持续 3天的发烧(102
°
f)。患者报告同时发生的肘部和手指双侧关节疼痛，背部和 腹部有增加的非瘙痒性皮疹，伴有整体的“身体疼痛”和头痛。在介绍时，他 表现得很好，并没有受到急性的痛苦。有延及背部、胸部和腹部的温和的、 发白的丘疹(见图4)。注意到轻微的结膜炎。骨骼检查对于没有红斑或积液的 肿胀的手指、膝盖和肘部是显着的。受影响的关节的肌肉力量和运动范围完 好无损，但关节活动引起疼痛。
[0201]
抽取血液进行cbc，血清学和疟疾涂片，患者出院。白细胞计数为4.0x 104个细胞/mm3，血细胞比容为41％，血小板计数为180,000/mm3。总淋巴细 胞计数为1.0x 104个细胞/mm3。疟疾涂片和血清学是阴性的，并且患者被初 步诊断为病因不明的病毒性疾病。
[0202]
患者两周后回到诊所，无热，但伴有持续性关节痛，手指最突出。患者 描述了疼痛和僵硬并不比上次访视时更好，甚至更糟糕。该患者报告了切昆 贡亚热爆发发生在之前旅行的地区。抽取血液并分离血清，送到cdc进行 pcr和血清学检测，证实切昆贡亚热感染的诊断。
[0203]
2012年4月，在指数感染(index infection)5年半后，在ficoll上通过密度梯 度分离法分离了外周血单核细胞(pbmc)，在居住在美国期间，在间隔期间 没有已知的chikv或其他关节炎病毒α病毒的暴露。将细胞冷藏并在液氮中 储存直至研究。招募和从受试者收集血液样品的方案由北卡罗来纳大学教堂 山分校和范德比尔特大学医学中心的机构审查委员会批准。
[0204]
人杂交瘤的生成。如所述(smith等,2012)，将低温保存的pbmc样品在 37℃快速解冻，并在用epstein-barr病毒转化之前洗涤。将培养物在37℃，使 用5％co2温育10天，并使用vrp中和测定和elisa筛选上清液中分泌chikv 特异性抗体的细胞的存在。本发明人使用相同血液样品的单独的等分试样进 行两次独立的转化。
[0205]
在第一次转化中，本发明的发明人建立了每个培养物含有平均42个转化 的b细胞集落的3840个培养物(10
×
384孔板)，估计总共约161,000个单独的b 细胞集落。为了在bsl2条件下筛选显示针对chikv的中和活性的抗体，本 发明的发明人使用表达绿色荧光蛋白作为报道分子的chikv复制子颗粒 (vrp)开发了高通量荧光还原中和测定法。vrp是展示天然病毒糖蛋白但缺 乏全长病毒基因组并因此不能产生感染性后代的病毒体(vander veen等, 2012)。本发明的发明人使用了2006年从斯里兰卡分离的毒株sl15649 (morrison等,2011)的vrp。sl15649与感染供体的毒株同时存在，并且可能 在序列上非常相似。从该实验中，本发明的发明人用以90％抑制作用介导中 和的上清液鉴定了160个b细胞培养物，表明了占总b细胞的0.099％病毒特异 性b细胞的频率(约1,000个中的1个)。总共60个这样的细胞系以》98％的水平 抑制，并且在二级筛选中，来自60个系中的58个的上清液含有在elisa中结 合到在免疫测定板上捕获的细胞培养生成的chikv(毒株181/25)的抗体。本 发明的发明人选择了58个系中的35个具有最高中和和结合活性的用于杂交 瘤融合，在融合和铺板后鉴定了22株具有病毒结合上清液的杂交瘤，并成功 分离出14个克隆用于进一步研究。在第二次转化中，本发明的发明人建立了 每培养物含有平均38个转化的b细胞集落的1,536个培养物(4
×
384孔板)，估计 总共大约58,000个测试的单个b细胞集落，这表明病毒特异性b细胞的频率为 0.1％(再次，约1,000个中的1个)。在这个实验中，他们使用了elisa结合 chikv毒株181/25的初步筛选，没有事先的中和试验。本发明的发明人鉴定 了60个系，其中elisa光密度信号大于背景水平的4倍，选择了elisa中具有 最高光密度信号
的30个b细胞系进行融合，在融合和铺板后鉴定了18个具有 病毒结合上清液的杂交瘤，并成功分离出16个克隆用于进一步研究。
[0206]
与骨髓瘤细胞融合。如所述(smith等,2012)，将具有能够中和chikv感 染性的上清液的孔的细胞与hmma2.5非分泌性骨髓瘤细胞融合。产生的杂 交瘤通过在含有哇巴因的次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hat)培养基中生长、使用 facsaria iii细胞分选仪(bd biosciences)通过单细胞facs进行生物学克隆 并进行扩增来选择。
[0207]
人mab的产生和纯化。含有产生chikv特异性抗体的杂交瘤的孔通过 三轮有限稀释或用clonepix装置(molecular devices)根据制造商的说明克隆。 一旦获得单个克隆，将每个杂交瘤扩展至75cm2烧瓶中的50％融合 (confluent)。为了抗体表达，用细胞刮刀收集细胞，在无血清培养基(invitrogen 的gibco hybridoma-sfm，12045084)中洗涤，并等分至四个含有250ml无 血清培养基的225cm2烧瓶(corning，431082)中。将细胞温育21天，然后将培 养基通过离心澄清并通过0.2μm无菌过滤器。通过g蛋白色谱法(ge lifesciences，protein g hp columns)从澄清的培养基中纯化抗体。
[0208]
细胞。将bhk-21细胞(atcc ccl-10)保持在补充含有10％胎牛血清(fbs) 和10％磷酸胰蛋白胨(sigma)的α最低必需培养基(αmem；gibco)中。将vero 81 细胞(atcc ccl-81)保持在补充有5％fbs的αmem中。补充所有细胞的培养 基以含有0.29mg/ml l-谷氨酰胺(gibco)、100u/ml青霉素(gibco)、100 μg/ml链霉素(gibco)和500ng/ml两性霉素b。细胞保持在37℃在5％co2的潮 湿气氛中。
[0209]
