乳酸片球菌、发酵菌剂及其应用和杂粮发酵食品的制备方法与流程

1.本发明涉及食品发酵领域，具体涉及一株乳酸片球菌、发酵菌剂及其应用和杂粮发酵食品的制备方法。


背景技术：

2.随着社会经济水平的提高，人们对于食品的要求也不断提高，食品的健康、营养、安全等方面越来越被消费者重视。相比于“精米细面”而言，杂粮中蛋白质、维生素、矿物质以及纤维素等成分的含量较高，并且各营养成分的比例合理，近年来受到消费者的广泛关注。然而，杂粮的口感较为粗糙，而且其中含有植酸等抗营养因子，不利于消化和吸收，使得杂粮食品的发展受到了限制。
3.发酵食品在制备过程中，由于发酵菌的作用，使得原料中的营养物质化学结构发生改变，从而改变了其蒸煮品质，能够使得食品的口感和营养成分组成比例发生改变。对杂粮进行发酵处理制备相关食品可以有效避免杂粮食品的上述缺陷。但是，目前常用的发酵菌种一般都是基于常规食品的制备需要选育的，对于与普通白面营养成分不同的杂粮进行发酵时的发酵效率和效果并不理想。因此，亟需开发针对杂粮食品特点的专用菌株以满足杂粮食品市场的需要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的杂粮食品口感差、营养吸收效果差，且缺乏专用于杂粮食品生产使用的发酵菌株等问题，提供一株乳酸片球菌、发酵菌剂及其应用和杂粮发酵食品的制备方法。本发明提供的乳酸片球菌能够有效降解植酸，适应杂粮食品生产，并且采用该乳酸片球菌制备的杂粮发酵食品还有独特的发酵风味。
5.为了实现上述目的，本发明一方面提供一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici),所述乳酸片球菌的保藏编号为cgmcc no.21160。
6.本发明第二方面提供一种发酵菌剂，所述发酵菌剂中含有如上所述的乳酸片球菌。
7.本发明第三方面提供如前所述的乳酸片球菌或发酵菌剂在制备杂粮发酵食品中的应用。
8.本发明第四方面提供一种杂粮发酵食品的制备方法，所述方法包括将杂粮原料与如前所述的乳酸片球菌或发酵菌剂混合进行发酵。
9.本发明第五方面提供如上所述的方法制备获得的杂粮发酵食品。
10.通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：
11.(1)本发明提供的乳酸片球菌温度适应范围广、产酸能力强，从而能够适应不同种类的杂粮发酵使用，具有大规模工业化生产应用的潜力；
12.(2)本发明提供的乳酸片球菌能够有效降解植酸，从而解决了杂粮食品中植酸含量高，营养吸收效果差的问题，能够满足消费者对杂粮食品的营养要求，有利于杂粮食品市
场的发展；
13.(3)本发明提供的乳酸片球菌制备的杂粮发酵食品口感好，具有独特的风味，而且保质期较长，更利于杂粮食品的推广和发展；
14.(4)本发明提供的乳酸片球菌还能够缩短杂粮的蒸煮时间，从而提高了杂粮发酵食品的生产效率，提高了企业经济效益。
附图说明
15.图1是本发明提供的乳酸片球菌的菌落形态；
16.图2是本发明提供的乳酸片球菌的显微形态。
17.生物保藏
18.本发明提供的乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21160，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
19.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
20.本发明的发明人在研究的过程中，自西藏林芝天然发酵酸奶中分离获得一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)，经过进一步研究发现，该乳酸片球菌菌株具有较广的温度适应范围，产酸能力强，并且能够有效降解植酸，用于杂粮发酵时能够改善杂粮口感和营养结构，缩短蒸煮时间，延长保质期。于2020年11月11日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21160。
21.本发明一方面提供一株乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)，所述乳酸片球菌的保藏编号为cgmcc no.21160。
22.本发明第二方面提供一种发酵菌剂，所述发酵菌剂中含有如上所述的乳酸片球菌。
23.本发明提供的发酵菌剂中的乳酸片球菌含量没有特别限制。根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵菌剂中，以活菌数计，所述乳酸片球菌的含量在10
