一种检测CD16A基因多态性的试剂盒及其应用和使用方法与流程

一种检测cd16a基因多态性的试剂盒及其应用和使用方法
技术领域
1.本发明是关于乳腺癌检测领域，具体地说，是一种检测cd16a基因多态性的试剂盒及其应用和使用方法。


背景技术：

2.乳腺癌是世界范围内女性最常见的癌症，也是威胁我国女性健康的重大杀手。据2020年年底，世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布的全球最新癌症负担数据，全球乳腺癌新发病例高达226万例，首次正式取代肺癌(220万)成为全球第一大癌症，占所有新增癌症患者的11.7％。
3.研究表明，her2在20-30％的原发性乳腺浸润性导管癌中存在基因的扩增和蛋白的过度表达。her2阳性的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，肿瘤浸润性强，无病生存期端，预后差。为此，多种阻断her2的抗癌药物相继问世，其中，目前经fda批准最为常用的此类药物是曲妥珠单抗，它是一种重组dna衍生的人源化单克隆抗体，选择性的作用于her2的细胞外部分，适用于治疗her2过度表达的乳腺癌。
4.为获得更长的生存期，her2+mbc治疗方案不断进行探索，研发出新型治疗药物。2020年12月，fda批准margetuximab(马吉妥昔单抗)上市，用于治疗既往接受过两种及以上抗her2的转移性her2阳性乳腺癌成年患者。margetuximab(马吉妥昔单抗)是一种基因工程改造药物，通过对fc段改造而增强免疫活性。马吉妥昔单抗的fab段可以和her2特异性结合，修饰的fc段可通过增强抗体介导细胞依赖细胞毒(adcc)效应来增加对肿瘤细胞的杀伤作用。
5.不同免疫细胞表达的fcγ受体(fcγr)具有不同功能，fcγrⅱa(cd32a)和fcγrⅲa(cd16a)属于激活性受体，fcγrⅱb(cd32b)属于抑制性受体，fcγr的基因多态性影响其与igg抗体的结合，最终影响her2单克隆抗体临床疗效。回顾性研究显示，在her2+乳腺癌中，cd16a受体上158位氨基酸的不同等位基因表达影响疗效，数据表明，mbc患者携带cd16a-158f基因可能与曲妥珠单抗治疗后更低的客观缓解率和更短的无进展生存期(pfs)相关。在辅助治疗的相关研究中显示，携带cd16a-158ff基因型的患者接受曲妥珠单抗表现出不良预后和更短的无病生存期(dfs)，而目前该结论还需要更多的数据支持。
6.fc段修饰的马吉妥昔单抗可以调节免疫应答。fc修饰与cd16a亲和力增加，增强固有免疫，与cd32b亲和力下降，增强获得性免疫。上述亲和力的改变，使得马吉妥昔单抗诱导免疫反应比曲妥珠单抗更具有优势。
7.文献研究中，tahar van der straaten等人阐述了一种特异性于rs396991且不共扩增cd16b的焦磷酸测序方法，并显示该方法与life technologies公司的一种用于rs396991的市售taqman基因分型方法(c__25815666_10)100％一致。然而，他们没有证明c__25815666_10的特异性，因为克隆和测序的taqman产物与cd16a和cd16b都是100％同源的。
8.因此，考虑cd16a及cd16b基因组高度同源性的问题，开发一种特异性扩增cd16a，
并基于taqman基因分型方法分析cd16a基因rs396991位点多态性的试剂盒是有必要的。
9.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种检测cd16a基因多态性的试剂盒及其应用和使用方法，其能够提供一种操作简便、准确度高、特异性好、成本低，且辅助判断乳腺癌患者对马吉妥昔单抗治疗敏感性的试剂盒及测试方法。
11.为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种检测cd16a基因多态性的试剂盒，包括试剂盒，所述试剂盒包括扩增cd16a基因序列的第一引物对和检测cd16a基因rs396991位点多态性的第二引物对和荧光探针；
12.所述扩增cd16a基因序列的第一引物对，其正向引物核苷酸序列为cd16a-f1：5
’‑
tggggtgtctgtgtctttca-3’，其反向引物核苷酸序列为cd16a-r1：5
’‑
ctttgatgtgaccttagggaaact-3’，能与cd16a基因的rs396991位点上下游特异性结合并扩增出包含rs396991位点的基因序列；
13.所述检测cd16a基因rs396991位点多态性的第二引物对，其正向引物核苷酸序列为cd16a-f2：5
’‑
tggggtgtctgtgtctttca-3’，其反向引物核苷酸序列为cd16a-r2：5
’‑
tgcaaacctaccctgcaatc-3’；
14.所述荧光探针包括检测cd16a基因rs396991位点多态性的探针，所述探针包括：
15.第一探针158f-probe：5
’‑
fam-ttactcccaaaaagccccctg-mgb-3’；
16.第二探针158v-probe：5
’‑
hex-ttactcccaacaagccccctg-mgb-3’。
17.作为优选的，所述试剂盒还包括2*pcr反应液，2*探针型pcr反应液和无核酸酶无菌去离子水，ff型参考品，fv型参考品，vv型参考品。
