长链非编码RNA在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用

长链非编码rna在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及长链非编码rna在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种以骨量减少，骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。
3.长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是转录组的一个重要组成部分，在细胞生命活动中发挥着重要而广泛的作用，近年来受到高度重视。随着对长链非编码rna研究的深入，发现越来越多的长链非编码rna与人体各种疾病的发生、发展密切相关。lncrna虽然不编码蛋白质，但通过反式和顺式两种方式在调控基因转录中发挥重要作用，可以在转录、转录后和表观遗传学水平上调节靶基因，但是长链非编码rna在骨质疏松症治疗中的应用，目前尚未见报道。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供长链非编码rna在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用，基因lncrna-gzss的表达上调，能促进成骨细胞的活力和矿化程度，改善骨质疏松症引起的症状以及预后。
5.本发明的目的采用如下技术方案实现：
6.长链非编码rna在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用，所述长链非编码rna为lncrna-gzss，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步地，所述lncrna-gzss在制备检测骨质疏松症的试剂中的应用。
8.进一步地，所述lncrna-gzss在制备预防和/或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
9.进一步地，所述药物中包括lncrna-gzss的表达促进剂。
10.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
11.本发明的长链非编码rna在骨质疏松症的检测、预防和/或治疗靶点的应用，基因lncrna-gzss的表达与成骨细胞的活性和分化程度相关，因此可采用基因lncrna-gzss作为检测靶点，用于检测骨质疏松症。体外实验表明，基因lncrna-gzss的表达上调，能促进成骨细胞的活力和矿化程度。可通过将骨质疏松症作为药物靶点，进行预防和/或治疗骨质疏松症药物的筛选，为骨质疏松症预防和/或治疗药物提供了一种新的筛选方法和研发思路。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
13.图1为本发明的实施例1中sham组与ovx组的骨质疏松大鼠模型对比图；其中，图1a
为sham组与ovx组的骨密度检测图；图1b为sham组与ovx 组的microct检测图；图1c为sham组与ovx组的he染色显微照片对比图。
14.图2为本发明的实施例3中琼脂糖凝胶电泳检测图。
15.图3为本发明的实施例3中对比各个染色体的密度统计图。
16.图4为本发明的实施例4中lncrna筛选统计图。
17.图5为本发明的实施例4中编码潜能预测结果韦恩图。
18.图6为本发明的实施例4中lncrna的特征分析图；其中，图6a为lncrna 与mrna的长度比较图；图6b为exon数目比较图；图6c为orf长度比较图；图6d为lncrna类型分布图。
19.图7为本发明的实施例4中转录本表达水平对比图；图7a为mrna、 lncrna和tucp表达水平对比图；图7b为sham组和ovx组的表达水平对比图。
20.图8为本发明的实施例4中差异表达转录本的火山图；其中，图8a为差异表达的mrna火山图；图8b为差异表达的lncrna火山图；图8c为差异表达的tucp火山图。
21.图9为本发明的实施例4中差异表达转录本的染色体分布图；其中，图9a 为差异表达mrna的染色体分布；图9b为差异表达lncrna的染色体分布；图 9c为差异表达tucp的染色体分布。
22.图10为本发明的实施例5中差异表达的mrna进行go富集分析图。
23.图11为本发明的实施例5中差异表达的lncrna的co-location靶基因的 kegg显著性富集图。
24.图12为本发明的实施例5中差异表达的lncrna的co-expression靶基因的 kegg显著性富集图。
25.图13为本发明的实施例6中腺病毒载体转染表达图。
26.图14为本发明的实施例6中cck8检测腺病毒转染后lncrna-gzss的表达对比图；其中，线1为过表达组(over)，线2为过表达-阴性对照组(over-nc)，线3为空白组(blank)，线4为沉默-阴性对照组(loss-nc)，线5为沉默组(loss)。
