一种用于检测JPH3基因的引物对、试剂盒及检测方法与流程

一种用于检测jph3基因的引物对、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测jph3基因的引物对、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.亨廷顿病样2(huntington disease-like 2,hdl2)是一种类似于亨廷顿病(huntington disease,hd)的神经退行性疾病，其临床表型、遗传特征、神经病理学和发展均与hd相似。亨廷顿病样2(hdl2)通常出现在中年，伴有持续的运动、情绪和认知异常三联征。神经系统异常包括舞蹈病、运动减退(僵直、运动迟缓)、构音障碍和后期反射亢进，在疾病的持续时间和运动和认知障碍的进展之间有很强的相关性，会导致10至20年内死亡。
3.在hdl2相关的iph3基因中ctg会出现大约大于40个三碱基ctg重复扩增。但目前对iph3基因中ctg重复状况并没有适配分析方法，所以需要设计新的检测方法对ctg重复状况进行分析，以便对iph3基因进行分析。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的问题是：如何提供一种用于检测jph3基因的引物对、试剂盒及方法，以解决现有技术中对iph3基因中ctg重复状况分析方法缺失的问题。
5.为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
6.hdl2相关的iph3基因中ctg会出现大约大于40个三碱基ctg重复扩增。所以可以尝试设计一种检测ctg重复状况的引物及方法，通过对重复数的确定，以便确定iph3基因。
7.本发明主要内容：合成引物对，引物对的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由荧光基团标记；从待测样本中提取基因组dna，作为dna模板；配置包含所述引物对和所述扩增模板的pcr扩增体系；对所述pcr扩增体系进行扩增反应，获得含有ctg三核苷酸重复序列的pcr产物；毛细管电泳检测所述pcr产物，并根据电泳检测结果计算所述待测样本的jph3基因ctg三核苷酸重复数。
8.其一，本发明提供一种用于检测jph3基因ctg重复序列动态突变的引物对，所述引物对的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由荧光基团标记，所述引物对序列如下：
9.jph3-famf：ggcagagccggggccgg；
10.jph3-r：ggttccctgcacagaaaccatc。
11.更优的，所述引物对famf向引物5’端带5
’‑
fam荧光基团。
12.其二，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
13.具体的，所述试剂盒包括25体积份的2xgoldstar best mastermix、2.4体积份的dmso、13.6体积份的无核酸酶纯化水和4体积份上述的引物对。
14.其三，本发明提供一种检测jph3基因ctg重复序列动态突变的非诊断目的的检测
方法，包括：
15.1)提取dna并利用权利要求1所述的引物对进行pcr扩增；
16.2)对所述步骤1)pcr扩增后的产物进行毛细管电泳；
17.3)分析jph3基因中ctg重复情况。
18.进一步，所述步骤1)pcr扩增包括：
19.按dna检测样本数量配置扩增反应液混合液，所述扩增反应液混合液中：2
×
goldstar best master mix试剂用量25
×
nμl；10um的jph3-famf引物用量2
×
nμl；10um的jph3-r引物用量2
×
nμl；dmso用量2.4
×
nμl；ddh2o用量13.6
×
nμl；所述n＝检测样本数+1；按45ul扩增反应混合液中加入5ul dna；进行pcr扩增。
20.具体的，所述pcr扩增包括：
21.在pcr仪中先以95℃变性1分钟；再运行35次如下循环：94℃变性30秒、59℃退火30秒、72℃延伸1分钟；之后72℃延伸5分钟，4℃保存。
22.进一步，所述步骤2)对所述步骤1)pcr扩增后的产物进行毛细管电泳包括：
23.对pcr扩增产物进行稀释，在ddh2o中加入pcr扩增产物；
24.取abi gs500-liz内标和hidi按1∶250的体积比混合后，取混合液与稀释后的pcr扩增产物混合制成上机混合液；
25.将配置好的上机混合液在pcr仪上以95℃运行3分钟后，冰水混合物中冷却5分钟，确保温度在0℃，作变性处理；
26.上机混合液在abi3730xl测序仪中进行检测，采用g5颜色分组，在abi3730xl测序仪中的分型参数设置如下：检测恒温oven_temperature 60℃，缓冲液温度buffer_temperature 35℃；预电泳电压prerun_voltage 15kv，预电泳时间prerun_time 180s；注入电压injection_voltage为1.5kv；注入时间injection_time为15s；第一次读数first_readout_time 300ms；第二次读数second_readout_time 300ms；电泳电压run_voltage 15kv；突跳步数voltage_number_of_steps设置为10步；突跳电压voltage_steps_interval设置为20s；电压容差voltage_tolerance设置为0.6kv；电流current_stability为30ua，变温延迟ramp_delay 1s；日期延迟data_delay 600s；电泳时间run_time1600s。
27.进一步，所述步骤3)分析jph3基因中ctg重复情况包括：
28.采用genemapper id v3.2软件对分型结果进行判读，核对校正内标峰后定义61bp处为ctg1处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断ctg重复数，ctg1之后第一个最高峰所对应的ctg重复数为第一个等位基因；若之后还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的ctg重复数作为第二个等位基因。
29.其四，本发明提供所述用于检测jph3基因ctg重复序列动态突变的引物对或所述用于检测jph3基因ctg重复序列动态突变的试剂盒在制备亨廷顿病样2诊断剂中的应用。
30.本发明的有益效果在于：本发明提供的引物对、试剂盒以及检测方法，可以利用检测jph3基因(ctg)n重复数对hdl2进行评估，可以快速对类亨廷顿病综合征2型jph3基因的重复数做出检测、评估，检测过程耗时短，检测效率高。
附图说明
31.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进
