一种九肽及其美容组合物或药用组合物和用途的制作方法

1.本发明涉及一种九肽、以及包含这些肽的美容组合物或药用组合物及其用途。


背景技术：

2.人体皮肤的颜色受表皮色素体系的含量与分布、真皮血液循环情况以及角质层厚度的影响，其中黑色素的含量与分布是决定皮肤颜色的主要因素。当人体受到适量紫外线照射时，位于皮肤表皮基底层中的黑素细胞会产生黑色素并通过树状突起运输到周围的角质层细胞内，从而避免紫外线对细胞染色体的伤害和皮肤晒伤。但是，随着年龄增长、生活节奏加快以及环境污染的加剧，肌肤新陈代谢减慢，人体内会累积过多的黑色素，导致皮肤出现颜色加深变暗现象，甚至引起皮肤表面黑色素分布不均并出现斑块。因此，黑色素沉着和色斑形成已成为现代医学美容关注的热点问题，美白祛斑类产品及其功能性原料的开发已呈现日趋活跃、快速增长的态势。
3.在人体内，黑色素的形成受多种外源性(如紫外线、情绪和压力等)或内源性因素(如蛋白酶、细胞因子和激素等)调控，其中酪氨酸酶(tyr)、dhica氧化酶(trp-1)和多巴色素异构酶(trp-2)是黑色素生成过程中的关键酶。当皮肤受到外界刺激或者紫外线照射，α-促黑色素细胞激素(α-msh)生成增加。α-msh作用于黑色素皮质素受体1(mc1-r)，活化腺苷酸环化酶，环磷酸腺苷(camp)增加，促进小眼畸形相关转录因子(mitf)的表达，增加酪氨酸酶(tyr)合成，黑素细胞内的酪氨酸在tyr的氧化催化作用下生成多巴醌(dq)，dq经分子内反应生成白色多巴色素，后者通过进一步反应生成多巴色素。生成的多巴色素大部分经脱羟分解生成5,6-二羟基吲哚(dhi)，而另一部分在trp-2催化作用下生成5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(dhica)，最后dhi和dhica经氧化生成真黑色素。另外，在谷胱甘肽或半胱氨酸的作用下，dq可以转换为5-s-半胱氨酸多巴(5-s-cd)和少量的2-s-半胱氨酸多巴(2-s-cd)，然后反应生成谷胱氨酸多巴，进而被氧化成半胱苯肼噻嗪(hbta)，生成褐色素。黑色素生成以后通过黑色素细胞枝状突起向角朊细胞转移，转移至角朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，从而影响皮肤的颜色或形成色斑。
4.目前，人们为了保持皮肤洁白，防止皮肤变黑和形成色斑，已经开发出了多种保持皮肤美白的方法。例如磨砂膏、果酸、过氧化氢、氯化氨基汞或各种酚类衍生物等通过物理或化学刺激，促使皮肤表皮角质细胞快速脱落或黑色素组织迅速瓦解，从而达到美白换肤效果；熊果苷、曲酸、l-抗坏血酸、鞣花酸或氨甲环酸等可以抑制酪氨酸酶的活性，特异性地阻断黑色素生成，从而防止色斑形成或淡化斑块；烟酰胺、绿茶提取物或抑糖蛋白等能有效抑制黑素颗粒从黑色素细胞向角质细胞转运，从而达到美白亮肤效果。但是这些产品通常具有较大的细胞毒性、皮肤刺激性、不稳定性等，或单一治疗效果不佳。因此，针对黑色素生成的机理，开发一种绿色安全、高效稳定的新型美白类活性原料显得尤为必要。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种能够稳定高效地抑制黑色素
生成的九肽。这些肽、含有这些肽的美容组合物或药用组合物，可用于增亮皮肤颜色、褪除色斑或消除肤色不均匀，亦可用于制备遮光剂。
6.鉴于此，本发明提供一种式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，
[0007][0008]
式(i)中，
[0009]
r1选自：r
12-co-，其中r
12
选自：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
[0010]
r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
彼此独立地选自：h、氘或氚；
[0011]r11
选自：-nr
13r14
或-or
13
，其中各个r
13
和r
14
彼此独立地选自：h、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
[0012]
所述烷基是指具有1-24个碳原子(可选具有1-16个碳原子；可选具有1-14个碳原子；可选具有1-12个碳原子；可选具有1、2、3、4、5、或6个的碳原子)的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选选自：甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、2-乙基己基、2-甲基丁基、或5-甲基己基；
[0013]
所述烯基是指具有2-24个碳原子(可选具有2-16个碳原子；可选具有2-14个碳原子；可选具有2-12个碳原子；可选具有2、3、4、5、或6个碳原子)的直链或支链烯基；所述烯基具有一个或多个碳-碳双键，可选具有1、2或3个共轭或非共轭的碳-碳双键；所述烯基是通过一个单键而结合至分子的其余部分；可选选自：乙烯基、油烯基、或亚油烯基；
[0014]
可选地，所述“取代的烷基”、“取代的烯基”中的取代基选自c
1-c4烷基；羟基；c
1-c4烷氧基；氨基；c
1-c4氨基烷基；c
1-c4羰氧基；c
1-c4氧基羰基；卤素(如氟、氯、溴、以及碘)；氰基；硝基；叠氮化物；c
