一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法

1.本发明涉及微生物诱导碳酸盐沉淀领域和凹凸棒粘土应用技术领域，具体而言，涉及一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法。


背景技术：

2.早在1973年boquet等首次发现土壤微生物诱导碳酸钙沉淀(microbialinduced calcium carbonate precipitation,micp)现象。微生物在自然环境中，由于细菌表面带负电荷，可以富集环境中的阳离子如钙、镁离子等金属离子在细胞表面，随后金属离子与脲酶分解尿素产生的碳酸根结合，使得金属离子以碳酸盐形式沉淀到环境中或者附着在微生物表面。有部分重金属离子与ca
2+
具有化学相似性，在微生物诱导碳酸盐沉淀过程中能够替换碳酸钙晶格中的ca
2+
，通过共沉淀的形式将金属离子沉淀到方解石晶体中，或重金属吸附在方解石表面，甚至有的重金属与微生物产生的胞外聚合物相互络合被方解石包裹，从而实现金属离子的固定化。micp可广泛的用于制作生物水泥、土壤固化、重金属钝化、裂缝修复等领域，但由于微生物所需营养成分和钙源的成本较高等原因，micp过程还未大规模应用于各领域。由此，降低micp的经济成本是有待解决的重要问题之一。
3.cn108718586a公布了一种利用生蚝壳作为再生钙源通过微生物诱导碳酸盐沉淀固化砂土的方法。其中利用8％-15％的硝酸溶解生蚝壳中的钙离子，但是钙源的提取成本较高并存在产生酸污染的风险。
4.微生物诱导碳酸盐沉淀需要大量的游离阳离子尤其钙离子，大量研究表明，在现有钙盐中以氯化钙作为钙源产生的沉淀最多，形成的碳酸盐以方解石为主。在不计经济成本的情况下氯化钙是最优选的钙源。但是氯化钙的经济成本较高，使得该技术的推广应用受到限制。因此找到低成本的钙源对于micp技术的推广应用具有重要意义。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提出一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，其利用凹凸棒粘土中的钙离子为微生物诱导碳酸盐沉淀提供物质基础，促进微生物诱导碳酸盐沉淀。
9.第二方面，本发明还提供一种上述利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法在水体重金属去除和土壤重金属钝化稳定化方面的应用。
10.本发明具有以下有益效果：
11.本发明提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，其是利用凹凸棒粘土中的钙离子为微生物诱导碳酸盐沉淀(micp)提供物质基础的方法，促进微生物诱
导碳酸盐沉淀。方法为:将微生物菌液接种至含有凹凸棒粘土浸提液的液体培养基中，同时加入尿素，恒温震荡培养，促进微生物诱导产生白色沉淀，对生成的沉淀进行表征鉴定，确定其可行性。该方法经济成本低，提取简单，无二次污染，在水体重金属去除和土壤重金属钝化稳定化方面具有很好的应用前景。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
13.图1为利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀方法的示意图；
14.图2为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lf)在cacl2诱导下产生沉淀的sem图；
15.图3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lf)在白银凹凸棒粘土水溶态浸提液诱导下产生沉淀的sem图；
16.图4为肠球菌(lzu-1)在cacl2诱导下产生沉淀的sem图；
17.图5为肠球菌(lzu-1)在白银凹凸棒粘土水溶态浸提液诱导下产生沉淀的sem图；
18.图6为两种菌株在不同钙源诱导下产生沉淀的xrd图(b-atp：白银凹凸棒粘土水溶态浸提液)；
19.图7为两种菌株在不同钙源诱导下去除同浓度as溶液的去除效率；
20.图8为凹凸棒粘土修复土壤中as修复效率；
21.图9为不同尿素浓度对土壤中as的修复效率；
22.图10为不同固液比提取凹凸棒粘土中的钙、镁离子含量。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
24.本发明的目的在于提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法。其是一种凹凸棒粘土的环境应用方法，利用凹凸棒粘土中的钙离子为微生物诱导碳酸盐沉淀提供物质基础，可以优化微生物诱导碳酸盐沉淀过程的环境效益和经济效益。
25.为实现本发明的上述目的，采用以下的方案：
