一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基及培养方法

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基及培养方法。


背景技术：

2.人间充质干细胞从骨髓、脂肪和脐带等组织中获得，可在体外扩增并分化为成软骨细胞、成骨细胞等多个谱系。人间充质干细胞的应用不仅消除了伦理问题，而且为骨骼、软骨、肌肉和神经等组织的再生和修复提供了一种新方法。然而，干细胞在体内外不定向分化的特性可导致非所需细胞的形成，甚至存在一定的致瘤性，这对干细胞治疗骨缺损的临床应用带来了挑战。因此，需要在原有基础上进一步提升干细胞的定向成骨分化效率，从而缩短干细胞治疗周期，提高治疗效果。
3.传统的间充质干细胞成骨诱导方法通常联合使用化学诱导试剂，包括地塞米松，β甘油磷酸钠，维生素c。近年来，随着通过细胞培养基底，细胞外基质力学性能等物理因素调控干细胞命运的研究逐步深入，现已证明生物-力学耦合作用是调控干细胞命运的重要途经之一。尽管大量研究表明干细胞分化过程伴随着细胞力学性能的变化，然而通过调控细胞骨架力学性能影响干细胞分化行为的报道至今鲜见。


技术实现要素：

4.针对现阶段人间充质干细胞成骨分化效率低下的问题，本发明提供一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基及培养方法，使用细胞松弛素d调节分化过程中间充质干细胞骨架力学性能，从而进一步提升人间充质干细胞的成骨分化效率。
5.为此，本发明采用如下技术方案：一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基，所述培养基中包含细胞松弛素d。
6.进一步地，所述细胞松弛素d的浓度为50-5000ng/ml。
7.进一步地，所述培养基以α-mem培养基为基础。
8.进一步地，所述培养基中还包括地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素c、胎牛血清、青霉素/链霉素溶液及谷氨酰胺溶液。
9.进一步地，所述培养基中各成分的浓度为：地塞米松10-8-10-7
m，β甘油磷酸钠10-100 mm、维生素c 5-50 μg
•
ml-1
、胎牛血清10-20%v/v、青霉素/链霉素溶液0-1% v/v、谷氨酰胺溶液0-1% v/v。
10.一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养方法，包括前期培养基和后期培养基，前期培养基为上述的可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基，后期培养基为以α-mem为基础的培养基；前期培养基用于人间充质干细胞体外成骨诱导的基质分泌期，后期培养基用于体外成骨诱导的成骨矿化期。
11.进一步地，所述基质分泌期为14天，成骨矿化期为14-28天。
12.进一步地，所述后期培养基包括地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素c、胎牛血清、青霉素/链霉素溶液及谷氨酰胺溶液。
13.进一步地，所述后期培养基中各成分的浓度为：地塞米松10-8-10-7
m，β甘油磷酸钠10-100 mm、维生素c 5-50 μg
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ml-1
、胎牛血清10-20% v/v、青霉素/链霉素溶液0-1% v/v，谷氨酰胺溶液0-1% v/v。
14.一、人间充质干细胞成骨分化过程中粘弹性力学性能的变化研究为了明确人间充质干细胞成骨分化过程中粘弹性力学性质的变化趋势，使用原子力显微镜在成骨分化第0，7，14，21，28天检测细胞蠕变柔量及流变系数。将3-8代的人间充质干细胞进行体外培养，待细胞融合程度达到80%后，将培养基更换为α-mem基础培养基包含终浓度为10-8
m的地塞米松，10mm的β甘油磷酸钠，5μg
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ml-1