27.图15为本发明的实施例6中alp染色检测腺病毒载体转染后成骨细胞分泌 alp情况及中药对其影响的alp染色图。
28.图16为本发明的实施例6中茜素红染色检测腺病毒载体转染后成骨细胞矿化情况及中药对其的影响的茜素红染色图。
具体实施方式
29.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
30.实验动物：spf级6月龄雌性sparague dawley(sd)大鼠24只，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号scxk(粤)2013-0034。实验在广州中医药大学实验动物中心spf级实验室进行，保持12h光暗循环，温度控制在 22-24℃，湿度为50-60％。喂饲大鼠专用饲料(购自广州中医药大学动物实验中心)。所有实验方案均经广州中医药大学伦理委员会批准(no.2016046)。
31.实施例1
32.建立去卵巢大鼠绝经后骨质疏松模型
33.1、动物分组、造模
34.24只6月龄sd大鼠在实验开始之前自由摄取标准实验室啮齿动物饮食，适应环境7天。然后随机分为两组，每组12只：假手术组(sham)、模型组(ovx)。根据fda指南对大鼠进行背部卵巢切除术或假手术，并将其放置12周以在ovx 中发生骨质减少。
35.模型组具体手术过程为：大鼠麻醉成功后背部剃毛，取俯卧位，常规消毒铺巾后，于右侧肋骨下缘和脊柱旁开约1cm处纵行切开背部皮肤，暴露腹后壁，剪刀剪开肌肉暴露脂肪组织，无齿镊翻转脂肪组织暴露卵巢，止血钳钳夹卵巢基底部并进行结扎，切除卵巢，逐层缝合肌肉和皮肤。依法切除左侧卵巢。假手术组大鼠依照同样的方法暴露卵巢，切除卵巢附近等体积大小的脂肪组织后逐层缝合肌肉和皮肤。术后各组大鼠给予青霉素8万单位/只，每天一次，连续 1周。同时，各组大鼠均进行单笼饲养2周以防止相互咬伤。术后12周检测骨密度验证造模成功，进行标本采集，检测指标。然后，取大腿内侧入路去除肌肉组织，迅速分离整段股骨。左侧股骨采用10％中性多聚甲醛固定24小时，进行骨密度检测、microct扫描检测和病理染色。
36.2、离体股骨骨密度检测
37.离体左侧股骨固定24小时后，生理盐水洗涤2小时，采用双能x射线“区域高分辨率”模式扫描股骨全段，感兴趣区标记为股骨头，股骨近端，股骨干，股骨远端和整个股骨。采用仪器自带分析软件分析股骨骨密度。
38.3、microct检测
39.测量离体股骨骨密度后进行microct扫描。将股骨固定在15ml离心管制成的模具中，将模具置于可以轴向移动的转台上，设置扫描条件(55kv，145ma) 进行股骨远端扫描。通过自带分析软件的“自由绘制形状”框取松质骨，选择股骨远端生长板上方1mm的松质骨作为感兴趣区。，分析骨体积分数(bonevolume/total volume,bv/tv,％)，骨表面积和体积比(bone surface/totalvolume,bs/tv，mm-1)，骨小梁厚度(trabecular thickness,tb.th，mm)，骨小梁数量(trabecular number,tb.n,1/mm)和骨小梁分离度(trabecularseparation,tb.sp,mm)，并通过多平面重构获得三维图像。
40.4、结果
41.1)全身和腰椎骨密度检测
42.如表3所示，两组大鼠造模12周后进行骨密度检测，与sham组相比，ovx 组大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明去卵巢大鼠绝经后骨质疏松模型建立成功。
43.表3去卵巢大鼠的全身、腰椎骨密度
[0044][0045]
注：*，与sham组相比，p《0.05。
[0046]
1)离体股骨骨密度、microct检测和he染色
[0047]
由于本次研究的高通量测序实验部分的实验对象是股骨远端，我们进一步对离体股骨进行了骨密度检测和microct扫描，结果如表4所示，与sham组相比，ovx组离体股骨的整体骨密度和股骨头、股骨近端、股骨干和股骨远端骨密度水平均显着降低(p＜0.05)。
[0048]
表4去卵巢大鼠离体股骨骨密度
[0049][0050]
注：*，与sham组相比，p《0.05。
[0051]
对于microct检测结果，与sham组相比，ovx组中bv/tv，bs/tv和 tb.n的水平显著降低，而tb.sp水平明显增加(p＜0.05)，两组间tb.th比较虽然无统计学差异，但ovx组tb.th水平有下降趋势，结果如表5所示。
[0052]
表5去卵巢大鼠股骨远端骨微结构
[0053][0054]
注：*，与sham组相比，p《0.05。
[0055]
如图1所示，he染色结果显示，与sham组相比，ovx组股骨远端的骨小梁变薄，骨小梁数量明显减少，排列稀疏，骨小梁间隙相对较宽，这与microct 的三维图像相一致。这些结果表明，与sham组相比，ovx大鼠股骨的骨量明显减少，股骨远端的骨微结构明显变差。
