脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法

1.本发明属于细胞分离培养技术领域，涉及干细胞的分离方法，具体地说是脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法。


背景技术：

2.近年来，干细胞相关技术的进步为组织修复等再生医学的发展奠定了基础。在众多类型的干细胞中，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一种理想的种子细胞，因其广泛分布于骨髓、脐带、脂肪及子宫内膜等组织中，且具有在保持干细胞特性的同时有效增殖、多向分化及低免疫原性等优异特性，可为多种疾病提供潜在治疗手段，有着广阔的研究前景。
3.最初，间充质干细胞是从骨髓中提取分离，用于自体细胞治疗的，但骨髓提取的手术过程复杂，不仅给供体带来痛苦和不可逆的创伤，还伴随一定的感染风险。如今，除从骨髓中提取外，间充质干细胞还可从脐带的结缔组织即沃顿胶(wharton's jelly，wj)中分离获得，常用的分离方法主要有三种：酶解法、爬出法及酶解爬出法。
4.酶解法是通过胰蛋白酶等的酶解作用，使沃顿胶中的间充质干细胞解离出来；爬出法是将组织剪碎并置于培养皿上，经培养，待细胞从组织块中自主爬到培养皿中，收集或解离爬至培养皿表面的细胞，即为间充质干细胞；酶解爬出法则是结合上述两种方法，先酶解沃顿胶组织，再等待间充质干细胞爬出。基于这三种原理，通过改变酶的组成或调整处理时间，形成了多种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法。爬出法或酶解爬出法中，除往往因未意识到自主爬出的细胞仅占沃顿胶中极小部分，而造成材料资源的浪费外，这些方法仍存在部分缺陷，例如胰蛋白酶处理时间较长，分离所得细胞往往存在破损率高，细胞形态不统一，细胞数量少，细胞扩增能力有限等问题，有着不小的改进空间。


技术实现要素：

5.本发明的目的，是要提供一种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法，通过浸泡处理和消化液充分消化沃顿胶中胶原蛋白等组织，高效分离脐带中间充质干细胞，解决现有技术分离所得间充质干细胞的破损率高，形态不统一，数量少，细胞扩增能力有限等问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法，它是取脐带组织研磨，加入培养基，经浸泡处理后，分离得细胞组织，加入消化液，经消化，过滤，取滤液离心，所得沉淀即为间充质干细胞；
8.所述消化液包括胶原酶、脱氧核糖核酸酶和透明质酸酶；
9.所述培养基是在dmem培养基的基础上添加20％体积分数的胎牛血清、10,000单位/ml青霉素、10,000μg/ml链霉素和1％体积分数的无水乙醇。
10.作为一种限定，所述研磨前，脐带组织经生理盐水冲洗除去血液、除去血管且剪碎至碎块体积均不大于8mm3；所述研磨采用十字研磨法，研磨20-80次。
11.作为第二种限定，所述浸泡处理为在温度为36-38℃，co2体积分数为4-6％的条件下，浸泡5-9天。
12.作为进一步限定，所述分离得细胞组织，是取浸泡处理后的悬液离心，经磷酸盐缓冲液洗涤下沉物，所得下沉物即为细胞组织。
13.作为第三种限定，所述胶原酶包括质量比为1:1-2:1-2的胶原酶ii、胶原酶iii和胶原酶iv。
14.作为进一步限定，所述消化液包括质量比为60:1:2-5的胶原酶、脱氧核糖核酸酶i和透明质酸酶。
15.作为进一步限定，所述消化是在温度为36-38℃的条件下消化70-100min。
16.作为第四种限定，所述过滤的筛孔直径为40-100um。
17.作为第五种限定，所述离心的转速为400-700g。
18.本发明还有一种限定，所述脐带组织和胶原酶的质量比为1:0.015-0.045。
19.本发明原理中，基于浸泡处理，使组织中胶原蛋白浓度降低，然后通过胶原酶进一步消化胶原组织，以提高间充质干细胞的分离得率。
20.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
