egfr基因突变多重检测引物探针及其试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种egfr基因突变检测产品，属于生物技术领域。
背景技术：2.egfr基因的突变在几种癌症类型中很常见，而且这些突变往往会导致表达和活性的改变。这种类型的激活突变经常发生在上皮性癌症，特别是肺癌和胶质母细胞瘤，也是我国肺腺癌发生的主要驱动基因。肺癌在所有恶性肿瘤中的发病率和死亡率位居首位，非小细胞肺癌(nsclc)是世界上最常见的癌症之一，经常与egfr的突变有关。egfr的上调和过表达可导致不受控制的细胞分裂，导致组织恶性生长并导致癌症。一个常见的例子是egfr第21外显子中的一个点突变(c.2573t》g)，通常被称为l858r变异，另一种高频突变是egfr突变是位于第19外显子的高度可变缺失。egfr酪氨酸激酶抑制剂(tkis)已被证明对治疗具有egfr激活突变的非小细胞肺癌(nsclc)患者有效。然而，大多数应答者最终对egfr-tkis产生了获得性耐药性，其中，在近一半对egfr-tkis耐药的病例中观察到继发性错义t790m突变。
3.在过去的40年里，非小细胞肺癌(nsclc)的治疗取得了巨大的进展。致癌驱动因子如egfr(表皮生长因子受体)的发现，使癌症治疗的一个新的、越来越有效的阶段成为可能。由于空间和时间的异质性，使用初始组织样本的分子检测方法不适合在整个治疗过程中进行治疗指导，特别是在疾病进展后。癌症组织通常是高度异质性的，癌症生物标志物在疾病类型和疾病进展阶段而不同，这使早期阶段的癌症检测和识别复杂化。因此，在其他易于动态获得的标本中研究了检测突变的方法，如使用血浆、胸膜液和痰等标本。血浆细胞游离dna(cfdna)作为一种液体活检，被研究作为一种潜在的有价值的检测肿瘤特异性畸变的替代标本。使用cfdna进行肿瘤突变检测的优点包括i)无创收集，ii)病程中任何时间的可用性，iii)实时检测和动态监测与肿瘤组织检测相比，异质性问题可能更少。事实上，cfdna中的egfr激活突变状态已被证明能够预测egfr-tki治疗nsclc的疗效。然而，在检测cfdna检测肿瘤egfr突变方面仍存在技术挑战。来自个体患者的cfdna的存在和/或浓度可能是可变的，而且通常往往较低。cfdna片段相对较小，峰值大小约为180bp。肿瘤来源的dna部分在总cfdna中的百分比是单独可变的，往往太低，无法检测。最后，既往研究报道，与肿瘤组织检测相比，cfdna中egfr突变检测的敏感性仅为43％～66％。因此，开发一种具有高灵敏度的基于cfdna的egfr突变检测方法具有重要意义。
4.聚合酶链反应(pcr)的发明改变了生命科学的研究和分子诊断。现在，数字pcr(dpcr)正在改变传统pcr的领域，并重新定义了对突变检测的检测下线。对于许多检测方法，dpcr的敏感度明显高于传统的pcr分析，并且通过单独计数更多的分子，提高了检测方法的准确性和精度。数字pcr的敏感性将会提高检测限制重新定义了我们对疾病发病、进展和复发的理解。数字pcr的一个特别有吸引力的应用是在大量野生型分子中定量检测少量的突变dna分子，这与癌症研究有关，特别是与次要等位基因的检测有关。
技术实现要素：5.本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测体系的特异性与灵敏度高，游离dna的利用率高，准确度高的egfr基因突变多重检测引物探针，以及采用该引物探针的试剂盒。
6.本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种egfr基因突变多重检测引物探针，包括检测egfr基因20号外显子t790m突变的上游引物f-t790m、下游引物r-t790m、野生型探针wp-t790和突变型探针mp-t790m，检测egfr基因21号外显子l858r突变的上游引物f-l858r、下游引物r-l858r、野生型探针wp-l858和突变型探针mp-l858r，以及检测egfr基因19号外显子片段缺失突变的上游引物f-e19del、下游引物r-e19del、野生型探针wp-e19和突变型探针mp-e19del；
7.所述上游引物f-t790m的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物r-t790m的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述野生型探针wp-t790的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述突变型探针mp-t790m的核苷酸序列如seq id no.4所示；
8.所述上游引物f-l858r的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述下游引物r-l858r的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述野生型探针wp-l858的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述突变型探针mp-l858r的核苷酸序列如seq id no.8所示；
