一种检测玉米品种纯度的SNP位点及其应用的制作方法

一种检测玉米品种纯度的snp位点及其应用
技术领域
1.本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种检测玉米品种纯度的snp位点及其应用。


背景技术：

2.玉米是主要的粮食作物；玉米主要的生产来源于杂交种。随着玉米育种技术的不断发展和杂交品种大面积的推广应用，制种的亲本品种和遗传材料纯度检测成为玉米育种研发、种子生产以及种子交易必不可少的质量保证。
3.现在玉米品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法(grow-out test)。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区，通过观察植株不同生长时期(苗期、生长、花期、成熟期以及种子)的植物学形态特征(如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等)和生物学特性(如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等)的不同来鉴定该玉米品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。
4.ssr目前已经成为纯度和品种真实性检测的主要方法之一，在多种作物如水稻，玉米、小麦、大豆等都有ssr的国标，目前ssr大面积使用有它的优势，包括具有实验室操作简单，成本低，重复性较好，结果真实可靠等。比较起ssr标记法，snp标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。目前基于snp标记的玉米纯度检测方法鲜见报道。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测玉米纯度的snp位点。
6.本发明还提出用于检测上述snp位点的引物组。
7.本发明还提出一种试剂盒。
8.本发明还提出一种基因芯片。
9.本发明还提出上述snp位点、引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用。
10.本发明还提出上述snp位点的检测方法。
11.根据本发明的第一方面实施方式的snp位点，所述位点选自如下第一snp位点到第四十snp位点中至少一种：
12.第一snp位点，所述第一snp位点位于玉米参考基因组第1染色体第82587178位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/t；
13.第二snp位点，所述第二snp位点位于玉米参考基因组第1染色体第291348623位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
14.第三snp位点，所述第三snp位点位于玉米参考基因组第1染色体第157283336位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
15.第四snp位点，所述第四snp位点位于玉米参考基因组第1染色体第213137297位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a/g；
16.第五snp位点，所述第五snp位点位于玉米参考基因组第2染色体第141204710位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
17.第六snp位点，所述第六snp位点位于玉米参考基因组第2染色体第28211592位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/g；
18.第七snp位点，所述第七snp位点位于玉米参考基因组第2染色体第207814666位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
19.第八snp位点，所述第八snp位点位于玉米参考基因组第2染色体第237488672位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/g；
20.第九snp位点，所述第九snp位点位于玉米参考基因组第3染色体第129484896位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
21.第十snp位点，所述第十snp位点位于玉米参考基因组第3染色体第225786467位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a/c；
22.第十一snp位点，所述第十一snp位点位于玉米参考基因组第3染色体第184720677位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
23.第十二snp位点，所述第十二snp位点位于玉米参考基因组第3染色体第22035145位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a/c；
24.第十三snp位点，所述第十三snp位点位于玉米参考基因组第4染色体第157469658位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/c；
25.第十四snp位点，所述第十四snp位点位于玉米参考基因组第4染色体第84668766位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/g；
26.第十五snp位点，所述第十五snp位点位于玉米参考基因组第4染色体第243991142位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
27.第十六snp位点，所述第十六snp位点位于玉米参考基因组第4染色体第236715436位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
28.第十七snp位点，所述第十七snp位点位于玉米参考基因组第5染色体第7486959位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/c；
29.第十八snp位点，所述第十八snp位点位于玉米参考基因组第5染色体第135108514位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
30.第十九snp位点，所述第十九snp位点位于玉米参考基因组第5染色体第199452705位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/t；
31.第二十snp位点，所述第二十snp位点位于玉米参考基因组第5染色体第215650073位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
32.第二十一snp位点，所述第二十一snp位点位于玉米参考基因组第6染色体第13727981位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/a；
33.第二十二snp位点，所述第二十二snp位点位于玉米参考基因组第6染色体第132514637位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