产生chikv vrp质粒构建体。使用基于pcr的克隆方法从含有chikv 毒株sl15649(genbank：gu189061.1)基因组序列的全长cdna的质粒衍生出 三质粒chikv复制子辅助系统。chikv复制子基因组是使用两步法构建的， 涉及产生具有用多克隆位点(mcs)取代的chikv全长结构盒的中间克隆载 体。将增强的绿色荧光蛋白(egfp)亚克隆到该质粒的多克隆位点以产生 pmh41(chikv sl15649 egfp复制子)。双质粒辅助系统的构建包括多步克 隆过程，首先涉及通过除去大部分(6,891nt)chikv非结构盒而产生全长结构 基因辅助质粒。将全长结构盒进一步细分为两个构建体，pmh38(chikvsl15649衣壳辅助者)，其包含衣壳基因序列，随后是独特的avrii限制性位点， 和pmh39(chikv sl15649糖蛋白辅助者)，其包含衣壳rna结合结构域的符 合读框的缺失(in-frame deletion)，随后是完整的包膜糖蛋白(e3-e1)编码序列 的。
[0210]
重组chikv p62-e1产生。将含有chikv p62(即e3[aa s1-r64]-e2[aas1-e361]-16氨基酸接头-e1[aa y1-q411]，随后是his标签)的质粒(voss等, 2010)用293外源凝集素试剂(invitrogen)转染到293f细胞中。温育72小时后， 除去上清液，再培养细胞72小时。将合并的上清液加载到镍琼脂糖珠柱 (goldbio)上并用咪唑洗脱。使用superdex s200凝胶过滤柱(ge life sciences) 进一步纯化蛋白质。将含有chikv p62-e1蛋白的级分合并、冷冻并储存在
ꢀ‑
80℃。
[0211]
chikv毒株sl15649衍生的vrp原种的产生。按照范德比尔特大学环境 健康与安全部和范德比尔特机构生物安全委员会批准的方案，在生物安全柜 的经认证的生物安全级别3(bsl3)设施中从重组chikv质粒中回收vrp原 种。通过用noti-hf消化线性化三种sl15649复制子系统质粒，通过苯酚-氯 仿提取纯化，并使用mmessage mmachine sp6转录试剂盒(life technologies) 在转录反应中用作模板以在体外产生加帽的全长rna转录
物。通过使用 genepulser电穿孔仪的电穿孔将病毒rna转录物引入bhk21细胞。电穿孔后 24小时收集含有vrp的培养上清液；以855
×
g离心20分钟澄清上清液，等分， 并储存在-80℃。通过使用vero81细胞连续传代20％的储备液和10％的第1代 培养物上清液评估vrp原种中有增殖能力的重组病毒，在感染后72小时检查 细胞病变效应(cpe)。在最后一个传代未检测到cpe时，原种被认为已经通 过了这个安全测试。然后从bsl3实验室取出原种。
[0212]
vrp中和和gfp报道分子测定。将vero 81细胞(2.25
×
103个细胞/孔)接 种于384孔板的孔中并在37℃下温育24小时。纯杂交瘤上清液或纯化的mab 的连续稀释液与病毒稀释缓冲液(vdb；含有20mm hepes的补充含1％fbs 的rpmi培养基)中～5感染单位/细胞的moi的vrp在37℃温育1小时，然后吸 附到细胞上。将细胞在37℃温育18小时，用hoechst染色剂染色以标记细胞核， 并使用imagexpress micro xl成像系统(molecular devices)在范德比尔特高通 量筛选设备(vanderbilt high-throughput screening facility)成像。使用 metaxpress软件(molecular devices)在每个孔的两个视野中定量总和和 chikv感染的细胞(以gfp表达标记)。对于每种抗体，使用非线性回归确定 95％置信区间的ec
50
值，以使用r统计程序(r.c.team,2014)来拟合单独的对 数生长曲线。
[0213]
制备作为elisa抗原的病毒原种。chikv疫苗株181/25(levitt等,1986 和mainou等,2013)的感染性克隆质粒用noti-hf线性化，并使用mmessagemmachine sp6转录试剂盒(life technologies)体外转录。通过电穿孔将病毒 rna引入bhk21细胞。24小时后收获培养物上清液，通过以855
×
g离心20分 钟澄清，等分并储存在-80℃。
[0214]
用于杂交瘤筛选的病毒捕获elisa。通过用在0.1m na2co3和0.1m nahco
3 ph 9.3结合缓冲液中以1μg/ml制备的纯化的小鼠mab chk-187 (pal等,2013)的包被测定板来进行抗体与病毒颗粒的结合，将其用来包被 elisa平板(nunc 242757)并在4℃下温育过夜。将平板与封闭缓冲液(含 tween 20的pbs[pbs-t]中的1％奶粉和2％山羊血清)一起温育1小时后，用 pbs-t洗涤平板5次，并与25μl来自用chikv疫苗株181/25感染的bhk21细 胞单层的培养上清液一起温育。在室温下温育1小时后，用pbs洗涤平板十次， 并将10μl b细胞培养上清液加入到25μl/孔的封闭缓冲液中。将平板在室温 下温育1小时，然后用pbs-t洗涤5次。缀合碱性磷酸酶的二级抗体(山羊抗人 fc；meridian life science，w99008a)以1:5,000稀释度施加至25μl/孔的封闭 缓冲液中，并将平板在室温下温育1小时。在用pbs-t洗涤5次后，以25μl/ 孔加入磷酸酶底物溶液(在1m tris氨基甲烷中的1mg/ml磷酸酶底物[sigma， s0942])，并将平板在室温下温育2小时，然后使用biotek读板器在405nm测定 光密度。
[0215]
chikv特异性对照人mab。在一些测定中，使用两种先前描述的人 chikv特异性mab、5f10和8b10(warter等,2011)作为阳性对照。基于cheng-iwang和alessandra nardin(singapore immunology network,a*star, singapore)提供的序列，用含有5f10和8b10抗体可变基因区的序列最优化 cdna的igg1表达质粒(lonza)转染后，在293f细胞(invitrogen)中表达这些 mab。
[0216]
单克隆抗体与e2蛋白结合的elisa。如所述(pal等,2013)，在大肠杆菌 中产生了重组chikv e2胞外域蛋白(对应于chikv-lr2006毒株)并吸附到 微量滴定板(100μl的2μm/ml e2蛋白溶液，在0.1m na2co3，0.1m nahco3和0.1％nan3[ph 9.3]中)在4℃过夜。用含有0.05％tween-20的pbs漂洗平板 三次，并用封闭缓冲液(pbs，0.05％tween-20和2％[w/v]