26.本发明实施例提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，其利用凹凸棒粘土中的钙离子为微生物诱导碳酸盐沉淀提供物质基础，促进微生物诱导碳酸盐沉淀。
27.在可选的实施方式中，利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，包括以下步骤：将富集菌液接种至含有凹凸棒粘土浸提液的液体培养基中，同时加入尿素，恒温震荡培养，促进微生物诱导产生白色沉淀碳酸钙。
28.在可选的实施方式中，含有凹凸棒粘土浸提液的液体培养基的制备包括以下步
骤：将蛋白胨9-11g，氯化钠4-6g，牛肉膏2-4g，凹凸棒粘土浸提液950-1050ml加入培养基中，调节ph至6.8
±
0.2，110-121℃高温高压灭菌20-30min；
29.优选地，将蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，凹凸棒粘土浸提液 1000ml加入培养基中，调节ph至6.8
±
0.2，121℃高温高压灭菌20min，得到含有凹凸棒粘土浸提液的液体培养基。
30.在可选的实施方式中，凹凸棒粘土浸提液的制备包括以下步骤：将凹凸棒粘土和水混合后，恒温振荡以提取凹凸棒粘土中的钙离子；
31.优选地，将凹凸棒粘土与蒸馏水以固液比为1：2-10混合，室温， 150-180rpm下震荡2-3h，离心，过滤，保存过滤液，即得凹凸棒粘土浸提液；
32.优选地，将凹凸棒粘土与蒸馏水以固液比为1：10的比例混合，室温，200rpm下震荡2h后，4000rpm下离心20min，过滤，保存过滤液，制得凹凸棒粘土浸提液；
33.更优选地，凹凸棒粘土在使用前，自然风干，研磨，过0.15mm筛。
34.在可选的实施方式中，凹凸棒粘土选自甘肃省白银凹凸棒粘土和甘肃省临泽凹凸棒粘土中的至少一种。
35.在可选的实施方式中，恒温震荡培养的条件为：加入占液体培养基总质量为4-10％的尿素，在恒温震荡器中，25-30℃，120-150rpm下振荡培养 3d-5d；
36.优选地，恒温震荡培养的条件为：加入占所述液体培养基总质量为6％的尿素，在恒温震荡器中，30℃下，150rpm下振荡培养3d-5d。
37.在可选的实施方式中，微生物为产脲酶菌株。
38.在可选的实施方式中，产脲酶菌株选自纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lf和/ 或肠球菌lzu-1；
39.优选地，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lf为中国北京北纳生物菌种保存库编号bncc210664的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌；
40.优选地，肠球菌lzu-1为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏号为 cgmcc 22622的肠球菌。
41.本发明实施例提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，其中所使用的肠球菌lzu-1，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为：cgmcc 22622，保藏日期为：2021年5月31日，分类命名的拉丁名称：enterococcus gallinarum。
42.在可选的实施方式中，微生物在接种至含有凹凸棒粘土浸提液的液体培养基前进行扩培；
43.优选地，微生物的扩培包括以下步骤：将保存的菌株在超净台中接种于营养肉汤培养基中，接种量为1％-2％，在恒温振荡器中25-30℃， 120-150rpm条件下培养，定时检测其吸光值od
600
，直至吸光值od
600
为 1-1.5；
44.优选地，将保存的菌株在超净台中接种于50ml营养肉汤培养基中，接种量为1％-2％，在恒温振荡器中30℃，150rpm条件下培养，定时检测其吸光值od
600
，直至吸光值od
600
为1，完成微生物的扩培；
45.优选地，营养肉汤培养基组成为：蛋白胨9-11g/l，牛肉膏2-4g/l，氯化钠4-6g/l，ph为7
±
0.2。
46.第二方面，本发明实施例还提供一种上述的用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法在水体重金属去除和土壤重金属钝化稳定化方面的应用。
47.本发明实施例提供一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法。与已有方法相比较优点在于：
48.(1)我国凹凸棒粘土储量丰富，经济成本低，并且现有大量凹凸棒粘土产业在生产过程中产生的凹凸棒粘土淋滤液或凹凸棒酸改性产生的废水需要处理，以此为钙源可以降低微生物诱导碳酸盐沉淀的经济成本，又到达废物资源化利用；