34.第二十三snp位点，所述第二十三snp位点位于玉米参考基因组第6染色体第95771968位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a/g；
35.第二十四snp位点，所述第二十四snp位点位于玉米参考基因组第6染色体第160230101位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
36.第二十五snp位点，所述第二十五snp位点位于玉米参考基因组第7染色体第8195312位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
37.第二十六snp位点，所述第二十六snp位点位于玉米参考基因组第7染色体第74052945位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
38.第二十七snp位点，所述第二十七snp位点位于玉米参考基因组第7染色体第169955912位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a/c；
39.第二十八snp位点，所述第二十八snp位点位于玉米参考基因组第7染色体第136144222位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
40.第二十九snp位点，所述第二十九snp位点位于玉米参考基因组第8染色体第4978106位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/g；
41.第三十snp位点，所述第三十snp位点位于玉米参考基因组第8染色体第126914854位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/c；
42.第三十一snp位点，所述第三十一snp位点位于玉米参考基因组第8染色体第173505727位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
43.第三十二snp位点，所述第三十二snp位点位于玉米参考基因组第8染色体第75160235位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t/c；
44.第三十三snp位点，所述第三十三snp位点位于玉米参考基因组第9染色体第11442148位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
45.第三十四snp位点，所述第三十四snp位点位于玉米参考基因组第9染色体第150460620位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
46.第三十五snp位点，所述第三十五snp位点位于玉米参考基因组第9染色体第89076495位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
47.第三十六snp位点，所述第三十六snp位点位于玉米参考基因组第9染色体第121462317位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/a；
48.第三十七snp位点，所述第三十七snp位点位于玉米参考基因组第10染色体第15090132位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
49.第三十八snp位点，所述第三十八snp位点位于玉米参考基因组第10染色体第41610224位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/a；
50.第三十九snp位点，所述第三十九snp位点位于玉米参考基因组第10染色体第113193861位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g/c；
51.第四十snp位点，所述第四十snp位点位于玉米参考基因组第10染色体第119856037位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c/t；
52.其中，所述玉米参考基因组为玉米b73 v3版本参考基因组。
53.根据本发明第二方面实施方式的用于扩增上述snp位点的引物组。
54.在本发明的一些实施方式中，所述引物组均独立地包括两条特异性引物和1条通用引物。
55.在本发明的一些实施方式中，所述引物组包括：
56.第一snp引物组，用于扩增所述第一snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.3所示的通用引物；
57.第二snp引物组，用于扩增所述第二snp位点，包括如seq id no.4、seq id no.5所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.6所示的通用引物核苷酸序列；
58.第三snp引物组，用于扩增所述第三snp位点，包括如seq id no.7、seq id no.8所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.9所示的通用引物核苷酸序列；
59.第四snp引物组，用于扩增所述第四snp位点，包括如seq id no.10、seq id no.11所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.12所示的通用引物核苷酸序列；
60.第五snp引物组，用于扩增所述第五snp位点，包括如seq id no.13、seq id no.14所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.15所示的通用引物核苷酸序列；
61.第六snp引物组，用于扩增所述第六snp位点，包括如seq id no.16、seq id no.17所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.18所示的通用引物核苷酸序列；
62.第七snp引物组，用于扩增所述第七snp位点，包括如seq id no.19、seq id no.20所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.21所示的通用引物核苷酸序列；
63.第八snp引物组，用于扩增所述第八snp位点，包括如seq id no.22、seq id no.23所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.24所示的通用引物核苷酸序列；
64.第九snp引物组，用于扩增所述第九snp位点，包括如seq id no.25、seq id no.26所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.27所示的通用引物核苷酸序列；
65.第十snp引物组，用于扩增所述第十snp位点，包括如seq id no.28、seq id no.29
所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.30所示的通用引物核苷酸序列；
66.第十一snp引物组，用于扩增所述第十一snp位点，包括如seq id no.31、seq id no.32所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.33所示的通用引物核苷酸序列；