bsa)在37℃温育1 小时。在室温下将一级人类mab(在封闭缓冲液中稀释至10μg/ml)加入到孔 中1小时。用含有0.05％tween-20的pbs漂洗平板三次，并顺序加入二级抗体 (在封闭缓冲液中稀释1/20,000的对小鼠血清蛋白具有最小交叉反应性的(生 物素缀合的山羊抗人igg(h和l链)(jackson immunoresearch laboratories))和 链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(在含有0.05％tween-20的pbs中稀释； vector laboratories)，各自在室温下1小时，在步骤之间用板漂洗。用pbs漂 洗四次后，将板在室温下与100μl的tmb(3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺)显色底物溶 液(dako)一起温育5分钟，通过加入2n h2so4终止反应。使用elisa读板器 在450nm的光密度测定产物强度。
[0217]
通过表面等离子体共振的亲和力测量。如所述(austin等,2012)，使用 biacore t100仪器动力学分析纯化的人mab和chikv蛋白的相互作用。对于 具有可溶性chikv p62-e1的完整igg，将抗人igg抗体(ge life sciences)固定 到s系列cm5芯片上，并用于捕获抗chikv或对照(hu-wnv e16)抗体。将 chikv p62-e1以65μl/min注射到表面上180秒，并在循环之间用3m mgcl2再生之前，解离1000秒。一些抗体不结合单体e1蛋白，因此发明人测试了它 们与vlp的结合。对于使用chikv vlp的动力学测量，将抗小鼠igg抗体(gelife sciences)固定以捕获具有亚纳摩尔亲和力的一组小鼠抗chikv抗体，其 随后用于捕获chikv vlp。将抗chikv igg或fab以65μl/min注射到芯片表 面上180秒，并在循环之间用10mm甘氨酸ph 1.7再生之前解离1000秒。所有 数据均使用biacore评估软件(版本1.1.1)和曲线的全球1:1langmuir拟合进行 处理。结果从至少三个独立的实验中获得。
[0218]
用于病灶减少中和试验的病毒株。为了确定mab的宽度和中和效力，本 发明人使用了四个代表性毒株，每种chikv基因型具有至少一个代表，包括 来自三种基因型的每种的一种原型病毒以及来自当前加勒比海地区爆发的 毒株。由stephen higgs(manhattan，ks)提供毒株lr2006_opy1(lr)(chikv 东/中/南非[ecsa]基因型)。毒株ni 64ibh 35(西非基因型)以及毒株rsu1和 99659(亚洲基因型；2014年从英属维尔京群岛(lanciotti&valadere,2014)的受 试者分离)由robert tesh(world reference center for emerging viruses andarboviruses,galveston,tx)提供。
[0219]
使用传染性chikv的病灶减少中和测试(frnt)。将纯化的人mabs的连 续稀释液与chikv的100个病灶形成单位(ffu)在37℃下温育1小时。将mab
‑ꢀ
病毒复合物加入到96孔板中的vero细胞中。温育90分钟后，将细胞用含有 2％fbs补充的改良eagle培养基(mem)中的1％(w/v)甲基纤维素覆盖。将细胞 温育18小时并用1％多聚甲醛的pbs溶液固定。将细胞依次与500ng/ml鼠 chk-11(pal等,2013)和辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗小鼠igg在补充 以含有0.1％皂苷和0.1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs中温育。使用trueblue过氧 化物酶底物(kpl)使chikv感染的病灶可视化，并使用immunospot 5.0.37宏 观分析仪(cellular technologies ltd)定量。在与没有抗体的情况下接种chikv 的孔比较后，使用非线性回归分析计算ec
50
值。
[0220]
生物层干涉测量竞争结合测定。将含有聚组氨酸标签(20μg/ml)的 chikv-lr2006e2胞外域蛋白质固定在抗五his生物传感器尖端(fortebio# 18-5077)上2分钟。在动力学缓冲液(kb，1x pbs，0.01％bsa和0.002％吐温 20)中测定基线信号1分钟后，将生物传感器尖端浸入含有浓度100μg/ml的一 级抗体的孔中5分钟，然后浸入含有100μg/ml浓度竞争mab的孔中5分钟。竞 争mab在第一mab存在下的结合百分比通过比较在初始mab复合物
之后施 用的竞争mab的最大信号与单独竞争mab的最大信号来确定。如果竞争性 mab的最大结合降低至《30％单独的结合亲和力，则判定抗体竞争与同一位 点的结合。如果竞争性mab的最大结合》非竞争结合的70％，则认为抗体是 非竞争性的。30-70％的非竞争性结合水平被认为是中等竞争。
[0221]
诱变表位绘图。将具有c末端v5标签的chikv包膜蛋白表达构建体(毒 株s27，uniprot reference#q8jux5)进行丙氨酸扫描诱变以产生综合突变文 库。设计引物以使包膜蛋白的e2、6k和e1区域内的每个残基(结构多聚蛋白 中的残基y326至h1248)突变为丙氨酸；丙氨酸密码子突变为丝氨酸(fong等, 2014)。总共产生910个chikv包膜蛋白突变体(覆盖率为98.5％)，序列确认， 并排列在384孔板中。在384孔板中用chikv突变文库转染hek-293t细胞并 温育22小时。将细胞在含有钙和镁的pbs(pbs+/+)中的4％多聚甲醛(electronmicroscopy sciences)中固定，并用0.25至1.0μg/ml的纯化mab或2.5μg/ml纯 化的fab片段(稀释在10％正常山羊血清(ngs；sigma)中)染色。使用针对野生 型chikv包膜蛋白的独立免疫荧光滴定曲线确定一级抗体浓度，以确保信号 在线性检测范围内。在10％ngs中使用3.75μg/ml alexafluor488缀合的二抗 抗体(jackson immunoresearch laboratories)检测抗体。将细胞用不含镁和钙 的pbs(pbs-/-)洗涤两次，并用0.1％bsa(sigma)重悬于cellstripper(cellgro) 中。使用高通量流式细胞仪(htfc，intellicyt)检测平均细胞荧光。相对于野 生型蛋白质反应性，通过从模拟转染的对照中减去信号并标准化为来自野生 型转染的对照的信号来计算针对每个突变体克隆的抗体反应性。如果相应的 丙氨酸突变体不与测试mab反应，但是确实与其它chikv抗体反应，则氨基 酸被鉴定为mab结合所需的。这种反筛选策略有助于排除错误折叠或具有表 达缺陷的突变体(christian等,2013,paes等,2009and selvarajah等,2013)。使用 pymol软件在chikv包膜蛋白晶体结构(单体pdb id#3n41和三聚体pdbid#2xfb)上显示抗体结合所需的氨基酸。