18.作为优选的，所述第一引物对和第二引物对的浓度总和为10um，荧光探针浓度为5um。
19.一种检测cd16a基因多态性的试剂盒的应用，该检测cd16a基因多态性的试剂盒应用于检测乳腺癌马吉妥昔单抗药物治疗敏感性。
20.一种检测cd16a基因多态性的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
21.s1、基因组待测dna提取；
22.s2、采用该检测cd16a基因多态性的试剂盒，对s1中提取到的基因组dna进行pcr扩增，并同时进行参考品的扩增，扩增结束后进行磁珠纯化或琼脂糖凝胶电泳回收900-1000bp片段大小核酸产物；
23.s3、采用该检测cd16a基因多态性的试剂盒，对步骤b中pcr纯化产物，进行tapman分型检测。
24.作为优选的，s2中所述的pcr扩增反应条件如下：
[0025][0026]
作为优选的，s1中待测dna取自肿瘤组织标本或外周血基因组dna。
[0027]
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：本发明基于taqman分型方法对人cd16a基因的多态性位点rs396991进行基因分型，具有操作简便、准确度高、特异性好、成本低等优点，检测结果可以辅助判断乳腺癌患者对马吉妥昔单抗治疗敏感性。
附图说明
[0028]
图1示出了9例已知cd16a基因rs396991位点的dna分型结果，其中纵坐标为158v型探针荧光型号强度，横坐标为158f型探针荧光型号强度；
[0029]
图2示出了20例临床样本cd16a基因rs396991位点的dna分型结果，其中纵坐标为158v型探针荧光型号强度，横坐标为158f型探针荧光型号强度。
具体实施方式
[0030]
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0031]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0032]
实施例1：
[0033]
用于检测cd16a基因多态性的特异性pcr引物和荧光探针制备，包括如下步骤：
[0034]
1.序列获得：所用基因序列的来源为ncbi(美国国立生物技术信息中心)
[0035]
2.设计方法：
[0036]
2.1根据ncbi数据库公布的cd16a、cd16b基因序列，选取特异性区域，该区域包含rs396991多态性位点，用于设计合适的引物和探针，筛选所得序列信息如下：
[0037]
caggctttgaagtctttgatgtgaccttagggaaacttatttatttatttttgcacctcggttacttcatctgtaaaatggaatattacctatctcatgttgtgaaggtctactgtgatagtcaaaccaggtgcatgtaaagaattgtttagcacagagtctagcacactgaaaggtgcccaataaatgtcagcttatttttgttacggaagaagaaattggggttcagagagactaagtggctcacctctggtcagatggttaattagctgcagggccagaacccaggttctgggctctttctgtgaggggatgaggggctcctgccagtttggatcgtggctaaaaggcttggataagaaggaggccagcacgataggaacatatgacaccgtgggtgtgattagcgtaaggaaagacagaggtatttattggggaggagatgtggcttctgctcctgccatcatgctgcagagtgaatgacacctcctagctaccccaaaagaatggactgaaacagagctgcaaacctaccctgcaatcagggacttttggggacctcctggtgatcaccaggagggaaccacatatgaagaagtgcgtgtaagaatcaggaatctcctcccaactcaacttcccagtgtgattgcaggttccacacacaggcgtccctgggcattccagggtggcacatgtctcaccttgagtgatggtgatgttcacagtctctgaagacacatttttactcccaaaaa
[0038]
此处共5个a碱基，中间一个就是rs396991位点。
[0039]
gccccctgcagaagtaggagccgctgtctttgagtgtggcttttggaatgtagaagtcagaattatgatgaaaatacttcctgcctttgccattctgtaaatatgtgaccttatgcagagcagtgttcttccagctgtgacacctcaggtgaatagggtcttcctccttgaacacccaccgaggggcctggagcaacagccagcctgaaagacacagacaccccaggcccgggaggcctcagctct(》hg38_dna range＝chr1:161544000-161545000 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+)
[0040]
2.2利用primerexpress 3.0进行引物和引物的设计：
[0041]
taqman探针设计原则：
[0042]
