一株根瘤菌属菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域中一株根瘤菌属菌株及其应用。


背景技术：

2.纤维素酶是一类能将纤维素水解为低聚葡萄糖及葡萄糖的酶，很多自然界微生物均含有纤维素酶。纤维素酶可以广泛应用于纺织、造纸、食品及生物燃料等工业。然而，在纤维素酶水解的过程中，产生的大量纤维二糖及寡糖会强烈抑制纤维素酶的活性，导致纤维素水解效率的急剧下降。β-葡萄糖苷酶可以高效催化纤维二糖及寡糖转化为葡萄糖，会解除产物抑制，从而保证整个水解过程连续而稳定。苯酚是炼焦、炼油、医药、农药等行业生产的原料或中间体，含酚废水的排放导致水体污染并严重威胁人类的健康，开发能降解苯酚的功能微生物具有重要价值。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是开发具有β-葡萄糖苷酶活性并具有降解苯酚功能的微生物。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1。
5.本发明所提供的根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.23976。该菌株已于2021年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。下文简称根瘤菌xs-1。
6.根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1来源于江苏宿迁水样，为革兰氏阴性菌，且菌株形态呈棒状，在lb固体培养基划线培养72小时后，菌株呈规则圆形，黄色。根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1的16s rdna具有核苷酸是序列表中序列1的片段，其reca基因具有核苷酸是序列表中序列2所示的片段，atpd基因具有核苷酸是序列表中序列3的片段。
7.根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
8.u1、根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物在生产β-葡萄糖苷酶中的应用或在制备生产β-葡萄糖苷酶的产品中的应用；
9.u2、根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物在降解苯酚中的应用或在制备降解苯酚的产品中的应用；
10.u3、根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物在处理污水中的应用或在制备处理污水的产品中的应用。
11.为了解决以上技术问题，本发明还提供了产品，本发明所提供的产品含有根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物。
12.所述产品可为菌剂或含有所述菌剂的微生态制剂。
13.所述产品具体可为下述任一种产品：
14.v1、生产β-葡萄糖苷酶的产品；
15.v2、降解苯酚的产品；
16.v3、处理污水的产品。
17.上述产品的活性成分可为根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物，上述产品的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述产品的其他活性成分本领域技术人员可根据产品的效果确定。
18.所述产品还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述产品中，根瘤菌xs-1或/和根瘤菌xs-1的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述产品的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
19.根据需要，所述产品中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
20.上述产品的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
21.x1、所述的产品在生产β-葡萄糖苷酶中的应用；
22.x2、所述的产品在降解苯酚中的应用；
23.x3、所述的产品在处理污水中的应用。
24.上文中，所述根瘤菌xs-1的代谢物可为根瘤菌xs-1的发酵液。根瘤菌xs-1的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养根瘤菌xs-1，收集发酵液(含有根瘤菌xs-1和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为根瘤菌xs-1的代谢物。
25.根瘤菌xs-1的培养物也属于本发明的保护范围。根瘤菌xs-1的培养物是将根瘤菌xs-1在微生物培养基中培养得到的物质(如含有根瘤菌xs-1和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有根瘤菌xs-1和分泌到固体培养基内的物质)。
26.上述根瘤菌xs-1的培养物具有下述w1-w3的至少一种功能：
27.w1、生产β-葡萄糖苷酶；
28.w2、降解苯酚；
29.w3、处理污水。
30.培养所述的根瘤菌xs-1的方法也属于本发明的保护范围。
31.本发明所提供的培养所述的根瘤菌xs-1的方法包括将所述根瘤菌xs-1在培养基中培养的步骤。
32.制备所述产品的方法也属于本发明的保护范围。
33.本发明所提供的制备所述产品的方法，包括将所述根瘤菌xs-1和/或所述根瘤菌xs-1的代谢物作为产品的成分，得到所述产品的步骤。
34.上述方法中，所述产品可为菌剂。所述菌剂可为固体菌剂或液体菌剂。
35.上述方法中，所述根瘤菌xs-1可在发酵培养基中培养，得到发酵液，将发酵液与载体混合，得到所述液体菌剂。
36.实验证明，本发明的根瘤菌xs-1不仅具有β-葡萄糖苷酶活性，还能够水解苯酚，能
处理污水，可用于环境治理。本发明的根瘤菌xs-1耐盐耐低氧：本发明的根瘤菌xs-1能够在10％氯化钠溶液下生长且能在厌氧下生长。根瘤菌xs-1对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单、容易保存，适合开发应用。
37.保藏说明
38.生物材料的的分类命名：根瘤菌
39.生物材料的的拉丁文学名：rhizobium sp.