[0222]
连接前和连接后中和分析。将vero 81细胞(atcc ccl-81；～7.5
×
103个 细胞/孔)接种到96孔板的孔中并在37℃下温育约24小时。对于连接前测定， 在4℃下在病毒稀释缓冲液(vdb)中制备mab稀释液，并在4℃下与vrp预温 育1小时。将抗体-病毒复合物在4℃下加入到预冷的vero 81细胞中1小时。通 过用vdb洗涤三次除去未吸附的病毒，并将细胞在完全培养基中在37℃下温 育18小时。类似地进行连接后测定，除了等效moi的vrp首先在4℃下吸附 到vero 81细胞1小时，未结合的vrp通过用病毒稀释缓冲液洗涤三次而除去， 并将细胞与含有连续稀释的mab的预冷的vdb一起在4℃下温育1小时。未结 合的mab通过使用vdb洗涤三次除去，细胞在完全培养基中于37℃温育18 小时。对细胞进行染色、成像和分析，如针对vrp中和测定所述，每个孔具 有四个视野，每个样品产生总共～800至1,000个细胞用于分析gfp表达。
[0223]
融合抑制测定。使用ffwo测定法(edwards&brown，1986)评估与质膜 融合的病毒。将vero 81细胞(～3.75
×
103个细胞/孔)接种到96孔板的孔中并在 37℃下温育～24小时。将细胞用结合培养基(补充以含有1％fbs，25mmhepes[ph7.4]和20mm nh4cl的rpmi 1640以防止通过内涵体融合的感染) 洗涤一次，并在4℃的结合培养基中温育15分钟。将含有vrp的接种物在结 合培养基中稀释，并与细胞在4℃温育1小时。未结合的vrp通过用结合培养 基洗涤两次而除去。将vdb中mab的连续稀释液与细胞在4℃下温育1小时， 用vdb洗涤两次除去未结合的mab。通过在37℃加入预热的融合培养基 (rpmi 1640,1％fbs，25mm hepes
和30mm琥珀酸，ph 5.5)诱导ffwo 2分 钟。在平行的孔中，在37℃加入对照培养基(rpmi 1640,1％fbs，25mmhepes，ph7.4)2分钟。除去培养基，并将细胞在补充以含有5％fbs、20mmnh4cl(以确保感染仅通过ph依赖性质膜融合发生)和25mm hepes[ph 7.4] 的dmem中温育。在感染后18小时，将细胞染色，成像并如所述进行分析， 每个孔有四个视野，产生每个样品总共～800-1,000个细胞用于分析gfp表达。
[0224]
小鼠体内保护研究。本研究严格按照国家卫生研究院关于实验室动物的 管理使用的指南中的建议进行。该协议得到了华盛顿大学医学院动物管理和 使用委员会的批准(保证号：a3381-01)。在华盛顿大学医学院的无病原动物 设施中培育ifnar-/-小鼠，并且在华盛顿大学动物研究委员会的批准下在 a-bsl3设施中进行感染实验。在盐酸氯胺酮和赛拉嗪诱导和维持的麻醉下 进行足垫注射。对于预防性研究，在使用含1％热灭活的fbs的hbss中稀释 的10ffu的chikv-lr皮下接种于足垫的前1天，人mab通过腹膜内注射施用 给6周龄ifnar-/-小鼠。对于治疗性研究，在以特定剂量施用单剂量的单个人 mab或人mab组合之前24、48或60小时递送10ffu的chikv-lr。
[0225]
实施例2
–
结果
[0226]
chikv特异性人mab的分离。本发明的发明人从2006年在斯里兰卡获 得chikv感染并且出现发烧、关节痛和皮疹(图4)的单个个体中分离出一组 mab。在线方法提供了临床过程和b细胞转化和筛选程序。他们在两次单独 实验中从自然感染五年半后的供体收集的单一血液样品中转化了b细胞。他 们观察到了病毒特异性的b细胞频率大约为1,000个总b细胞中的1个，并且从 分泌与病毒结合的抗体的b细胞系建立了30个稳定的杂交瘤。mab组包含多 个亚类的igg，有24个igg1、3个igg2和2个igg3；一个由于杂交瘤生长差而 未被确定(表5)。
[0227]
评估mab中和。十八种mab对亚洲chikv株sl15649-gfp病毒报道分子 颗粒(vrp)显示出中和活性，ec
50
《40ng/ml，十一种表现出超有效抑制活性 (定义为ec
50
值《10ng/ml，表5)。四种mab具有弱抑制活性(ec
50
值在0.1至 5μg/ml范围内)，并且八种mab在最高测试浓度(ec
50
值》10μg/ml)下不具有 抑制活性。
[0228]
中和活性的广度。本发明的发明人使用高通量病灶减少中和试验 (frnt)(pal等,2013)确定了每种抗体针对东/中/南非(ecsa)基因型 (lr2006opy1[lr]毒株)、西非洲基因型(ni64ibh35毒株)和亚洲基因型 (rsu1和99659[2014加勒比]毒株)的代表感染chikv毒株的ec
50
值。二十五 种mab对至少一种chikv毒株显示出中和活性(ec
50
值《10μg/ml)，其中八种 mab在有效范围内呈现中和(ec
50
值在10-99ng/ml之间)，十三种mab表现出 超强范围内的中和(ec
50
值《10ng/ml)(表5)。为了比较的目的，本发明的发明 人还针对所有三种基因型的病毒测试了以前报道的人mab 5f10和8b10，并 且在每种情况下，ec
50
值均大于100ng/ml(范围161-1337)。在大多数情况下， 本发明的发明人分离的mab对来自所有三种基因型的病毒表现出相对相似 的中和活性。六种mab(2b4、2h1、4j21、n12、m16和9d14)以超有效活性 (ec
50
值《10ng/ml)抑制来自所有三种基因型的病毒。这些数据表明，单个个 体可以形成多种chikv特异性抗体，其是超有效的并且具有广泛中和性。
[0229]
