重组抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及重组抗体及其应用，更具体地，涉及重组抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物以及所述重组抗体或抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途和试剂盒。


背景技术：

2.癌症是一种严重威胁人民群众的生命健康的疾病，近年来全球癌症的发生率、死亡率却不断上升。目前已有的癌症治疗手段，包括手术切除、放疗、化疗、小分子靶向治疗、抗体靶向治疗、大分子免疫治疗等仅能够在部分癌症患者中发挥有限的作用，癌症仍是困扰人类生命健康的难题。
3.近年来，重组抗体成为了免疫治疗中的研究热点。重组抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够在靶细胞(肿瘤细胞)和效应细胞(免疫细胞)之间架起桥梁，产生导向性杀伤肿瘤的效应功能。因此，开发低免疫原性、强亲和力的特异性抗体对于治疗肿瘤具有重要意义。


技术实现要素：

4.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
5.肿瘤组织中cd155相对于正常组织的差异化高表达，且cd155结合免疫检查点受体tigit，进而抑制免疫细胞的抗癌功能，cd16抗体单链可变片段(scfv)能够结合nk细胞，因此，发明人设计了重组抗体cd16
×
tigit，更进一步地，发明人惊喜地发现在所述双特异性抗体中加入人白细胞介素21(il-21)后，获得的重组抗体(cd16
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il-21
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tigitextra)的抗癌能力显著强于cd16
×
tigit extra双特异性抗体，并且重组抗体(cd16
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il-21
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tigitextra)诱导产生的炎性细胞因子il-6显著低于cd3
×
tigit extra和cd16
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tigit extra双特异性抗体。
6.因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，所述重组抗体为双链抗体，包括：第一条肽链，包括cd16单链抗体、il-21分子和第一fc区，所述cd16单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及第二条肽链，包括tigit胞外区和第二fc区；其中，所述cd16单链抗体的c端与所述il-21分子的n端相连，所述il-21分子的c端与所述第一fc区的n端相连，所述tigit胞外区的c端与所述fc区的n端相连。根据本发明实施例的重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
7.在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸可以在一定条件下表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿
瘤抑制能力和较高的安全性。
8.在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带第二方面所述的核酸。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
9.在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组抗体的方法。根据本发明的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。根据本发明实施例的方法可以有效获得所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
10.在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、或第三方面所述的表达载体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
11.在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd155蛋白分子结合，进而可特异性识别肿瘤细胞，同时与cd16a和il-21r进行结合，从而促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，且具有较高的安全性。
12.在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd155蛋白分子结合，进而可特异性识别肿瘤细胞，同时与cd16a和il-21r进行结合，从而促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，且具有较高的安全性。
13.在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16a、cd155和il-21r蛋白分子结合，进而可特异性识别肿瘤细胞，并促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，因此，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症
的作用，且具有较高的安全性。
14.在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述重组抗体可与cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的cd16和/或cd155和/或il-21r。
15.在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例提供的所述重组抗体可与cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的cd155水平后，判断其cd155水平是否过高于或低于正常水平。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
18.图1是根据本发明实施例的重组抗体的结构示意图，其中，并未给出连接肽的连接位置，重组双特异性抗体的第一fc区(左侧)和第二fc区(右侧)通过knob-into-hole结构进行连接；
19.图2是根据本发明实施例的抗体与cho-k1-cd16a细胞结合能力的检测结果图；
20.图3是根据本发明实施例的抗体与cho-k1-cd155细胞结合能力的检测结果图；
21.图4是根据本发明实施例的抗体与肺癌nci-h1299细胞结合能力的检测结果图；
22.图5是根据本发明实施例的抗体对pbmc杀伤肺癌nci-h1299细胞的检测结果图；
23.图6是根据本发明实施例的抗体对pbmc产生il-6含量的检测结果图。
具体实施方式
24.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
25.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
26.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
27.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本
文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
28.本文中，“双链抗体”是指由可特异性识别不同蛋白分子的肽链分别与fc区的两条链进行连接而获得的，其中，所述fc区的两条链通过knob into hole结构进行连接。