1-c4烷基磺酰基；硫醇；c
1-c4烷硫基；c
6-c
30
芳氧基如苯氧基；-nrb(c＝nrb)nrbrc，其中rb和rc是独立地选自：h、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
3-c
10
环烷基、c
6-c
18
芳基、c
7-c
17
芳烷基、具有三至十元的杂环基、或氨基的保护基。
[0015]
可选地，r1选自：h、乙酰基、叔-丁酰基、己酰基、2-甲基己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基或亚油酰基；
[0016]
可选地，r1选自h、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基；
[0017]
可选地，r1是h、乙酰基或棕榈酰基。
[0018]
可选地，r
13
、r
14
彼此独立地选自：h、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
[0019]
可选地，r
13
是h并且r
14
选自：h、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
[0020]
可选地，r
11
是-oh或-nh2。
[0021]
式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，选自下列肽(1)-(12)：
[0022]
(1)h-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-oh；
[0023]
(2)h-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-nh2；
[0024]
(3)h-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-oh；
[0025]
(4)h-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2；
[0026]
(5)ac-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-oh；
[0027]
(6)ac-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-nh2；
[0028]
(7)ac-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-oh；
[0029]
(8)ac-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2；
[0030]
(9)palm-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-oh；
[0031]
(10)palm-l-arg-l-lys-l-met-l-phe-l-phe-l-pro-l-pro-l-trp-l-val-nh2；
[0032]
(11)palm-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-oh；
[0033]
(12)palm-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2。
[0034]
本发明的式(i)所示的肽可以作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，其所包含的这些氨基酸可以具有l-、d-的构型、或彼此独立地是外消旋的。因此，有可能获得同分异构混合物以及外消旋混合物或非对映混合物、或纯的非对映异构体或对映异构体，这取决于不对称碳的数量和存在什么同分异构体或同分异构混合物。本发明的式(i)所示的肽的优选的结构是纯的同分异构体，即，对映异构体或非对映异构体。
[0035]
例如，当本发明所述-phe-时，应理解-phe-选自-l-phe-、-d-phe-、或两者的混合物，是外消旋的或非外消旋的。在本文件中描述的制备方法使本领域的普通技术人员能够通过选择具有正确构型的氨基酸来获得本发明的肽的每种立体异构体。
[0036]
本发明的这些肽可以是其中至少一个氢原子被氘或氚代替的化合物。
[0037]
术语“美容上可接受的盐或药学上可接受的盐”指被认可的在动物，并且更确切地说在人类中使用的一种盐，包括式(i)所示的肽的金属盐，所述金属包括，但不局限于：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等；包括式(i)所示的肽与有机碱形成的盐，所述有机碱包括，但不局限于：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪等；包括式(i)所示的肽与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括，但不局限于：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸(pamoate)或葡萄糖酸等；所述无机酸包括，但不局限于：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