9.所述上游引物f-e19del的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述下游引物r-e19del的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述野生型探针wp-e19的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述突变型探针mp-e19del的核苷酸序列如seq id no.12所示。
10.上述突变型探针mp-t790m的使用浓度为30nm，所述突变型探针mp-l858r的使用浓度为10nm，所述突变型探针mp-e19del的使用浓度为50nm。所有引物的使用浓度为50nm。所有野生型探针的使用浓度为20nm。
11.所有野生型探针和突变型探针为经过修饰的mgb探针，所有野生型探针的5’端为vic荧光基团修饰，所有突变型探针的5’端为fam荧光基团修饰，所有突变型探针的3’端为nfq基团修饰。
12.本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述引物探针的egfr基因突变多重检测试剂盒。
13.上述egfr基因突变多重检测试剂盒还包括带有egfr基因t790m突变的质粒，带有egfr基因l858r突变的质粒，以及带有egfr基因19号外显子片段缺失的e19del突变的质粒。
14.本发明具有积极的效果：
15.(1)本发明的egfr基因突变多重检测产品的标准品是用酶切后的正常cfdna和酶切后的插入egfr基因e19del、l858r和t790m突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成，不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用cfdna和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征，给体系的优化提供了很多的基础，在体系优化中起到决定性的作用。
16.(2)本发明的egfr基因突变多重检测产品通过中突变频率标准品的数字pcr检测结果确定各突变探针在不同浓度下产生的终点荧光信号值，使得数据统计的结果更加准确。本发明的egfr基因e19del、l858r和t790m突变检测体系通过野生型模板的数字pcr检测结果确定检测体系各突变位点的背景阈值，检测样本的突变拷贝数时，突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值，可以使得结果更加准确。
17.(3)本发明的egfr基因突变多重检测产品通过低突变频率标准品的数字pcr检测结果，可以确定检测体系的灵敏度。
18.(4)本发明的egfr基因突变多重检测产品检测突变的优化通过高突变频率标准品的传统实时荧光pcr检测结果进行各探针浓度优化，根据各突变不同浓度探针反应后荧光强度的差异，选择合适的探针浓度，该方法结果准确，成本较低。
19.(5)本发明的egfr基因突变多重检测产品的引物探针为自行设计，探针为mgb探针，探针序列更短，特异性好。引物探针经过多重组合优化选定，扩增效率高，灵敏度高。
20.(6)本发明的egfr基因突变多重检测产品快速，高效，成本较低，准确度高可根据样本中微量的e19del、l858r和t790m突变ctdna快速准确的监测出肿瘤患者egfr基因发生的各种突变，因此可将数字pcr平台用于ctdna的检测，能及时监测患者新的基因突变的发生，为临床治疗方案的制定和调整提供依据。
附图说明
21.图1为实施例的试剂盒检测全野生型模板的反应数据结果图；
22.图2为实施例的试剂盒检测突变野生比为0.5的模板的反应数据结果图；
23.图3为实施例的试剂盒检测突变野生比为0.0001的模板的反应数据结果图；
24.图4为不同浓度突变型探针的突变信号fam荧光的强度分布图。
具体实施方式
25.下面介绍的内容是通过具体实施例对本发明内容进行描述，其中需要指出的有：接下来的实施例只用于对本发明进行说明，并不表示对该发明所保护范围的限制，任何第三方可以根据本发明所阐述的方法及内容作出一些非本质的改进和调整。在接下来的实施例中，除存在特别申明，所用的试剂均默认为分析纯，所用试剂均可通过商业购买获得。该发明未做出明确表示的实验方法，基本可按照常规实验方法如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》书籍中所公布的基础生化分子实验方法进行完成，或者按照试剂供应商明确表明的实验方法进行得到。除了少数文中明确指出的定义，文中所涉及的全部专业和科学用语与本领域技术人员所共识的意义一致。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
26.主要试剂：