一步的详细描述，其中：
32.图1为本发明实施例中一个样本采用genemapper id v3.2分析后的波形图。
33.图2为本发明实施例中一个模拟阳性的质粒样本采用genemapper id v3.2分析后的波形图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
35.需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
36.本发明针对jph3基因的ctg重复，设计了一对特异性的引物。使用这对引物对样本进行pcr扩增，会产生一系列片断长度不等的pcr产物，产物的一端包含有fam荧光，对pcr产物进行毛细管电泳，可以清楚的看到产物中ctg的重复数，误差不超过1次重复。
37.实施例1
38.针对jph3的ctg重复，设计了一对特异性的引物，引物对的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由荧光基团标记，引物对序列如下：
39.jph3-famf：ggcagagccggggccgg；
40.jph3-r：ggttccctgcacagaaaccatc。
41.选用fam荧光基团，引物对famf向引物5’端带5
’‑
fam荧光基团，引物对序列如下：
42.jph3-famf：ggcagagccggggccgg；
43.jph3-r：ggttccctgcacagaaaccatc。
44.实施例2血液样本的gdna提取
45.采用实施例1中设计的一对引物，对血液样本进行检测。
46.血液样本提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的磁珠法通用型基因组dna提取试剂盒(dp705-02)：
47.1、取250μl血液样品至2ml离心管中，加入20μl proteinase k溶液和300μl裂解液ghl，振荡混匀，75℃裂解15min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。当样本数目比较大时，可以把裂解液ghl和proteinase k预先混合，现用现配。
48.2、加入300μl异丙醇，振荡混匀10sec。
49.3、加入15μl磁珠悬浮液gh，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。
50.4、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
51.5、加入900μl缓冲液gdz，振荡混匀2min。
52.6、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
53.7、加入500μl缓冲液gdz，振荡混匀2min。
54.8、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
55.9、将离心管从磁力架上取下，加入900μl漂洗液pwd(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀2min。
56.10、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
57.11、将离心管从磁力架上取下，加入300μl漂洗液pwd，振荡混匀2min。
58.12、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体。
59.13、将离心管于磁力架上，室温晾干10-15min。乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。
60.14、将离心管从磁力架上取下，加入50μl洗脱缓冲液tb，振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。
61.15、将gdna溶液转移至一个新离心管中，用nanodrop测定其浓度，并根据测定浓度将gdna浓度浓缩或者稀释至20ng/μl，然后进行后续实验，提取完的gdna建议立即进行pcr扩增，或者直接放于-20
±
5℃条件下保存，保存时间不超过一个月。
62.实施例3对提取的dna进行pcr扩增
63.使用上述引物对对血液样本和模拟阳性的质粒样本(20ng/μl)进行pcr扩增，会产生一系列片断长度不等的pcr产物，产物的一端包含有fam荧光；
64.pcr采用市售的pcr试剂盒，本实施例采用的试剂盒品牌为康为世纪，名称为2xgoldstar best mastermix，货号为cw0656s。
65.1、试剂配置：按dna检测样本数量配置扩增反应液混合液，每份45ul分装，所述扩增反应液混合液中试剂用量如下：
66.成分用量2xgoldstar best mastermix25ul
×
nhdl2引物mix4ul
×
ndmso2.4ul
×
n无核酸酶纯化水13.6ul
×
n总体积45ul
×n67.其中，n＝检测样本数+1。
68.2、加样：在19ul扩增反应混合液中加入1ul dna；
69.3、扩增：在pcr仪中进行pcr扩增程序，扩增程序如下：
70.在pcr仪中先以95℃变性1分钟；再运行35次如下循环：94℃变性30秒、59℃退火30秒、72℃延伸1分钟；之后72℃延伸5分钟，4℃保存。
71.实施例4对pcr产物进行毛细管电泳
72.1、样本稀释：对pcr产物进行100倍样本稀释，在99ulddh2o中加入1ulpcr扩增产物。
73.2、配置上机混合液：取abi gs500-liz内标和hidi按1∶250体积比混合后，取9ul混合液与1ul稀释后的pcr扩增产物混合制成上机混合液。
74.3、预变性：将配置好的上机混合液在pcr仪上95℃运行3分钟后，冰水混合物中极速冷却5分钟，作变性处理。
75.4、毛细管电泳：上机混合液在abi3730xl测序仪中进行检测，采用g5颜色分组，在abi3730xl测序仪中分型参数设置如下表所示。
[0076][0077][0078]
实施例5数据分析
[0079]
3730xl测序仪分型完成后在genemapper id v3.2中对分型结果进行判读，核对校正内标峰后定义61bp处为(ctg)1处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断ctg重复数，(ctg)1之后第一个最高峰所对应的ctg重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的ctg重复数作为第二个等位基因，参见图1，该样本中ctg重复数为14/16；参见图2，该模拟阳性的质粒ctg重复数为40/40，与质粒合成序列一致。
[0080]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。