67.第十二snp引物组，用于扩增所述第十二snp位点，包括如seq id no.34、seq id no.35所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.36所示的通用引物核苷酸序列；
68.第十三snp引物组，用于扩增所述第十三snp位点，包括如seq id no.37、seq id no.38所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.39所示的通用引物核苷酸序列；
69.第十四snp引物组，用于扩增所述第十四snp位点，包括如seq id no.40、seq id no.41所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.42所示的通用引物核苷酸序列；
70.第十五snp引物组，用于扩增所述第十五snp位点，包括如seq id no.43、seq id no.44所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.45所示的通用引物核苷酸序列；
71.第十六snp引物组，用于扩增所述第十六snp位点，包括如seq id no.46、seq id no.47所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.48所示的通用引物核苷酸序列；
72.第十七snp引物组，用于扩增所述第十七snp位点，包括如seq id no.49、seq id no.50所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.51所示的通用引物核苷酸序列；
73.第十八snp引物组，用于扩增所述第十八snp位点，包括如seq id no.52、seq id no.53所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.54所示的通用引物核苷酸序列；
74.第十九snp引物组，用于扩增所述第十九snp位点，包括如seq id no.55、seq id no.56所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.57所示的通用引物核苷酸序列；
75.第二十snp引物组，用于扩增所述第二十snp位点，包括如seq id no.58、seq id no.59所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.60所示的通用引物核苷酸序列；
76.第二十一snp引物组，用于扩增所述第二十一snp位点，包括如seq id no.61、seq id no.62所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如seq id no.63所示的通用引物核苷酸序列。
77.第二十二snp引物组，用于扩增所述第二十二snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.64、seq id no.65所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.66所示的通用引物；
78.第二十三snp引物组，用于扩增所述第二十三snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.67、seq id no.68所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.69所示的通用引物；
79.第二十四snp引物组，用于扩增所述第二十四snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.70、seq id no.71所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.72所示的通用引物；
80.第二十五snp引物组，用于扩增所述第二十五snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.73、seq id no.74所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.75所示的通用引物；
81.第二十六snp引物组，用于扩增所述第二十六snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.76、seq id no.77所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.78所示的通用引物；
82.第二十七snp引物组，用于扩增所述第二十七snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.79、seq id no.80所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.81所示的通用引物；
83.第二十八snp引物组，用于扩增所述第二十八snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.82、seq id no.83所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.84所示的通用引物；
84.第二十九snp引物组，用于扩增所述第二十九snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.85、seq id no.86所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.87所示的通用引物；
85.第三十snp引物组，用于扩增所述第三十snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.88、seq id no.89所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.90所示的通用引物；
86.第三十一snp引物组，用于扩增所述第三十一snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.91、seq id no.92所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.93所示的通用引物；
87.第三十二snp引物组，用于扩增所述第三十二snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.94、seq id no.95所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.96所示的通用引物；
88.第三十三snp引物组，用于扩增所述第三十三snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.97、seq id no.98所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.99所示的通用引物；
