一种牛CFL2基因腺病毒干扰载体及其构建和鉴定方法

一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体及其构建和鉴定方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体及其构建和鉴定方法。


背景技术：

2.肌肉是影响动物生长发育的重要因素，也是衡量肉品质的重要指标之一，且肌肉的生长发育是非常重要的数量性状，是一系列相关基因时序性表达和关闭的结果，其表型具有特殊的调控机制和复杂的遗传基础，同时，动物的产肉力与肌细胞的数量和生长密切相关。但是，由于目前对家畜的选育手段还处在传统育种向分子育种转变的初级阶段，所以，在分子层面研究肌肉生长发育的调控机理具有重要的指导意义。并且，这对提高牛的产肉量及肉品质也具有深远影响，进而可为我国地方黄牛的快速高效选育以及肉品质的遗传改良提供可靠的数据支持和理论研究基础。
3.cfl2是cofilin蛋白家族的新成员，主要调控骨骼肌和心肌等的表达。在哺乳动物肌肉组织中，丝切蛋白cofilin通常表达m-cofilin(muscle type cofilin,m-type cofilin,肌型cfl2)亚型。有研究表明，大白猪中cfl2基因与肌肉纤维的形成密切相关，也是影响其肌肉高产的重要指标。在对鸡的肉质性状研究时发现，如果提高鸡cfl2基因3’utr区域的等位基因的含量，对鸡肉质性状的改善有一个明显提升。因此，可推断cfl2基因在鸡的肌肉生长发育调控中发挥着一定的生物学作用，并且，肌纤维的组织学特在一定程度上受cfl2基因的变异影响。综上，在对影响鸡的肉质性状等相关指标进行研究时，cfl2基因的变化则可作为一个候选参考因素。cfl2基因在蒙古牛5岁肌肉组织中的表达量远高于其在16月龄时的表达量，且cfl2基因的高表达可降低蒙古牛的肉品质。我们的前期实验中，研究了cfl2基因外显子多态性单倍型与秦川牛不同生长性状之间的关联，在其外显子编码区发现了三个多态位点的碱基突变可极显著的影响牛的体长等不同生长形状，说明cfl2基因可作为牛选育时其生长性状的遗传标记。根据cfl2基因对骨骼肌纤维等相关功能的调控研究，说明cfl2基因在骨骼肌细胞的生长发育中有着深远影响。通过构建牛cfl2基因腺病毒干扰载体，可以达到在牛肌肉组织和细胞中持续性敲低cfl2基因表达的目的，为后续研究cfl2基因与肌肉生长发育之间的分子调控机制提供有效的技术支撑，也可进一步为我国地方黄牛的遗传改良和高效育种提供新的分子标记和选育思路。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体及其构建和鉴定方法，旨在解决在牛肌肉组织和骨骼肌细胞中持续性敲低cfl2基因表达的问题。有助于为后续研究cfl2基因与肌肉生长发育之间的分子调控机制提供有效的技术支撑。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体，所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体的序列为：
7.shrna-1上游引物：gatccctgaaagtgcaccgttaaagagtactgttta
8.acggtgcactttcagttttttc；
9.shrna-1下游引物：tcgagaaaaaactgaaagtgcaccgttaaacagtactc
10.tttaacggtgcactttcagg。
11.一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体，所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体的序列为：
12.shrna-2上游引物：gatccgctctaaagatgccattaagagtactgttaatggcatctttagagcttttttc；
13.shrna-2下游引物：agcttaaaaaagctctaaagatgccattaacagtactcttaatggcatctttagagcg。
14.本发明还提供上述牛cfl2基因腺病毒干扰载体构建方法，包括以下步骤：
15.用bamh i和xho i双酶切载体，酶切完成后胶回收；利用3’和5’的单链退火获得目的片段，将处理好的目的片段与载体连接反应；转化感受态细胞dh5a，得到pentr/cmv-gfp/u6-shrna载体。
16.进一步的，在cfl2基因的序列的上游引物5’端添加bamh i酶切位点，下游引物5’端添加xho i酶切位点，中间添加loop序列，末尾添加tttttt终止信号。
17.进一步的，酶切体系如下：
[0018][0019][0020]
进一步的，转化感受态细胞dh5a的步骤如下：
[0021]
将感受态细胞置于冰上，取10μl的连接产物加入100μl的感受态细胞，混匀；
[0022]
冰上放置30min；
[0023]
将离心管放到42℃水浴中，热激90s；
[0024]
冰上冷却2min；
[0025]
加入500μl液体lb培养基，37℃摇床培养1h；
[0026]
3,000r/min离心2min；
[0027]
吸去部分上清，剩余200μl混匀，一半用于涂板，另一半4℃储存备用；
[0028]
100μl菌液涂布于含kana抗生素(25μg/ml)的固体lb培养基平板表面；
[0029]
37℃培养箱，正置培养30min，后倒置培养12-16h，待单菌落长出后，挑取单菌落。
[0030]
本发明还提供上述牛cfl2基因腺病毒干扰载体鉴定方法，鉴定引物如下：
[0031]
f:tggactatcatatgcttaccg；
[0032]
r:tattggcgttactatgggaac。
[0033]
进一步的，pcr反应体系为：
[0034][0035]