[0038]
本发明式(i)所示的肽、或其立体异构体或其美容上可接受的盐、或其药学上可接
受的盐的合成可以根据现有技术中已知的常规方法来进行，例如固相合成法、液相合成法或固相与液相结合的方法，还可以通过以产生所希望的序列为目标的生物技术方法、或通过具有动物、真菌、或植物来源的蛋白质的控制水解来制备。
[0039]
例如，一种获得式(i)所示的肽的方法包括以下步骤：
[0040]-将具有受保护的n-末端和自由的c-末端的氨基酸与具有自由的n-末端和受保护的或与固体载体结合的c-末端的氨基酸偶联；
[0041]-消除保护n-末端的基团；
[0042]-重复该偶联顺序和消除保护n-末端的基团，直到获得所希望的肽序列；
[0043]-消除保护c-末端的基团或从该固体载体裂解。
[0044]
优选地，c-末端与一种固体载体结合并且该方法是在固相上进行，包括将具有受保护的n-末端和自由的c-末端的氨基酸与具有自由的n-末端和与一种聚合物载体结合的c-末端的氨基酸偶联；消除保护n-末端的基团；并且重复此顺序所需要的次数以便因此获得具有所希望的长度的肽，接着从最初的聚合物载体裂解所合成的肽。
[0045]
在整个合成中这些氨基酸的侧链的官能团用临时或永久的保护基团保持充分地保护，并且可以与从该聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。
[0046]
可选地，固相合成可以通过将二肽或三肽偶联到聚合物支持体上或偶联到先前与聚合物支持体结合的二肽或氨基酸上的汇集策略(convergent strategy)来进行。
[0047]
使用本领域已知的标准条件和方法对n-末端和c-末端脱保护和/或以非确定的次序从聚合物支持体裂解肽，随后可以修饰所述末端的官能团。可以对与聚合物支持体结合的式(i)的肽进行n-末端和c-末端的任选的修饰，或在肽已从聚合物支持体裂解后进行n-末端和c-末端的任选的修饰。
[0048]
本发明的另一方面，提供一种美容或药用组合物，包括有效量的上述的式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，以及至少一种赋形剂和任选的美容上或药学上可接受的佐剂。
[0049]
可选地，所述佐剂选自：胶原合成刺激剂、调节pgc-1α合成的剂、调节pparγ的活性的剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三酸酯含量的剂、刺激或延迟脂肪细胞分化的剂、脂解剂或刺激脂肪分解的剂、溶脂剂、生脂剂、乙酰胆碱受体聚集的抑制剂、抑制肌肉收缩的剂、抗胆碱能试剂、弹性蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、黑色素合成刺激或抑制剂、增白剂或脱色剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、抗老化剂、no-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰羟化酶和/或脯氨酰羟化酶的抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的剂、活性羰基类物质清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保湿剂、保留水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、增湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素或着色剂、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、抗皱剂、能够减少或治疗下眼袋的剂、去角质剂、角质剥离剂、角质层分离剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、灭菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子的合成和/或能够抑制或预防它们的降解的剂、刺激弹性蛋白合成的剂、刺激核心蛋白聚糖合成的剂、刺激层粘连蛋白合成的剂、刺激防御素合成的剂、刺激伴侣蛋白合成的剂、刺激camp合成的剂、热休克蛋白、刺激hsp70合成的剂、刺激热休克蛋白合成的剂、刺激透明质酸合成的剂、刺激纤连蛋白合成的剂、刺激去乙酰化酶合成的剂、刺激脂质和角质层组分
的合成的剂、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原降解的剂、抑制弹性蛋白降解的剂、抑制丝氨酸蛋白酶的剂、刺激成纤维细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞增殖的剂、刺激脂肪细胞增殖的剂、刺激黑色素细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞分化的剂、抑制乙酰胆碱酯酶的剂、皮肤松弛剂、刺激糖胺聚糖合成的剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病剂、抗皮炎剂、抗湿疹剂、dna修复剂、dna防护剂、稳定剂、止痒剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