10
cfu/g以上。所述“10
10
cfu/g”是指发酵菌剂中乳酸片球菌的含量在数量级水平达到10
10
，例如1
×
10
10
cfu/g、5
×
10
10
cfu/g、9.9
×
10
10
cfu/g等均属于“10
10
数量级水平”。
24.优选地，所述乳酸片球菌的含量为10
11-10
12
cfu/g。
25.本发明提供的发酵菌剂可以为任意本领域现有菌剂类型。例如固体(粉末)菌剂、液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂等。
26.根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵菌剂中还可以含有辅料。
27.优选地，所述辅料选自冻干保护剂和/或稳定剂。
28.更优选地，所述冻干保护剂选自脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖和甘油中的至少一种。
29.更优选地，所述稳定剂选自脱脂乳粉、海藻糖和甘油中的至少一种。
30.本发明提供的发酵菌剂可以采用任意本领域现有的菌剂制备方法制备获得。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述发酵菌剂的制备方法可以包括以下几种：
31.(1)将乳酸片球菌cgmcc no.21160在培养基中进行培养，使得其中活菌数达到108cfu/ml以上，获得液体发酵菌剂。
32.(2)将所述液体发酵菌剂与发酵底物混合，使得活菌数达到105cfu/ml以上，获得半液体发酵菌剂。
33.(3)将所述液体发酵菌剂进行浓缩，获得浓缩发酵菌剂。
34.(4)分离获得所述液体发酵菌剂中的乳酸片球菌，进行干燥处理，获得固体发酵菌剂。
35.优选地，方法(1)中，所述培养基可以为任意本领域现有用于培养乳酸片球菌的培养基，例如mrs培养基、mc培养基等。其既可以通过商购获得，也可以根据现有技术自行配制。
36.优选地，所述液体发酵菌剂中，以活菌数计，所述乳酸片球菌的含量为10
6-107cfu/ml。
37.优选地，方法(2)中，所述发酵底物选自面粉和/或(混合)杂粮粉。更优选所述发酵底物中含有杂粮(也即，更优选(混合)杂粮粉)，所述杂粮含量优选占所述发酵底物总重量的10-80重量％。
38.方法(3)中，所述浓缩可以采用任意本领域现有浓缩方式进行。优选地，所述浓缩可以采用离心、膜分离和沉降中的至少一种方式进行。
39.优选地，所述浓缩发酵菌剂中，已活菌数计，所述乳酸片球菌的含量在10
10
cfu/ml以上。更优选为10
11-10
12
cfu/ml。
40.方法(4)中，可以采用任意本领域现有用于在液体培养基中分离培养的菌体的方式进行。优选地，采用离心的方式进行所述乳酸片球菌菌体分离。
41.任意本领域现有对菌体进行离心分离的条件均可适用于本发明。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述离心的条件可以包括：温度1-10℃，转速5000-12000rpm，时间5-20min。
42.优选地，所述干燥处理前，可以先将分离的乳酸片球菌菌体与辅料(例如冻干保护剂等)混合。优选所述辅料与乳酸片球菌以1：1-10的体积比进行混合。
43.更优选地，所述乳酸片球菌菌体在与辅料进行混合前，先采用缓冲液对其进行清洗。所述缓冲液可以为任意本领域现有用于菌体冲洗的缓冲液，例如生理盐水、pbs缓冲液等。为了彻底洗净残留的培养基，所述清洗的操作可以重复多次，例如重复3-5次。
44.优选地，所述干燥可以采用冻干干燥的方式进行。
45.更优选地，所述冻干干燥的条件可以包括：温度-25至-75℃，时间12-22h，优选干燥后发酵菌剂的水含量不超过5重量％。
46.根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵菌剂中还可以添加其他乳酸菌，以达到获得更好的发酵效果、提高发酵食品风味、改善质地和口感等目的。
47.任意本领域现有用于发酵食品制作的乳酸菌均可适用于本发明。优选地，所述乳酸菌可以选自乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌和乳酸片球菌中的至少一种。
48.本发明第三方面提供如前所述的乳酸片球菌或发酵菌剂在制备杂粮发酵食品中的应用。
49.本发明中，所述杂粮发酵食品是指将含杂粮的原料进行发酵处理，而后蒸煮制成的食品。优选在原料中杂粮的含量在10重量％以上。
50.本发明第四方面提供一种杂粮发酵食品的制备方法，所述方法包括将杂粮原料与如前所述的乳酸片球菌或发酵菌剂混合进行发酵。