21.本发明的分离方法不同于现有技术中利用细胞自主爬出，收集或解离爬至培养皿表面细胞的方法，而是先进行5天以上的浸泡处理，使沃顿胶中胶原蛋白等组织膨胀松散易于被消化水解，再利用富含胶原酶的消化液，消化组织块中的胶原蛋白，解除脐带中胶原蛋白等胶质物质对间充质干细胞自主爬出的阻拦，基于浸泡处理和消化液消化这两步协同作用的关键步骤，分离得到大量间充质干细胞，显著提高细胞产量；
22.本发明的分离方法，通过浸泡处理的步骤，使组织块中的胶原蛋白消化更容易，极大地提高了酶解的效率，而由于酶解效率的提高，使酶处理细胞的时间缩短，采用酶的浓度也降低，这都降低了细胞在解离过程中受到的外界压力和伤害，相较于胰蛋白酶等直接酶解的方法，显著改善所得细胞破损率高，细胞形态不统一，细胞扩增能力有限的问题。
23.本发明的分离方法适用于脐带中间充质干细胞的分离，有利于促进间充质干细胞在再生医学领域的大规模应用。
附图说明
24.图1是本发明对比例中间充质干细胞的产量的结果图；
25.图2是本发明对比例中间充质干细胞的细胞增殖率的结果图；
26.图3是本发明对比例中间充质干细胞的流式细胞术结果图；
27.图4是本发明对比例中子宫厚度结果图；
28.图5是本发明对比例中子宫腺体的数量结果图。
具体实施方式
29.下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。实施例1一种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法
30.本实施例提前配制dmem培养基：取dmem培养基添加20％体积分数的胎牛血清、10,000单位/ml青霉素、10,000μg/ml链霉素和1％体积分数的无水乙醇，即得dmem培养基，备
用。
31.本实施例包括依次进行的以下步骤：
32.s1.取材及预处理
33.取新生儿新鲜离体健康脐带约6cm，用生理盐水反复冲洗，挤干净脐带中血液，于50ml离心管中用dmem培养基保存，使用封口膜封口，移至超净工作台中，采用dmem培养基清洗脐带2次，剔除两根脐动脉，剪开脐静脉管壁，清除血液凝块；去除血管后用50ml用含10,000单位/ml青霉素和10,000μg/ml链霉素双抗的pbs缓冲液清洗组织两次，至无血水，得脐带组织，备用。
34.s2.剪切研磨
35.取2g脐带组织，加入dmem培养基，用灭菌后的眼科剪及有齿镊辅助剪切脐带组织；将脐带组织剪至1mm
×
1mm
×
1mm大小的碎泥样，转移至15ml离心管内，经400g离心5min，离心后弃上清，将沉淀物倒至研磨碗，采用十字研磨法，每20次停留15s，共研磨40次，得研磨样品。
36.s3.浸泡处理
37.取全部研磨样品，加入10mldmem培养基，随后转移组织悬液至10cm培养皿中，于37℃，co2体积分数为5％的条件下，在培养箱中浸泡7天。
38.s4.分离得细胞组织
39.浸泡处理后，从培养皿中转移组织悬液至15ml离心管，400g离心5min，弃上清，加入5ml含双抗的pbs缓冲液至15ml离心管内，400g离心5min，弃上清，反复重复此步骤，经洗涤下沉物3次，最终所得下沉物即为细胞组织。
40.s5.消化液消化
41.取细胞组织，至离心管，加入10mg胶原酶ii、10mg胶原酶iii和10mg胶原酶iv至各自的终浓度为2mg/ml，加入0.5mg脱氧核糖核酸酶i至终浓度为0.1mg/ml，加入1.5mg透明质酸酶至终浓度为0.3mg/ml，再加入dmem培养基至总体积为5ml。最后，加入rho相关螺旋卷曲蛋白激酶抑制剂(y-27632)至终浓度为10umol/l，随后放至摇床37℃，220rpm条件下消化90min。
42.其中，脐带组织和胶原酶的质量比为1:0.015。
43.s6.过滤离心
44.消化结束后，取出离心管，采用100um的细胞筛过滤，取滤液600g离心5min，弃去上清液，所得沉淀即为脐带中间充质干细胞。
