一种复合固定化酶材料的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于固定化酶技术领域，涉及一种复合固定化酶材料的制备方法及其应用。所述固定化酶应用于制备va棕榈酸酯。


背景技术：

2.游离酶在反应过程中会受到温度、ph、有机溶剂等影响而失去催化活性，固定化酶技术能够极大地提升酶的稳定性和活性，同时更加利于回收利用，有效降低生产成本。近年来，纳米材料凭借其较大的比表面积、较高的酶负载量引起了研究人员的广泛关注，其中具有高孔隙率、宏观可回收的纳米纤维膜尤为突出。
3.聚丙烯睛(pan)可耐有机溶剂、耐腐蚀、稳定性好，是非常优异的成膜材料，通过静电纺丝法可以调控制备高比表面积、高载酶量、小传质阻力的聚丙烯腈纳米纤维膜。同时金属有机框架(mofs)作为一种新型固定化载体，以其高比表面积、孔体积、易调节的孔道尺寸、可调变的金属节点和配体、热稳定性好以及合成条件温和等优势受到关注。zif-8是沸石咪唑骨架材料中的一种，其具有更加优良的热稳定性和水溶液稳定性。将酶分子原位生长在zif-8粒子中可有效地保护酶不受恶劣环境的影响，极大地保护其活性，同时反应物小分子可通过孔径自由进出。将纳米纤维膜与纳米粒子相结合能够高效的进行酶的固定化，提升酶的负载率，是一种新型的固定化方式。
4.维生素a又称视黄醇，是人体必须的营养素之一，其系列产品由于较为不稳定，常以酯类形式进行出售。其中维生素a(va)棕榈酸酯的碳链较长、熔点低、稳定性佳，从而在药品、食品、化妆品领域有较为广泛的应用。与传统的化学合成法比，va棕榈酸酯的生物酶法催化效率较低，同时存在酶催化剂使用寿命短、很难再生等问题。因此，寻求一种绿色环保、催化效率高的固定化酶合成va棕榈酸酯方法是十分必要的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种复合固定化酶材料的制备方法及其应用，得到的复合固定化酶材料具有高机械强度、高载酶量及耐有机溶剂等优势；该复合材料在合成va棕榈酸酯反应中底物转化率高，工艺稳定性强，可实现多批次套用。
6.为达到以上发明目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种复合固定化酶材料的制备方法，该方法利用同轴静电纺丝制备氨基改性聚丙烯腈纤维膜，后在其表面生长zif-8纳米粒子作为晶种，再通过原位生长法将酶固定在二次生长的金属有机骨架中，过程中加入聚乙烯亚胺促进成核及酶固定。
8.作为一种优选的方案，一种复合固定化酶材料的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)通过同轴静电纺丝制备氨基改性聚丙烯腈(pan)纤维膜；
10.(2)在纤维膜表面一次生长zif-8纳米粒子晶种；
11.(3)聚乙烯亚胺(pei)吸附酶后原位二次生长将酶固定在zif-8金属有机骨架中。
12.本发明中，步骤(1)所述氨基改性pan纤维膜为核壳结构，通过同轴静电纺丝法，由
普通聚丙烯腈pan溶液作核层，改性pan溶液作壳层制备而成。
13.本发明中，电纺溶液的制备方法为将聚丙烯腈pan粉末在有机溶剂中搅拌溶解，冷凝回流，溶解温度为40～60℃，溶解时间为2～3h，得到质量分数为5～10wt％的电纺溶液；
14.其中，pan粉末指普通pan粉末或改性pan粉末；
15.其中，所述有机溶剂优选为n,n二甲基甲酰胺。
16.本发明中，所述改性pan粉末制备方法为：将氨基化试剂与等质量的超纯水混合后加入普通pan粉末，冷凝回流加热至80～120℃，优选90～100℃；搅拌时间为3～5h；结束后将改性pan粉末洗涤至ph为中性，置于烘箱中干燥，优选干燥温度为70～80℃，时间为3～5h。