的维生素c，10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素溶液，1%l-谷氨酰胺的成骨诱导培养基，分别在第0，7，14，21，28天检测细胞蠕变柔量。图1为间充质干细胞成骨分化过程中蠕变柔量和流变系数的变化趋势，在这里蠕变柔量反映了细胞的软度，流变系数描述了细胞的流动性。该结果显示，在间充质干细胞成骨分化过程中，细胞的粘弹性力学性能呈现早期变软后期硬化的趋势。
15.二、细胞松弛素d对间充质干细胞生物学行为及粘弹性力学性质的影响使用细胞松弛素d调控细胞成骨分化过程中细胞骨架粘弹性力学性质。使用终浓度为50ng/ml的细胞松弛素d与人间充质干细胞共培养4天，随后使用cck8检测细胞松弛素d对间充质干细胞增殖的影响。图2为不同浓度的细胞松弛素d对间充质干细胞增殖及粘弹性力学性质的影响，该结果显示，50ng/ml的细胞松弛素d可以在不严重影响间充质干细胞增殖活性的前提下显著增大细胞的蠕变柔量及流变系数。
16.三、生物力学启发的人间充质干细胞阶段式成骨诱导培养基于人间充质干细胞成骨分化过程中细胞蠕变柔量先增后降的变化趋势，在成骨分化前期，使用含有细胞松弛素d的前期培养基培养基继续增大细胞蠕变柔量和流变系数，在成骨分化后期使用后期培养基培养基保持细胞及细胞外基质的矿化。图3，4为本发明所述的阶段式成骨诱导培养基提高人间充质干细胞成骨分化效率的茜素红染色图，碱性磷酸酶活性图，成骨相关基因及蛋白（col1a1, ocn）表达图。该图结果显示，本发明所述的阶段式成骨诱导培养基较传统成骨诱导培养基可以显著促进间充质干细胞成骨分化。
17.一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基，是以α-mem作为基础培养基，最终包含终浓度为10-8
m的地塞米松，10mm的β甘油磷酸钠，5μg
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ml-1
的维生素c，50ng/ml的细胞松弛素d，10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素溶液，1%l-谷氨酰胺溶液。
18.一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养方法，包括前期培养基和后期培养基，前期培养基为上述的可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养基，后期培养基为以α-mem为基础的培养基，最终包含终浓度为10-8
m的地塞米松，10mm的β甘油磷酸钠，5μg
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ml-1的维生素c，10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素溶液，1%l-谷氨酰胺溶液。
19.前期培养基用于成骨诱导的前14天，后期培养基用于成骨诱导的14-28天。
20.本发明的有益效果在于：1.诱导人间充质干细胞成骨分化效果良好。骨髓来源的人间充质干细胞经过产品的28天阶段式诱导后，茜素红染色结果，成骨相关基因，蛋白的表达均较对照组明显上调，
证明了产品的有效性。
21.2.制备简单。前期培养基培养基只需在传统的成骨诱导培养基中添加细胞松弛素d，使得细胞松弛素d终浓度为50ng/ml即可制得；后期培养基培养基即为传统的成骨诱导培养基。
22.3.本发明使用的细胞松弛素d具有用量极少，低细胞毒性，低成本的优点。
附图说明
23.图1为人间充质干细胞成骨分化过程中蠕变柔量及流变系数的变化趋势图；图2为不同浓度细胞松弛素d对人间充质干细胞增殖及粘弹性力学性质的影响图；图3为本发明所述的诱导培养基提高人间充质干细胞成骨分化效率的茜素红染色图及碱性磷酸酶活性图；图4为本发明所述的诱导培养基提高人间充质干细胞成骨分化效率的成骨相关基因及蛋白（col1a1, ocn）表达图。
具体实施方式
24.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但所述举例并不限制本发明所保护的内容。
25.1.人间充质干细胞粘弹性力学性质的测试骨髓间充质干细胞购置于cyagen公司，复苏后培养于包含10％胎牛血清，1%青霉素/链霉素，1%l-谷氨酰胺的α-mem培养基中，置于37℃，5％co2的孵育箱内培养，取3-8代间充质干细胞进行实验。待上述间充质细胞生长至对数期且有80％以上融合后；培养于包含10-8
m的地塞米松，10mm的β甘油磷酸钠，5μg