29.本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
30.本文中“knob into hole结构”为在抗体重链fc的ch3区形成钮(knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体，例如，本技术中，通过突变人igg1-fc ch3结构域中氨基酸(一条链中为t366s、l368a、y407v突变，即“hole”；另一链中为t366w突变，即“knob”)实现。
31.在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体，包括：第一条肽链，包括cd16单链抗体、il-21分子和第一fc区，所述cd16单链抗体包括重链可变区、轻链可变区；以及第二条多肽链，包括tigit胞外区和第二fc区；其中，所述cd16单链抗体的c端与所述il-21分子的n端相连，所述il-21分子的c端与所述第一fc区的n端相连，所述tigit胞外区的c端与所述fc区的n端相连。根据本发明实施例的重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
32.根据本发明的一些具体的实施例，上述重组抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
33.根据本发明的一些具体的实施例，进一步包括连接肽1，所述连接肽1的n端与所述重链可变区的c端相连，所述连接肽1的c端与所述轻链可变区的n端相连。
34.根据本发明的一些具体的实施例，所述连接肽1包括seq id no：15所示的氨基酸序列。
35.ggggsggggsggggs(seq id no：15)。
36.根据本发明的一些具体的实施例，进一步包括连接肽2，所述连接肽2的n端与所述轻链可变区的c端相连，所述连接肽2的c端与所述il-21分子的n端相连。
37.根据本发明的一些具体的实施例，所述连接肽2包括seq id no：17所示的氨基酸序列。
38.ggggs(seq id no：17)。
39.根据本发明的一些具体的实施例，进一步包括连接肽3，所述连接肽3的n端与所述il-21分子的c端相连，所述连接肽3的c端与所述第一fc区的n端相连。
40.根据本发明的一些具体的实施例，所述连接肽3包括seq id no：18所示的氨基酸序列。
41.ggggs(seq id no：18)。
42.根据本发明的一些具体的实施例，进一步包括连接肽4，所述连接肽4的n端与所述tigit胞外区的c端相连，所述连接肽4的c端与所述第二fc区的n端相连。
43.根据本发明一些具体的实施例，所述连接肽4包括seq id no：21所示的氨基酸序
列。
44.ggggs(seq id no：21)。
45.根据本发明一些具体的实施例，所述第一fc区和第二fc区通过knob into hole结构进行连接。
46.根据本发明一些具体的实施例，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
47.根据本发明一些具体的实施例，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自人源igg或其突变体。
48.根据本发明一些具体的实施例，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自人源igg1或其突变体。
49.根据本发明一些具体的实施例，所述第一fc区与野生型igg1 fc区相比具有缺少ch1区、t366w突变中的至少之一，所述第二fc区与野生型igg1 fc区相比具有缺少ch1区、t366s、l368a、y407v突变中的至少之一。
50.根据本发明一些具体的实施例，所述第一抗体fc区具有如seq id no:19所示的氨基酸序列，所述第二抗体fc区具有如seq id no:22所示的氨基酸序列。
51.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：19)。
52.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：22)。
53.根据本发明一些具体的实施例，所述重组抗体的具有seq id no：3、4所示的氨基酸序列。
54.qvtlresgpalvkptqtltltctfsgfslstsgmgvgwirqppgkalewlahiwwdddkrynpalksrltiskdtsknqvvltmtnmdpvdtatyycaqinpawfaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasqsvdfdgdsfmnwyqqkpgqppklliyttsnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpytfgqgtkleikggggshksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgsedsggggspkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：3)。
55.mmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqipggggspkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：4)。
56.在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸可以在一定条件下表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
57.根据本发明一些具体的实施例，所述核酸具有seq id no：1、2所示的核苷酸序列。
58.caggtaactttgagagaaagtggacccgcattggtcaaaccaacacaaactctgaccttgacttgcaccttctcaggcttcagcctttcaacatccggaatgggcgtaggctggattcgtcaacctcccggcaaggctctggagtggttggctcacatttggtgggacgacgacaaacggtataaccccgccctgaaatcacgtctgactatctccaaggatacctctaagaaccaggtggtactgactatgaccaatatggatcccgtcgataccgccacctactactgtgctcagataaatcccgcatggtttgcttactgggggcaaggcacactggttaccgtgtcatcaggtggtggaggtagcggtggaggagggtctggtggaggaggatctgacatcgtgatgacccaatctcccgattcacttgctgttagcctgggagagcgggctaccatcaattgcaaagcaagtcagtccgtggactttgacggagactcttttatgaactggtaccaacagaaaccaggccagcctcccaaactgctgatctacacaaccagtaatctggagagcggcgtgcctgacaggttttctggcagtggttctggcaccgactttacactgactatcagtagcctgcaggctgaggatgtggccgtctattattgccagcagtctaatgaagacccatacacattcggacaaggaaccaaacttgaaatcaagggaggtggaggatcccataaaagttcaagccaggggcaggatcgccatatgatcaggatgcggcagctgatcgatattgtcgaccagctgaagaattatgtgaacgacctggtgcctgaattcctcccagccccagaggatgtagagaccaactgcgagtggtcagcattttcatgttttcagaaagctcagctgaagtctgccaacacaggcaacaatgaaaggatcatcaacgtgtctattaagaagttgaagagaaagcctccatccacaaacgcaggaagacgccagaagcaccgacttacttgtccctcctgcgacagctacgaaaagaaacctcccaaggagtttctggaaaggtttaagtctctgctgcagaagatgattcaccagcatctgtcttctaggacacatggtagcgaggatagtggaggggggggttctcctaagtcatgcgataaaacacacacatgtccaccctgtcctgcaccagaagctgctggtggtccctcagtgtttttgtttcctcccaaaccaaaggacacactgatgatctcccggacccctgaggttacctgcgtcgtggtggatgtgtcccacgaggatccagaagtgaagtttaactggtacgtggacggagtcgaggtgcataatgcaaaaacaaaacccagagaggagcagtacaatagtacatatcgcgttgtctcagtgttgaccgtgctgcatcaggactggctgaatgggaaagaatacaaatgcaaggtctcaaacaaagccctgcctgcaccaattgagaagactatttcaaaagctaaaggccagccacgggagccacaggtatacactttgcccccatctagagaggagatgaccaagaaccaagtgtcactgtggtgccttgtaaaaggcttttatccctccgatattgccgtggagtgggaatcaaacggccagcctgaaaacaattacaaaaccacccctccagtgttggacagcgatggctccttcttcctctacagcaagctgacagtagataaatccagatggcagcagggaaatgtgttctcctgttccgtcatgcatgaggccctgcataaccattacacacaaaagtcactgtccctcagtcctggcaag(seq id no：1)。
59.atgatgacaggcaccattgaaaccaccgggaacatttcagccgaaaagggtggcagcatcatcctgcagtgtcatctgtctagtactacagcccaggtgacccaggtgaattgggagcagcaggaccagctgctggcaatctgtaacgccgacctcggttggcatattagccccagtttcaaggatagggtcgcacccggccccggattgggcctgacactccagagcctgaccgtgaacgatacaggtgaatacttttgtatttaccacacataccctgacggaacatatactggtaggatattcctcgaggtgctggaatcttcagtggccgagcacggggctcggtttcagattcctggaggtggagggagtcccaagagttgtgataagacacatacatgccctccctgcccagcacccgaagcagctggaggcccaagtgtgttcctgttccctcctaaacctaaggacaccctgatgatctcacgcactcctgaggttacctgcgtggtagtggatgtgtcccacgaagaccccgaggtgaaattcaactggtacgtcgatggagtcgaagtccataacgccaagaccaagcca
cgtgaggagcagtacaattcaacataccgagtggtgagtgtgctgaccgtcctccaccaggactggctgaacgggaaagagtacaagtgtaaggtgtctaataaagcattgcccgcccccatcgagaagacaatttcaaaggctaaaggtcagccacgagaaccccaagtttataccctgcctcccagccgggaggagatgaccaagaatcaggtcagtctttcttgtgccgtgaagggtttttacccctccgacatcgccgtggagtgggagtcaaacgggcagcccgagaataattataagacaacaccaccagtgctggactccgatggaagctttttcctggtgtccaagctcactgtcgacaagtctaggtggcaacagggaaatgtgttctcatgttccgtaatgcacgaggccctccataaccactatactcaaaagagcctgagcctgagtcccggcaag(seq id no：2)。
60.需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
61.在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，携带第二方面所述的核酸。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
62.在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组抗体的方法，包括：将第三方面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组抗体。根据本发明实施例的方法可以有效获得所述重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
63.根据本发明一些具体的实施例，所述细胞为真核细胞。
64.根据本发明一些具体的实施例，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
65.根据本发明的一些具体实施例，所述真核细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
66.在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、或第三方面所述的表达载体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达重组抗体，所述重组抗体可以同时与cd16a、cd155和il-21r进行结合，有效介导nk细胞对高表达cd155的肿瘤细胞的杀伤作用，且促使免疫细胞产生更少的促炎性细胞因子il-6，具有较强的肿瘤抑制能力和较高的安全性。
67.需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞，且不
包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
68.需要说明的是，本技术说明书中所述的“适合条件”，是指适合本技术所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
69.在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物，包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd155蛋白分子结合，进而可特异性识别肿瘤细胞，同时与cd16a和il-21r进行结合，从而促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，且具有较高的安全性。
70.需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
71.在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd155蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达肿瘤细胞，同时与cd16a和il-21r进行结合，从而促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防肿瘤的作用，且具有较高的安全性。
72.根据本发明一些具体的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