与e2蛋白结合。chikv e2蛋白是鼠(goh等,2013；lum等,2013)、非人 灵长类(kam等,2014)和人(fong等,2014；kam等,2012a；kam等,2012b； selvarajah等,2013)体液应答的主要靶标。本发明的发明人测试了人mab与大 肠杆菌中表达的e2蛋白的胞外域的单体形
式的结合(pal等,2013)。9个mab 与e2胞外结构域强烈结合，6个表现出中度结合，1个弱结合，以及14个不能 以背景之上的水平结合(表5)。体外结合纯化的e2蛋白的能力与中和效力不直 接相关(表5)。使用表面等离子体共振测定来测试17个人mab的子集与源自哺 乳动物细胞的p62-e1蛋白的结合(voss等,2010)。所有mab在nm范围内结合， kd值为0.5至20nm。结合动力学的差异与抗原特异性或功能活性不相关(表 s1)。
[0230]
有竞争约束力的研究。为了鉴定不同中和mab识别的重组e2蛋白中的非 重叠抗原区域，本发明的发明人使用定量竞争结合测定。为了比较，他们还 评估了先前描述的四种鼠mab(chk-84、chk-88、chk-141和chk-265)(pal 等,2013)和先前描述的人mab 5f10(warter等,2011)(图5)。竞争的模式是复杂 的，但是三个主要的竞争组是明显的，本发明的发明人指定了组1(红色框)、 组2(蓝色框)或组3(绿色框)。本发明的发明人还定义了含有单个人mab 5f19(橙色框)的第四组。这些竞争研究表明存在由chikv特异性抗体识别的 三个主要抗原区。
[0231]
使用丙氨酸扫描诱变的表位绘图。本发明的发明人使用了与基于细胞的 表达和流式细胞术相结合的丙氨酸扫描诱变文库来鉴定抗体结合所需的 chikv毒株s27(ecsa基因型)的e2和e1蛋白中的氨基酸(fong等,2014)(图 6a-f)。对于20个人mab的亚组，抗体结合chikv糖蛋白所需的所需的残基 列于表6中。影响这20个mab的结合的突变在毒株s27和用于本研究的代表所 有chikv基因型的全长e2序列的比对(图1a)中表示。影响结合的e2中的氨基 酸主要位于结构域a和b的溶剂暴露区域以及连接结构域a和b的β带状连接 体的拱1和2(voss等,2010)(图1a)。对通过使用丙氨酸扫描诱变的结合损失实 验与竞争结合分析鉴定的抗原位点的比较(图5)证明了竞争组1和2通常对应 于结构域a和拱内的位点，而组3对应于结构域b中的区域
[0232]
抗原区域的结构分析。结构域a和b中的大量不同数量的表面残基和拱 与至少一种mab接触(图1b-c)。e2中的两个主要抗原区域占多个mab的结 合。第一个区域位于氨基酸58和80之间的结构域a中，并含有推定的受体结 合结构域(rbd)(sun等,2014；voss等,2010)。第二个区域位于氨基酸190和 215之间的结构域b中。两个序列区域远离病毒包膜并位于e2三聚体顶点附近 (图6a-f和7)。
[0233]
中和机制。本发明的发明人使用展示一系列抑制活性的mab进行了连接 前和连接后中和测定。如所预期的，当与vrp预温育时，所有五种mab均有 效检测中和的感染(图2a)。然而，mab 4b8即使在高浓度下也不能完全中和 vrp，这表明存在一部分对该mab有抗性的chikv病毒体；在使用对应于三 种不同chikv基因型的活chikv毒株的测定中也观察到这种模式(数据未显 示)。相反，mab 3e23、4j21、5m16和9d14在连接前施用时完全中和了感染。 所有五种人mab当加入以下连接物时也中和chikv感染，但发明人观察到了 三种不同的活性模式(图2a)。当连接后添加时，mab 4b8不能完全中和，并 且抗性病毒体的比例与在连接前中和之后观察到的相比更大。无论是在连接 之前还是之后添加，mab 9d14都以相当的效率中和了vrp。mab 3e23、4j21 和5m16显示vrp的完全中和，但连接后中和效率低于连接前。当在连接之 前或之后添加时，mab 2h1和4n12也有效地中和了vrp(图8)。
[0234]
对五种超有效中和性mab(3e23、4b8、4j21、5m16或9d14)的无融合 (fusion-from-without；ffwo)测定法测试显示所有均抑制了融合(edwards和 brown，1986)。如所预期的，当用mab预处理的病毒体与中性ph缓冲的培养 基连续温育时，几乎没有观察到感染(图
2b)。在没有抗体处理的情况下，酸 性ph缓冲介质的短脉冲导致感染的细胞，这表示病毒包膜和质膜之间的融 合。值得注意的是，全部五种人mab都抑制了质膜融合和感染，其中mab 9d14在该测定中表现出最大的效力。这些研究表明超有效中和性mab阻断 chikv融合。
[0235]
体内mab预防。本发明的发明人使用6周龄、高度免疫缺陷的ifnar-/-小 鼠在致死性感染模型中测试了表现出不同水平中和活性的mab亚组(表7)。在 皮下注射致死剂量的chikv-lr2006前24小时，用单一的50μg剂量(～3mg/kg) 的人抗chikv mab或西尼罗河病毒特异性同种型对照mab(wnv he16)预处 理小鼠。用同种型对照mab处理的所有小鼠在接种后4天死于感染。用mab 4b8、4j21或5m16的预处理完全保护了ifnar-/-小鼠，而用mab 3e23或9d14 的处理部分地保护了感染的动物，具有67％的存活率(图3a)。令人惊讶的是， 体外弱中和的mab 2d12保护了83％的动物。
[0236]
体内mab暴露后治疗。使用致死剂量的chikv-lr2006接种ifnar-/-小鼠， 然后在病毒接种后24小时施用单一的50μg(～3mg/kg)剂量的代表性mab。这 些mab的治疗性施用提供了完全的保护，而同种型对照mab不提供保护(图 3b)。为进一步确定疗效的治疗窗口，在用chikv-lr2006攻击48小时后，对 ifnar-/-小鼠施用单一的250μg(～14mg/kg)剂量的代表性mab。用5m16、4j21 和4b8处理分别保护了动物中的85％、50％和12.5％(图3c)。值得注意的是， 当以500μg(～28mg/kg)的剂量使用时，在60小时的较晚时间点4n12单一疗法 保护了100％的动物(图3d)。这些数据确定，人mab可以针对chikv诱导的 死亡进行保护，即使在感染确立之后的时间段。
[0237]
类似地，在wt小鼠中进行研究以评估人mab对chikv急性和慢性关节 炎的作用。感染后第1天或第3天施用单克隆抗体，感染后在d3、5或28分析 病毒负荷或rna。根据所检查的组织和时间，1h12或4j14提供最显著的病毒 学保护。在这些测定中4n12也提供了显著的保护。