27.本专利内容涉及所有实验所用试剂耗材均从正规试剂耗材生产厂商购买，用到主要试剂有(少数通用常规试剂不再列举)：25
×
droplet stabilizer(raindance)、taqman genotypingmaster mix(2
×
)(applied biosystems)、ecor i内切酶(takara，1040a)、10
×
t buffer(takara，1116a)、0.1％bsa(takara，1116a)、质粒小量提取试剂盒(d1100，北京索莱宝科技有限公司)、qiaamp circulating nucleic acid kit(50)(55114，qiagen公司)、qubit
tm
dsdna hs assay kit(q32854)等。
28.主要仪器：
29.磁力架、漩涡震荡仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、miniamp pcr仪(厂家：applied biosystems)、生物安全柜、水浴锅、raindropsource(raindance technologies)、移液枪、raindropsense(raindance technologies)等。
30.实施例
31.本实施例的egfr基因突变多重检测试剂盒包括检测egfr基因20号外显子t790m突变的上游引物f-t790m、下游引物r-t790m、野生型探针wp-t790和突变型探针mp-t790m，检测egfr基因21号外显子l858r突变的上游引物f-l858r、下游引物r-l858r、野生型探针wp-l858和突变型探针mp-l858r，检测egfr基因19号外显子片段缺失突变的上游引物f-e19del、下游引物r-e19del、野生型探针wp-e19和突变型探针mp-e19del，带有egfr基因t790m突变的质粒，带有egfr基因l858r突变的质粒，带有egfr基因19号外显子片段缺失的e19del突变的质粒。
32.本实施例中涉及的引物、探针和质粒的设计均有普瑞斯新(上海)生物医疗科技有限公司实验室技术人员自行设计，合成单位是南京金斯瑞生物科技有限公司完成，引物和探针的核苷酸序列如表1所示。
33.表1引物探针特征表
[0034][0035]
引物为常规引物，探针为经过修饰的mgb探针，所有野生型探针的5’端荧光修饰基团为vic荧光(wp-t790、wp-l858、wp-e19)，3’端为nfq基团修饰；所有突变型探针的5’端荧光修饰基团为fam荧光(mp-t790m、mp-l858r、mp-e19del)，3’端为nfq基团修饰。
[0036]
本实施例中用到的野生型扩增模板采用的是非肿瘤患者健康人游离dna(cfdna)，突变型扩增模板采用的是实验室人工构建的质粒，该质粒经过内切酶酶切处理成线性结构。
[0037]
将野生型模板和突变型模板按不同的拷贝数比例配制成理论突变频率的模板，制备方法如下：
[0038]
1.样本抽提。
[0039]
血浆抽提使用qiaamp circulating nucleic acid kit(50)(55114，qiagen公司)试剂盒进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的产品说明。
[0040]
质粒的提取采用的是质粒小量提取试剂盒(d1100，北京索莱宝科技有限公司)，按照产品说明书进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的官方说明书。
[0041]
2.cfdna和突变质粒的浓度测定。
[0042]
提取得到的cfdna和质粒用为3.0荧光定量仪，使用qubit
tm
dsdna hs assay kit(q32854)进行定量，具体的实验操作步骤参照试剂盒中自带的说明书。
[0043]
3.标准品的制备。
[0044]
1)质粒模板酶切线化及回收。
[0045]
血浆游离dna为高度片段化的核酸双链，无需进行片段化。
[0046]
将定量后的突变质粒进行酶切，如下表2所示。
[0047]
表2各种突变质粒的酶切反应体系
[0048]
成分用量10
×
sebuffer10μlbsa10μlecorⅰ1.0μl质粒dna79.0μl
[0049]
酶切后的突变采用磁珠法回收方法如下：
[0050]
a.将酶切后的产物全部转移至一个1.5ml的ep管中，向ep管中加入ampure xp reagent磁珠，反复吹打混匀，室温静置，计时5min。
[0051]
b.将ep转移至磁力架上，静置10min，磁珠和溶液分离，待磁珠完全吸附于管壁，用移液器吸取液体，弃溶液。
[0052]
c.加入用200μl新鲜配置的80％的乙醇水溶液，没过磁珠。
[0053]
d.弃清洗过的乙醇溶液，重复上一步，弃乙醇溶液，并用10μl移液器吸去残留的少量溶液，晾干。
[0054]
e.待磁珠干燥，用80μl的去离子水加入ep管子，溶解磁珠，吹打混匀，至于磁力架上，静置约10min，至磁珠和液体完全分离。
[0055]
f.小心吸取转移79μl的澄清的dna溶液于新的ep管中。
[0056]