89.第三十四snp引物组，用于扩增所述第三十四snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.100、seq id no.101所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.102所示的通用引物；
90.第三十五snp引物组，用于扩增所述第三十五snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.103、seq id no.104所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.105所示的通用引物；
91.第三十六snp引物组，用于扩增所述第三十六snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.106、seq id no.107所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.108所示的通用引物；
92.第三十七snp引物组，用于扩增所述第三十七snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.109、seq id no.110所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.111所示的通用引物；
93.第三十八snp引物组，用于扩增所述第三十八snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.112、seq id no.113所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.114所示的通用引物；
94.第三十九snp引物组，用于扩增所述第三十九snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.115、seq id no.116所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.117所示的通用引物；
95.第四十snp引物组，用于扩增所述第四十snp位点，包括核苷酸序列如seq id no.118、seq id no.119所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如seq id no.120所示的通用引物。
96.根据本发明的一些实施方式，所述两条特异性引物连接有不同的荧光基团标签序列，优选地，所述荧光基团标签序列选自fam、hex。
97.根据本发明第三方面实施方式，提出了一种鉴定玉米品种纯度的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
98.根据本发明第四方面实施方式，提出了一种鉴定玉米品种纯度的基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。
99.根据本发明的第五方面实施方式的一种检测玉米品种纯度的方法，所述方法包括如下步骤：
100.s1、从待测玉米样品中提取基因组dna；
101.s2、对步骤s1中提取的基因组dna中的所述snp位点进行多态性检测，得到待测玉米样品对应的snp位点的基因型；
102.s3、统计分析步骤s2获得的待测样品个体的基因型，鉴别杂株，根据杂株个体数目和检测总数计算品种纯度。
103.在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，玉米中提取基因组dna采用简化ctab法(十六烷基三甲基溴化铵法)。
104.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，用kasp(竞争性等位基因特异性pcr)技术对snp位点进行检测。
105.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述待测玉米样品的个数为100个以上，优选为200个。
106.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，若某一待测玉米个体基因型在2个及以上snp位点上不同于其他多数待测个体，则判断定所述待测玉米个体为杂株。
107.在本发明的一些实施方式中，计算品种纯度的方法为：纯合度％＝(检测总数-杂株数)/检测总数
×
100％。
108.根据本发明的第六方面实施方式的上述snp位点、引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用，所述应用为：
109.(1)在鉴定或辅助鉴定玉米品种纯度中的应用；
110.(2)在玉米分子标记辅助育种中的应用；
111.(3)制备玉米育种的产品中的应用。
112.一种玉米育种方法，包括如下步骤：利用上述玉米纯度的检测方法，选择所需要纯度的玉米进行后续育种。
113.根据本发明实施方式的检测玉米snp位点，至少具有如下有益效果：通过筛选出一套(4snp/染色体)共40个高质量和高多态性的snp标记，可用于来源不同的玉米品种(系)纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性；标记为共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本发明利用基于douglas array tape平台的kasp技术对本发明方案所开发的snp标记进行基因
分型，分型准确，技术简单，易于自动化，速度快，自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误；单位数据点检测成本低，检测通量高，加快玉米品种的选育进程。
114.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
115.图1为本发明实施例的位点开发流程图；
116.图2为本发明实施例的snp位点zm_k_10000630的基因型分型示意图。
具体实施方式
117.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
118.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
119.本发明实施例为：用于玉米品种纯度检测的snp位点
120.本发明实施例的位点的设计过程，如图1所示，通过搜集56110个玉米snp位点信息，经过比对和筛选得到用于玉米品种纯度检测的snp位点，提取snp位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行验证和检测，具体如下：
121.1 40个用于玉米品种纯度检测的snp位点的筛选
122.基于156份玉米全基因组检测数据，根据筛选条件：maf》0.1、缺失率《0.02、染色体均匀分布、pca聚类效果好、区分度高且两翼25bp序列保守，选择出来的snp集合对应的数据库样品的基因型至少存在2个位点差异，挑选得到多个高质量的snp位点，最终筛选出本发明方案最少的高质量snp组合为40个snp位点。上述40个snp位点的基本信息详见表1。其中snp位点在染色体上的位置是基于玉米参考基因组b73序列比对确定的。
123.表1.用于玉米品种纯度检测的snp位点的物理位置