17.其中氨基化试剂可为乙二胺、丙二胺、1,6-己二胺中的一种或多种。
18.其中氨基化试剂与丙烯腈单体的摩尔比为6:1～3:1，优选5:1。
19.pan粉末通常为分子量150kd的购买商品。
20.本发明中，所述静电纺丝方法为在环境湿度40～60％，电压12～18kv，针头距离接收器15～20cm的条件下，将浓度相同的核层和壳层电纺溶液分别吸入内外注射器中，以1.5～2.5ml/h的流速同时纺丝，得到直径为100-400nm的改性pan纤维膜。
21.上述得到的改性pan纤维膜需置于烘箱中干燥后待用，优选干燥温度为50～70℃，时间为12～24h。
22.本发明中，步骤(2)所述一次生长得到zif-8晶种的方法为：将纳米纤维膜置于二水合乙酸锌的甲醇溶液中超声振荡3～5h，后再将膜置于二甲基咪唑的甲醇溶液中，于烘箱加热，加热温度50～70℃，时间为2～4h；最后用新鲜甲醇浸泡清洗膜1～2h，重复3次。其中二水合乙酸锌的浓度为1～3mol/l，二甲基咪唑的浓度为0.5～1.5mol/l。二水合乙酸锌的甲醇溶液和二甲基咪唑的甲醇溶液都是过量的。
23.本发明中，步骤(3)所述二次生长固定化酶的方法为：将一次生长后的膜放入二水合乙酸锌水溶液中常温超声振荡1～2h，再加入pei酶溶液后振荡10～20min，然后再加入二甲基咪唑水溶液共振荡2～4h。固定化结束后用水浸泡清洗膜1～2h，重复3次。最后将复合固定化酶材料置于-20℃冷冻干燥后待用。其中，二水合乙酸锌浓度1～3mol/l，二甲基咪唑的浓度为5～10mol/l。二水合乙酸锌水溶液、pei酶溶液及二甲基咪唑水溶液过量。
24.其中，所述pei酶溶液的制备方法为：先将适量pei溶解于水中配置成30～50mg/ml水溶液，搅拌均匀后再加入浓度为50～120mg/ml的酶溶液，室温超声交联2～3h。其中pei酶溶液中pei与酶的质量比为1:1～3，优选1:1.5～2。
25.所述酶指来自嗜热丝孢菌、南极假丝酵母或皱褶假丝酵母的脂肪酶，优选南极假丝酵母脂肪酶；所述酶溶液指将酶溶解于磷酸盐缓冲液中得到。所述磷酸盐缓冲液优选由磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制，优选浓度为0.2～0.5mol/l，ph为6.5～7.5。
26.本发明的复合固定化酶材料可以用于制备va棕榈酸酯。
27.制备va棕榈酸脂方法为，将原料va醋酸酯、棕榈酸与本发明的的复合固定化酶材料混合反应。
28.其中，va醋酸酯与棕榈酸的摩尔比为1:0.8～1:1.5，优选1:1～1:1.1。
29.需要加入有机溶剂使得va醋酸酯与棕榈酸充分溶解，所述有机试剂为正己烷、正庚烷、二氯甲烷中的一种，优选正己烷；所述有机溶剂与va醋酸酯的质量比为6:1～2:1，优
选4:1～3:1。
30.所述复合固定化酶材料与va醋酸酯的质量比为1:10～1:20，优选1:12～1:15；
31.所述反应温度为30℃～60℃，优选35℃～45℃；反应时间为3～6h，优选4～4.5h；搅拌速率100～250rpm，优选150～200rpm。
32.所述反应可在常压下进行，反应环境可为氮气、氦气、氩气等惰性气体。
33.所述反应完成后可通过简单过滤操作分离复合固定化酶材料与反应液，固定化酶经磷酸盐溶液冲洗后可回用，反应液取样进行液相色谱含量测定。
34.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