g.将纯化得酶切产物，取1μl使用3.0进行定量。
[0057]
2)配置实验所需标准品
[0058]
①
理论上，人类dna每1ng的单个基因拷贝数约300ng计算，将血浆游离dna(cfdna)逐级稀释到约2.0
×
105copies/μl。
[0059]
②
酶切后得到的质粒拷贝数计算，9.1
×
108×
质粒浓度(ng/μl)
÷
质粒长度(2800bp)；将得到的质粒逐级稀释到2.0
×
106copies/μl、2.0
×
105copies/μl、2.0
×
102copies/μl、20copies/μl。
[0060]
③
配置实验所需标准品：取10ul的2.0
×
105copies/μlcfdna和同等体积的2.0
×
105copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入同等体积去离子水，得到1.0
×
105copies/μl模板，突变频率0.5，取10ul的2.0
×
105copies/μlcfdna和1ul体积的2.0
×
103copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0
×
105copies/μl模板，突变频率为0.001模板；取10ul的2.0
×
105copies/μlcfdna和1ul体积的2.0
×
102copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0
×
105copies/μl模板，突变频率为0.0001模板。
[0061]
本实施例使用miniamp pcr仪(厂家：applied biosystems)测定各突变位突变型探针的最适工作浓度，以达到在实验反应的终点区分开各突变位点的目的。
[0062]
本实施例采用实时荧光定量(qpcr)反应进行探针浓度的优化。
[0063]
根据开发的目的，确定三组引物(50nm)和三种野生型探针(20nm)的工作浓度恒定不变，将三组引物和三位点的野生型探针提前混合均匀成mix1，分别调节各突变型探针的
工作浓度，以最大限度使各突变型探针的区分相互独立：
[0064]
确定将各突变位点的突变型探针实验终浓度分别是10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、和60nm。使用突变型模板和野生型模板按照拷贝数比例1∶1配制成扩增模板，根据表3所示的qpcr反应体系组分表，配制qpcr反应体系。
[0065]
表3 qpcr反应体系组分表
[0066][0067]
其中的x表示突变型探针的体积。
[0068]
根据表4所示的qpcr反应程序进行qpcr反应。在miniamp pcr仪(厂家：applied biosystems)反应28各循环。
[0069]
表4 qpcr的反应程序
[0070][0071]
qpcr反应结束，在突变模板和野生型模板在1∶1情况下，记录在各突变探针浓度下，突变的荧光信号值，根据各荧光信号值汇总统计，综合统筹选出多重体系中各探针最适合的浓度，避免数字pcr(ddpcr)反应各反应微滴的相互干扰。
[0072]
表5 qpcr反应结果
[0073][0074]
根据各探针的终点荧光信号值做出如图4所示的突变信号fam荧光的强度分布图，由图中各突变信号的荧光值的位置就可以合理挑选出多重ddpcr体系中各突变探针的浓度值。
[0075]
由图4可知，确定三组引物(50nm)和三种野生型探针(20nm)的工作浓度恒定不变时，随着突变型探针的工作浓度不断上升时，荧光值在不断上升，继而到达平台期，此时随着浓度的上升荧光值并没有随之上升，根据各探针在不同浓度下的荧光信号的差异，选择各突变位点终点信号差异最大的荧光浓度作为ddpcr进行后续的检测实验和试剂盒开发。由以上原则，选择各突变型探针最适合的探针浓度为：egfr基因19号外显子e19del检测突变型探针mp-e19del浓度为50nm；egfr基因20号外显子t790m检测突变型探针mp-t790m浓度为30nm；egfr基因21号外显子l858r检测突变型探针mp-l858r浓度为10nm。这三种探针浓度组合时，突变信号值相互影响最小，可大大降低假阳性和提高检测的灵敏度。
[0076]
本实施例的egfr基因突变多重检测试剂盒根据以上的实验结论，进行下一步ddpcr反应，验证该体系的有效性，先根据上述结论将所有引物探针配制成mix2，然后加入公共试剂成分和反应模板进行后续实验，ddpcr反应体系如表6所示。
[0077]
表6 ddpcr反应体系组分表
[0078][0079]
使用突变型模板和野生型模板按照表7所示的突变频率配制成相应的突变模板。
[0080]
表7 ddpcr反应突变模板
[0081][0082]
进行dpcr反应，ddpcr反应程序如表8所示。
[0083]
表8 ddpcr反应程序表
[0084][0085]
反应结束后，采用raindance公司仪器自带的桌面化软件raindropanalyst
ꢀⅱ
(v1.0.0)进行后续的分析，步骤如下：