73.在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，所述药物包括：第一方面所述的重组抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第四方面所述的组合物。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd3、cd155和il-21r蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达肿瘤细胞，并促使nk细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，因此，包含所述重组抗体的一系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防癌症的作用，且具有较高的安全性。
74.根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
75.根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
76.根据本发明的一些具体实施例，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活
性成分。
77.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
78.如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
79.本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
80.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
81.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
82.在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组抗体在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述重组抗体可与cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的cd16和/或cd155和/或il-21r。
83.在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例提供的所述重组抗体可与cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测cd16和/或cd155和/或il-21r。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的cd16和/或cd155和/或il-21r蛋白，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的cd155水平后，判断其cd155水平是否过高于或低于正常水平。
84.根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测cd16a和/或cd155和/或il-21r。
85.下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
86.实施例1双特异性抗体分子的制备
87.本实施例进行双特异性抗体的生产，具体实验操作如下：利用expicho expression medium培养基(购自thermo fisher，a2910001)培养expicho细胞(购自thermo fisher)，调整细胞浓度为6
×
106/ml，以获得expicho细胞溶液。将含有a链(seq id no:1)
和b链编码基因(seq id no:2)的ptt5载体(购自苏州金唯智公司)加入2ml optisfm培养基(thermo fisher，12309019)中，获得溶液a，其中，a链(第一条肽链)编码基因包括编码cd16单链抗体(seq id no：5)、连接肽1(seq id no：6)、il-21分子(seq id no：7)、连接肽2(seq id no：8)、连接肽3(seq id no：9)和第一fc区(seq id no：10)的核苷酸序列，b链(第二条肽链)编码基因包括编码tigit胞外区(seq id no：11)、连接肽4(seq id no：12)和第二fc区(seq id no：13)的核苷酸序列。将160μl expifectaminecho转染试剂(thermo fisher，a29130)加入2ml optisfm培养基中，获得溶液b。然后将溶液a和溶液b混合，获得转染混合物，并在5分钟内将转染混合物全部加入50ml expicho细胞溶液中。在37℃、5％co2条件下培养1天后，加入8ml feed、300μl enhancer(thermo fisher，a29130)，并转入32℃、5％co2条件下培养9天后收获培养上清，其中第5天添加8ml feed。利用protein a纯化柱(购自ge)从培养上清中亲和纯化重组抗体(如图1所示)，seq id no:3和seq id no:4分别示出了该重组抗体中的片段a和片段b的氨基酸序列，其中，所述a片段包括cd16单链抗体(seq id no：14)、连接肽1(seq id no：15)、il-21分子(seq id no：16)、连接肽2(seq id no：17)、连接肽3(seq id no：18)和第一fc区(seq id no：19)的氨基酸序列，所述b片段包括tigit胞外区(seq id no：20)、连接肽4(seq id no：21)和第二fc区(seq id no：22)的氨基酸序列。
88.caggtaactttgagagaaagtggacccgcattggtcaaaccaacacaaactctgaccttgacttgcaccttctcaggcttcagcctttcaacatccggaatgggcgtaggctggattcgtcaacctcccggcaaggctctggagtggttggctcacatttggtgggacgacgacaaacggtataaccccgccctgaaatcacgtctgactatctccaaggatacctctaagaaccaggtggtactgactatgaccaatatggatcccgtcgataccgccacctactactgtgctcagataaatcccgcatggtttgcttactgggggcaaggcacactggttaccgtgtcatcaggtggtggaggtagcggtggaggagggtctggtggaggaggatctgacatcgtgatgacccaatctcccgattcacttgctgttagcctgggagagcgggctaccatcaattgcaaagcaagtcagtccgtggactttgacggagactcttttatgaactggtaccaacagaaaccaggccagcctcccaaactgctgatctacacaaccagtaatctggagagcggcgtgcctgacaggttttctggcagtggttctggcaccgactttacactgactatcagtagcctgcaggctgaggatgtggccgtctattattgccagcagtctaatgaagacccatacacattcggacaaggaaccaaacttgaaatcaagggaggtggaggatcccataaaagttcaagccaggggcaggatcgccatatgatcaggatgcggcagctgatcgatattgtcgaccagctgaagaattatgtgaacgacctggtgcctgaattcctcccagccccagaggatgtagagaccaactgcgagtggtcagcattttcatgttttcagaaagctcagctgaagtctgccaacacaggcaacaatgaaaggatcatcaacgtgtctattaagaagttgaagagaaagcctccatccacaaacgcaggaagacgccagaagcaccgacttacttgtccctcctgcgacagctacgaaaagaaacctcccaaggagtttctggaaaggtttaagtctctgctgcagaagatgattcaccagcatctgtcttctaggacacatggtagcgaggatagtggaggggggggttctcctaagtcatgcgataaaacacacacatgtccaccctgtcctgcaccagaagctgctggtggtccctcagtgtttttgtttcctcccaaaccaaaggacacactgatgatctcccggacccctgaggttacctgcgtcgtggtggatgtgtcccacgaggatccagaagtgaagtttaactggtacgtggacggagtcgaggtgcataatgcaaaaacaaaacccagagaggagcagtacaatagtacatatcgcgttgtctcagtgttgaccgtgctgcatcaggactggctgaatgggaaagaatacaaatgcaaggtctcaaacaaagccctgcctgcaccaattgagaagactatttcaaaagctaaaggccagccacgggagccacaggtatacactttgcccccatctagagaggagatgaccaagaaccaagtgtcactgtggtgccttgtaaaaggcttttatccctccgatattgccgtggagtgggaatcaaacggccagcctgaaaacaattacaaaaccacccctccagtgttggacagcgatggctccttcttcctctacagcaagctgacagtagataaatccagatggcagcagggaaatgtgttctcctgttccgtcatgcatg
aggccctgcataaccattacacacaaaagtcactgtccctcagtcctggcaag(seq id no:1)。
89.atgatgacaggcaccattgaaaccaccgggaacatttcagccgaaaagggtggcagcatcatcctgcagtgtcatctgtctagtactacagcccaggtgacccaggtgaattgggagcagcaggaccagctgctggcaatctgtaacgccgacctcggttggcatattagccccagtttcaaggatagggtcgcacccggccccggattgggcctgacactccagagcctgaccgtgaacgatacaggtgaatacttttgtatttaccacacataccctgacggaacatatactggtaggatattcctcgaggtgctggaatcttcagtggccgagcacggggctcggtttcagattcctggaggtggagggagtcccaagagttgtgataagacacatacatgccctccctgcccagcacccgaagcagctggaggcccaagtgtgttcctgttccctcctaaacctaaggacaccctgatgatctcacgcactcctgaggttacctgcgtggtagtggatgtgtcccacgaagaccccgaggtgaaattcaactggtacgtcgatggagtcgaagtccataacgccaagaccaagccacgtgaggagcagtacaattcaacataccgagtggtgagtgtgctgaccgtcctccaccaggactggctgaacgggaaagagtacaagtgtaaggtgtctaataaagcattgcccgcccccatcgagaagacaatttcaaaggctaaaggtcagccacgagaaccccaagtttataccctgcctcccagccgggaggagatgaccaagaatcaggtcagtctttcttgtgccgtgaagggtttttacccctccgacatcgccgtggagtgggagtcaaacgggcagcccgagaataattataagacaacaccaccagtgctggactccgatggaagctttttcctggtgtccaagctcactgtcgacaagtctaggtggcaacagggaaatgtgttctcatgttccgtaatgcacgaggccctccataaccactatactcaaaagagcctgagcctgagtcccggcaag(seq id no:2)。
90.a片段包括如下所示氨基酸序列：
91.qvtlresgpalvkptqtltltctfsgfslstsgmgvgwirqppgkalewlahiwwdddkrynpalksrltiskdtsknqvvltmtnmdpvdtatyycaqinpawfaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasqsvdfdgdsfmnwyqqkpgqppklliyttsnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpytfgqgtkleikggggshksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgsedsggggspkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:3)。
92.b片段包括如下所示氨基酸序列：
93.mmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqipggggspkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:4)。
94.编码cd16单链抗体的基因包括如下所示的核苷酸序列：
95.caggtaactttgagagaaagtggacccgcattggtcaaaccaacacaaactctgaccttgacttgcaccttctcaggcttcagcctttcaacatccggaatgggcgtaggctggattcgtcaacctcccggcaaggctctggagtggttggctcacatttggtgggacgacgacaaacggtataaccccgccctgaaatcacgtctgactatctccaaggatacctctaagaaccaggtggtactgactatgaccaatatggatcccgtcgataccgccacctactactgtgctcagataaatcccgcatggtttgcttactgggggcaaggcacactggttaccgtgtcatcaggtggtggaggtagcggtggaggagggtctggtggaggaggatctgacatcgtgatgacccaatctcccgattcacttgctgttagcctgggag
agcgggctaccatcaattgcaaagcaagtcagtccgtggactttgacggagactcttttatgaactggtaccaacagaaaccaggccagcctcccaaactgctgatctacacaaccagtaatctggagagcggcgtgcctgacaggttttctggcagtggttctggcaccgactttacactgactatcagtagcctgcaggctgaggatgtggccgtctattattgccagcagtctaatgaagacccatacacattcggacaaggaaccaaacttgaaatcaag(seq id no:5)。
96.编码连接肽1的基因包括如下所示的核苷酸序列：
97.ggtggtggaggtagcggtggaggagggtctggtggaggaggatct(seq id no:6)。
98.编码il-21分子的基因包括如下所示的核苷酸序列：
99.cataaaagttcaagccaggggcaggatcgccatatgatcaggatgcggcagctgatcgatattgtcgaccagctgaagaattatgtgaacgacctggtgcctgaattcctcccagccccagaggatgtagagaccaactgcgagtggtcagcattttcatgttttcagaaagctcagctgaagtctgccaacacaggcaacaatgaaaggatcatcaacgtgtctattaagaagttgaagagaaagcctccatccacaaacgcaggaagacgccagaagcaccgacttacttgtccctcctgcgacagctacgaaaagaaacctcccaaggagtttctggaaaggtttaagtctctgctgcagaagatgattcaccagcatctgtcttctaggacacatggtagcgaggatagt(seq id no:7)。
100.编码连接肽2的基因包括如下所示的核苷酸序列：
101.ggaggtggaggatcc(seq id no:8)。