[0056]
综上，我们成功建立了一个通过骨密度检测，microct检测和he染色验证的骨质疏松大鼠模型。
[0057]
实施例2
[0058]
高通量测序
[0059]
1、骨组织总rna提取
[0060]
1)从液氮中取出备用的右侧股骨，研钵提前采用液氮预冷，取股骨远端约 40mg的骨组织进行研磨，边研磨边添加液氮，保持骨组织浸润在液氮中，研磨至骨组织变为粉末状。
[0061]
2)将粉末状骨组织收集到1.5ml离心管内，加入1ml trizol，剧烈震荡后冰上静置5min。
[0062]
3)加入200μl氯仿，涡旋30s充分混匀，冰上静置5min。然后4℃12000rpm 离心10min。
[0063]
4)离心后液体分层，上层为无色水相，中间层为蛋白质，下层为有机相，用移液枪小心吸取400μl水相，转移到新的1.5ml离心管内，加入等体积的异丙醇，吹打混匀后冰上静
置10min。然后4℃12000rpm离心15min。
[0064]
5)离心后可见白色沉淀，倒出上清液，残留部分上清液用移液枪缓慢吸出，加入1ml现配的75％乙醇，手动颠倒洗涤沉淀，然后4℃7500rpm离心5min。
[0065]
6)重复上述步骤5)2次。
[0066]
7)弃去上清液，再次4℃12000rpm离心1min，用移液枪小心吸净75％乙醇，于37℃恒温金属浴中进行干燥，至rna沉淀透明。加入40μl无rna酶水溶解沉淀，吹打混匀。
[0067]
8)采用nanodrop nd-2000分光光度计测定浓度和纯度，-80℃冰箱保存备用。
[0068]
2、高通量测序
[0069]
随机选取10个股骨样本(每组5个)进行高通量测序，高通量测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。
[0070]
3、基因表达水平定量
[0071]
采用cuffdiff v2.1.1进行定量分析。通过对每个基因组中转录物的fpkm 求和来计算基因fpkm，其含义是每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量，并计算映射到该片段的读数。
[0072]
4、差异表达分析
[0073]
ballgown套件包括用于交互式探索转录组装配的功能，转录物结构的可视化和每个基因座的特征特异性丰度。cuffdiff提供了统计程序，用于使用基于负二项分布的模型确定数字转录物或基因表达数据中的差异表达。具有p-adjust 《0.05的转录物被指定为差异表达。
[0074]
5、lncrna靶基因预测
[0075]
lncrna通过调控mrna实现功能，研究表明lncrna可通过顺式作用(cis) 调节附近蛋白质编码基因的表达，并通过反式作用(trans)调节远缘基因。此外，lncrna的功能可以通过其密切相关的顺式或反式调节的靶蛋白编码基因来预测。因此，我们通过一下两种方法来预测生物学功能。
[0076]
1)与蛋白编码基因的位置关系(co-location)
[0077]
本次研究将co-location的阈值设定为lncrna的上游和下游100kb内的蛋白质编码基因，再通过对基因进行功能富集分析预测lncrna的主要功能。
[0078]
2)与蛋白编码基因的表达相关性(co-expression)
[0079]
本次研究采用皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient，pcc)法分析lncrna与mrna的相关性，取pcc绝对值大于0.95的蛋白质编码基因作为靶基因进行功能富集分析，以预测lncrna的功能。
[0080]
6、差异表达基因和差异表达的lncrna的靶基因的功能富集分析
[0081]
基因本体论(gene ontology，go)是基因功能国际标准分类体系。go分为细胞组分(cellular component,cc)，分子功能(molecular function,mf)和生物学过程(biological process,bp)三个方面对基因的本质进行描述，进行差异表达mrna和差异表达的lncrna的靶基因的go富集分析可以了解其在 gene ontology中的分布和在基因功能上的体现。本研究采用goseq进行go富集，设定p-adjust《0.05的go条目被显著富集。
[0082]
实施例3
[0083]
高通量测序数据分析
[0084]
1、骨组织总rna质量检测
[0085]
将10个骨组织的总rna样本采用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果如图2a所示，各样本的电泳条带明亮、边缘清晰，均可明显看到28s、18s和 5s共3个条带，除5、6、8样本外，其他样本均可见到28s条带亮度明显强于 18s条带。
[0086]
对5、6、8号骨组织重新进行总rna抽提，进行完整性检测，如图2b示，28s条带亮度明显强于18s条带，初步说明抽提的总rna样本完整性较高，无明显降解。其中，图2b中，1、2、3号为图2a中5、6、8号骨组织重新检测图。