35.(1)利用聚丙烯腈粉末直接氨基改性制备壳层纺丝液，并选取同轴纺丝方式以节约成本，此合成工艺简单且保留了膜的高机械强度。
36.(2)以膜表面的氨基作为锚点，通过配位作用使得纤维表面均匀致密地生长zif-8纳米粒子，从而形成晶种引导其二次生长。
37.(3)由于水体系中zif-8成核速度过快，加入pei后利用其含有的大量氨基与2-甲基咪唑发生配位竞争，有效降低了成核速度使得金属离子顺利附着在晶种表面引导生长。同时pei可与酶发生静电作用，形成“锁链”进一步增强了酶的固定。
38.(4)该固定化酶材料载酶量高，且酶被包埋在金属有机骨架中，其活性受到了极大限度的保护，具体表现在其在合成va棕榈酸酯反应中转化率高，同时可视化的纤维膜结构使其更易分离，可实现多批次套用。
附图说明
39.图1为实施例1纳米纤维膜a的扫描电镜图，其直径为200～300nm。
40.图2为实施例1复合固定化酶材料a的扫描电镜图，其中纳米粒子直径50～80nm。
具体实施方式
41.下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。高效液相采用agilent色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)柱温：35℃，进样量：10μl，紫外检测器检测波长：350nm，流速：1.0ml/min，使用甲醇、异丙醇、水作流动相进行梯度洗脱。
42.南极假丝酵母脂肪酶、嗜热丝孢菌脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶均购买自西格玛奥德里奇公司。
43.静电纺丝仪，型号hd-2335，购买自北京永康乐业科技发展有限公司。
44.聚丙烯腈，平均分子量14，9000～15，1000，购买自阿拉丁试剂(上海)实施例1
45.(1)制备氨基改性pan纤维膜a
46.称取聚丙烯腈粉末10g、乙二胺57g、超纯水57g，加入到烧瓶中反应，油浴加热至90℃，配置冷凝回流，搅拌4h。过滤得到反应后的改性pan粉末，将其用超纯水反复洗涤至ph为中性后，置于80℃烘箱中干燥3h备用。
47.称取1g改性pan粉末溶解于19g二甲基甲酰胺中在50℃冷凝回流搅拌2.5h配制5wt％改性pan壳层纺丝溶液。再称取1g普通pan粉末溶解于19g二甲基甲酰胺在50℃冷凝回流搅拌2.5h配制5wt％普通pan核层纺丝溶液。
48.使用两个注射器分别吸入核层和壳层纺丝溶液，插上22号针头并放置在静电纺丝
仪上，内外针头同时与两个注射泵相连使用，控制静电压14kv，推注速度为2ml/h，针头与接收器距离为15cm，环境湿度为50％，在滚轴上包裹铝箔纸作为载体进行静电纺丝。将纺好的纳米纤维膜a放在50℃烘箱中干燥24h。
49.(2)纤维表面生长zif-8粒子并固定化酶
50.裁取合适大小的纳米纤维膜a，放入1.5mol/l的二水合乙酸锌甲醇溶液中，超声震荡3h。然后取出纤维膜a放入1mol/l的二甲基咪唑甲醇溶液中，在60℃烘箱加热2h,在纤维表层完成zif-8纳米粒子的一次生长。使用新鲜甲醇浸泡清洗膜2h，重复3次。
51.将南极假丝酵母脂肪酶溶解于0.2mol/l、ph7.0的磷酸盐溶液中配置成60mg/ml的酶溶液，取等体积的30mg/ml pei水溶液与酶溶液混合，超声振荡交联2h得到pei酶溶液。
52.将一次生长后的膜a放入30ml的1.5mol/l二水合乙酸锌水溶液中，常温超声振荡1h，再加入40ml的pei酶溶液后振荡10min，然后再加入30ml 8mol/l二甲基咪唑水溶液共振荡2h。固定化结束后用水浸泡清洗膜1h，重复3次。最后将复合固定化酶材料a置于-20℃冷冻干燥后待用。