的剂、固化剂、紧致剂、重构剂、抗拉伸纹剂、粘合剂、调节皮脂产生的剂、止汗剂、刺激愈合的剂、协助愈合的剂、刺激再上皮化的剂、协助再上皮化的剂、细胞因子生长因子、镇静剂、抗炎剂、麻醉剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的剂、刺激血管生成的剂、抑制血管渗透性的剂、静脉紧张剂、作用于细胞代谢的剂、用于改善真皮-表皮接合的剂、诱导毛发生长的剂、毛发生长抑制或延缓剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、得自生物发酵过程的剂、无机盐、细胞提取物、防晒剂、以及有效抗a和/或b紫外线的有机或无机光防护剂或其混合物。
[0050]
可选地，所述美容或药用组合物的制剂选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶；
[0051]
可选地，所述胶囊剂包括：软胶囊剂、硬胶囊剂，可选为明胶胶囊剂；
[0052]
可选地，所述片剂包括：糖衣片剂。
[0053]
本发明的肽根据它们的序列的性质或n-末端和/或c-末端中的任何可能的修饰，在水中具有可变的溶解度。因此本发明的肽可以通过水溶液掺入组合物中，且不溶于水的那些可溶解于美容上或药学上可接受的常规溶剂中，所述溶剂例如并且不限于乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、丁二醇或聚乙二醇或其任何组合。
[0054]
待施用的美容上或药学上有效量的本发明的肽以及它们的剂量将依赖于许多因素，包括年龄、患者的状态、病症或疾病的严重性、施用的途径和频率以及待使用的肽的具体性质。
[0055]“美容上或药学上有效量”意指无毒性的但足以提供希望的效果的本发明的一种或多种肽的量。在本发明的美容组合物或药用组合物中以获得希望的效果的美容上或药学上有效的浓度使用本发明的肽；在一个优选形式中，相对于组合物的总重量，在0.00000001％(按重量计)和20％(按重量计)之间，优选在0.000001％(按重量计)和15％(按重量计)之间、更优选在0.0001％(按重量计)和10％(按重量计)之间，并且甚至更优选在0.0001％(按重量计)和5％(按重量计)之间。
[0056]
本发明的另一方面，提供一种美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统，以便实现有效成分的更好渗透和/或改进它的药物代谢动力学和药效动力学特性，其包含有效量的上述式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述的美容或药用组合物。
[0057]
术语“递送系统”是指与本发明的肽一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，它们选自：水、油或表面活性剂、包括石油来源、动物来源、植物来源、或合成来源的那些，例如并且不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、醚硫酸酯、硫酸酯、甜菜碱、葡萄糖苷、麦芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油、毛地黄皂苷和类似物。本领域的普通技术人员已知在可以给予本发明的
肽的不同递送系统中可以使用的稀释剂。
[0058]
术语“缓释”以常规含义使用，指提供化合物在一段时间内逐渐释放的化合物的递送系统，且优选地但不是必须地，在整个时间段内具有相对恒定的化合物释放水平。
[0059]
递送系统或缓释系统的实例是脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。优选的递送系统或缓释系统是脂质体和微米乳液，更优选具有反胶束的内部结构的油包水型微米乳液。
[0060]
缓释系统可以通过现有技术中已知的方法来制备，并且可以例如通过以下方式来给予：通过局部或经皮给药，包括粘附贴剂、非粘附贴剂、封闭贴剂、以及微电子贴剂；或通过全身给药例如并且不局限于，口服或胃肠外途径，包括鼻、直肠、皮下植入或注射、或直接植入或注射至特定身体部位中，并且优选地应该释放相对恒定量的本发明的这些肽。在该缓释系统中包含的肽的量将取决于例如该组合物将被给予的部位、本发明的肽的释放动力学和持续时间、以及有待治疗和/或护理的病状、病症和/或疾病的性质。
[0061]
本发明的另一方面，提供一种上述式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述美容或药用组合物，或上述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备用于抑制黑色素生成、增亮皮肤颜色、褪除色斑或消除肤色不均匀的美容组合物或药物组合物中的用途。
[0062]
本发明的另一方面，提供一种上述式(i)所示的肽，或其立体异构体、或立体异构体的混合物、或其美容上可接受的盐、或其药学上可接受的盐，或上述美容或药用组合物，或上述的美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统在制备遮光剂中的用途。
[0063]
为了便于理解本发明，对在本发明所使用的一些术语和表述的含义说明如下：
