一种与印度南瓜短蔓基因CmDw-1连锁的SNP标记及其引物、试剂盒与应用

一种与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记及其引物、试剂盒与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术辅助育种领域，特别涉及一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记及其引物、试剂盒与应用。


背景技术：

2.印度南瓜(cucurbitamaximad.)，是葫芦科重要的经济作物，在全球范围内广泛栽培。印度南瓜栽培种大部分都是蔓生品种，藤蔓较长，不利于田间栽培管理，而植株适度矮生可节约空间，有利于合理密植，提高单位面积产量。
3.目前，关于印度南瓜短蔓的研究报道极少，未对其遗传规律进行系统研究，也未见其基因克隆和分子标记的相关报道。


技术实现要素：

4.基于上述领域的空白，本发明利用印度南瓜短蔓突变体材料agol，旨在开发与短蔓基因紧密连锁的snp标记，用于育种研究。本发明提供了与印度南瓜短蔓基因cmdw-1紧密连锁的snp标记，并提供了其在选择印度南瓜种质资源上的应用。
5.发明的技术方案如下：
6.一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps，其特征在于，所述snp标记cmdw-1-dcaps的第150个碱基位点具有g/c单核苷酸多态性。
7.可扩增所述snp标记cmdw-1-dcaps的引物包含下述上下游引物对：
8.cmdw-1-dcaps-f:cctttcattctataagccgcca；
9.cmdw-1-dcaps-r:cttcgcaggctttgacgag。
10.用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物，其特征在于，可扩增权利要求1或2所述的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps。
11.优选地，所述的snp标记cmdw-1-dcaps的上下游引物扩增的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.3；
12.所述的snp标记cmdw-1-dcaps的上下游引物扩增的与印度南瓜长蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.4。
13.用于鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括可扩增所述的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps的引物，和/或，所述的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物。
14.所述的用于鉴别携带短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒还包括：pcr试剂、和/或，电泳试剂；
15.优选地，所述pcr试剂包括：taq酶、pcr缓冲液、dntp；所述pcr试剂优选3gtaqmastermixforpage(reddye)；
16.优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、tris-hcl、sds、丙烯酰胺、过硫酸胺、temed、双蒸水、银染试剂；
17.优选地，所述试剂盒还包括alui限制性内切酶、酶切缓冲液、双蒸水。
18.一种鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法，其特征在于，采用所述的一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps，和/或，所述的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物，和/或，所述的用于鉴别携带短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒，对待测印度南瓜材料进行pcr扩增。
19.所述的一种鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法还包括，对所述pcr的扩增产物进行测序或酶切电泳；
20.测序结果如seqidno.1所示，或，酶切电泳结果为149bp的南瓜材料的基因型和表型均为短蔓cmdw-1；
21.测序结果如seqidno.2所示，或，酶切电泳结果为168bp的南瓜材料的基因型和表型均为长蔓cmdw-1。
22.对待测材料进行pcr扩增和酶切反应；
23.所述pcr扩增体系包括：0.75ng/μldna模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)；
24.优选地，所述pcr体系为：7.5ngdna模板，正向和反向引物各50ng，5μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)，加双蒸水至10μl；
25.优选地，所述pcr程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
26.优选地，所述检测还包括：对pcr产物测序；
27.所述酶切反应体系为：3μlpcr扩增产物，5μlnebbuffer，0.2μlalui限制性内切酶，加双蒸水至10μl；
28.优选地，所述酶切反应程序为：37℃酶切2h后，进行凝胶电泳检测；
29.所述电泳指，将pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