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ml-1
的维生素c，10％胎牛血清，1%青霉素/链霉素，1%l-谷氨酰胺的α-mem培养基中进行成骨分化。使用原子力显微镜（nanowizard iii bioscience, jpk, germany）在成骨分化第0，7，14，21，28天对细胞进行蠕变实验。实验采用三角形的氮化硅悬臂，弹性系数0.01n/m, 针尖为直径4.5μm的聚苯乙烯小球（novascan, usa）。对于单个贴壁细胞，在细胞核区域进行测量，加载速度设置为5μm/s, 待悬臂偏折力达到1nn后，保持该力大小不变10s, 最后以1μm/s 的速度卸载。使用power-law模型进行数据处理，对力保持不变阶段的细胞蠕变变形进行分析，从而获得细胞的蠕变柔量与流变系数。
26.图1结果显示随着间充质干细胞成骨分化的进行，细胞的蠕变柔量和流变系数呈现先增大后减小的趋势，其在成骨分化第21天出现峰值。这说明在间充质干细胞成骨分化过程中，细胞呈现先软后硬的变化趋势。
27.2.细胞松弛素d使用浓度的的确定以5000/cm2的密度接种人间充质干细胞，使用含有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素溶液，1%l-谷氨酰胺溶液的α-mem基础培养基进行，同时分别将50ng/ml，500ng/ml，5000ng/ml终浓度的细胞松弛素d加入培养体系，使用常规培养液做对照，期间隔日换液。在第四天时使用cck8检测各组细胞增殖活性。图2结果显示，50ng/ml的细胞松弛素d相较于500ng/ml与5000ng/ml组对细胞活性的抑制程度更低，同时使用50ng/ml的细胞松弛素d可以显著增大细胞蠕变柔量，这说明50ng/ml的细胞松弛素d在低毒性的同时可以显著软化细
胞，该浓度适用于后续研究。
28.3.本发明成骨培养基的制备：人间充质干细胞在成骨分化过程中粘弹性力学性质呈现“先软后硬”的变化，基于细胞的生物力学变化趋势，本发明设计了阶段式诱导策略，将原有的成骨培养基拆分为成骨前期培养基和成骨后期培养基，其中前期培养基：在500ml的α-mem基础培养基（hyclone，美国）中加入体积比10％胎牛血清（hyclone，美国），1%青霉素/链霉素溶液（hyclone，美国），1%l-谷氨酰胺溶液（hyclone，美国），随后加入地塞米松（sigma，美国），β甘油磷酸钠（sigma，美国），维生素c（sigma，美国），细胞松弛素d（sigma，美国），使得终浓度为：地塞米松浓度10-8
m，β甘油磷酸钠浓度10mm，维生素c浓度5μg
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ml-1
，细胞松弛素d浓度50ng/ml；后期培养基：在500ml的α-mem基础培养基中加入体积比10％胎牛血清，1%青霉素/链霉素溶液，1%l-谷氨酰胺溶液，随后加入地塞米松，β甘油磷酸钠，维生素c，使得终浓度为：地塞米松浓度10-8
m，β甘油磷酸钠浓度10mm，维生素c浓度5μg
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ml-1
。
29.本发明一种可提高人间充质干细胞成骨分化效率的培养方法，具体如下：待人间充质细胞生长至对数期且有80％以上融合后，将细胞培养条件更换为前期培养基，每隔两天更换一次新鲜的前期培养基。在成骨分化进行第14天时，将前期培养基更换为后期培养基，每隔两天更换一次新鲜的后期培养基，至第28天结束成骨诱导，使用传统的成骨培养基作为对照。
30.在成骨分化第0，7，14，21，28天，分别对成骨分化过程中的碱性磷酸酶活性，矿化结节，成骨相关基因及蛋白col1a1, ocn的表达进行检测，分别采用碱性磷酸酶试剂盒（南京建成，中国），茜素红染色（索莱宝，北京），实时定量pcr及western blot技术进行检测。由图3，4可见（标尺100μm），采用本发明所述的成骨诱导培养液可以显著提升茜素红染色效果，同时显著促进成骨相关基因及蛋白col1a1和ocn在人间充质干细胞在成骨分化后期的表达，以上结果说明，本发明可以显著提升人间充质干细胞成骨分化效率，该结果预示本发明可用于干细胞治疗骨组织再生和修复。
31.需要说明的是，以上仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。