[0087]
注：图2a中，marker为trans 2k plus，图中对应上表序列1-2、10为原液稀释3倍上样1ul，序列3、5、9为原液稀释7倍上样1ul，序列4为原液上样0.5ul，序列6-8为原液稀释5倍上样1ul。
[0088]
图2b中，marker为trans 2k plus，图中对应上表序列1-2为原液稀释5 倍上样1ul，序列3为原液稀释3倍上样1ul。
[0089]
对初步检测完整性合格的总rna样本进行纯度、浓度的精确定量和完整性检测，各rna样本的浓度均较高，od260/280均大于2.0，28s/18s比值最低的也有1.5，rna完整值(rnaintegrity number，rin)均在7以上，满足建库需求，可以进行下一步实验。
[0090]
2、高通量测序数据的质控
[0091]
对各样本通过高通量测序及过滤获得的clean reads进行质控分析，得到的各样本获得的clean bases均大于12g，碱基测序错误率均为0.01％，q20均在 97.74％以上，q30均在94.21％以上，表明本次测序的数据产出量较高，质量较好。
[0092]
3、序列比对与拼接
[0093]
比对分析发现超过95％的clean reads可以比对到大鼠的参考基因组，并且超过88％的测序序列在参考序列上具有唯一的比对位置。用htseq软件对每个样品进行已知类型基因的定量分析。然后对比对到的各个染色体的密度进行统计，图3为以2号样品为例的对比各个染色体的密度统计图，其他样品的密度统计图相似，发现在大鼠各条染色体上分布均匀，无明显集中于某条或某几条染色体，说明建库时rna打断的随机性较好。
[0094]
综上，本发明的测序数据可靠，可用于后续的分析。
[0095]
实施例4
[0096]
转录本的筛选与分析
[0097]
1、转录本的筛选
[0098]
对本次测序共得到的301462个转录本进行lncrna的筛选，如图4所示，通过对转录本进行外显子数目，转录物长度，与已知lncrna数据库的比对以及转录物表达量统计的四步分析后，筛选总共14130个lncrna。然后，在第五步中，使用3种编码潜能预测软件cnci，cpc和pfam去除潜在的编码转录物，最终预测得到7281个非编码转录物作为新的lncrna(如图5所示)。
[0099]
注：图5中，每个圆圈代表一种预测软件，圆圈中的数字代表无编码潜能的转录本数，交叠的部分表示预测软件重叠的无编码潜能的转录本数。
[0100]
2、转录本的结构分析
[0101]
对本研究获得的lncrna与mrna进行结构比较分析，既能了解lncrna 与mrna的差别，又能验证预测得到的lncrna是否符合一般lncrna特征。
[0102]
与已知的mrna相比，本研究获得的lncrna的转录本长度与mrna长度相似(图6a)，外显子(exon)个数明显少于mrna的的外显子(exon)数(图 6b)，orf长度远低于mrna的orf长度(图6c)。说明预测得到的lncrna 符合lncrna的一般特征。分类统计分析显示lincrna占70.5％，anti-senselncrna占14.9％，intronic lncrna占14.7(图6d)。
[0103]
同时，对本研究获得的tucp进行结构比较分析，发现与已知的mrna相比，本研究获得的tucp的转录本长度与mrna长度相似，外显子(exon)个数明显少于mrna的的外显子(exon)数，orf长度远低于mrna的orf长度。说明预测得到的tucp在一定程度上符合lncrna的一般特征，可以纳入到后续分析中。
[0104]
3、转录本的定量分析
[0105]
使用cuffdiff v2.1.1软件对筛选得到的mrna，lncrna和tucp进行定量分析，结果如图7a，发现mrna的表达水平明显高于lncrna和tucp。分别对两组内的样品的所有转录本的表达量取平均值，绘制箱型图(图7b)比较sham 组和ovx组的表达水平。发现两组间整体的转录水平无明显差异，可以进行后续的单转录本差异表达分析。
[0106]
4、转录本的差异表达分析
[0107]
对sham组和ovx组的mrna，lncrna和tucp进行差异表达分析，发现共440条mrna存在组间差异表达，其中160条上调和280条下调(图8a)；共17条lncrna存在组间差异表达(如表6所示)，其中9条上调和8条下调(图 8b)；共21条tucp存在组间差异，其中11条上调和10条下调(图8c)。
[0108]
表6差异表达的lncrna
[0109]
expression)预测获得3个靶基因，分别为免疫球蛋白v-set 结构域(icos)，低密度脂蛋白受体相关蛋白4(lrp4)，nk6转录因子相关2 (nkx6-2)。
[0125]
表7 lncrna co-location靶基因预测
[0126][0127][0128]