30.优选地，电泳条件为150v恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色。
31.一种印度南瓜cucurbitamaximad.高产种植方法，其特征在于，采用所述的一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps，和/或，所述的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物，和/或，所述的用于鉴别携带短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒，和/或，采用所述的一种鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法鉴别筛选出携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源进行自交或杂交，得到含有短蔓基因cmdw-1纯合体的印度南瓜品种进行高密度种植。
32.所述高密度种植指将含有短蔓基因cmdw-1纯合体的印度南瓜品种的单株按种植密度1000-1200株/亩进行种植。
33.本发明所述snp标记扩增的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如seqidno.1所示，序列的150位碱基为g,经alui酶切后得到150bp片段，如seqidno.3所示。所述snp标记扩增的与印度南瓜长蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如
seqidno.2所示，序列的150位碱基为a，经alui酶切后得到169bp片段，如seqidno.4所示。
34.上述snp标记在筛选印度南瓜短蔓基因cmdw-1的中的应用，其步骤如下：
35.(1)提取被检测样品基因组dna；
36.(2)以所述印度南瓜基因组dna为模板，以权利要求2所述引物进行pcr扩增，获得一个169bp的核苷酸片段，该核苷酸片段中包含一个与印度南瓜短蔓基因cmdw-1紧密连锁的snp位点或与印度南瓜长蔓基因cmdw-1紧密连锁的snp位点；
37.(3)将步骤(2)所述的核苷酸片段进行测序或alui酶切后进行凝胶电泳检测；
38.如果测序结果如seqidno.1所示，则为印度南瓜短蔓基因材料，如果测序结果如seqidno.2所示，则为黄印度南瓜长蔓基因材料；
39.若酶切后片段为150bp，则待测样品为印度南瓜短蔓基因材料，若酶切后片段为169bp，则待测样品为印度南瓜长蔓基因材料。
40.所述pcr反应体系为:7.5ngdna模板，正向和反向引物各50ng，5μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)，加双蒸水至10ul；
41.所述pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存；
42.alui酶切的体系为：3μlpcr扩增产物，5μlnebbuffer，0.2μlalui限制性内切酶，加双蒸水至10μl，切温度为37℃，酶切时间为2h；
43.所述凝胶电泳检测：指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150v恒功率电泳分离1h30min，最后银染显色，进行条带统计。
44.前期研究发现，印度南瓜栽培种大部分都是蔓生品种，藤蔓较长，田间栽培管理不便，通风和透光效率较差，而植株适度矮生可节约空间，有利于合理密植，提高单位面积产量。所以，短蔓的印度南瓜材料则为解决上述难题提供了可能。因此，研究印度南瓜短蔓性状的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义
45.本实验室利用印度南瓜短蔓材料agol和以短蔓材料agol为轮回亲本，并与原始蔓生材料雪二回交构建的染色体片段置换材料nil开发snp标记，通过对96份不同类型的南瓜种质资源进行验证，结果发现cmdw-1-dcaps标记用于分子标记辅助育种选择的正确率为100％。
46.本发明基于开发的snp标记提供用于辅助筛选具有印度南瓜短蔓基因cmdw-1的南瓜新品种的方法。该方法中，采用所述cmdw-1-dcaps特异性引物扩增待测材料的dna，然后对扩增产物进行测序及酶切电泳。通过本发明提供的方法，可以在南瓜候选材料的任何阶段对其进行南瓜短蔓的筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
47.图1是采用本发明的一个实施例提供的与南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps标记检测印度南瓜短蔓材料agol、其近等基因系nil和96份不同类型的印度南瓜种质资源的扩增条带。
48.具体实施方法
49.下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范
围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
50.生物材料来源
51.本研究所用的试验材料为申请人实验室保存的南瓜资源agol(短蔓突变体)和96份不同类型的南瓜种质资源，申请人声明自本发明申请日起20年内可向公众发放用于本发明技术效果的验证。
52.主要试剂
53.pcr实验使用vazyme公司的2*3gtaqmastermixforpage(reddye)；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
54.第1组实施例、本发明的snp标记cmdw-1-dcaps