102.编码连接肽3的基因包括如下所示的核苷酸序列：
103.ggaggggggggttct(seq id no:9)。
104.编码第一fc区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
105.cctaagtcatgcgataaaacacacacatgtccaccctgtcctgcaccagaagctgctggtggtccctcagtgtttttgtttcctcccaaaccaaaggacacactgatgatctcccggacccctgaggttacctgcgtcgtggtggatgtgtcccacgaggatccagaagtgaagtttaactggtacgtggacggagtcgaggtgcataatgcaaaaacaaaacccagagaggagcagtacaatagtacatatcgcgttgtctcagtgttgaccgtgctgcatcaggactggctgaatgggaaagaatacaaatgcaaggtctcaaacaaagccctgcctgcaccaattgagaagactatttcaaaagctaaaggccagccacgggagccacaggtatacactttgcccccatctagagaggagatgaccaagaaccaagtgtcactgtggtgccttgtaaaaggcttttatccctccgatattgccgtggagtgggaatcaaacggccagcctgaaaacaattacaaaaccacccctccagtgttggacagcgatggctccttcttcctctacagcaagctgacagtagataaatccagatggcagcagggaaatgtgttctcctgttccgtcatgcatgaggccctgcataaccattacacacaaaagtcactgtccctcagtcctggcaag(seq id no:10)。
106.编码tigit胞外区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
107.atgatgacaggcaccattgaaaccaccgggaacatttcagccgaaaagggtggcagcatcatcctgcagtgtcatctgtctagtactacagcccaggtgacccaggtgaattgggagcagcaggaccagctgctggcaatctgtaacgccgacctcggttggcatattagccccagtttcaaggatagggtcgcacccggccccggattgggcctgacactccagagcctgaccgtgaacgatacaggtgaatacttttgtatttaccacacataccctgacggaacatatactggtaggatattcctcgaggtgctggaatcttcagtggccgagcacggggctcggtttcagattcct(seq id no:11)。
108.编码连接肽4的基因包括如下所示的核苷酸序列：
109.ggaggtggagggagt(seq id no:12)。
110.编码第二fc区的基因包括如下所示的核苷酸序列：
111.cccaagagttgtgataagacacatacatgccctccctgcccagcacccgaagcagctggaggcccaag
tgtgttcctgttccctcctaaacctaaggacaccctgatgatctcacgcactcctgaggttacctgcgtggtagtggatgtgtcccacgaagaccccgaggtgaaattcaactggtacgtcgatggagtcgaagtccataacgccaagaccaagccacgtgaggagcagtacaattcaacataccgagtggtgagtgtgctgaccgtcctccaccaggactggctgaacgggaaagagtacaagtgtaaggtgtctaataaagcattgcccgcccccatcgagaagacaatttcaaaggctaaaggtcagccacgagaaccccaagtttataccctgcctcccagccgggaggagatgaccaagaatcaggtcagtctttcttgtgccgtgaagggtttttacccctccgacatcgccgtggagtgggagtcaaacgggcagcccgagaataattataagacaacaccaccagtgctggactccgatggaagctttttcctggtgtccaagctcactgtcgacaagtctaggtggcaacagggaaatgtgttctcatgttccgtaatgcacgaggccctccataaccactatactcaaaagagcctgagcctgagtcccggcaag(seq id no:13)。
112.cd16单链抗体包括如下所示的氨基酸序列：
113.vtlresgpalvkptqtltltctfsgfslstsgmgvgwirqppgkalewlahiwwdddkrynpalksrltiskdtsknqvvltmtnmdpvdtatyycaqinpawfaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratinckasqsvdfdgdsfmnwyqqkpgqppklliyttsnlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpytfgqgtkleik(seq id no:14)。
114.连接肽1包括如下所示的氨基酸序列：
115.ggggsggggsggggs(seq id no:15)。
116.il-21分子包括如下所示的氨基酸序列：
117.hksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds(seq id no:16)。
118.连接肽2包括如下所示的氨基酸序列：
119.ggggs(seq id no:17)。
120.连接肽3包括如下所示的氨基酸序列：
121.ggggs(seq id no:18)。
122.第一fc区包括如下所示的氨基酸序列：
123.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:19)。
124.tigit胞外区包括如下所示的氨基酸序列：
125.mmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqip(seq id no:20)。
126.连接肽4包括如下所示的氨基酸序列：
127.ggggs(seq id no:21)。
128.第二fc区包括如下所示的氨基酸序列：
129.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:22)。
130.实施例2重组抗体与cho-k1-cd16a细胞的结合能力鉴定
131.本实施例使用流式细胞术检测重组抗体的结合特性，并基于重组抗体加入后信号的强弱用于判断重组抗体和cho-k1-cd16a细胞的结合特性。
132.hek293t细胞按照5
×
105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-cd16a-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入编码cd16a蛋白的核苷酸序列(seq id no:23)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共计3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem培养基中，加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司)，获得的cd155蛋白具有seq id no:24所示的氨基酸序列。混匀后静置16min，然后将全部液体加入铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去原培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养，转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
×
