调控玉米叶片衰老的主效QTL及其分子标记和应用

调控玉米叶片衰老的主效qtl及其分子标记和应用
1.该申请为申请号为“2020111152910”，发明名称为“两个调控玉米叶片衰老的主效qtl及其分子标记和应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及调控玉米叶片衰老的主效qtl及其分子标记和应用，属于分子遗传育种领域。


背景技术：

3.在叶片发育的最后阶段，衰老是养分转移的一个重要过程，对保证作物产量起着至关重要的作用。叶片衰老的起始与叶龄相关(jing,h.c.,hille,j.,dijkwel,p.p.,ageing in plants:conserved strategies and novel pathways.plant biology,2003,5,455-464)，除此之外，各种生物或非生物胁迫，如病原菌侵染、干旱胁迫和黑暗胁迫也能诱导叶片衰老(guo,y.,gan,s.s.,convergence and divergence in gene expression profiles induced by leaf senescence and 27senescence-promoting hormonal,pathological and environmental stress treatments.plant cell and environment,2012,35,644-655)。这一过程中伴随着许多生理生化和分子水平的变化，如叶绿素的降解，光合膜系统的破坏，源库关系的改变和成千上万的衰老相关基因(senescence-associated genes,sags)的表达。适时延缓叶片衰老是延长叶片功能期、提高作物产量的有效手段。已有研究发现，延缓叶片衰老可以使玉米平均增产0.29吨/公顷(zhang j.,fengler k.a.,van hemert j.l.,gupta,r.,mongar,n.,sun,j.,allen,w.b.,wang,y.,weers,b.,mo,h.,lafitte,r.,hou,z.,bryant,a.,ibraheem,f.,arp,j.,swaminathan,k.,moose,s.p.,li,b.,shen,b.,identification and characterization of a novel stay-green qtl that increases yield in maize.plant biotechnology journal,2019,17,2272-2285)，水稻平均增产10％(mao,c.,lu,s.,lv,b.,zhang,b.,shen,j.,he,j.,luo,l.,xi,d.,chen,x.,ming,f.,a rice nac transcription factor promotes leaf senescence via ababiosynthesis.plant physiology,2017,174,1747-1763)，小麦平均增产6-28％(christopher,j.t.,manschadi,a.m.,hammer,g.l.,borrell,a.k.,developmental and physiological traits associated with high yield and stay-green phenotype in wheat.australian journal of agricultural research,2008,59,354-364)。因此，阐明叶片衰老的分子机制对作物育种具有重要意义。
4.玉米(zea mays)是我国的主要粮食作物，也是重要的工业原料和饲料来源。极端天气的频发，诱发叶片早衰或死亡，造成减产乃至绝产。因此，培育衰老延缓的玉米种质是稳产的重要保障。测序技术和分子标记辅助育种技术的发展，为深入挖掘控制玉米叶片衰老的主效qtl及其应用奠定了基础。
5.到目前为止，通过构建多种类型的遗传群体(重组自交系群体、回交群体和双单倍体群体等)和开发多种分子标记，研究者已在玉米的10条染色体上定位到268个叶片衰老相
关的主效qtl，这些位点能够解释0.47-24.32％的叶片衰老表型变异(almeida,g.d.,nair,s.,borem,a.,cairns,j.,trachsel,s.,ribaut,j.m.,banziger,m.,prasanna,b.m.,crossa,j.,babu,r.,molecular mapping across three populations reveals a qtl hotspot region on chromosome 3for secondary traits associated with drought tolerance in tropical maize.molecular breeding,2014,34,701-715；beavis,w.d.,smith,o.s.,grant,d.,fincher,r.,identification of quantitative trait loci using a small sample of topcrossed and f