51.任意本领域用于食品制作的杂粮均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述杂粮原料中的杂粮选自红豆、绿豆、大麦、高粱、玉米、小米、燕麦和薏米中的至少一种。
52.本发明提供的方法可以用于制备任意本领域现有类型的杂粮发酵食品。根据本发明的优选实施方式，其中，所述杂粮发酵食品选自杂粮面条、杂粮馒头和杂粮面包中的至少一种。
53.本发明提供的方法中，所述杂粮原料即为以杂粮为主要成分(之一)的食品原料，其既可以是仅含杂粮的食品原料，也可以是杂粮与精粮(如大米、面粉等)的混合物，对于其中的杂粮含量没有特别限定。根据本发明的优选实施方式，其中，所述杂粮原料为含有杂粮的面粉(小麦粉)，其中杂粮的含量在10重量％以上，优选为10-80重量％。
54.优选地，所述杂粮原料中杂粮的含量为20-50重量％。
55.本发明提供的方法中，对于所述乳酸片球菌或发酵菌剂的用量没有特别限制，可以根据实际情况进行调整。为了获得更好的发酵效果，提高发酵效率，提升发酵产品品质性能，根据本发明的优选实施方式，其中，乳酸片球菌或发酵菌剂的用量使得发酵体系中所述乳酸片球菌的初始含量为10
5-106cfu/ml。所述“发酵体系”指的是将杂粮原料、水和乳酸片球菌(或发酵菌剂)混合后进行发酵的体系。
56.优选地，所述发酵的条件包括：温度10-45℃，ph4-8。
57.本发明提供的方法还包括在发酵完成后，对发酵后的杂粮原料进行处理，以制成不同种类的杂粮发酵食品的步骤。该处理步骤可以采用任意本领域现有的方法进行。
58.本发明第五方面提供如上所述的方法制备获得的杂粮发酵食品。
59.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
60.以下实施例中，未进行特别说明的情况下，采用的化学试剂均购自正规化学试剂供应商。
61.下述实施例中涉及的培养基配方如下：
62.mrs培养基：蛋白胨1重量％，牛肉粉0.5重量％，酵母粉0.4重量％，葡萄糖2重量％，吐温800.1重量％，k2hpo4.7h2o 0.2重量％，乙酸钠
·
3h2o0.5重量％，柠檬酸三铵0.2重量％，mgso4·
7h2o 0.02重量％，mnso4·
4h2o0.005重量％。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，调节ph至6.2
±
0.2，121℃高压灭菌15-20min，即得液体mrs培养基。灭菌前加入琼脂粉1.5重量％，然后121℃高压灭菌15-20min，冷却凝固后即得固体mrs培养基。
63.待灭菌后的固体mrs培养基冷却至不烫手(约50℃)，将其倒入培养皿中，冷却凝固后即可获得mrs培养平板。
64.mc培养基：大豆蛋白胨0.5重量％，牛肉粉0.3重量％，酵母粉0.3重量％，葡萄糖2
重量％，乳糖2重量％，碳酸钙1重量％。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中调节ph至6.0
±
0.2，加入1％中性红溶液0.5重量％，121℃高压灭菌15-20min，即得液体mc培养基。灭菌前加入琼脂1.5重量％，然后121℃高压灭菌15-20min，冷却凝固后即得固体mc培养基。
65.待灭菌后的固体mc培养基冷却至不烫手(约50℃)，将其倒入培养皿中，冷却凝固后即可获得mc培养平板。
66.实施例1
67.本实施例用于说明乳酸片球菌的分离、纯化、鉴定和保藏。
68.发明人自西藏林芝天然发酵酸奶中分离获得一株乳酸菌，采用划线分离纯化法纯化三次，获得若干单个纯种菌落。
69.形态学鉴定：采用mrs培养平板对纯化后的乳酸菌菌株进行培养，观察菌落形态(如图1所示)。
70.采用液体mrs培养基培养该乳酸菌菌株，并利用显微镜观察菌体形态(如图2所示)。
71.16s-its rdna基因测序鉴定：以提取纯化后乳酸菌的总dna(采用天根生化科技有限公司公司dna提取试剂盒(dp302)，按照其说明书内容进行提取)为模板，27f(5
’‑
agagcctggctcagtttgat-3’，seq id no:1)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’，seq id no:2)分别为正向引物和反向引物，按照表1中的pcr体系和表2中的扩增程序进行its rdna扩增。
72.表1
73.试剂体积/μl10
×
pcr buffer3dntps2.5正向引物(27f)1.5反向引物(1492r)1.5模板dna2taq dna聚合酶(5u/μl)0.3dd h2o19.2总体积30