45.对上述沉淀使用含双抗的pbs缓冲液清洗2次，再次于600g离心5min后，用10ml dmem培养基重悬并加入rho相关螺旋卷曲蛋白激酶抑制剂(y-26732)至终浓度为10umol/l，转移至10cm细胞培养皿，放入37℃，co2浓度为5％的培养箱培养，1天后观察细胞生长情况，同时进行换液，除去未贴壁细胞，每3天换液1次，至贴壁细胞80％融合后传代，用于后续研究使用。
46.采用本发明的方法分离所得的脐带中间充质干细胞，能够持续传代培养。
47.实施例2-6脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法
48.实施例2-6分别为一种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于部分工艺参数不同，具体详见表1；
49.其中，胶原酶ii、胶原酶iii和胶原酶iv的质量比标记为比例a；
50.胶原酶、脱氧核糖核酸酶i和透明质酸酶的质量比标记为比例b；
51.脐带组织和胶原酶的质量比标记为比例c；
52.表1实施例2-6中部分工艺参数一览表
[0053][0054][0055]
实施例2-6的其它部分与实施例1相同；其中，脐带组织经剪碎至碎块体积均不大于8mm3。
[0056]
采用本发明的方法分离所得的脐带间充质干细胞，能够持续传代培养。
[0057]
对比例七种脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法效果比较
[0058]
本对比例通过检测采用下述七种方法分离所得脐带中间充质干细胞的产量、增殖率、纯度和应用效果来比较各分离方法的效果。
[0059]
m1法：将2g沃顿胶切成大小为1-2mm的小块，并转移到涂有0.2％明胶的100mm康宁浅盘中；每个培养皿中放入2g组织，并完全用培养基覆盖；在第5天小心更换一半量的培养基(不扰动组织块)；第8天，取出所有组织块，全量换液一次。
[0060]
m2法：将2g沃顿胶切成1-2mm的小块，然后在dmem/f12+20％fbs中用均质搅拌机横
向研磨约40次，使小块呈直径1-2mm的细粒状；随后，用dmem/f12+20％fbs混合液反复冲洗，将冲洗后的组织片放置在涂有0.2％明胶的100毫米康宁浅盘中；在第5天小心更换一半量的培养基(不扰动组织块)；第8天，取出所有组织块，更换新鲜培养基；此后根据细胞成簇生长情况，每2天观察记录一次。
[0061]
m3法：将2g沃顿胶切割成约1-2mm，并与1mg/ml胶原酶ii(sigma-aldrich)在4℃下培养过夜，次日，用100目筛滤除大块组织，用pbs洗涤3次，并在含dmem和20％fbs的培养基中洗涤1次；然后，将组织铺在涂有0.2％明胶并盛有5ml培养基的100mm培养皿中；随后第二天，细胞开始从组织中解离，再向表面皿中加入2-3ml培养基，两天后，更多的细胞从组织中分离出来，再加入2-3ml培养基；每三天更换一次培养基，直到第8天或者直至细胞生长达80％融合。
[0062]
m4法：将沃顿胶切割成约1-2mm的小块，并将2g的组织块转移到一个15ml的离心管中，并加入3ml含1mg/ml胶原酶ii和0.25mg/ml胰蛋白酶的混合酶，将离心管样品安放于振荡器中，在200rpm及37℃条件下振荡15分钟，该反应用7ml培养基中和，通过离心过程收集750g解离的细胞和组织片，并转移到涂有按涂抹密度1片/cm2涂抹0.2％明胶的培养皿中；将5ml培养基加入培养皿中，并将样品置于5％co2培养箱中4-5天，直至细胞贴壁。在第5天更换一次培养基，此后每2天全液更换一次。
[0063]
m5法：以胶原酶i(终浓度为2mg/ml)、胶原酶iv(终浓度为2mg/ml)、透明质酸酶(终浓度为0.3mg/ml)、脱氧核糖核酸酶i(终浓度为0.1mg/ml)和体积比例为0.25％的胰蛋白酶配制混合酶；
[0064]
将2g沃顿胶切成1-2mm的组织块，将组织块用pbs液洗涤3次以除去残余培养液，再将组织块转移到15ml离心管中，加入1.6ml混合酶；将离心管样品置于振荡器中，在200rpm及37℃条件下振荡2h；将分离的细胞用pbs洗涤3次，使细胞沉淀重新悬浮于培养基中；再将细胞接种于培养板中，在37℃，co2体积分数为5％的培养箱内培养，每三天全量换液一次。
[0065]