49.(2)凹凸棒粘土中的钙离子提取方法简单环保，不会造成二次污染；凹凸棒粘土协同micp钝化重金属污染物过程同时能减少温室气体排放。
50.(3)凹凸棒粘土中的镁离子对碳酸盐沉淀的生成具有促进作用。
51.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
52.一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸盐沉淀的方法，参见图1，具体步骤如下：
53.(1)凹凸棒粘土的预处理：本发明所采用的凹凸棒粘土为白银凹凸棒粘土(b-atp)，成本低廉。将采集的凹凸棒粘土自然风干，过0.15mm筛，备用。
54.(2)凹凸棒粘土中水溶态钙离子的提取：凹凸棒粘土样品与蒸馏水以固液比1：10(m/v)的比例混合，在恒温振荡器中25℃，200rpm震荡2h后，在高速离心机4000rpm，离心20min，过滤，得凹凸棒粘土的浸提液。
55.(3)液体培养基的制备：本发明采用营养肉汤培养基(nb)：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，凹凸棒粘土浸提液1000ml，将ph调至6.8
±
0.2， 121℃高温高压灭菌20min。上述白银凹凸棒粘土(b-atp)的理化性质及水溶态的钙、镁离子含量见表1。
56.(4)菌株的扩培：将保存的菌株在超净台中接种于50ml营养肉汤(nb) 培养基中，接种量为1％-2％，在恒温振荡器中30℃，150rpm条件下培养，定时检测其吸光值od
600
(optical density600)，直至其吸光值od
600
在1左右。
57.(5)微生物诱导方解石沉淀的生成及鉴定：在超净台中将(4)的富集菌液解接种于(3)的培养基中，同时加入6％的尿素，在恒温震荡器中30℃，150rpm 培养3d-5d，产生白色沉淀，离心，冷干。再通过扫描电镜(scanning electronmicroscope，sem)和x射线衍射(x-ray diffraction，xrd)分析确定沉淀产物主要成分。
58.以下为了验证该方法的适用性，分别选用四种不同的凹凸棒粘土在水溶液和土壤中进行类重金属砷(as)的稳定化。四种凹凸棒粘土分别为：白银凹凸棒粘土(b-atp)、临泽凹凸棒粘土1(l-atp1)、临泽凹凸棒粘土 2(l-atp2)、临泽凹凸棒粘土3(l-atp3)，其理化性质和水溶态ca
2+
、mg
2+
含量如表1所示，全岩矿物组成与粘土矿物组成如表2和表3所示。
59.表1四种凹凸棒粘土的理化性质及水溶态ca
2+
、mg
2+
含量
[0060][0061]
表2四种凹凸棒粘土的全岩矿物组成(％)
[0062][0063]
表3四种凹凸棒粘土的粘土矿物组成
[0064][0065]
注：s是蒙脱石，i/s是伊利石与蒙脱石混层，i是伊利石，k是高岭石， c是绿泥石，c/s是绿泥石和蒙脱石混层，pa是凹凸棒石，也就是坡缕石。混层比(％s)为蒙脱石的百分比含量。
[0066]
实施例1
[0067]
四种凹凸棒粘土水溶态提取液为micp提供物质基础去除水溶液中类重金属砷(as)；
[0068]
第一步，用凹凸棒粘土(atp)的水溶态提取液配制液体培养基：称取35g 白银凹凸棒粘土，按固液比1：10添加350ml蒸馏水，经过震荡2h(200rpm， 25℃)，离心(4000rpm，10min)，过滤，取300ml提取液备用。
[0069]
第二步，空白组(ck)和对照组用蒸馏水配制as浓度为20m g/l的 na3aso4溶液和营养肉汤混合液，实验组用凹凸棒提取液配制as浓度为 20m g/l的na3aso4溶液和营养肉汤混合液。用50ml锥形瓶分装，做三个平行实验。在121℃高温高压灭菌20min，降至室温，在无菌台中接种1ml lf 菌株的富集菌液，同时加入尿素溶液于锥形瓶中(尿素溶液用0.22μm的水系滤头过滤，最终尿素浓度为6％)。
[0070]
第三步，在25℃，150rpm的条件下培养20天，最后测定去除前后as 浓度变化，计算其去除效率。其中，空白组(ck)添加了20m g/l的砷和6％的尿素及1ml富集菌液；以氯化钙为钙源的对照组添加了20m g/l的砷和 6％的尿素以及60mm的cacl2，并接种1ml的lf菌液；
由凹凸棒粘土的水溶态提取液作为钙源的实验组添加了20m g/l的砷和6％的尿素以及1ml的 lf菌液。
[0071]
lzu-1菌所有处理与lf菌相同。
[0072]
实施例2
[0073]
凹凸棒粘土在土壤中为micp提供物质基础，固化类重金属砷(as)；
[0074]
第一步，菌液的富集：根据实验所需用量，用nb液体培养基对lf菌株进行扩增培养(接种量为1％-5％)；土壤样品预处理，将采集的土样自然风干，研磨，过2mm筛，备用。