104个cho-k1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为cho-k1-cd16a细胞。
133.atgtggcagctgcttttgccaaccgccttgctgttgctcgttagtgctggtatgcggactgaagatctgcctaaggcagtcgtcttcctcgaaccacaatggtaccgtgtgctggaaaaagacagtgtcactttgaaatgccaaggggcttattctcctgaggataactccacacagtggtttcacaatgagtccctgatctcatcccaggcttcaagctactttattgatgcagcaaccgtggacgactccggggaataccggtgccagaccaacctgtctactttgtctgaccccgttcagctcgaagtgcacatcggttggctgctgcttcaggcccctaggtgggtcttcaaggaggaggaccctattcatctgcggtgccattcctggaagaacacagctctgcacaaggtgacctacttgcagaacgggaaaggcaggaagtacttccaccataattccgatttctatatcccaaaggccacattgaaggattccggaagttacttctgtcgcgggctttttggaagcaagaacgtgtcttctgagactgtcaacattacaatcacccagggattggccgtgagtactatttccagtttcttccccccaggttaccaggttagcttttgcctggttatggtgctgttgtttgctgtggacaccggtctgtacttcagcgtcaagacaaacatcagatcttctactagggattggaaggaccacaagttcaagtggaggaaggacccccaggataaa(seq id no:23)。
134.mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglfgsknvssetvnititqglavstissffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdk(seq id no:24)。
135.用pbs将cho-k1-cd16a细胞稀释为1
×
106个/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管小鼠血清，于4℃封闭30min。加入一系列浓度梯度(10-3
、10-2
、10-1
、100、101、102μg/ml)的重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd16
×
tigitextra)、对照抗体igg(igg1，biolegend，qa16a12)，添加体积为10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，向其中加入1μl/管alexa-647标记的小鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，hp6017)，4℃、避光孵育30min。孵育结束后，用pbs洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管pbs重悬细胞沉淀，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图2所示，说明本发明重组抗体能够结合cho-k1-cd16a细胞。
136.实施例3重组抗体与cho-k1-cd155细胞的结合能力鉴定
137.本实施例使用流式细胞术检测重组抗体的结合特性，并基于重组抗体加入后信号
的强弱用于判断重组抗体和cho-k1-cd155细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
138.hek293t细胞按照5
×
105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-cd155-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入有cd155蛋白(seq id no:25)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem培养基中，加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司，获得的cd155蛋白具有seq id no:26所示的氨基酸序列。混匀后静置16min，然后将全部液体加入铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
×
104cho-k1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为cho-k1-cd155细胞。
139.atggctagagcaatggcagctgcttggccacttttgttggtagcactcctggtgctttcatggcccccacctggaactggcgatgtggtcgtgcaggctcctacccaggtgcctggtttcttgggggattctgtcacactgccatgttaccttcaggttcctaacatggaagtcactcacgtgtcccaactgacatgggctaggcacggtgagtctggctccatggccgtgttccaccagacacagggtcctagttattcagagtccaaacgcttggagtttgtcgccgcaagactgggggctgagttgaggaatgcaagcctgcggatgttcggacttcgggtcgaagatgaagggaactacacctgcttgtttgttacctttcctcagggtagcagatccgttgacatatggttgagagtactggccaagccacagaatactgcagaggtccagaaggtccagttgacaggcgaacctgtgccaatggcaagatgcgtttccaccggtggtagaccaccagctcagattacttggcatagtgacctgggcgggatgcctaacacatctcaagtgcctggctttttgtcaggcaccgtcactgtgacctccctttggatcctggttccaagttctcaggttgacggcaaaaacgtaacatgcaaggtggagcatgagagctttgagaagccacagctccttaccgtgaatctcaccgtgtattaccctcctgaggtgtctatcagcggatatgacaacaactggtatctcgggcagaatgaggcaaccctgacctgtgatgctcgcagtaatcctgagcccaccgggtataattggagcactaccatgggcccacttccccctttcgctgtggctcagggcgcacaactgcttattcggcctgtagataagcccattaacaccactttgatctgtaacgtgactaatgctttgggagctcgccaggccgaattgaccgtacaggtgaaagaaggtcctccttccgagcattccggcatttcccgaaacgccatcatttttctggtgctgggtatcctggtgtttctgatcttgttggggatcggtatctacttttactggtccaaatgcagccgcgaagtcctgtggcactgccatctgtgcccaagttctactgagcacgcctctgcctccgcaaatggtcacgtgtcctacagtgctgtgtctagagagaactcatctagtcaggatcctcagactgagggtactcgg(seq id no:25)。