4 progeny from maize.crop science,1994,34,882-896；bel
í
cuas,p.r.,aguiar,a.m.,bento,d.a.v.,t.m.m.,de souza junior,c.l.,inheritance of the stay-green trait in tropical maize.euphytica,2014,198,163-173；khanal,r.,navabi,a.,lukens,l.,linkage map construction and quantitative trait loci(qtl)mapping using intermated vs.selfed recombinant inbred maize line(zea mays l.).canadian journal of plant science,2015,95,1133-1144；messmer,r.,fracheboud,y.,m.,stamp,p.,ribaut,j.m.,drought stress and tropical maize:qtls for leaf greenness,plant senescence,and root capacitance.field crops research,2011,124,93-103；trachsel,s.,sun,d.,sanvicente,f.m.,zheng,h.,atlin,g.n.,suarez,e.a.,babu,r.,zhang,x.,identification of qtl for early vigor and stay-green conferringtolerance to drought in two connected advanced backcross populations in tropical maize(zea mays l.).plos one,2016,11,e0149636；wang,a.,li,y.,zhang,c.,qtl mapping for stay-green inmaize(zea mays).canadian journal of plant science,2012,92,249-256；yang,z.,li,x.,zhang,n.,wang,x.,zhang,y.,ding,y.,kuai,b,huang,x.,mapping and validation of the quantitative trait loci for leaf stay-green-associated parameters in maize.plant breeding,2017,136,188-196；zheng,h.j.,wu,a.z.,zheng,c.c.,wang,y.f.,cai,r.,shen,x.f.,xu,r.r.,liu,p.,kong,l.j.,dong,s.t.,qtl mapping of maize(zea mays)stay-green traits and their relationship to yield.plant breeding,2009,128,54-62)。可见分子标记对于从分子水平上研究玉米叶片衰老特性具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是，提供两种与玉米叶片衰老主效qtl位点连锁的分子标记。
7.本发明的另一个目的是提供与玉米叶片衰老主效qtl连锁的分子标记的应用。
8.扩增玉米叶片衰老主效位点stg3和stg7连锁的分子标记的引物对，其中：
9.m36的正向引物1序列为seq id no.1，正向引物2序列为seq id no.2，反向引物序列为seq id no.3；
10.a-3-11的正向引物1序列为seq id no.4，正向引物2序列为seq id no.5，反向引物序列为seq id no.6；
11.a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8；
12.a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10。
13.与玉米叶片衰老主效位点stg3和stg7连锁的分子标记，其特征在于，所述主效
stg3位点位于玉米第3号染色体上，并且与所述主效stg3位点连锁的分子标记为m36和a-3-11；所述主效stg7位点位于玉米第7号染色体上，并且与所述主效stg7位点连锁的分子标记为a-7-6和a-7-7；各分子标记扩增的特异性引物序列如下：
14.m36的正向引物1的序列为seq id no.1，正向引物2的序列为seq id no.2，反向引物的序列为seq id no.3，在持绿株系中分子标记扩增产物碱基为g；