55.本组实施例提供一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述snp标记cmdw-1-dcaps的第150个碱基位点具有g/c单核苷酸多态性。
56.在具体的实施例中，可扩增所述snp标记cmdw-1-dcaps的引物包含下述上下游引物对：
57.cmdw-1-dcaps-f:cctttcattctataagccgcca；
58.cmdw-1-dcaps-r:cttcgcaggctttgacgag。
59.第2组实施例、本发明用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物
60.本组实施例提供用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物可扩增第1组实施例任一项所提供的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps。
61.在一些实施例中，所述引物包含下述上下游引物对：
62.cmdw-1-dcaps-f:cctttcattctataagccgcca；
63.cmdw-1-dcaps-r:cttcgcaggctttgacgag。
64.在另一些实施例中，所述的snp标记cmdw-1-dcaps的上下游引物扩增的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.3；
65.所述的snp标记cmdw-1-dcaps的上下游引物扩增的与印度南瓜长蔓基因cmdw-1连锁的特征条带核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.4。
66.第3组实施例、本发明的试剂盒
67.本组实施例提供用于鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括可扩增第1组实施例任一项所提供的与印度南瓜短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps的引物，和/或，第2组实施例任一项所提供的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物。
68.在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括：pcr试剂、和/或，电泳试剂；
69.优选地，所述pcr试剂包括：taq酶、pcr缓冲液、dntp；所述pcr试剂优选3gtaqmastermixforpage(reddye)；
70.优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、tris-hcl、sds、丙烯酰胺、过硫酸胺、
temed、双蒸水、银染试剂；
71.优选地，所述试剂盒还包括alui限制性内切酶、酶切缓冲液、双蒸水。
72.第4组实施例、本发明鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法
73.本组实施例提供一种鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法。本组所有的实施例提供的所述方法都具备如下共同特征：采用第1组实施例任一项所提供的一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps，和/或，第2组实施例任一项所提供的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物，和/或，第3组实施例任一项所提供的用于鉴别携带短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒，对待测印度南瓜材料进行pcr扩增。
74.在进一步的实施例中，所述方法还包括，对所述pcr的扩增产物进行测序或酶切电泳；
75.测序结果如seqidno.1所示，或，酶切电泳结果为149bp的南瓜材料的基因型和表型均为短蔓cmdw-1；
76.测序结果如seqidno.2所示，或，酶切电泳结果为168bp的南瓜材料的基因型和表型均为长蔓cmdw-1。
77.在具体的实施例中，对待测材料进行pcr扩增和酶切反应；
78.所述pcr扩增体系包括：0.75ng/μldna模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)；
79.优选地，所述pcr体系为：7.5ngdna模板，正向和反向引物各50ng，5μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)，加双蒸水至10μl；
80.优选地，所述pcr程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
81.优选地，所述检测还包括：对pcr产物测序；
82.所述酶切反应体系为：3μlpcr扩增产物，5μlnebbuffer，0.2μlalui限制性内切酶，加双蒸水至10μl；
83.优选地，所述酶切反应程序为：37℃酶切2h后，进行凝胶电泳检测；
84.所述电泳指，将pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
85.优选地，电泳条件为150v恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色。
86.第5组实施例、本发明的印度南瓜cucurbitamaximad.高产种植方法