[0075]
第二步，待富集菌液培养到18-20h，对照组：土壤+尿素+lf菌+cacl2，其中，菌液按照固液比为7：3添加，尿素添加量为12％，cacl2的添加量为60mm，lf以菌液的形式添加。实验组：土壤+尿素+lf菌+凹凸棒粘土, 尿素和菌液的添加量同对照组相同，凹凸棒粘土的添加量为10％，本次实施例添加的凹凸棒粘土分别为白银凹凸棒粘土(b-atp)、临泽凹凸棒粘土1(l-atp1)、临泽凹凸棒粘土2(l-atp2)、临泽凹凸棒粘土3(l-atp3)。
[0076]
根据实施例1和实施例2可以得出凹凸棒粘土无论是以原样还是浸提液作为钙源都可以为micp过程提供物质基础。利用凹凸棒粘土和产脲酶微生物联合修复水体或土壤重金属污染时，既可以利用凹凸棒粘土的浸提液或改性废水，也可以利用凹凸棒粘土原样。
[0077]
由图2-图5所示，通过sem的分析结果可知，两者诱导产生的碳酸钙沉淀形态略有不同：氯化钙诱导的沉淀为规则的菱形结构，白银凹凸棒诱导的沉淀为不规则的菱形结构。
[0078]
由图6所示，通过xrd分析可知，以氯化钙为钙源产生的沉淀主要为方解石，白银凹凸棒粘土(b-atp)为钙源产生的沉淀也主要为方解石。
[0079]
由图7分析可得，对于同浓度as的水溶液，以凹凸棒粘土提取液作为钙源和cacl2作为钙源相比，前者的去除效率更高。在钝化土壤中as实验中，虽然cacl2作为钙源的去除效率更高，但是结合经济成本和环境意义(防止土壤盐渍化)考虑凹凸棒粘土更为可取。cacl2需经过加工提纯，而凹凸棒粘土只需要进行简单的水溶态或者原矿，并且有研究表明mg
2+
可以提高 micp成矿结晶度，表4可得镁离子和lzu-1对as的去除率呈显著正相关。
[0080]
表4水溶液中凹凸棒粘土的提取液对as的去除率与凹凸棒粘土ca
2+
、 mg
2+
含量的相关性分析
[0081] 钙源种类as钝化率lfas钝化率lzu-1钙离子镁离子钙源种类1.00-0.200.00-0.67-0.33as钝化率lf-0.201.000.400.670.33as钝化率lzu-10.000.401.000.001.000*钙离子-0.670.670.001.000.00镁离子-0.330.331.000**0.001.00
[0082]
注：*.在0.05级别(双尾)，相关性显著。**.在0.01级别(双尾)，相关性显著。
[0083]
根据图8所示，在土壤中分别以氯化钙、b-atp、l-atp1、l-atp2、l-atp3为钙源稳定土壤中的as，其修复效果为：氯化钙》 l-atp3》l-atp2》l-atp1》b-atp，虽然在土壤中凹凸棒粘土作为钙源对as 的修复效率略低于氯化钙作为钙源的情况，但是考虑到氯化钙与凹凸棒粘土在价格和制作工艺的差异，综合考虑凹凸棒粘土作为钙源其性价比更高。
[0084]
对比例1
[0085]
在氯化钙浓度定量60mm的情况下，尿素浓度分别在0％、2％、4％、 6％、8％、10％，
在土壤中加入lzu-1和lf菌株，同时添加所需营养肉汤培养基，菌液按固液比7：3添加，通过修复后土壤中as的钝化率评估最优尿素浓度。
[0086]
根据图9所示，当尿素的添加量为6％时，两种菌株对土壤中as的钝化率最高，由此可得到培养基内尿素的最优添加量为6％。其中，尿素浓度对利用lzu-1菌株钝化土壤中as的影响相对于对lf菌株的影响更为明显一些。
[0087]
对比例2
[0088]
将四种凹凸棒粘土分别在不同的固液比下提取，固液比分别为1：2、1：5、1：10，称取一定量凹凸棒粘土，按照不同固液比添加蒸馏水，经过震荡2h-3h(200rpm，25℃)，离心(4000rpm，10min)，过滤，得到不同固液比下的提取液，采用火焰原子吸收分光光度法测定其中钙、镁含量。
[0089]
根据图10所示，将四种凹凸棒粘土分别在固液比为1：2、1：5、1： 10时提取液中钙、镁的含量进行比较，随着固液比的减小，l-atp3中提取的钙含量下降幅度较大，其余的凹凸棒粘土提取液中钙离子浓度下降幅度较小。在相等质量下同时考虑不同固液比得到提取液的体积和钙离子浓度得到优选固液比为1:10。
[0090]
综上，本发明实施例提供了一种利用凹凸棒黏土促进微生物诱导碳酸沉淀的方法，通过利用凹凸棒粘土中的钙离子为微生物诱导碳酸盐沉淀 (micp)提供物质基础的方法，促进微生物诱导沉积碳酸盐沉淀。其关键在于利用凹凸棒粘土中的钙离子进行micp过程。通过对凹凸棒粘土进行预处理，利用凹凸棒粘土中的可溶态的钙离子为micp过程提供物质基础。通过蒸馏水提取凹凸棒粘土中的钙离子，利用该浸提液培养菌种，并加入所需尿素，对生成的沉淀进行表征鉴定，确定其可行性。该方法经济成本低，提取简单，无二次污染，在水体重金属去除和土壤重金属钝化稳定化方面具有很好的应用前景。
[0091]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。