15.a-3-11的正向引物1的序列为seq id no.4，正向引物2的序列为seq id no.5，反向引物的序列为seq id no.6，在持绿株系中分子标记扩增产物碱基为a；
16.a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8，在持绿株系中分子标记扩增产物为145bp的dna片段；
17.a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10，在持绿株系中分子标记扩增产物为144bp的dna片段。
18.所述持绿株系为si-144以及持绿株系si-144与衰老株系si-287构建的近等基因系nil-stg3
si-144
、nil-stg7
si-144
和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
。
19.本发明是通过以下技术方案实现的：
20.两种与玉米叶片衰老主效qtl(stg3和stg7)连锁的分子标记，所述主效位点stg3和stg7分别位于玉米的第3号染色体和第7号染色体上，在叶片早衰株系si-287和叶片持绿株系si-144构建的f2群体中，stg3和stg7对衰老表型的贡献率分别为7.40％和8.41％。并且，与所述主效位点stg3和stg7连锁的分子标记分别为m36、a-3-11(stg3)和a-7-6、a-7-7(stg7)，各分子标记引物序列及其在持绿株系si-144中扩增的目的条带长度或碱基如下：
21.m36的正向引物1的序列为seq id no.1，正向引物2的序列为seq id no.2，反向引物的序列为seq id no.3，在持绿株系si-144中可检测到的碱基为g；
22.a-3-11的正向引物1的序列为seq id no.4，正向引物2的序列为seq id no.5，反向引物的序列为seq id no.6，在持绿株系si-144中可检测到的碱基为a；
23.a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8，在持绿株系si-144中可扩增出条带大小为145bp的dna片段；
24.a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10，在持绿株系si-144中可扩增出条带大小为144bp的dna片段。
25.与玉米叶片衰老主效位点stg3和stg7连锁的分子标记的应用，包括：
26.(1)在定位玉米叶片衰老主效位点stg3和stg7中的应用；
27.(2)在鉴定玉米叶片衰老性状中的应用；
28.(3)在筛选和鉴定玉米衰老延缓株系中的应用。
29.所述的应用，提取玉米基因组dna，采用下述引物对进行扩增，所述引物对为m36的正向引物1序列为seq id no.1，正向引物2序列为seq id no.2，反向引物序列为seq id no.3；或者
30.a-3-11的正向引物1序列为seq id no.4，正向引物2序列为seq id no.5，反向引物序列为seq id no.6；或者
31.a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8；或者
32.a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10；
33.其中：m36的正向引物1的序列为seq id no.1，正向引物2的序列为seq id no.2，
反向引物的序列为seq id no.3，在持绿株系中分子标记扩增产物碱基为g；表明该玉米叶片衰老主效位点stg3
si-144
等位基因的存在，该株系具有玉米叶片衰老延缓性状，该株系为玉米叶片衰老延缓株系；
34.a-3-11的正向引物1的序列为seq id no.4，正向引物2的序列为seq id no.5，反向引物的序列为seq id no.6，在持绿株系中分子标记扩增产物碱基为a；表明该玉米叶片衰老主效位点stg3
si-144
等位基因的存在，该株系具有玉米叶片衰老延缓性状，该株系为玉米叶片衰老延缓株系；
35.a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8，在持绿株系中分子标记扩增产物为145bp的dna片段；表明该玉米叶片衰老主效位点stg7
si-144
等位基因的存在，该株系具有玉米叶片衰老延缓性状，该株系为玉米叶片衰老延缓株系；
36.a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10，在持绿株系中分子标记扩增产物为144bp的dna片段；表明该玉米叶片衰老主效位点stg7
si-144
等位基因的存在，该株系具有玉米叶片衰老延缓性状，该株系为玉米叶片衰老延缓株系。
37.具体地，本发明提供的分子标记，通过以下方法获得：