[0238]
体内联合mab治疗。鉴于在用单一抗chikv mab处理的动物中体内抗 性选择的可能性(pal等,2013)，发明人测试了两种抗chikv人mab的组合是 否可以保护小鼠免受致命攻击。他们基于单个mab的体外效力选择了中和 mab。在接种后60小时，对ifnar-/-小鼠施用最有效的mab的单一组合抗体治 疗剂量(每种250μg，总共～28mg/kg)。尽管一些mab组合([4j21+2h1]和[4j21 +5m16])几乎没有或没有提供保护，但其他([4j21+4n12])在这个非常晚的 时间点产生了63％的存活率(图3d)。因此，即使在这些动物死亡的24至36小 时内施用时，组合mab疗法在高免疫受损的小鼠中也保护其免受致死的 chikv感染。在这种情况下，4n12与4j21联合使用的效果不如其作为单一疗 法好，尽管4n12在单一疗法实验(500μg)中的剂量是联合疗法(250μg)中4n12 组分的两倍。
[0239]
表s1.通过spr测量的人chikv抗体结合抗原的动力学
[0240]
ka、kd、kd的值是平均值
±
标准偏差。kd＝kd/ka；t
1/2
＝(in(2)kd)/60
[0241][0242]
实施例3-讨论
[0243]
本发明的发明人报道了从单个个体中分离出一组多种多样的天然存在 的人mab，其中大多数识别chikv e2蛋白并显示显著的体外中和活性和体 内治疗功效。作为一个类别，最有抑制作用的抗体也表现出广泛的活性，中 和所有三种chikv基因型的病毒，包括目前在加勒比地区流行的毒株。本研 究中分离的大多数人chikv特异性mab以低于100ng/ml的浓度中和病毒， 许多在低于10ng/ml时表现出抑制活性。这种活性比本发明的发明人在先前 针对包括h1、h2、h3或h5流感病毒(hong等,2013；krause等,2012；krause 等,2011a；krause等,2011b；krause等,2010；thornburg等,2013；yu等,2008)、 登革热病毒(messer等,2014；smith等,2013a；smith等,2014；smith等,2013b； smith等,2012)等在内的其它致病性人病毒的人mab研究中观察到的更大。许 多人类chikv mab的效力与最佳类型的鼠中和chikv mab相当或超过其最 佳类型(fong等,2014；fric等,2013；pal等,2013；warter等,2011)，这是迭代 增强和亲和力成熟后产生的。大多数其他针对chikv的中和性人mab的效力 显著较弱(fong等,2014；selvarajah等,2013；warter等,2011)。一个先前报道 的人chikv特异性mab(im-ckv063)显示与这里报道的超有效中和 mab(fong等,2014)相当的活
性。
[0244]
本发明的发明人通过测试的不同中和性chikv mab观察到了e2中表位 识别模式的多样性。用丙氨酸取代的chikv糖蛋白进行精细表位绘图显示了 对e2中三个结构区域的识别与mab介导的中和作用相关：包含推定的rbd 的结构域a(sun等,2013；voss等,2010)，接触并屏蔽e1中的融合环的结构域 b(voss等,2010)，和含有酸敏感区域并连接结构域a和b的β-带状连接体的 拱1和2(voss等,2010)。在定位到e2中的表位的抗体中，大部分(竞争组1和2 中的那些)优先识别结构域a和拱1和2中的位点，而较小的组(在竞争组3中) 识别结构域b中的位点。这些数据表明，结构域a和拱中的表面暴露区域是 引起人中和性抗体应答的主要抗原性位点。本发明的发明人得出结论，结构 域a和拱2中高度保守的区域可能引起广泛的保护性免疫应答，并且对于聚焦 于表位的疫苗设计充当了有吸引力的候选者。
[0245]
值得注意的是，关键的e2结构域中几乎四分之一的表面暴露的残基似乎 被来自单个个体的一个或多个mab涵盖(engage)。两个观察结果暗示了主要 抗原位点上功能多样的结合模式的存在：(a)一些mab与相似的表位结合，但 表现出相差几个数量级的抑制活性，和(b)中和能力与e2蛋白结合的亲和力之 间几乎没有相关性。最有力的中和性人mab中的7个(2h1、3e23、4b8、4j21、 4n12、5m16和9d14)在连接后的一个步骤中抑制chikv感染，可能是通过 预防ph依赖性结构改变来防止核衣壳渗入细胞质(kielian等,2010)。
[0246]
由于小鼠中的治疗效果似乎预示了实验诱导的感染和非人灵长类动物 的关节炎的治疗结果(pal等,2013；pal等,2014)，这里的数据表明用chikv 特异性人mab对人类进行预防会防止感染。考虑到关于使用单一疗法的抗性 变体的选择(pal等,2013)，使用靶向不同e2区域的超有效中和抗体的组合疗 法可能是期望的。在爆发期间可以针对严重疾病风险明显增加的患者群体， 包括具有严重潜在医疗状况的患者(例如，孕晚期妇女，免疫功能受损者和 老年人)。计划进行进一步的临床测试以确定中和性人mab是否可以预防或 改善人体内已有的关节疾病。
[0247]
表1-抗体可变区的核苷酸序列
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256][0257]
表2-用于抗体可变区的蛋白质序列
[0258]
[0259]
[0260]
[0261][0262]
表3-cdr重链序列
[0263]
[0264]
[0265][0266]
表4-cdr轻链序列
[0267]
[0268][0269]
表5
–
切昆贡亚热病毒特异性人单克隆抗体的特征
[0270]
[0271][0272]1抗体顺序反映抗体在针对不同基因型的临床chikv分离株的中和测定 中的效力程度和广度的水平。
[0273]2免疫球蛋白的同种型、亚型和轻链使用通过elisa来确定。nt表示由 于b细胞系生长不良而未测试。
[0274]3(-)表示没有可检测的结合[od《0.1]；(+/-)表示弱的结合[od0.31-0.499]；(++)表示中度结合[od 0.5-0.99]；(+++)表示强的结合[od》1.0]。
[0275]4显示的值表示来自两个或更多个独立实验的组合数据。
[0276]5中和50％病毒的浓度(ng/ml)(ec
50