140.maramaaawplllvallvlswpppgtgdvvvqaptqvpgflgdsvtlpcylqvpnmevthvsqltwarhgesgsmavfhqtqgpsyseskrlefvaarlgaelrnaslrmfglrvedegnytclfvtfpqgsrsvdiwlrvlakpqntaevqkvqltgepvpmarcvstggrppaqitwhsdlggmpntsqvpgflsgtvtvtslwilvpssqvdgknvtckvehesfekpqlltvnltvyyppevsisgydnnwylgqneatltcdarsnpeptgynwsttmgplppfavaqgaqllirpvdkpinttlicnvtnalgarqaeltvqvkegppsehsgisrnaiiflvlgilvflillgigiyfywskcsrevlwhchlcpsstehasasanghvsysavsrensssqdpqtegtr(seq id no:26)。
141.用pbs将cho-k1-cd155细胞稀释为1
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管小鼠血清，于4℃封闭30min。加入一系列浓度梯度(10-3
、10-2
、10-1
、100、101、102μg/ml)的重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd16
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd3
×
tigitextra)、对照抗体igg(igg1，biolegend，qa16a12)10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后向ep管中加入1ml pbs，4℃100g
×
5min离心，弃尽上
清，再用pbs洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，向其中加入1μl/管alexa-647标记的小鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，hp6017)，4℃、避光孵育30min。孵育结束后用pbs洗两遍，离心后弃尽上清；用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图3所示，进一步显示本发明的重组抗体能够结合cho-k1-cd155细胞。
142.实施例4重组抗体与nci-h1299肺癌细胞的结合能力鉴定
143.本实施例使用流式细胞术检测重组抗体的结合特性，并基于重组抗体加入后信号的强弱用于判断重组抗体和nci-h1299细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
144.用pbs将nci-h1299细胞稀释为1
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管小鼠血清，于4℃封闭30min。封闭结束后，向其中加入一系列浓度梯度(10-3
、10-2
、10-1
、100、101、102μg/ml)的重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd16
×
tigitextra)、对照抗体igg(igg1，biolegend，qa16a12)的重组抗体10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后，向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，向其中加入1μl/管alexa-647标记的小鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，hp6017)，4℃、避光孵育30min。孵育结束后用pbs洗两遍，离心后弃尽上清；用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图4所示，进一步显示本发明的重组抗体能够结合nci-h1299细胞。
145.实施例5重组抗体对pbmc杀伤肿瘤细胞的影响
146.本实施例共设置2组，分别为肺癌nci-h1299细胞+pbmc+重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)、肺癌nci-h1299细胞+pbmc+双特异性抗体(cd16
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tigitextra)组，具体实验操作如下：
147.(1)向16孔rtca板中加入完全dmem培养基，上机校准；
148.(2)用完全dmem培养基将肿瘤细胞稀释为2
×
105/ml，加入步骤(1)获得的rtca板中，50μl/孔，然后于37℃、5％co2条件下使用xcelligence rtca tp设备检测24h；
149.(3)用完全dmem将重组抗体稀释为一系列浓度梯度(10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、100、101、102μg/ml)，加入步骤(2)获得的rtca板中，20μl/孔；
150.(4)用完全dmem将pbmc稀释为1.25
×
106个细胞/ml，加入步骤(3)获得的rtca板中，添加体积为80μl/孔；
151.(5)将上述获得的各组于37℃、5％co2条件下使用xcelligence rtca tp设备检测72h。
152.具体的实验结果如图5所示，进一步显示本发明的重组抗体能够促进pbmc杀伤表达cd155的肺癌nci-h1299细胞。并且本发明的重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)抗癌功能强于cd16
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tigitextra双特异抗体。
153.实施例6：重组抗体对pbmc产生il-6的影响
154.本实施例的具体实验操作步骤如下：
155.利用th1/th2/th17细胞因子检测试剂盒(bd，560484)检测pbmc(赛笠生物)和nci-h1299细胞共孵育上清中细胞因子的表达水平，具体的实验操作参考试剂盒中的说明书进行，具体操作为：
156.(1)利用试剂盒中的稀释液溶解标准品，并将其稀释为一系列梯度(0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml)；
157.(2)将细胞因子beads加入流式细胞管中，50μl/管；
158.(3)将稀释后的标准品、共孵育上清加入流式管中，添加体积为50μl/管；
159.(4)将重组抗体(cd16
×
il21
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd16
×
tigitextra)、双特异性抗体(cd3
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tigitextra)分别加入不同的流式管中，添加体积为50μl/管；
160.(5)将步骤(4)获得混合液混合均匀，于室温避光条件下孵育3小时；
161.(6)结束上述孵育后于体系中加入清洗液，添加体积为1ml/管，然后于4℃、200g条件下离心10min，弃上清；
162.(7)将步骤(6)获得的物质用pbs进行重悬，利用流式细胞仪进行检测。
163.具体的实验结果如图6所示，进一步显示相比于cd16
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tigitextra、cd3
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tigitextra双特异抗体，本发明的重组抗体(cd16
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il21
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tigitextra)促使pbmc产生更少il-6。
164.从以上实验结果可以看出，本发明得到的重组抗体能够结合cd16a阳性细胞、肿瘤细胞，促进nk细胞杀伤肿瘤细胞，且产生更少促炎性细胞因子il-6。
165.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
166.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。