74.表2
[0075][0076]
扩增产物送至英潍捷基上海贸易有限公司进行测序，结果如以下所示：
[0077]
gcttgcactgaatgagattttaacacgaagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgc
ccagaagcaggggataacacctggaaacagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcctggttttcttttaaaagatggctctgctatcacttctggatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgatgatgcgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacgtgggtgagagtaactgttcacccagtgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtcttttaagtctaatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaaaacaagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctgttagtaccctgctgtcaacgataagagtgattactaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagttatccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaagaattgacgggggccgcacaagcgtggagcatgtggttaattcgaagtacgcgaagaacttaccaggtcttgacatctttgccaacctaagagattaggcgttccctttcggggacagaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcattcagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaaaccgcgaggtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcc(seq id no:3)
[0078]
结合形态学和生化鉴定结果，鉴定出此菌株为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)。
[0079]
于2020年11月11日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21160，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例用于说明乳酸片球菌cgmcc no.21160的温度适应性及产酸能力
[0082]
乳酸片球菌菌悬液制备：将乳酸片球菌cgmcc no.21160接种至mc培养基中，30℃培养6h，至活菌数达到10
10-10
12
cfu/ml，获得乳酸片球菌菌悬液。
[0083]
杂粮样品处理：将杂粮(由燕麦、豌豆、扁豆按照重量比1：1.5：2.5混合)采用3重量％过氧化氢水溶液冲洗3次，每次10min，进行消毒，获得消毒后的杂粮样品。
[0084]
将消毒后的杂粮样品与无菌水按照1:1.5
±
0.3的重量比混合，而后按照1:1的体积比加入乳酸片球菌菌悬液。分别在10℃、15℃、20℃、30℃、35℃和45℃恒温培养箱中发酵培养，每3小时测量一次发酵杂粮ph值，当发酵杂粮ph低于4时停止培养，对不同温度条件下乳酸片球菌cgmcc no.21160的产酸能力进行评价。结果详见表3。
[0085]
表3
[0086][0087]
由表3可以看出，乳酸片球菌cgmcc no.21160在24h内，在10-45℃均能使发酵杂粮ph达到4以下，说明该菌株适应温度范围广，产酸能力强。
[0088]
实施例3
[0089]
本实施例用于说明乳酸片球菌cgmcc no.21160的对杂粮中植酸的降解、外观完整度及口感的影响。
[0090]
按照实施例2中的方法对杂粮样品(具体种类详见表4)进行处理和发酵，具体发酵条件：温度30℃，时间2h。获得发酵杂粮。
[0091]
将发酵杂粮进行干燥(75℃，4h)，对不同发酵杂粮的植酸含量与蒸煮后口感(软硬度)的接受度进行比较。检测结果详见表4。