[0064]
在本发明中，术语“皮肤”应理解为是构成它的多个层，从最上层或角质层至最下层或皮下组织，两个端点都包括在内。这些层由不同类型的细胞组成，如角质形成细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、和/或脂肪细胞等。
[0065]
在本说明书中，用于氨基酸的缩写遵循iupac-iub生化命名委员会(iupac-iubcommission of biochemical nomenclature)在欧洲生物化学杂志(eur.j.biochem.1984,138:9-37)中所指定的规则。
[0066]
因此，例如，val表示nh
2-ch(ch(ch3)2)-cooh，val-表示nh
2-ch(ch(ch3)2)-co-，-val表示-nh-ch(ch(ch3)2)-cooh，并且-val-表示-nh-ch(ch(ch3)2)-co-。因此，表示肽键的连字符消除了当位于该符号的右侧时的氨基酸(在此用常规非离子化形式来表示)1-羧基中的oh，并且消除了当位于该符号的左侧时的氨基酸2-氨基中的h；两种修饰可以应用于同一个符号(见表1)。
[0067]
表1 氨基酸残基的结构以及它们的单字母和三字母缩写符号
[0068][0069]
缩写“ac
‑”
在本发明中用来表示乙酰基(ch
3-co-)，并且缩写“palm
‑”
用来表示棕榈酰基(ch
3-(ch2)
14-co-)。
[0070]
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
[0071]
本发明所述的肽通过人工设计得到，合成方便，且对人体安全无刺激，能够抑制黑色素生成，用于增亮皮肤颜色、褪除色斑或消除肤色不均匀，亦可用于制备遮光剂。
附图说明
[0072]
图1是肽(4)h-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2(分子式c
61h87n15
o9s)质谱图，[m+h]
+
m/z 1206.6453为化合物分子离子峰。
[0073]
图2是测试样品对b16f10细胞黑色素生成的抑制作用结果图。###表示α-msh组与pbs组相比，差异极为显著，p《0.001(n＝3)。*表示给药组与α-msh组相比具有统计学差异，p《0.05(n＝3)。
[0074]
图3是测试样品对酪氨酸酶活性的抑制作用结果图。###表示α-msh组与pbs组相比，差异极为显著，p《0.001(n＝3)。*表示给药组与α-msh组相比具有统计学差异，p《0.05(n
＝3)。
具体实施方式
[0075]
为了更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例及附图仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
[0076]
缩写
[0077]
用于氨基酸的缩写遵循iupac-iub的生物化学命名委员会在eur j.biochem.(1984)138：9-37和j.chem(1989)264：633-673中指定的规则。
[0078]
amide resin：一种多肽合成用的起始树脂(交联度1％，替代度1.72mmol/g)；fmoc-linker：4-[(2,4-二甲氧基苯基)(fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸；ac2o：醋酸酐；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；dipea：二异丙基乙胺；dic：二异丙基碳二亚胺；piperidine：哌啶；hobt：1-羟基苯并三氮唑；tfa：三氟乙酸；tis：三异丙基硅烷；edt：1,2-乙二硫醇；val：缬氨酸；trp：色氨酸；pro：脯氨酸；phe：苯丙氨酸；met：甲硫氨酸；lys：赖氨酸；arg：精氨酸；fmoc：9-芴基甲氧羰基；boc：叔丁氧基羰基；pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
[0079]
实施例1 fmoc-l-arg(pbf)-l-lys(boc)-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp(boc)-l-val-linker-amide resin的制备
[0080]
1.1 fmoc-linker-amide resin的制备
[0081]
称取amide resin树脂5g于固相合成反应柱中，用dmf溶胀，洗涤树脂，抽走溶剂。
[0082]
称取7.0g的fmoc-linker、2.10g的hobt于干燥三角瓶中，用40ml的dmf溶解后置于冰水浴中冷却10min，加dic活化10min，避免水汽。
[0083]
将活化后的fmoc-linker加入溶胀后的树脂中反应2.5h，抽走反应液，洗涤树脂，用ac2o、dipea处理1.5h，封闭余留的氨基基团。洗涤树脂，抽走溶剂。
[0084]
1.2脱fmoc
[0085]
fmoc-linker-amide resin用20％piperidine/dmf脱fmoc二次，每次10min，取样k检，显色深蓝。用dmf重复洗涤树脂7～8次，抽走溶剂。
[0086]
1.3投料反应