specific primer y；primer_y)以及一条通用引物c(common primer；primer_c)。两条等位基因特异性引物分别连接fam和hex(或vic)荧光基团序列标签。如果样品中只检测到fam荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因x(allele_x)；如果只检测到hex荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因y(allele_y)；如果同时检测到fam和hex荧光，则该样品的基因型为杂合(同时带有等位基因x和y)。40个用于玉米品种纯度检测的kasp标记的等位基因型和引物序列见表2。
128.表2.引物序列表
129.130.131.132.133.[0134][0135]
3 kasp检测
[0136]
dna提取：从玉米中提取基因组dna，采用简化ctab法。
[0137]
kasp标记检测流程：kasp标记的验证和检测用douglas scientific的array tape系统进行。array tape基因型分型平台包括用于pcr扩增体系组装的nexar、pcr扩增的soellex、荧光信号扫描的araya以及数据分析的intellics。
[0138]
pcr反应体系：用nexar进行pcr反应体系的自动组装，pcr反应体系如下表3所示。
[0139]
pcr扩增：用soellex进行pcr扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环。
[0140]
信号扫描和基因型分型：pcr反应完成后用araya进行反应体系荧光信号扫描；然
后用intellics进行基因型分型和数据分析。在kasp标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为x簇、y簇以及杂合基因型簇(见图2)。如图2所示，从图中可以看出，图中标为红色，位于图形左上角的为x簇，表示样品在这个kasp标记位点含有纯合x等位基因，图中标为蓝色，位于图形右下角的为y簇，表示样品在这个kasp标记位点含有纯合y等位基因型，图中标为紫色的为杂合基因型簇，表示样品在这个kasp标记位点含有x和y杂合等位基因型。
[0141]
表3.kasp检测的pcr反应体系
[0142][0143]
4 40个用于玉米品种纯度检测的snp位点验证
[0144]
40个用于玉米品种纯度检测的kasp标记的基因型分型质量验证：根据上述检测方法，用376个的玉米多样性材料对40个kasp标记进行验证。经验证，每个kasp标记的二个纯合和杂合簇分型好、紧凑，位点为单拷贝且检出率都高于99.5％，与测序结果一致，结果表明40个kasp标记均可以准确分型，且基因型分型质量完全能满足玉米品种纯度的精准检测。其中，位点zm_k_10000630的kasp标记基因型分型图如图2所示，其他位点的结果同zm_k_10000630一致。
[0145]
5玉米品种纯度的计算
[0146]
玉米品种纯度的计算包括以下步骤：
[0147]
(1)统计分析待测样品184个玉米(玉米b73)40个snp位点的基因型。若某一待测个体中存在2个及以上位点不同于其他多数待测个体，则判定所述待测小麦个体为杂株；待测个体中与对照位点或群体一致位点(基因型频率比例大于50％的基因型为一致位点)差异数小于等于1的单株为纯株；有效单株，若snp纯度检测缺失位点低于总检测位点数的5％，判定为有效单株，纳入纯度判定统计。
[0148]
如表4(表4包括表4-1、4-2、4-3)所示，184个个体在40个snp位点的基因型一致，均为有效单株(有效单株数为检测总数)；其中，编号为6的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225等10个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为14的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225等8个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为15的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225等9个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为27的个体在zm_k_10000225、zm_k_10000154等10个snp位点上不同于其他183个个体，判断判断为杂株；编号为63的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000312等9个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为72的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225、zm_k_10000312等8个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为107的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225、zm_k_10000312等9个snp位点上不同于其他183个个体，判
断为杂株；编号为164的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225、zm_k_10000312等8个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为169的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225等8个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；编号为176的个体在zm_k_10000154、zm_k_10000225、zm_k_10000312等8个snp位点上不同于其他183个个体，判断为杂株。
[0149]
(2)根据步骤(1)中杂株个体数目和检测总数计算品种纯度。
[0150]
纯合度的计算为：纯合度％＝(检测总数-杂株数)/检测总数
×
100％。
[0151]
所述待测玉米品种b73的品种纯度为：(184-174)/184
×
100％＝94.57％。
[0152]
表4-1
[0153]
[0154]
[0155]
[0156][0157]
表4-2
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162][0163]
表4-3
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168][0169]
综上所述，本发明提供一套40个snp位点，可用于来源不同的玉米品种和遗传材料纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性，并且能追溯推测不纯样品的污染来源；具有共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；技术简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。
[0170]
本发明中使用的douglas array tap基因分型平台包括用于pcr扩增体系组装的nexar、pcr扩增的soellex、荧光信号扫描的araya以及数据分析的intellics，与其配套试剂耗材均购于英国lgc公司。
[0171]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。