)。(》)表示ec
50
值大于所测试的最高 mab浓度(10μg/ml)。n.d.＝未完成的。
[0277]
表6
–
切昆贡亚热病毒特异性人单克隆抗体的主要抗原性位点
[0278]
[0279][0280]1抗体顺序反映抗体在针对不同基因型的临床chikv分离株的中和测定 中的效力程度和广度的水平。
[0281]2显示的值表示来自两个独立实验的组合数据。低结合表明在生物传感 器上用于评估竞争的不完全mab与e2结合。nt表示未测试，因为ab在elisa 中不结合e2胞外域；nsf ab表示mab供应不足。
[0282]3notreact表明mab不与野生型包膜蛋白反应，不能在该系统中测试。noreduct表明mab确实与野生型e蛋白结合，但是对于任何突变体没有观察 到可再现的减少。da表示结构域a；db表示结构域b；arch指示拱1、拱2 或两者。
[0283]4在以前的低温em重建中通过与单克隆抗体接触鉴定的残基。
[0284]
表7-切昆贡亚热病毒特异性人单克隆抗体的体外中和效力和广度
[0285]
[0286][0287]1抗体顺序反映抗体在针对不同基因型的临床chikv分离株的中和测定 中的效力程度和广度的水平。
[0288]2中和50％病毒的浓度(ng/ml)(ec
50
)。(》)表示ec
50
值大于所测试的最高 mab浓度(10μg/ml)。n.d.＝未完成的。
[0289]
*****************
[0290]
本文公开和要保护的所有组合物和方法都可以根据本公开制造和进行 而不需要过多的实验。尽管已经根据优选的实施例描述了本公开内容的组合 物和方法，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的概 念、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文所述的组合物和方法以及 该方法的步骤或步骤的顺序。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学上 相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。 对本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都被认为在由所 附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念之内。
[0291]
综上所述，本技术包括但不限于以下项：
[0292]
1.检测受试者中的切昆贡亚热病毒的方法，其包括：
[0293]
(a)使来自所述受试者的样品与具有分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链 cdr序列的抗体或抗体片段接触；和
[0294]
(b)通过所述抗体或抗体片段与所述样品中的e2的结合检测所述样品中的切 昆贡亚热病毒糖蛋白e2。
[0295]
2.项1的方法，其中，所述样品是体液。
[0296]
3.项1-2的方法，其中，所述样品是血液、痰液、眼泪、唾液、粘液或血清、 尿液或粪便。
[0297]
4.项1-3的方法，其中，检测包括elisa、ria或蛋白质印迹。
[0298]
5.项1-4的方法，其进一步包括第二次进行步骤(a)和(b)，和确定与第一次检 测相比e2水平的变化。
[0299]
6.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段通过如表1所示的克隆配对可变 序列编码。
[0300]
7.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段通过与如表1所示的克隆配对可 变序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0301]
8.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段通过与如表1所示的克隆配对序 列具有95％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0302]
9.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含根据来自表2的克隆配对序 列的轻链和重链可变序列。
[0303]
10.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含与来自表2的克隆配对序 列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列。
[0304]
11.项1-5的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含与来自表2的克隆配对序 列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。
[0305]
12.项1-11的方法，其中，所述抗体片段是重组scfv(单链片段可变)抗体、 fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。
[0306]
13.一种治疗感染有切昆贡亚热病毒的受试者，或降低处于感染切昆贡亚热 病毒风险的受试者的感染可能性的方法，其包括向所述受试者递送抗体或抗 体片段，所述抗体或抗体片段具有分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链 cdr序列。
[0307]
14.项13的方法，所述抗体或抗体片段通过如表1所示的克隆配对轻链和重 链可变序列编码。
[0308]
15.项13-14的方法，所述抗体或抗体片段通过与如表1所述的具有95％同一 性的克隆配对轻链和重链可变序列编码。
[0309]
16.项13-14的方法，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表1的克隆配对 序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0310]
17.项13的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含根据来自表2的克隆配对序 列的轻链和重链可变序列。