53.(3)催化va棕榈酸酯合成
54.称取30g va醋酸酯、23.4g棕榈酸、2g剪切的固定化酶材料a，加入120g正己烷使其在三口烧瓶中混合，水浴35℃，配置冷凝回流，反应4h，搅拌速率150rpm,过程中通入氮气保持无氧状态。反应结束后过滤得到固定化酶a，将膜用0.2mol/l、ph7.0的磷酸盐缓冲液冲洗后备用。重复上述条件，使用同一固定化酶a进行8次催化实验。滤后的反应液均取样进行液相色谱检测，选择紫外检测器，得到反应转化率分别为99.86％、99.32％、98.92％、98.45％、98.03％、97.72％、97.30％、96.85％。
55.实施例2
56.(1)制备氨基改性pan纤维膜b
57.称取聚丙烯腈粉末10g、丙二胺84g、超纯水84g，加入到烧瓶中反应，油浴加热至120℃，配置冷凝回流，搅拌3h。过滤得到反应后的改性pan粉末，将其用超纯水反复洗涤至ph为中性后，置于70℃烘箱中干燥5h备用。
58.称取2g改性pan粉末溶解于23g二甲基甲酰胺中在40℃冷凝回流搅拌3h配制8wt％改性pan壳层纺丝溶液。再称取2g普通pan粉末溶解于23g二甲基甲酰胺在40℃冷凝回流搅拌3h配制8wt％普通pan核层纺丝溶液。
59.使用两个注射器分别吸入核层和壳层纺丝溶液，插上22号针头并放置在静电纺丝仪上，内外针头同时与两个注射泵相连使用，控制静电压12kv，推注速度为1.5ml/h，针头与接收器距离为16cm，环境湿度为40％，在滚轴上包裹铝箔纸作为载体进行静电纺丝。将纺好的纳米纤维膜b放在70℃烘箱中干燥12h。(2)纤维表面生长zif-8粒子并固定化酶
60.裁取合适大小的纳米纤维膜b，放入3mol/l的二水合乙酸锌甲醇溶液中，超声震荡5h。然后取出纤维膜b放入1.5mol/l的二甲基咪唑甲醇溶液中，在70℃烘箱加热4h,在纤维表层完成zif-8纳米粒子的一次生长。使用新鲜甲醇浸泡清洗膜1.5h，重复3次。
61.将嗜热丝孢菌脂肪酶溶解于0.3mol/l、ph6.5的磷酸盐溶液中配置成50mg/ml的酶溶液，取等体积的50mg/ml pei水溶液与酶溶液混合，超声振荡交联2.5h得到pei酶溶液。
62.将一次生长后的膜b放入30ml的1mol/l二水合乙酸锌水溶液中，常温超声振荡1.5h，再加入40ml的pei酶溶液后振荡20min，然后再加入30ml 5mo l/l二甲基咪唑水溶液
共振荡3h。固定化结束后用水浸泡清洗膜1.5h，重复3次。最后将复合固定化酶材料b置于-20℃冷冻干燥后待用。
63.(3)催化va棕榈酸酯合成
64.称取30g va醋酸酯、35.1g棕榈酸、3g剪切的固定化酶b，加入60g正庚烷使其在三口烧瓶中混合，水浴30℃，配置冷凝回流，反应6h，搅拌速率100rpm,过程中通入氮气保持无氧状态。反应结束后过滤得到固定化酶b，将膜用0.3mol/l、ph6.5的磷酸盐缓冲液冲洗后备用。重复上述条件，使用同一固定化酶b进行8次催化实验。滤后的反应液均取样进行液相色谱检测，选择紫外检测器，得到反应转化率分别为99.72％、99.15％、98.83％、98.55％、98.03％、97.69％、97.20％、96.91％、96.54％
65.实施例3
66.(1)制备氨基改性pan纤维膜c
67.称取聚丙烯腈粉末10g、己二胺66g、超纯水66g，加入到烧瓶中反应，油浴加热至80℃，配置冷凝回流，搅拌5h。过滤得到反应后的改性pan粉末，用超纯水反复洗涤至ph为中性后，置于75℃烘箱中干燥4h备用。
68.称取2g改性pan粉末溶解于18g二甲基甲酰胺中在60℃冷凝回流搅拌2h配制10wt％改性pan壳层纺丝溶液。再称取2g普通pan粉末溶解于18g二甲基甲酰胺在60℃冷凝回流搅拌2h配制10wt％普通pan核层纺丝溶液。