[0087]
称取3.7g的fmoc-l-val-oh，1.8g的hobt加入干燥三角瓶中。加入dmf使其溶解，密封置于-18℃冰箱30min。加2.5ml dic活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱保护后树脂中反应2h，抽走反应液。k检树脂无色透明说明反应完全。
[0088]
对n-末端fmoc基团进行脱保护，并且在存在1.8g hobt和2.5mldic的情况下，使用dmf作为溶剂，将活化后的5.8g fmoc-d-trp(boc)-oh偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在每次偶联中，在存在1.8g hobt和2.5mldic的情况下，使用dmf作为溶剂，顺序地偶联3.7g的fmoc-l-pro-oh；3.7g的fmoc-l-pro-oh。
[0089]
在存在2.5g hobt和3.6mldic的情况下，使用dmf作为溶剂，顺序地偶联6.1g的fmoc-l-phe-oh；6.1g的fmoc-d-phe-oh；5.8g的fmoc-l-met-oh；7.3g的fmoc-l-lys(boc)-oh。随后在存在3.2g hobt和4.6mldic的情况下，使用dmf作为溶剂，偶联13.0g的fmoc-l-arg(pbf)-oh。反应完全之后，洗涤树脂，抽走溶剂。
[0090]
实施例2去除n-末端fmoc保护基团
[0091]
将在实施例1中所获得的这些肽基树脂的n-末端fmoc基团脱保护。
[0092]
加入500ml 20％piperidine/dmf，通入氮气鼓泡10min，抽干3min。再加入500ml 20％piperidine/dmf，通入氮气鼓泡10min，抽干3min。接着加入500ml dmf，通入氮气鼓泡1～2min，抽干3min，重复洗涤树脂7～8次，抽走溶剂。
[0093]
实施例3将r1乙酰基基团引入至实施例2中所获得的肽基树脂上
[0094]
在存在25当量dipea的情况下、使用5ml的dmf作为溶剂，用25当量的ac2o处理1mmol的实施例2中所获得的肽基树脂。允许它们反应30min，在此之后用600ml dmf洗涤树脂7～8次，每次2min，抽走溶剂。
[0095]
实施例4将r1棕榈酰基基团引入至实施例2中所获得的肽基树脂上
[0096]
在存在1.53g的hobt(10mmol；10当量)和1.54ml的dic(10mmol；10当量)的情况下，将预先溶解于1mldmf中的2.56g的棕榈酸(10mmol；10当量)添加至1mmol的实施例2中所获得的肽基树脂上。允许它们反应15h，在此之后用600ml dmf洗涤树脂7～8次，每次2min，抽走溶剂。
[0097]
实施例5将实施例2、3以及4中所获得的肽基树脂从聚合物支撑体上裂解
[0098]
用甲醇500ml，300ml，200ml收缩实施例2、3以及4中所获得的肽基树脂三次。真空抽干。
[0099]
分别称取1g所获得的干燥的实施例2、3以及4的肽基树脂，用7ml的裂解液(tfa：tis：edt：h2o＝113.5：3.2：3.2：3.2)处理，搅拌反应2h。用沙芯漏斗抽滤，将滤液缓慢滴加到冰的异丙醚中，析出沉淀，离心处理，用异丙醚洗6次。在真空下干燥最终的沉淀物，分别得到以下粗肽：
[0100]
1、h-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2，即肽(4)；
[0101]
2、ac-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2，即肽(8)；
[0102]
3、palm-l-arg-l-lys-l-met-d-phe-l-phe-l-pro-l-pro-d-trp-l-val-nh2，即肽(12)。
[0103]
实施例6采用高效液相色谱仪对粗肽进行纯化
[0104]
将实施例5中获得的肽(4)溶于甲醇水溶液(甲醇：纯水＝1：7，体积比)，经0.22μm微孔滤膜过滤得到澄清透明溶液，通过反相hplc纯化处理，纯化梯度如下：
[0105]
时间(min)流速(ml/min)a％(乙腈)b％(0.1％醋酸水溶液)04010905402575454035656540406075406040
[0106]
将过滤后的样品进样纯化，收集馏分，浓缩冻干，得到纯度98％的肽(4)。通过esi-ms测定其分子量，质谱结果见图1，测得肽(4)的分子量为1205.6453。
[0107]
本发明式(i)中的其他化合物可以通过上述类似的方法制备。
[0108]
实施例7对小鼠黑色素瘤细胞b16f10黑色素生成的影响
[0109]
7.1试剂与材料
[0110]
dmem培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、α-msh、naoh、dmso。
[0111]
7.2仪器
[0112]
酶标仪(美国md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
[0113]
7.3细胞株
[0114]
小鼠b16f10黑色素瘤细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。
[0115]
7.4待测样品
[0116]