[0311]
18.项13的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含与来自表2的克隆配对序列 具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列。
[0312]
19.项13的方法，通过与来自表2的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重 链可变序列编码。
[0313]
20.项13-19的方法，其中，所述抗体片段是重组scfv(单链片段可变)抗体、 fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。
[0314]
21.项13-20的方法，其中，所述抗体是igg。
[0315]
22.项13-19的方法，其中，所述抗体是嵌合抗体。
[0316]
23.项13-22的方法，其中，所述抗体或抗体片段在感染前施用。
[0317]
24.项13-22的方法，其中，所述抗体或抗体片段在感染后施用。
[0318]
25.项13-24的方法，其中，递送包括抗体或抗体片段施用，或使用编码所述 抗体或抗体片段的rna或dna序列或者载体进行遗传递送。
[0319]
26.一种单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段的特征在于分别来自表3 和4的克隆配对重链和轻链cdr序列。
[0320]
27.项26的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段通过根据来自表1的克隆 配对序列的轻链和重链可变序列编码。
[0321]
28.项26的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表1的克隆配 对序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0322]
29.项26的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表1的克隆配 对序列具有至少95％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0323]
30.项26的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段包含根据来自表2的克隆 配对序列的轻链和重链可变序列。
[0324]
31.项26的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段包含与来自表2的克隆配 对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。
[0325]
32.项26-31的单克隆抗体，其中，所述抗体片段是重组scfv(单链片段可变) 抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。
[0326]
33.项26-31的单克隆抗体，其中，所述抗体是嵌合抗体，或靶向除糖蛋白之 外的切昆贡亚热病毒抗原的双特异性抗体。
[0327]
34.项26-33的单克隆抗体，其中，所述抗体是igg。
[0328]
35.项26-34的单克隆抗体，其中，所述抗体或抗体片段进一步包含细胞穿透 肽和/或是内抗体。
[0329]
36.一种编码抗体或抗体片段的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体 片段的特征在于分别来自表3和4的克隆配对重链和轻链cdr序列。
[0330]
37.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段通过根据来自表1 的克隆配对序列的轻链和重链可变序列编码。
[0331]
38.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表1 的克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序 列编码。
[0332]
39.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表1 的克隆配对可变序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列编码。
[0333]
40.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段包含根据来自表2 的克隆配对序列的轻链和重链可变序列。
[0334]
41.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段通过与来自表2 的克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序 列编码。
[0335]
42.项36的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段包含与来自表2 的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。
[0336]
43.项36-42的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体片段是重组scfv(单链片 段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。
[0337]
44.项36-43的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体是嵌合抗体。
[0338]
45.项36-43的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体是igg。
[0339]
46.项36-45的杂交瘤或工程细胞，其中，所述抗体或抗体片段进一步包含细胞穿透肽和/或是内抗体。
[0340]
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