69.使用两个注射器分别吸入核层和壳层纺丝溶液，插上22号针头并放置在静电纺丝仪上，内外针头同时与两个注射泵相连使用，控制静电压18kv，推注速度为2.5ml/h，针头与接收器距离为20cm，环境湿度为60％，在滚轴上包裹铝箔纸作为载体进行静电纺丝。将纺好的纳米纤维膜c放在60℃烘箱中干燥15h。(2)纤维表面生长zif-8粒子并固定化酶
70.裁取合适大小的纳米纤维膜c，放入1mol/l的二水合乙酸锌甲醇溶液中，超声震荡4h。然后取出纤维膜c放入0.5mol/l的二甲基咪唑甲醇溶液中，在50℃烘箱加热3h,在纤维表层完成zif-8纳米粒子的一次生长。使用新鲜甲醇浸泡清洗膜1h，重复3次。
71.将皱褶假丝酵母脂肪酶溶解于0.5mol/l、ph7.5的磷酸盐溶液中配置成120mg/ml的酶溶液，取等体积的40mg/ml pei水溶液与酶溶液混合，超声振荡交联2h得到pei酶溶液。
72.将一次生长后的膜c放入30ml的3mol/l二水合乙酸锌水溶液中，常温超声振荡1h，再加入40ml的pei酶溶液后振荡20min，然后再加入30ml的10mol/l二甲基咪唑水溶液共振荡4h。固定化结束后用水浸泡清洗膜2h，重复3次。最后将复合固定化酶材料c置于-20℃冷冻干燥后待用。
73.(3)催化va棕榈酸酯合成
74.称取30g va醋酸酯、18.7g棕榈酸、1.5g剪切的固定化酶c，加入180g二氯甲烷使其在三口烧瓶中混合，水浴60℃，配置冷凝回流，反应3h，搅拌速率250rpm,过程中通入氮气保持无氧状态。反应结束后过滤得到固定化酶c，将膜用0.5mol/l、ph7.5的磷酸盐缓冲液冲洗后备用。重复上述条件，使用同一固定化酶c进行8次催化实验。滤后的反应液均取样进行液相色谱检测，选择紫外检测器，得到反应转化率分别为99.65％、99.23％、98.48％、98.05％、97.89％、97.20％、96.85％、96.12％
75.酶负载量测定：
76.采用bradford方法检测溶液中的蛋白含量，以牛血清白蛋白(bsa)做标准品，分别
溶解于上述实施例中不同浓度的磷酸盐溶液中。通过紫外分光光度计检测固定化酶前后溶液及洗液中的酶蛋白含量c0、c1、c2，平行测定3次取均值，计算纳米纤维膜的载酶量。
[0077][0078]
式中v指固定化酶溶液体积(ml)，v2指磷酸盐洗液的体积(ml)，m指纳米纤维膜的质量(g)。
[0079]
实施例1、2、3中的固定化酶a、b、c载酶量分别为76.35mg/g、68.89mg/g、66.47mg/g。
[0080]
对比例1
[0081]
称取30g va醋酸酯、23.4g棕榈酸、2g novozyme 435(树脂固定化南极假丝酵母脂肪酶商品，诺维信)，加入120g正己烷使其在三口烧瓶中混合，水浴35℃，配置冷凝回流，反应4h，搅拌速率150rpm,过程中通入氮气保持无氧状态。反应结束后过滤得到颗粒固定化酶，将其用0.2mol/l、ph7.0的磷酸盐缓冲液冲洗后备用。重复上述条件，使用同一固定化酶进行8次催化实验。滤后的反应液均取样进行液相色谱检测，选择紫外检测器，得到反应转化率分别为99.84％、99.02％、98.12％、97.33％、96.81％、96.23％、95.37％、94.38％。
[0082]
与实施例1对比可以看出纳米纤维膜固定化酶较于商品化酶的反应转化率更高且重复使用后稳定性更佳。
[0083]
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。