40.生物材料的菌株编号：xs-1
41.保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
42.保藏单位简称：cgmcc
43.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
44.保藏日期：2021年11月25日
45.保藏编号：cgmcc no.23976
附图说明
46.图1为菌株xs-1的系统发育树。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
49.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
50.下述实施例中lb液体培养基的配制方法为(以1l为例)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，溶解于去离子水中定容至1l，调ph值为7-8，121℃下高压湿热灭菌20min。
51.下述实施例中lb固体培养基的配制方法为(以1l为例)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂10g，溶解于去离子水中定容至1l，调ph值为7-8，121℃下高压湿热灭菌20min。
52.实施例1
53.一、根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1cgmcc no.23976的分离鉴定
54.根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1cgmcc no.23976于2020年7月分离自江苏宿迁水样。
55.xs-1为革兰氏阴性菌，在lb固体培养基上培养72小时后形成圆形规则黄色菌落。将活化的xs-1接种在lb液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养72h。取1ml新鲜培养的xs-1菌液在4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2ml离心管中，采用dna提取试剂盒提取dna。电泳检测后，采用通用引物8f和1492r，以上述提取的dna为模版进行pcr扩增，检测16s rdna：
56.8f：5
’‑
agagtttgatcctggctca-3’57.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’58.菌株xs-1的16s rdna具有序列表中序列1的核苷酸序列。经过比对后xs-1属于根瘤菌属(rhizobium)，构建系统发育树(如图1)。
59.xs-1在不同盐浓度下的生长：在不含氯化钠的lb液体培养基添加不同浓度的氯化
钠，使氯化钠浓度分别为0、1％、5％、10％和15％(即150g/l)，接入1％(v/v)的新鲜xs-1菌液，30℃、150rpm振荡培养2d测定od
600
值分别为3.02、3.75、3.13、2.55和0.11。说明xs-1能够在10％氯化钠下生长。
60.xs-1在厌氧中的生长：在lb液体培养基中接入1％(v/v)的新鲜xs-1菌液，然后使用融化的凡士林进行密封，30℃静置培养，7d后在培养基底部形成明显的菌膜。说明xs-1能够在厌氧下生长。
61.xs-1与相似性最高的菌株rhizobium tarimense的生理生化特征比较如表1所示：rhizobium tarimense最高只能在3％氯化钠下生长且在厌氧下不生长，而xs-1能够在10％氯化钠下生长且能在厌氧下生长。
62.表1生理生化特征比较
63.菌株菌落颜色10％氯化钠生长厌氧生长rhizobium tarimense白色
‑‑
xs-1黄色++
64.使用引物reca-41f和reca-640r扩增基因reca：
65.reca-41f：5
’‑
ttcggcaagggmtcgrtsatg-3’；
66.reca-640r：5
’‑
acatsacrccgatcttcatgc-3’。
67.使用引物atpd-255f和atpd-782r扩增基因atpd：
68.atpd-255f：5
’‑
gctsggccgcatcmtsaacgtc-3’；
69.atpd-782r：5
’‑
gccgacacttcmgaaccngccg-3’。
70.xs-1的基因reca(见序列表中序列2)与rhizobium tarimense的基因reca相比较相似性只有94.42％，xs-1的基因atpd(见序列表中序列3)与rhizobium tarimense的基因atpd相比较相似性只有93.44％。
71.因此综上显示xs-1是一株rhizobium属新发现新种。根瘤菌(rhizobium sp.)xs-1已于2021年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.23976。下文简称根瘤菌xs-1。
72.实施例2、根瘤菌xs-1的β-葡萄糖苷酶活性
73.本实施例中所用的固体培养基a配制方法如下：以lb液体培养基为基础培养基，向础培养基中添加七叶苷、柠檬酸高铁铵和琼脂得到的培养基，该培养基中七叶苷的含量为0.05％(m/v)，柠檬酸高铁铵的含量为0.25％(m/v)，琼脂的含量为1.5％(m/v)。
74.将活化的xs-1接种在lb液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取2μl新鲜菌液点接在上述固体培养基a上，30℃静置培养48h，结果显示xs-1菌落周围出现明显的黑色沉淀圈，黑色沉淀圈与菌落的圈径比为17/8＝2.12，说明菌株xs-1具有较好的β-葡萄糖苷酶活性。
75.实施例3、根瘤菌xs-1降解苯酚功能检测
76.本实施例中所用的高盐苯酚培养基配制方法如下(以1l为例)：蛋白胨5g、酵母粉1g、氯化钠100g、苯酚0.2g，溶解于水中定容至1l，115℃灭菌20min。
77.将活化的xs-1接种在lb液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体然后用等体积的无菌水悬浮成菌悬液，得到xs-1菌悬
液。
78.接菌培养液处理：按5％(v/v)的体积比将xs-1菌悬液接种在装有50ml高盐苯酚培养基的100ml三角瓶中，30℃、150rpm振荡培养3d得到接菌培养液。设置3个重复，每个重复1个三角瓶。
79.不接菌对照处理：按5％(v/v)的体积比将无菌水接种在装有50ml高盐苯酚培养基的100ml三角瓶中，30℃、150rpm振荡培养3d得到接菌培养液。设置3个重复，每个重复1个三角瓶。
80.使用紫外分光光度法测定接菌培养液和未接菌对照的苯酚含量，具体方法如下：由于苯酚在270nm处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯酚的含量成正比。将蛋白胨5g、酵母粉1g、氯化钠100g、苯酚0.2g，溶解于水中定容至1l配成苯酚含量是200mg/l的溶液，然后依次稀释4、8、16、32、64倍，对应的苯酚含量分别是50、25、12.5、6.25、3.125mg/l，分别测定在270nm下的吸光度oda值。同时将蛋白胨5g、酵母粉1g、氯化钠100g，溶解于水中定容至1l也同样依次稀释4、8、16、32、64倍测定在270nm下的空白吸光度odb值。以苯酚含量50、25、12.5、6.25、3.125mg/l为横坐标，以吸光度oda值和odb值的相减的差值为纵坐标，过零点绘制标准曲线。苯酚购自国药集团化学试剂有限公司。同样的将接菌培养液和不接菌培养液稀释16倍后测定吸光度，扣除对应稀释倍数下的空白吸光度后计算其中的苯酚含量，并计算苯酚降解率：
81.苯酚降解率＝(不接菌对照苯酚浓度-接菌培养液苯酚浓度)/不接菌对照苯酚浓度
×
100％
82.分别测定接菌培养液和不接菌培养液中的苯酚含量是68.97mg/l和196.24mg/l，计算得到接菌培养液的苯酚降解率为64.85％。
83.综上，根瘤菌xs-1具有较好的β-葡萄糖苷酶活性，并能有效降解苯酚，可用于处理水体污染。
84.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。