注：(1)chromosome：lncrna来源基因所在的染色体；(2)distance：lncrna 距离靶基因的距离，单位bp；(3)location：lncrna相对靶基因的位置。
[0129]
表8 lncrna co-expression靶基因预测
[0130][0131][0132]
注：pearson_correlation：pearson相关系数。
[0133]
(2)kegg富集分析
[0134]
kegg显著性富集结果如图11所示，lncrna co-location靶基因富集的主要通路包括核糖体途径，胞吞作用和粘蛋白型o-聚糖生物合成，长期抑郁，沙门氏菌感染，fcγr介导的吞噬作用，阿米巴病，甲状腺激素信号通路，血管平滑肌收缩，紧密连接。
[0135]
如图12所示，lncrnaco-expression靶基因富集的主要通路包括磷脂酰肌醇信号系统通路，fcγr介导的吞噬作用，甘油脂代谢，赖氨酸降解，fc epsilonri信号通路，甘油磷脂代谢，氮代谢，selenocompound代谢，trp通道的炎症介质调节，背腹轴形成，血管平滑肌收缩。
[0136]
对于tucp，其co-location靶基因富集的主要通路包括wnt通路，氨酰基
ꢀ‑
trna生物合成，2-氧代羧酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，吞噬，柠檬酸循环，亨廷顿氏病，金黄色葡萄球菌感染，神经活性配体-受体相互作用，细胞溶质 dna传感途径，rig-i样受体信号通路；其co-expression靶基因富集的主要通路包括磷脂酰肌醇信号系统，fcγr介导的吞噬作用，紧密连接，fc epsilon ri 信号通路，致心律失常性右心室心肌病，沙门氏菌感染，氮代谢，selenocompound 代谢，阿米巴病，trp通道的炎症介质调节。
[0137]
(3)go分析
[0138]
对lncrna进行go分析，发现主要富集的go条目：细胞组分包括细胞内和细胞间，分子功能包括蛋白吸附和分子，说明lncrna的靶基因多可翻译为有功能的蛋白质，在骨质疏松发生发展过程中起作用。
[0139]
同时通路富集分析发现lncrna主要富集的通路包括wnt通路，血管平滑肌收缩，磷脂酰肌醇信号通路。
[0140]
(4)差异表达转录本的验证
[0141]
本研究中，随机选取8条差异表达的转录本进行real-time pcr实验。结果表明，设计的转录本的引物特异性较强，real-time pcr的结果与高通量测序的数据一致，并且每个转录本都具有相同的趋势(上调或下调)，表明rna-seq 分析是可靠的。
[0142]
实施例6
[0143]
综合基因富集的通路和上下调倍数的结果，筛选目的基因lncrna-gzss (lncrna id：ensrnot00000090777)，所述基因lncrna-gzss的核苷酸序列如seq id no.1所示。构建对应的过表达/沉默腺病毒，按照分组分别转染成骨细胞。通过cck8检测各组成骨细胞的细胞活力；alp、茜素红染色检测各组细胞的成骨矿化能力；qrt-pcr、wb检测凋亡基因、成骨相关基因。
[0144]
如图13所示，基因lncrna-gzss过表达腺病毒转染后基因的表达量上升，结果具有统计学意义(p＜0.05)，沉默腺病毒转染后基因的表达量下降，结果具有统计学意义(p＜0.05)。
[0145]
如图14所示，cck8结果显示：与空白组相比，过表达组的细胞活力升高 (24h、48h、72h)；沉默组的细胞活力降低(24h、48h、72h)。
[0146]
如图15所示，alp染色结果显示：与a组(空白对照组)相比，d组(沉默组)、e组(沉默+空白含药血清组)分泌alp明显降低(p＜0.05)，b组(中药组)、h组(过表达组)、i组(过表达+空白含药血清组)、j组(过表达+中药组)分泌的alp显著升高(p＜0.05)。
[0147]
如图16所示，茜素红染色结果显示：与a组(空白对照组)相比，d组(沉默组)、e组(沉默+空白含药血清组)矿化程度低，b组(中药组)、h组(过表达组)、i组(过表达+空白含药
血清组)、j组(过表达+中药组)矿化程度高。
[0148]
其中drug a为广州中医药大学第三附属医院研发出的中药复方补肾健脾活血方(“十味骨康口服液”)，主要成分：补骨脂、制淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣。经临床试验和动物、细胞实验证实，补肾健脾活血方在防治骨质疏松上具有抗氧化和调控线粒体凋亡及调控相关信号通路的作用。
[0149]
综述，基因lncrna-gzss的表达上调，能促进成骨细胞的活力升高，使成骨细胞分泌的alp量升高，并提高矿化程度；故基因lncrna-gzss在骨质疏松症的检测、预防和治疗中发挥着重要的作用。中药drug a提高矿化程度，同时中药drug a与基因lncrna-gzss的高表达对提高矿化程度具有协同增效的作用。
[0150]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。