m6法：将2g沃顿胶切成1-2mm的组织块，将组织块用pbs液洗涤3次以除去残余培养液，再将组织块转移到15ml离心管中进行两步消化：第一步，在dmem培养基中使用胶原酶ii(终浓度为2mg/ml)及体积比例为0.25％的胰蛋白酶和体积比例为0.5％的乙醇进行消化；第二步，在dmem培养基中使用胶原酶ii(终浓度为2mg/ml)、透明质酸酶(终浓度为0.3mg/ml)和脱氧核糖核酸酶(终浓度为0.1mg/ml)进行消化；将样品在200rpm及37℃条件下振荡90min。通过离心过程收集750g解离的细胞并重悬浮于10ml培养基中，将细胞接种于培养板中，在37℃，co2体积分数为5％的培养箱内培养，每三天全量换液一次。
[0066]
msd法：即本发明实施例1中的方法。
[0067]
(一)检测间充质干细胞的产量和增殖率
[0068]
本实验对m1法-m6法及msd法共七种方法分离所得间充质干细胞，培养至p3代细胞后以1000个/孔的密度接种在96孔板中，培养基液量均为100μl，培养14天后，通过血细胞计数器进行计数，用以检测不同方法所得的间充质干细胞的产量；每天记数以计算细胞增殖率；
[0069]
间充质干细胞的产量如图1所示，采用m1法和m2法在培养14天后产生的细胞数量比较接近，约5
×
105个细胞；m6法为m1法-m6法中细胞产量最高的方法，得到1.3
×
106个细胞；而msd法分离所得间充质干细胞经培养，细胞数量明显更多，从2g脐带组织中平均获得
4.7
×
106个细胞，该产量比m1-m6的六种方法高4-10倍。
[0070]
由m1法、m6法和msd法分离所得间充质干细胞的细胞增殖率如图2所示，由图可知，采用本发明的msd法所得细胞增殖率和m6法相近，均显著高于m1法，但本发明的msd法细胞产量更高。
[0071]
(二)检测间充质干细胞的纯度
[0072]
本实验通过流式细胞术对m1法-m6法及msd法共七种方法所得p2代间充质干细胞上的cd44、cd90、cd73和cd105表面标志物进行分析，同时对其它标志物hla-dr也进行检测，用以检测培养至p2代后间充质干细胞的纯度；
[0073]
表1 m1法-m6法所得p2代间充质干细胞纯度分析结果
[0074][0075]
m1法-m6法所得p2代间充质干细胞纯度分析结果如表1所示，结果表明，检测cd44、cd73、cd90和cd105时，由m2、m3、m5和m6法所得p2代间充质干细胞中超过90％显示为阳性，而hla-dr标记的阳性细胞不到1％，表明细胞中间充质干细胞纯度较高。而m1法和m4法所得p2代间充质干细胞中不到90％的细胞对cd44、cd73、cd90和cd105标记物呈阳性，间充质干细胞纯度较低。
[0076]
本发明的msd法所得p2代间充质干细胞纯度分析结果如图3所示，结果表明，大于95％的细胞对cd44、cd90、cd73和cd105呈阳性，仅0.86％的细胞对hla-dr呈阳性，结果表明，采用本发明的方法分离所得间充质干细胞，经传代后纯度极高，显著高于m1法-m6法所得细胞。
[0077]
(三)间充质干细胞的应用效果
[0078]
对大鼠实施子宫过机械损伤构建宫内粘连(iua)大鼠模型；
[0079]
本实验通过将m6法及msd法分离培养所得间充质干细胞移植至宫内粘连大鼠模型子宫内膜，同时构建假手术组(sham)和阴性对照组(control)，检测大鼠模型子宫厚度以及子宫腺体数量的恢复情况，以比较不同分离方法所得间充质干细胞的应用效果；
[0080]
结果如图4、图5所示，将msd法或m6法所得的间充质干细胞移植到大鼠模型子宫后，子宫厚度以及子宫腺体的数量可恢复到与假手术组相当的水平，虽然在组织恢复效果方面没有显着差异，但本发明的msd法具有更高细胞产量的优势。
[0081]
综上所述，本发明的脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法，能够分离得到大量间充质干细胞，显著提高细胞产量，且细胞损伤小，后续应用效果好，有利于促进间充质干细胞在再生医学领域的大规模应用。
[0082]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。