87.本组实施例提供一种印度南瓜cucurbitamaximad.高产种植方法。本组所有实施例都具备如下共同特征：采用第1组实施例任一项所提供的一种与印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记cmdw-1-dcaps，和/或，第2组实施例任一项所提供的用于筛选印度南瓜cucurbitamaximad.短蔓基因cmdw-1的引物，和/或，第3组实施例任一项所提供的用于鉴别携带短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的试剂盒，和/或，第4组实施例任一项所提供的一种鉴定携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源的方法鉴别筛选出携带有短蔓基因cmdw-1的印度南瓜种质资源进行自交或杂交，得到含有短蔓基因cmdw-1纯合体的印度南瓜品种进行高密度种植。
88.在具体的实施例中，所述高密度种植指将含有短蔓基因cmdw-1纯合体的印度南瓜品种的单株按种植密度1000-1200株/亩进行种植。
89.实验例1、印度南瓜短蔓基因cmdw-1紧密连锁的snp标记的获得
90.结合南瓜基因组序列的数据和agol、nil重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的片段差异，发现存在1个单核苷酸突变，发现该snp在南瓜短蔓突变体材料agol的基因组中，该位点碱基为g；在nil基因组中，该碱基为c。
91.基于获得的与印度南瓜agol短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记，开发与印度南瓜agol 短蔓基因cmdw-1连锁的snp标记(命名为cmdw-1-dcaps)。其中正向和反向引物分别为：
92.cmdw-1-dcaps-f:cctttcattctataagccgcca(seq id no.5)
93.cmdw-1-dcaps-r:cttcgcaggctttgacgag(seq id no.6)
94.由于上述所得snp的关系(snp＝g/c)，当碱基g存在时，形成内切酶alui的识别序列 (ag
↓
ct，
↓
为酶切位点)，扩增片段可以被内切酶切开；当碱基c存在时，不能形成内切酶识别序列，扩增片段无法被内切酶alui切开。
95.通过上述引物(cmdw-1-dcaps-f/cmdw-1-dcaps-r)对短蔓突变体agol、nil和96 份印度南瓜核心种质进行pcr扩增，并结合内切酶alui对扩增片段进行酶切，获得特异性条带，若酶切后片段为149bp(seq id no.3)，则待测样品为印度南瓜短蔓基因材料；若酶切后片段为168bp(seq id no.4)，则待测样品为印度南瓜长蔓基因材料。
96.具体操作方法：
97.步骤1.dna提取和pcr扩增
98.取南瓜植株的嫩叶，用用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取短蔓突变体agol、 nil和96份核心种质各单株的基因组dna。
99.snp标记pcr反应体系为：7.5ng dna模板，正向和反向引物各50ng，5μl 2
×
3g taqmaster mix for page(red dye)，加双蒸水至10μl(red dye)(vazyme公司产品)。
100.pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸30 秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存forever。
101.步骤2.alui完全酶切pcr产物
102.酶切体系为：pcr产物3μl，内切酶0.2μl，nebuffer1μl1μl，双蒸水5.8μl,酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
103.步骤3.结果判定
104.方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将pcr产物直接测序。agol(短蔓突变体)所得序列在第150位碱基为g；nil(其近等基因系材料)所得序列在150位碱基为c。
105.方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色，统计带型。
106.agol(短蔓突变体)得到一个为149bp的片段，条带带型记为a；nil得到一个168bp 的片段条带带型记为b。由于agol控制的短蔓基因是显性遗传，故带型为a或h是短蔓，带型为b为长蔓。
107.实验例2、本发明的印度南瓜短蔓基因连锁的snp标记的验证
108.利用本课题保存的96份核心种质材料，对与cmdw-1短蔓基因连锁的标记 cmdw-1-dcaps进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：经和所选材料的田间表现型相比，标记在96份印度南瓜核心种质材料中的表型数据和田间调查结果一致，经计算正
确率为100％。扩增条带见图1。
109.实验例3、高密度种植短蔓印度南瓜提高产量
110.本领域公知，普通长蔓印度南瓜的种植密度仅为500-600株/亩。
111.短蔓印度南瓜的单株产量与长蔓印度南瓜的单株产量数据如下表所示：
112.材料单株结瓜数(个)单瓜重(kg)亩株数(株)亩产量(kg)长蔓印度南瓜～3～1.2500-6001800-2160短蔓印度南瓜～3～1.21000-12003600-4320
113.因短蔓印度南瓜的蔓短，所占据的空间相比长蔓印度南瓜更小，在同样面积的土地上短蔓印度南瓜可比长蔓印度南瓜种植的单株更多更密，含有短蔓基因cmdw-1纯合体的印度南瓜品种的单株可按种植密度1000-1200株/亩进行种植，而前期试验发现短蔓印度南瓜的单株产量与长蔓印度南瓜的单株产量无显著差异，因此种植短蔓印度南瓜的亩产量会显著高于长蔓印度南瓜，产量可提高1倍以上。