[0086]
1.双击打开raindropanalyst
ꢀⅱ
软件，左键点击“add sample”机器自动读取fcs数据文件导入该软件，准备进行后续的分析。
[0087]
2.第一步选定突变频率为0.5样本数据进行分析，此时，可粗略选定阴性点集合、野生型探针vic荧光点集合和带有fam荧光的突变型点集，使用“apply spectral compensation”功能按钮，纵坐标设置成fam荧光信号值，横坐标设置成了vic设置成信号值。
[0088]
3.软件界面“elliptical gate”功能框可选取并调整聚集点的区域范围，选取的聚集点尽可能集中，并使其阳性突变频率尽可能接近理论值50％的突变频率，将该标准品的选择区域范围作为标准选取范围标准，并将应用于其他样本的分析。
[0089]
使用本实施例的反应体系在进行数据分析时，需将已知各位点突变为0.5的标准品使用同一实验体系和实验条件伴随进行。首先分析突变频率为0.5的标准品实验所得的数据，以此确定野生型聚集点区域和各突变位点聚集区的最适区域，为样本分析提供最适选择区域。与此同时，由突变频率为0.5的标准品计算出每一突变位点野生突变位点的比例常数k，k＝tt/na，常数k将用于该批次反应拥有不同突变频率样本的野生型位点数的计算，如图2所示，t790m:k＝878646/2676463＝0.328；l858r:k＝354616/2676463＝0.132；e19del：k＝791967/2676463＝0.295。
[0090]
使用本实施例的egfr基因突变多重检测试剂盒的过程中，需设置全野生型的标准品采用同样的体系和方法进行伴随实验，全野生型标准品分析得到突变区域内的阳性位点个数为同一批样本的假阳性背景数值(tf)，如图1所示，t790m:8，l858r:9，e19del:7。真阳性位点值(tt)＝总位点数(tn)-假阳性背景数值(tf)如图3所示，t790m:97-8＝89，l858r:48-9＝39，e19del:77-7＝70。
[0091]
使用本实施例的反应体系和反应程序，在各位点突变频率计算时，突变频率(v)＝tt/(tt+nt)*100％，其中nt代表该位点的野生型突变位点数，nt＝k*na，na是总的野生型位
点数，k由突变频率为0.5的标准品实验体系计算得到。如图3所示，t790m：89/(2799361*0.328+89)*100％＝0.012％，l858r：48-9＝39/(2799361*0.132+39)*100％＝0.00043％，e19del：70/(2799361*0.295+70)*100％＝0.00084％，所以该试剂盒的灵敏度可达到万分之一，特异性较好、信噪比高。
[0092]
本发明的egfr基因突变多重检测试剂盒将用于解决血浆游离cfdna检测突变灵敏都不够、灵敏度低、准确度低和血浆游离cfdna不足等问题，该检测方法体系还可用于，全血、脑脊液、胸腹水和组织样品。
[0093]
本发明是提供一种基于数字pcr系统的egfr基因多点突变的多重反应体系，提高血浆游离dna(cfdna)中微量肿瘤dna(ctdna)egfr基因21号外显子l858r、19号外显子多重片段缺失和20号外显子t790m突变的检测灵敏度和准确度，独立的一个ddpcr反应体系同时检测3个egfr基因多重热点突变，提高了血浆游离dna的利用效率，降低检测成本，并在后期通过优化体系进行试剂盒的开发。
[0094]
本发明野生型模板是酶切后的正常人体cfdna，突变型模板是酶切后的插入egfr基因各突变片段的突变质粒。将突变型模板和野生型模板按1∶1的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，首先使用普通的荧光定量qpcr仪器上进行充分的pcr反应，反应模板为突变频率为0.5的模板和纯野生型模板，探针浓度设置了10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm各级浓度，pcr反应后采集突变探针产生的终点荧光值，根据各终点荧光探针对应的荧光值的差异。在坐标系中标出各浓度下，突变探针对应的荧光值，选择接下来多重dpcr各探针的浓度的合理配置。由于在统一反应管中反应，野生型探针产生荧光终点值是一致的，使突变型探针对应的荧光信号值彼此差异最大化，即是选择的合理探针搭配。采用数字pcr以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同。
[0095]
采用数字pcr以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
[0096]
将突变型模板和野生型模板按1∶1，1∶10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字pcr以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。
[0097]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。