·
优先考虑探针位置
[0043]
·
探针的5'端第一个碱基不能是g
[0044]
·
基因表达探针tm值：68-70
□
c；基因分型探针tm值：65-67
□c[0045]
·
taqman探针长度13-30bp，taqman-mgb探针长度在13-25bp
[0046]
·
避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的g
[0047]
·
c比g多的探针效果更好，如果c少于g，选择其互补链
[0048]
·
多态位点应尽量位于探针中央，可以
±
3个碱基
[0049]
引物设计原则：
[0050]
·
引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠
[0051]
·
引物长度9-40bp，最优20bp，gc含量保持在30-80％之间
[0052]
·
避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的g
[0053]
·
引物tm值在58-60
□
c之间，上下游引物tm不要超过2
□c[0054]
·
引物3’端的5个碱基中，g和c加起来不要超过2个
[0055]
·
引物3’端不要是碱基a，避免出现3个以上相同碱基
[0056]
·
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对
[0057]
·
避免引物自身形成环状发卡结构
[0058]
·
扩增片段的长度在50-150bp之间
[0059]
primerexpress 3.0设计所得引物和探针序列信息见表1：
[0060]
表1特异性pcr引物和探针序列表
[0061][0062]
3.所得序列委托美国integrated dnatechnologies公司(简称idt)合成。
[0063]
实施例2
[0064]
实验方法准确性验证
[0065]
1.材料：9例已知cd16a基因rs396991位点基因型的基因组dna；
[0066]
2.方法：使用一种检测cd16a基因多态性的试剂盒检测上述样本中cd16a基因多态性位点rs396991基因型，试剂盒中用于检测cd16a基因多态性的特异性pcr引物和荧光探针均为实施例1中制备，。
[0067]
a.按照表2配置cd16a扩增反应液，涡旋混匀，瞬时离心；
[0068]
表2 cd16a扩增反应液配置表
[0069]
扩增反应组分体积(μl)待测dnax2*pcr扩增反应液12.5cd16a-f1(10μm)0.75cd16a-r1(10μm)0.75无核酸酶无菌去离子水(11-x)total25
[0070]
b.将扩增反应液放置bio-rad t100梯度型pcr仪，按表3运行扩增反应条件：
[0071]
表3 cd16a扩增反应条件
[0072][0073][0074]
c.采用磁珠法对扩增产物进行纯化，回收900-1000bp核酸产物。
[0075]
d.按照表4配置rs396991snp检测反应液，涡旋混匀，瞬时离心；
[0076]
表4rs396991 snp检测反应液配置表
[0077][0078]
e.将rs396991snp检测反应液放置abi7500荧光定量pcr仪，运行反应条件，进行taqman分型检测。
[0079]
f.结果分析：实验结果如图1所示，t1/t2/t3 fam荧光强度远大于vic荧光强度，说明为ff型；t4/t5/t6 fam荧光强度与vic荧光强度相当，说明为fv型；t7/t8/t9 vic荧光强度远大于fam荧光强度，说明为vv型；检测结果如表5所示。
[0080]
表5 9例已知cd16a基因rs396991位点的dna分型结果
[0081][0082]
3.实验结果分析：本次实验结果显示，本发明提供的试剂盒准确检测出了对应样本cd16a基因rs396991位点基因型，表明检测方法成功建立。
[0083]
实施例3
[0084]
临床样本检测
[0085]
1.材料：20例乳腺癌石蜡包埋组织样本
[0086]
2.方法：使用上述试剂盒对20例乳腺癌石蜡包埋组织样本进行检测，所述试剂盒在bio-rad梯度pcr仪和abi7500荧光定量pcr仪上完成。
[0087]
a.使用qiaamp dna ffpe tissue kit(德国qiagen公司，cat no.56404)对石蜡切片样本进行核酸提取，提取步骤按照产品说明书进行，得到50ul dna溶液，直接进行检测或-20℃暂存；同时进行质控品的检测。
[0088]
b.检测步骤及结果分析参照实施例2进行，检测结果如图2所示，详细结果见表6。
[0089]
表6 20例临床样本cd16a基因rs396991位点的dna分型结果
[0090]
[0091][0092]
3.实验结果分析：根据上述所制备的检测cd16a基因多态性的试剂盒，我们对20例乳腺癌临床标本进行了检测分型。其中s1 s7 s19分别为ff、fv、vv质控品，实验结果显示分型无误；所检测20例临床样本中，ff型6例，fv型9例，vv型5例，如图2所示，组内分布集中，组间分布差异明显。进一步说明本发明试剂盒可以简单、快速、准确的实现cd16a基因rs396991位点多态性检测。
[0093]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。