本发明还提供一种由所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体构建的重组腺病毒，由上述载体包装后制备而成。
[0036]
本发明还提供上述牛cfl2基因腺病毒干扰载体构建的重组腺病毒检测方法，其特征在于，采用实时荧光定量pcr检测cfl2基因的表达情况，引物序列如下：
[0037][0038]
本发明的另一目的在于提供一种所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体的构建方法，所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体的构建方法包括以下步骤：
[0039]
步骤一，载体用bamh i，xho i双酶切；
[0040]
步骤二，酶切完成后胶回收；
[0041]
步骤三，目的片断利用3’和5’的单链退火获得；
[0042]
步骤四，处理好的目的片段与载体连接反应；
[0043]
步骤五，转化感受态细胞:dh5a；
[0044]
步骤六，转化后的pentr/cmv-gfp/u6-shrna平板挑菌，37℃250转/分钟，摇菌14小时，将菌液送测序公司测序
[0045]
本发明的另一目的在于提供一种由所述牛cfl2基因腺病毒干扰载体构建的重组腺病毒的ad-cfl2 shrna。
[0046]
本发明对构建的重组腺病毒ad-cfl2 shrna进行鉴定，腺病毒ad-cfl2shrna侵染hek293a细胞48h，ad-cfl2 shrna-1和shrna-2对cfl2基因的干扰效率分别为：89.66％和40.86％。
[0047]
本发明将干扰效果较好的ad-cfl2 shrna-1侵染牛原代肌肉细胞，进行腺病毒的包装与扩繁。
[0048]
有益效果
[0049]
本发明提供一种牛cfl2基因腺病毒干扰载体及其构建和鉴定方法，可持续性敲低
肌型基因cfl2的表达。为后续研究cfl2基因与肌肉生长发育之间的分子调控机制提供有效的技术支撑，更具体的涉及在可为我国地方黄牛的遗传改良和高效育种提供新的分子标记和选育思路。
附图说明
[0050]
图1是本发明实施例提供的牛cfl2基因腺病毒干扰载体的构建方法流程图。
[0051]
图2是本发明实施例提供的pentr/cmv-gfp/u6腺病毒干扰载体图谱。
[0052]
图3是本发明实施例提供的构建成功的pentr/cmv-gfp/u6-shrna重组质粒载体菌液pcr电泳结果。
[0053]
图4是本发明实施例提供的pad/pl-dest骨架载体图谱。
[0054]
图5是本发明实施例提供ad-cfl2 shrna-1和shrna-2的干扰效率检测结果示意图。
[0055]
图6是本发明实施例提供的牛原代肌肉细胞图(100
×
)。
[0056]
图7是本发明实施例提供的高滴度病毒ad-cfl2 shrna-1侵染牛原代肌肉细胞示意图(200
×
)。
具体实施方式
[0057]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0058]
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0059]
实施例1
[0060]
本发明实施提供的牛cfl2基因腺病毒干扰载体的序列设计如下：
[0061]
根据genbank公布的cfl2基因的序列(nc_037348.1)和pentr/cmv-gfp/u6质粒图谱(图1)上分布的酶切位点，在上游引物5’端添加bamh i(ggatcc)酶切位点，下游引物5’端添加xho i(ctcgag)酶切位点，中间添加loop序列(gagtactg，loop序列两边反向互补)，末尾添加tttttt终止信号，同时添加连接所用的粘性末端(bamh i酶切位点上的g，xho i酶切位点上的c)，并设计阴性对照组引物。具体引物序列如下：
[0062]
牛cfl2 shrna-1的序列为seq id no：1(5
’‑3’
):
[0063]
shrna-1上游引物:gatccctgaaagtgcaccgttaaagagtactgtttaacggtgcactttcagttttttc(seq id no：1)
[0064]
shrna-1下游引物:
[0065]
tcgagaaaaaactgaaagtgcaccgttaaacagtactctttaacggtgcactttcagg(seq id no：2)
[0066]
牛cfl2 shrna-2的序列为seq id no：2(5
’‑3’
):
[0067]
shrna-2上游引物:
[0068]
gatccgctctaaagatgccattaagagtactgttaatggcatctttagagcttttttc(seq id no：3)
[0069]
shrna-2下游引物:
[0070]
agcttaaaaaagctctaaagatgccattaacagtactcttaatggcatctttagagcg(seq id no：4)
[0071]
阴性对照组引物序列(5
’‑3’
)：
[0072]
shrna-nc上游引物:
[0073]
gatccttctccgaacgtgtcacgtgagtactgacgtgacacgttcggagaattttttc(seq id no：5)
[0074]
shrna-nc下游引物:
[0075]
tcgagaaaaaattctccgaacgtgtcacgtcagtactcacgtgacacgttcggagaag(seq id no：6)
[0076]
如图1所示，本发明实施例提供的牛cfl2基因腺病毒干扰载体的构建方法包括以下步骤：
[0077]
(1)：载体用bamh i，xho i双酶切；
[0078]
(2)：酶切完成后胶回收；
[0079]
(3)：目的片断利用3’和5’的单链退火获得；
[0080]
(4)：处理好的目的片段与载体连接反应；
[0081]