38.(1)以玉米早衰品种si-287为母本，持绿品种si-144为父本构建杂交群体，得到杂交f1代。f1进一步自交得到由207个单株组成的f2群体，在30dap(days after pollination)时，调查并统计各单株的叶片黄化面积，并使用101个在双亲间具有多态性的kasp标记对各单株的基因型进行检测。将获得的基因型和表型数据导入qtl icimapping软件进行qtl分析，获得了两个主效位点，它们分别位于玉米的第3号(stg3)和第7号(stg7)染色体上，对表型的解释率(pve)分别为7.40％和8.41％，lod值分别为3.40和4.04。
39.(2)在f2中选取持绿单株作为父本，以si-287作为轮回亲本连续杂交三代，并自交1代后获得bc3f2群体。2015年夏在北京种植该群体并调查叶片衰老表型，根据表型选取极端持绿的单株30个，极端衰老的单株30个，提取基因组dna进行qtl-seq分析。结果表明，第3号染色体和第7号染色体上分别存在一个主效qtl，它们分别位于对应染色体上的145.66-161.01mb和167.12-170.68mb区间，该结果进一步验证了qtl mapping得到的两个位点stg3和stg7。
40.(3)为了进一步缩小候选区间，我们接着种植了bc3f3和bc3f4群体，同样的在30dap时对群体的叶片衰老表型进行调查和统计，并使用新开发的在双亲间具有多态性的分子标记30个对目标区段进行精细定位，最终确定的候选区间分别为5.86mb(stg3)和380kb(stg7)，确定与叶片衰老主效qtl连锁的分子标记分别为m36、a-3-11(stg3)和a-7-6、a-7-7(stg7)。
41.本发明的有益效果是：
42.(1)本发明定位的两个叶片衰老qtl(stg3和stg7)分别位于玉米的第3号和第7号染色体上，与其连锁的分子标记的物理距离分别为5.86mb和380kb。这为今后进一步定位叶片衰老相关基因以及利用其进行分子标记辅助选择衰老延缓的玉米品种奠定了基础。
43.(2)本发明利用f2群体(si-287
×
si-144)对玉米叶片衰老相关qtl进行分析，发现两个主效qtl，分别为stg3和stg7，主效位点stg3能够解释7.40％的表型变异，主效位点stg7能够解释8.41％的表型变异。
44.(3)本发明所述分子标记在筛选或鉴定衰老延缓玉米株系、克隆或进一步精细定
位qtl中包含的衰老相关基因中具有重要应用价值。本发明可以应用于分子标记辅助育种，可以对玉米种质进行早代筛选，克服环境影响，提高育种和选择效率。
附图说明
45.图1为叶片衰老两个主效qtl的定位；其中，
46.a图是叶片衰老候选位点鉴定的群体构建过程示意图。主要是以si-287作为轮回亲本构建回交群体；
47.b图是f2群体叶片衰老表型的频率分布图；
48.c图是叶片衰老调控位点stg3的鉴定。pve代表f2群体中通过传统的qtl定位得到的候选位点对表型变异的解释率，qtl-seq的delta snp指数图进一步将stg3定位在第3号染色体(chr3)上的145.66-161.01mb区域，利用分子标记对定位群体进行连锁分析，将该候选区域定位在标记m36和a-3-11之间；
49.d图是叶片衰老调控位点stg7的鉴定。qtl-seq的delta snp指数图进一步将stg7确定在第7号染色体(chr7)上的167.12-170.68mb的区域，利用分子标记对定位群体进行连锁分析，将该位点定位在a-7-6和a-7-7之间的区域。
50.图2通过stg3和stg7的置换系得到的jidan27的改良系的田间表现；其中，
51.a图表示与正常浇水条件相比，干旱处理条件下各株系的叶片持绿度下降比例；
52.b图表示与正常浇水条件相比，干旱处理条件下各株系的穗重下降比例。
具体实施方式
53.以下结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明为技术前提下进行实施，给出了详细的实施过程和方法。但本发明的保护范围不限于该实施例。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
54.下述实施例中所使用的生物材料均为市售。
55.实施例1玉米叶片衰老主效qtl紧密连锁的分子标记的确定方法
56.以衰老玉米材料si-287为母本，持绿玉米材料si-144为父本杂交，在f2代选取持绿单株作为父本，si-287作为母本连续回交三代，产生bc3f1，再自交一代获得bc3f2，表型及基因型鉴定后自交产生bc3f3和bc3f4群体(图1)。
57.为了记录和计算叶片衰老的表型，我们将玉米叶片衰老程度(ydl)分为0、25％、50％、75％和100％五个等级。记录叶片数(ln)，每个家系统计3个以上的个体。然后计算叶片的持绿度(rgl):rgl＝1-(total ydl)/ln。
58.f2代的qtl定位使用qtl icimapping软件进行，利用完备区间作图法(inclusive composite interval mapping，icim)，在p＝0.05的显著性水平下，通过1000次排列检验确定每个位点的lod阈值。分析发现，在第3号和第7号染色体上分别存在一个候选位点，其lod值分别为3.40和4.04，分别解释的遗传变异为7.40％和8.41％(图1)。