[0092]
空白对照组：未发酵杂粮
[0093]
阳性对照组：采用商业乳酸片球菌(购自安琪酵母股份有限公司)发酵处理的杂粮
[0094]
实验组：采用乳酸片球菌cgmcc no.21160发酵处理的杂粮
[0095]
植酸含量检测方法：称取1g样品于50ml烧杯，加入1ml浓硫酸(98％)和3ml浓硝酸(浓度68％)，消化处理，待其冷却后加入到50ml容量瓶，用蒸馏水稀释到刻度，获得消化样品溶液。再取相同量的样品加入到50ml容量瓶，加蒸馏水至刻线，获得对照样品溶液。分别取1ml消化处理样品和对照样品溶液，加入50ml容量瓶中，再将5ml钼酸铵-硫酸标准溶液加入其中，加蒸馏水至刻线。45℃水浴加热30min，冷却后检测660nm处吸光值。将消化处理样品和对照样品的吸光值差值在磷酸二氢钾标准曲线上查到对应的磷含量就是植酸磷的含量，乘以3.548后，计算获得植酸含量。
[0096]
表4
[0097]
[0098]
由表4可以看出，乳酸片球菌cgmcc no.21160发酵玉米、大麦、燕麦等杂粮均能降解其中植酸，且植酸降解率达到50％以上，比商业乳酸菌降解率高。蒸煮后软硬适中，说明本发明提供的乳酸片球菌具有制备营养成分、口感均满足消费者需要的杂粮发酵食品的潜力。
[0099]
实施例4
[0100]
本实施例用于说明利用乳酸片球菌cgmcc no.21160进行杂粮馒头制备时，产品的感官品质。
[0101]
(一)喜好度测试
[0102]
采用的杂粮粉制备方法为：将淘洗过的青稞堆放润麦使青稞粒皮层吸水，润麦时间3-5h，放入磨粉机粉碎，过80目筛。
[0103]
杂粮馒头制备步骤：将杂粮粉及小麦粉、水按照1：1：1的重量比混合均匀，加入实施例2中制备的乳酸片球菌菌悬液，使得乳酸片球菌cgmcc no.21160的含量约为10
3-105cfu/ml。放入和面机中搅拌8-10min，然后将面团(每块面团约130g)进行分块成型，置于35℃，相对湿度为80％条件下醒发1.5h，取出进行二次成型，再在相同条件下醒发40min，之后蒸制25min。
[0104]
观察杂粮馒头的气孔分布特点，发现其气孔细小均匀，使得口感更加柔软、回弹快。
[0105]
对该杂粮馒头进行喜好度测试，检测指标包括色泽、风味、湿润度、弹性、整体喜好度。结果显示该杂粮馒头具有湿润度高、回弹快、柔软、爽口不粘牙、乳酸香味突出等特点。
[0106]
(二)保质期检测
[0107]
采用相同的方法，利用商购乳酸菌(购自安琪酵母股份有限公司)制备杂粮馒头作为对照。
[0108]
保质期检测方法：将样品置于室温环境下，定期检测微生物含量(菌落总数、霉菌、大肠杆菌)，当微生物含量达到106cfu/g水平即视为样品变质。自实验开始至样品变质之间的时间即为该样品的保质期。结果详见表5。
[0109]
表5
[0110]
杂粮馒头所用发酵菌株杂粮馒头保质期/天乳酸片球菌cgmccno.211608天商购乳酸菌5天
[0111]
实施例5
[0112]
本实施例用于说明利用乳酸片球菌cgmcc no.21160进行发酵杂粮面条制备时，产品的感官品质。
[0113]
本实施例中采用的发酵杂粮粉为掺杂了乳酸片球菌cgmcc no.21160固体发酵菌剂的杂粮粉，其中乳酸片球菌的含量为10
5-106cfu/g。杂粮粉制备方法为：将淘洗过的杂粮(分别为玉米、大麦、红豆)堆放使皮层吸水，浸润时间4-6h，放入磨粉机粉碎，过80目筛。
[0114]
制备步骤：将发酵杂粮粉与小麦粉按照35：65的重量比混合后，与水以2：1的重量比依次倒入和面锅中进行搅拌，慢速(约30rpm)搅拌2-8分钟后快速(约60rpm)搅拌1-15分钟和成均匀的面絮。将面絮压延成光滑的面带后切成厚度1
±
0.5mm、宽度2
±
1mm的方形面条。
[0115]
采用相同的方法，利用商购乳酸菌(购自安琪酵母股份有限公司)制备大麦面条作为对照。
[0116]
邀请食品测评人员按照表6中的标准对该发酵杂粮面条进行感官评价。取各位测评人员的平均评分作为测评结果，结果详见表7。
[0117]
表6
[0118][0119]
表7
[0120]
种类风味粘性软硬度弹性顺滑度总分风味描述对照*2.38.28.28.78.836.3杂粮风味浓郁玉米面条8.28.28.58.38.741.9有淡淡的玉米及麦香气大麦面条8.98.68.78.8944有淡淡的麦芽香气红豆面条8.58.28.28.28.541.6有淡淡的红豆及麦芽香气
[0121]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。