一种grx-rogfp gpx3-rogfp基因过表达16hbe单克隆细胞系模型
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体是一种grx-rogfp/gpx3-rogfp基因过表达16hbe单克隆细胞系模型构建方法。
背景技术：
2.本细胞系是靶向线粒体的grx-rogfp和gpx3-rogfp支气管上皮细胞(16hbe)稳转细胞系。众所周知，活性氧(reactive oxygen species，ros)是一类化学性质活泼，氧化能力很强的含氧物质，对机体造成众多危害，很多疾病的发生发展均与活性氧有密切关联。故探究ros水平变化对于深入探讨药物或毒物或自身所处内环境有重要意义。
3.线粒体为胞内活性氧自由基产生的重要场所，精细结构和复杂功能使其成为多种外源性物质的初始靶向细胞器。线粒体内膜通透性与电子传递链完整性是决定线粒体功能状态的主要因素，而线粒体的功能状态与细胞的生长、增殖分化和死亡等生理活动紧密相关。且相比于其他细胞器，线粒体对各种损伤最为敏感。因此，检测线粒体内ros的水平对于研究机体内环境及探求机制具有重要意义。
4.目前传统检测ros的方法主要有两种类型：
5.1)间接测量与氧化还原相关的物质。如采用高效液相色谱或凝胶电泳等方法分离提取 nadph，ascorbic acid，gsh和trx等物质；或通过酶法间接检测相关的超氧岐化酶 (superoxide dismutase，sod)，催化酶，总过氧化酶，抗坏血酸过氧化酶的活性，以及脂过氧化酶，蛋白质氧化酶，谷胱甘肽还原酶等。间接测量法缺点为需要破坏细胞，分离组织，提取目标物，从而人为地造成氧化损伤，不能进行动态测量，无法分辨亚细胞水平的氧化还原情况。
6.2)直接检测ros。主要分为基于荧光素类化合物的检测方法与电子自旋共振(esr)法。荧光素探针如2',7'-二氯二氢荧光素(2',7'-dihydrodichlorofluore-scein，h2dcf)被 h2o2氧化时能产生荧光，但是除了h2o2，h2dcf还能被金属离子，过氧化酶和细胞色素c 等氧化，特异性差。esr法对样品制备要求较高，且只能测得样品细胞ros的平均值，操作复杂、费用昂贵。其他方法如化学染色剂3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine， dab)、氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，nbt)可与活性氧反应生成沉淀，是传统的ros原位(in situ)检测方法，但是此应用受到底物吸收、细胞渗透、组织固定等因素影响。且荧光试剂和染色剂都存在细胞毒性、无可逆性和非活体检测等缺点，不能对细胞中的ros发展进行实时动态观察。
7.综上所述，目前研究活性氧的方法尚存在很多不足与局限，因此开发一种高效、无毒并且能够实时动态监测ros水平的方法势在必行。
技术实现要素：
8.本发明的目的在于提供一种grx-rogfp/gpx3-rogfp基因过表达16hbe单克隆细胞
系模型构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.一种grx-rogfp/gpx3-rogfp基因过表达16hbe单克隆细胞系模型构建方法，其构建方法步骤如下：
11.步骤一：首先将目的基因grx-rogfp和gpx-rogfp克隆至慢病毒载体plv-puro上；
12.步骤二：进一步用慢病毒载体plv-w包装成慢病毒后感染16hbe细胞，并通过 puromycin筛选grx-rogfp和gpx-rogfp基因过表达稳定细胞株，从而构建了可实时动态观察支气管上皮细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系。
13.作为本发明进一步的方案：所述步骤一的具体步骤如下：
14.s1：首先选取双酶切基因片段grx-rogfp和gpx-rogfp和载体；
15.s2：进一步将酶切好的grx-rogfp和gpx-rogfp连接到plv-puro载体上；
16.s3：进一步进行pcr克隆鉴定。
17.作为本发明再进一步的方案：所述步骤二的具体步骤如下：
18.s1：首先进行质粒提取；
19.s2：进一步进行慢病毒包装；
20.s3：进一步感染慢病毒感染16hbe细胞和并进行筛选。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.1、本发明选取准确反应线粒体内氧化还原动态的gsh及h2o2，将可特异性检测gsh 的谷氧还蛋白(glutaredoxin，grx)与特异性检测h2o2的谷胱甘肽过氧化酶gpx3和rogfp 融合。通过观测grx-rogfp及gpx3-rogfp可实时动态检测细胞内谷胱甘肽和h2o2，从而推测细胞体内氧化还原状态的变化，揭示活性氧的致病机理；
23.2、本发明将grx-rogfp/gpx3-rogfp转染至16hbe细胞线粒体中，构建了可实时动态观察支气管上皮细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系，为研究细菌、病毒感染，烟草暴露，以及一些工作场所的灰尘和烟雾、天气和空气质量引起的肺部病变提供了原位模型。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明实施例中，一种grx-rogfp/gpx3-rogfp基因过表达16hbe单克隆细胞系模型构建方法，其构建方法步骤如下：
26.步骤一：首先将目的基因grx-rogfp和gpx-rogfp克隆至慢病毒载体plv-puro上；
27.所述步骤一的具体步骤如下：
28.s1：首先选取双酶切基因片段grx-rogfp和gpx-rogfp和载体；
29.s2：进一步将酶切好的grx-rogfp和gpx-rogfp连接到plv-puro载体上；
30.s3：进一步进行pcr克隆鉴定；
31.步骤二：进一步用慢病毒载体plv-w包装成慢病毒后感染16hbe细胞，并通过 puromycin筛选grx-rogfp和gpx-rogfp基因过表达稳定细胞株，从而构建了可实时动态观
察支气管上皮细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系；
32.所述步骤二的具体步骤如下：
33.s1：首先进行质粒提取；
34.s2：进一步进行慢病毒包装；
35.s3：进一步感染慢病毒感染16hbe细胞和并进行筛选。
36.本发明的工作原理是：
37.本发明将grx-rogfp/gpx3-rogfp转染至16hbe细胞线粒体中，构建了可实时动态观察支气管上皮细胞线粒体内氧化还原动态的细胞系，为研究细菌、病毒感染，烟草暴露，以及一些工作场所的灰尘和烟雾、天气和空气质量引起的肺部病变提供了原位模型。
38.尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。