59.为了进一步验证这两个候选位点，在bc3f2代，我们选取了极端表型(衰老和持绿)的个体各30株，利用ctab法提取基因组dna并进行混池测序(衰老dna池c1和持绿dna池c2)，将测序得到的高质量reads比对到参考基因组上，提取snp变异数据并计算snp-index，去除测序深度小于7，snp-index小于0.3的位点，最终得到4817475个变异位点，所有位点的
△
(snp-index)通过以下公式计算：
△
(snp-index)＝snp-index(c2)
–
snp-index(c1)。在99％的显著性水平下，分别在第3号(145.66-161.01mb)和第7号(167.12-170.68mb)染色体上检测到主效qtl，它们与qtl mapping得到的位点stg3和stg7的主要区域重叠，表明这两个位点在叶片衰老调控中具有重要作用。为了进一步缩小目标区段的范围，我们利用新开发的30个分子标记对bc3f3和bc3f4群体进行检测，最终将stg3定位在分子标记m36和a-3-11之间，将stg7定位在分子标记a-7-6和a-7-7之间。这两对与候选位点紧密连锁的分子标记为衰老延缓株系的筛选奠定了基础。
60.在stg3中，kasp/m36的正向引物序列1和2分别为seq id no.1和seq id no.2，反向引物序列为seq id no.3，在持绿株系si-144、nil-stg3
si-144
和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
中，可扩增得到的碱基为g；kasp/a-3-11的正向引物序列1和序列2分别为seq id no.4和seq id no.5，反向引物序列为seq id no.6，在持绿株系si-144、nil-stg3
si-144
和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
中，可扩增得到的碱基为a(表1)；在stg7中，indel/a-7-6的正向引物序列为seq id no.7，反向引物序列为seq id no.8，在持绿株系si-144、nil-stg7
si-144
和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
中，可扩增出条带大小为145bp的dna片段；indel/a-7-7的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10，在持绿株系si-144、nil-stg7
si-144
和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
中，可扩增出条带大小为144bp的dna片段(表2)。
61.表1本发明与stg3紧密连锁的分子标记在不同株系中的基因型鉴定
[0062][0063]
表2本发明与stg7紧密连锁的分子标记在不同株系中的基因型鉴定
[0064][0065]
实施例2利用携带qtl片段stg3和stg7的置换系进行吉单27的改良
[0066]
利用本发明中的两对分子标记m36、a-3-11和a-7-6、a-7-7对bc3f4群体中的单株进行基因型鉴定，得到表型和基因型均为持绿类型(衰老延缓)的单株共6个，包括两个nil-stg3
si-144
，两个nil-stg7
si-144
和两个nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
。使用104个kasp标记对这些株系的背景做了检测，结果表明，它们的背景恢复率(si-287背景)为90.38％-98.1％。分别
以这6个株系为母本，以si-144为父本进行杂交，获得改良的杂交种f1代(jidan27的改良系)。
[0067]
2017年夏于甘肃省酒泉市金塔县(39
°
57'n,98
°
22'e)和内蒙古巴彦淖尔市(40
°
75'n,107
°
42'e)种植这些杂交种和jidan27(以si-287为母本，si-144为父本杂交得到的杂交f1代)，这两个地点在植株的生长季干旱少雨。设置正常浇水和干旱处理两个试验区，正常浇水区按照当地的田间管理方式进行管理，干旱处理区在开花前一周至开花后45天停止浇水，其他管理方式和正常浇水区一致。开花后45天进行田间叶片衰老程度的调查，与正常浇水区相比，nil-stg3
si-144
×
si-144、nil-stg7
si-144
×
si-144和nil-stg3
si-144
/stg7
si-144
×
si-144的叶片持绿度下降比例均低于jidan27(图2a)，同时其穗重(ew)下降比例也呈现类似的趋势(图2b)。这表明，说明stg3和stg7这两个qtl不仅对叶片持绿性的改良具有重要作用，同时也有助于干旱条件下的稳产。
[0068]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。