(5)：转化感受态细胞dh5a；
[0082]
(6)：转化后的pentr/cmv-gfp/u6-shrna平板挑菌，37℃250rpm/min，摇菌14小时，将菌液送测序公司测序。
[0083]
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0084]
实施例1腺病毒载体pentr/cmv-gfp/u6-shrna的构建及验证
[0085]
首先用bamh i和xho i酶切载体，之后把目的序列插入u6启动子之后来调控其表达，该腺病毒载体中含有cmv启动子调控的gfp基因表达。具体如下：
[0086]
1.载体用bamh i和xho i双酶切，酶切体系如下。
[0087][0088]
双酶切程序：37℃，1小时
[0089]
2.酶切完成后胶回收，具体如下。
[0090]
(1)通过琼脂糖凝胶电泳(建议加入tae缓冲液)，尽可能将目的dna片段与其他片段分开，用干净的手术刀片段将含有目的dna片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重；
[0091]
(2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300～600μl(凝胶浓度：≤1％，300μl；》1％，≤1.5％，400μl；》1.5％，≤2％，500μl；》2％，600μl)的比例加入buffer b2；
[0092]
(3)将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；
[0093]
(4)将融化好的溶液全部移入吸附柱，8000
×
g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中(如果胶溶液总体积大于750μl，则每次使用700μl，多次上柱)；
[0094]
(5)向吸附柱中加入300μl的bufferb2，9000
×
g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0095]
(6)向吸附柱中加入500μl的washsolution，9000
×
g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中(此步骤重复一次)；
[0096]
(7)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000
×
g离心1min后；
[0097]
(8)将吸附柱插入一个新的1.5ml离心管，在吸附膜中央加入15～40μl的elutionbuffer，室温静置2～5min，9000
×
g离心1min，将所得的dna溶液置于-20℃保存或用于后续实验。
[0098]
3.目的片断利用3’和5’的单链退火获得：
[0099]
退火缓冲液(10
×
)：
[0100][0101]
退火体系：
[0102][0103]
退火程序：
[0104]
95℃10分钟
[0105]
自然冷却室温
[0106]-20℃保存
[0107]
4.处理好的目的片段与载体连接反应体系：
[0108][0109]
连接程序：16℃，过夜
[0110]
5.转化感受态细胞dh5a，具体步骤：
[0111]
(1)将感受态细胞置于冰上，取10μl的连接产物加入100μl的感受态细胞，混匀；
[0112]
(2)冰上放置30min；
[0113]
(3)将离心管放到42℃水浴中，热激90s(严格控制热激时间)；
[0114]
(4)迅速冰上冷却2min；
[0115]
(5)加入500μl液体lb培养基(不含抗生素)，37℃摇床培养1h；
[0116]
(6)3,000r/min离心2min；
[0117]
(7)吸去部分上清，剩余200μl混匀，一半用于涂板，另一半4℃储存备用；
[0118]
(8)100μl菌液涂布于含kana抗生素(25μg/ml)的固体lb培养基平板表面(平板已预热)；
[0119]
(9)37℃培养箱，正置培养30min，后倒置培养12-16h，待单菌落长出后，挑取单菌落，进行后续实验。
[0120]
6.转化后的pentr/cmv-gfp/u6-shrna平板挑菌，37℃250rpm/min，摇菌14小时，将菌液送测序。
[0121]
7.上述构建好的pentr/cmv-gfp/u6-shrna载体含干扰序列的片段，空载体pentr/cmv-gfp/u6(4639bp)不含干扰序列的片段，因此，在空载体酶切位点两端设计一对引物，如果shrna成功与载体连接，则会扩增到包含干扰序列的片段，其pcr扩增长度是254bp；如果shrna没有与载体连接，则扩增到不包含干扰序列的片段，其pcr扩增长度是219bp(图3)。
[0122]
用于cfl2基因pentr/cmv-gfp/u6-shrna载体验证的引物如下：
[0123][0124]
所述pcr反应体系为：
[0125][0126]
touchdown程序反应条件为：
[0127][0128]
实施例2重组腺病毒ad-cfl2 shrna腺病毒的生产实验流程
[0129]
1.重组腺病毒载体的包装
[0130]
待hek293a细胞生长密度达70％时，取重组腺病毒载体质粒pentr/cmv-gfp/u6-shrna及骨架质粒pad/pl-dest，用lipo 2000转染试剂进行转染。具体步骤为：
[0131]
a.转染前2小时更换完全培养基。取2ug重组腺病毒载体质粒pentr/cmv-gfp/u6-shrna，4ug骨架质粒pad/pl-dest。用300μl的dmem培养液进行稀释，室温放置5min。
[0132]
b.取15ul的lipo 2000，用300μl的dmem培养液进行稀释，室温放置5min。
[0133]