给药组：肽(4)，测试浓度为100ppm；α-熊果苷，测试浓度为100ppm。
[0117]
对照组：pbs空白对照。
[0118]
7.5实验方法
[0119]
参照标准：t/shrh 027-2019体外测试b16细胞黑素合成抑制实验。
[0120]
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，计数1～4
×
105个/ml，制成细胞悬液。
[0121]
将孔内的培养基完全吸出，加入1ml pbs溶液饥饿处理3-6h。
[0122]
加入待测样品，除pbs对照组外，其余孔内均应加入1μg/ml的α-msh。
[0123]
每24-48h更换一次培养基，培养72h后，收集细胞，调整细胞密度至5
×
105个/ml，离心(4000r/min，5min)后弃去上清液。加入450μl质量分数为10％的dmso、1m naoh溶液，置于80℃水浴30min，使细胞团块完全溶解。在490nm波长下，用酶标仪测定每孔的od值。
[0124]
黑色素含量(％)＝处理组od
490
/空白对照组od
490
×
100％
[0125]
7.6结果
[0126]
为探究本发明的肽对黑色素生成的影响，通过α-msh刺激b16f10黑色素瘤细胞来建立α-msh刺激黑色素模型，进而评价测试样品对b16f10细胞黑色素生成的抑制作用，结果见图2。
[0127]
结果显示，经α-msh刺激后，黑色素瘤细胞的黑色素含量明显增加。经给药组处理后，100ppm的肽(4)能够明显降低黑色素含量，使得小鼠b16f10黑色素瘤细胞内黑色素含量回归到与pbs空白对照组接近的水平，且肽(4)对黑色素生成的抑制作用与同浓度下的α-熊果苷效果相当。
[0128]
熊果苷是目前常用的美白成分，能够抑制酪氨酸酶活性，从而阻断黑色素形成，其中α-熊果苷美白效果更好。然而，熊果苷对皮肤的刺激性也比较大，不能长期使用，部分患者使用后易出现局部皮肤发红、瘙痒、面部刺痛等副作用。此外，熊果苷对使用浓度有相当严格的要求，在高浓度下使用会导致皮肤产生白斑。相比之下，小分子活性多肽的安全性更高，对皮肤温和无刺激，本发明的肽在满足高安全性的情况下，可以发挥与α-熊果苷相当的美白效果。
[0129]
实施例8对b16f10细胞酪氨酸酶活性的影响
[0130]
8.1试剂与材料
[0131]
dmem培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、α-msh、脱氧胆酸钠、l-dopa。
[0132]
8.2仪器
[0133]
酶标仪(美国md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
[0134]
8.3细胞株
[0135]
小鼠b16f10黑色素瘤细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。
[0136]
8.4待测样品
[0137]
给药组：肽(4)，测试浓度为100ppm；α-熊果苷，测试浓度为100ppm。
[0138]
对照组：pbs空白对照。
[0139]
8.5实验方法
[0140]
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，计数1～4
×
105个/ml，制成细胞悬液。
[0141]
将孔内的培养基完全吸出，加入1ml pbs溶液饥饿处理3-6h。
[0142]
加入待测样品，除pbs对照组外，其余孔内均应加入1μg/ml的α-msh。
[0143]
每24-48h更换一次培养基，培养72h后，收集细胞，通过pbs缓冲液，调整细胞密度至5
×
105个/ml。各吸取1ml细胞悬液分别置于3个平行管中，离心后弃去上清液。加入1ml0.5％脱氧胆酸钠溶液，并充分振摇使细胞溶解，制备含有活性酪氨酸酶的细胞裂解物。
[0144]
将试管置于0℃15min，再置于37℃水浴10min。加入0.1％l-dopa溶液，振摇后分别于0min和10min时，通过酶标仪在490nm波长下读取od值，计算两个时点od值的差值。
[0145]
酪氨酸酶活性(％)＝处理组od
490
/空白对照组od
490
×
100％
[0146]
8.6结果
[0147]
为进一步探究本发明的肽对下游酪氨酸酶通路的作用，在上述α-msh刺激黑色素模型的基础上，评价测试样品对酪氨酸酶活性的影响，结果见图3。
[0148]
结果显示，经α-msh刺激后，酪氨酸酶活性大幅提高。使用100ppm的肽(4)与α-熊果苷处理，酪氨酸酶活性出现明显降低，肽(4)与α-熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制作用相当，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑色素的生成。
[0149]
综上所述，本发明的肽能够抑制黑色素生成，用于增亮皮肤颜色、褪除色斑或消除肤色不均匀，亦可用于制备遮光剂。
[0150]
实施例9含肽(4)的精华液的制备
[0151][0152]
纯化水搅拌加热至85℃，保温30min；将透明质酸钠、黄原胶预溶于丁二醇，加入水
中，搅拌溶解完全；搅拌降温至35℃，加入剩余成分，搅拌均匀即得。
[0153]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。