c.将两者混合，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％co2的培养箱中培养。
[0134]
d.转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。
[0135]
2.重组腺病毒ad-cfl2 shrna干扰效率检测
[0136]
侵染48h后观察绿色荧光表达情况，收集细胞提取总rna，反转录rna为cdna，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测cfl2基因的表达情况。
[0137]
所述目的基因cfl2和内参基因gapdh定量引物为：
[0138][0139][0140]
所述细胞rna的提取步骤如下：
[0141]
(1)收获细胞1
×
107～5
×
107个，移入1.5ml离心管中，1000r/m离心5min，弃上清。
[0142]
(2)加入1ml trizol，震荡混匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心10min。
[0143]
(3)弃脂肪层，转移上清至一新的1.5ml离心管(如果是细胞样品，则步骤2、3可省略)。
[0144]
(4)加入0.2ml的三氯甲烷(trizol体积的五分之一)，剧烈震荡15s，室温静置3min。
[0145]
(5)4℃，12000r/min，离心15min。
[0146]
(6)转移上清至一新的1.5ml离心管，加入与上清等体积的异丙醇。
[0147]
(7)轻轻颠倒混匀后，室温静置10min。
[0148]
(8)4℃，12000r/min，离心10min。
[0149]
(9)弃上清，加入1ml的75％乙醇，洗涤。
[0150]
(10)4℃，12000r/min，离心10min。
[0151]
(11)弃上清，室温干燥沉淀。
[0152]
(12)加入50μl的depc水溶解(可用65℃促溶10min～15min)，-80度保存备用。
[0153]
所述rna反转录cdna反应体系:
[0154][0155]
反应条件：42℃2min。
[0156]
上述反应液加入5
×
no rt control mix，4.0μl
[0157]
反应条件：50℃15min，85℃2min。
[0158]
所述qrt-pcr反应体系：
[0159]
[0160]
反应条件：
[0161][0162]
生物学统计：
[0163]
实验都是按照重复3次来完成的，以sybr green作为荧光标记物，在light cycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量，结果数据都是以平均值
±
标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p《0.05时具有统计学意义。
[0164]
实施例3重组腺病毒ad-cfl2 shrna的收毒和扩繁
[0165]
1.重组腺病毒载体的收毒(p1)：
[0166]
当牛原代肌肉细胞生长到80％左右时，对ad-cfl2 shrna-1和ad-cfl2shrna-2的侵染干扰效果进行对比，结果如图5所示，侵染干扰效率较好的为高滴度病毒ad-cfl2 shrna-1。转染后，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。
[0167]
打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为ad-cfl2shrna-1第一代毒种(p1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。
[0168]
所述牛原代肌肉细胞的培养步骤如下：
[0169]
(1)取90天左右的胎牛腿部肌肉于平皿，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，hank’s洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；
[0170]
(2)将剪碎的肌肉移至离心管，hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；
[0171]
(3)向上述离心管中加入0.25％胰酶，37℃水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；
[0172]
(4)反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；
[0173]
(5)弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经多聚赖氨酸(ppl)包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37℃培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4天换液，以后每天换液1次。
[0174]
上述转染步骤同实施例2
[0175]
2.重组腺病毒载体的扩繁：
[0176]
取第1代病毒pi感染牛原代肌肉细胞4～5次，即可获得4～5代高滴度的病毒液。具体步骤如下：
[0177]
收集含有已包装好的腺病毒第1代细胞悬液，-80℃与37℃反复冻融3次，1000r/min离心5min，收取上清病毒液，即为第代1病毒液。取第1代病毒原液0.5ml～1ml重新接种牛原代肌肉细胞(生长融合度为70％～80％左右)，待细胞完全病变时(约接种后3d～4d)按前述方法反复冻融细胞3次，离心收集病毒上清液,即为第2代病毒悬液。用第2代病毒悬液多次感染牛原代肌肉细胞，重复“感染-冻融-收集”，大量扩增ad-cfl2 shrna-1重组腺病毒。