多特异性抗密蛋白-18.2构建体及其用途的制作方法

多特异性抗密蛋白-18.2构建体及其用途
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技术领域
2.本技术涉及与密蛋白-18同种型2(cldn18.2)结合的多特异性分子(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)、其制造方法和用途，该用途包括治疗疾病或病症。


背景技术：

3.密蛋白是紧密连接膜蛋白家族，其在上皮细胞和内皮细胞中表达并形成决定紧密连接渗透性的细胞旁屏障和孔。密蛋白18同种型2(cldn18.2)，密蛋白18蛋白的剪接变体，是在短寿命的分化胃上皮细胞上表达的胃谱系抗原。通常，cldn18.2的表达在其他健康人组织中未能检测到。然而，cldn18.2在多种人癌症(包括胃食管癌和胰腺癌)中以显著水平异位表达(sahin等人(2008)clin cancer res,14(23):7624-34)。cldn18.2在胃癌转移中也常检测出。
4.本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容通过援引以其全文特此并入本文。


技术实现要素：

5.本技术提供了多特异性构建体，这些多特异性构建体包含a)与密蛋白-18同种型2(“cldn18.2”)特异性结合的第一抗体部分；和b)与pd-l1特异性结合的第二抗体部分。在一些实施例中，第一抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。
6.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，第二抗体部分包含与pd-l1结合的单域抗体。在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的n末端融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的c末端融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体的两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，第二抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，肽接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头是可切割的接头。在一些实施例中，接头是不可切割的接头。在一些实施例中，接头包含源自igg铰链区的经修饰的序列。在一些实施例中，接头是gs接头。在一些实施例中，接头具有选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头具有选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
7.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，cldn18.2是人cldn18.2。在一些实施例中，第一抗体部分包含：a)hc-cdr1、hc-cdr2、和hc-cdr3，其分别包含具有seq id no:7所示的序列的重链可变区(vh)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列；和b)lc-cdr1、lc-cdr2、和lc-cdr3，其分别包含具有seq id no:8所示的序列的轻链可变区(vl)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列。在一些实施例中，第一抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。在一些实施例中，vh包含seq id no:7的氨基酸序列，或与seq id no:7具有至少约80％序列同一性的其变体；和/或vl包含seq id no:8的氨基酸序列，或与seq id no:8具有至少约80％序列同一性的其变体。
8.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，pd-l1是人pd-l1。在一些实施例中，第二抗体部分包含含有sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3的单域抗体(sdab)，该sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3分别包含单个单体可变抗体结构域内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列，该单个单体可变抗体结构域具有seq id no:22-24中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施例中，第二抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15或19的氨基酸序列的sdab-cdr1；b)含有seq id no:16、18或20的氨基酸序列的sdab-cdr2；和c)含有seq id no:17或21的氨基酸序列的sdab-cdr3。在一些实施例中，单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。在一些实施例中，单域抗体包含seq id no:22-24中任一个的氨基酸序列，或与seq id no:22-24中任一个具有至少约80％序列同一性的其变体。
9.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，1)全长抗体包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3；并且2)第二抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3；其中该第二抗体部分与该全长抗体部分任选地经由肽接头融合，该肽接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，1)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序
列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；2)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；3)第二抗体部分包含含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；4)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；5)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；6)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:80的序列；7)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；8)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；9)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:80的序列；10)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；11)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；12)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；13)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；14)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸
序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；15)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；16)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；17)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；18)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:73的序列；19)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:74的序列；20)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:75的序列；21)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:76的序列；或22)第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:77的序列。
10.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，与第二抗体部分融合的全长抗体的两条重链各自包含seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，全长抗体的两条轻链各自包含seq id no:10的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:10的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
11.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，与第二抗体部分融合的全长抗体的两条轻链各自包含seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，全长抗体的两条重链各自包含seq id no:9的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:9的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
12.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，a)与第二抗体部分融合的全长抗体的两条重链各自包含选自seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列，并且两条轻链各自包含seq id no:10的氨基酸序列；或b)与该第二抗体部分融合的该全长抗体的两条轻
链各自包含选自seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列，并且两条重链各自包含seq id no:9的氨基酸序列。
13.在上述多特异性构建体中的任一种的一些实施例中，构建体是双特异性抗体。
14.本技术还提供了药物组合物，所述药物组合物包含多特异性构建体中任一种的构建体以及药学上可接受的载体。
15.本技术还提供了核酸，这些核酸编码上述多特异性构建体中的任一种。
16.本技术还提供了核酸，这些核酸包含选自由seq id no:50-71组成的组的核酸序列。
17.本技术还提供了包含上述任一种核酸的载体。
18.本技术还提供了宿主细胞，这些宿主细胞包含所述核酸中的任一种、或所述载体中的任一种。
19.本技术还提供了产生多特异性构建体中的任一种的方法，这些方法包括：a)在有效表达多特异性构建体的条件下培养上述宿主细胞中的任一种；以及b)从该宿主细胞获得所表达的构建体。
20.本技术提供了治疗个体疾病或病症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的上述多特异性构建体中的任一种、或上述药物组合物中的任一种。在一些实施例中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施例中，所述癌症是胃癌。在一些实施例中，个体具有密蛋白-18(cldn18)畸变。在一些实施例中，该方法进一步包括施用第二药剂。在一些实施例中，所述第二药剂与her-2结合。在一些实施例中，将构建体或药物组合物肠胃外施用至个体内。在一些实施例中，所述个体是人。
21.本技术提供了套件，这些套件用于治疗疾病或病症，包含上述药物组合物、和说明书。
附图说明
22.图1显示了各种双特异性抗体对表达人pd-l1的cho-k1细胞的结合亲和力。
23.图2显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.2的cho-k1细胞的结合亲和力。
24.图3显示了各种双特异性抗体对表达人pd-l1的cho-k1细胞的结合亲和力。
25.图4显示了各种双特异性抗体对表达人pd-l1的cho-k1细胞的结合亲和力。
26.图5显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.2的cho-k1细胞的结合亲和力。
27.图6显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.2的cho-k1细胞的结合亲和力。
28.图7显示了各种双特异性抗体对表达人pd-l1的cho-k1细胞的结合亲和力。
29.图8显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.2的cho-k1细胞的结合亲和力。
30.图9显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.1的cho-k1细胞的结合亲和力。
31.图10显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.1的cho-k1细胞的结合亲和力。
32.图11显示了各种双特异性抗体对表达人cldn18.1的cho-k1细胞的结合亲和力。
33.图12显示如实例2所示的各种双特异性抗体的pd-1/pd-l1阻断测定的结果。
34.图13显示了如实例2所示的各种双特异性抗体诱导的cdc分析的结果。
35.图14显示了如实例2所示的各种双特异性抗体诱导的adcc分析的结果。
36.图15显示了如实例2所示的各种双特异性抗体诱导的adcc分析的结果。
37.图16显示了如实例2所示的各种双特异性抗体诱导的cdc分析的结果。
38.图17显示如实例2所示的各种双特异性抗体的pd-1/pd-l1阻断测定的结果。
39.图18显示了如实例2所示的各种双特异性抗体诱导的adcc分析的结果。
具体实施方式
40.本技术提供了与cldn18.2和pd-l1均结合的多特异性构建体。在一些实施例中，多特异性构建体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的抗cldn18.2抗体部分，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分是全长抗体。在一些实施例中，多特异性构建体包含抗pd-l1抗体部分，该抗pd-l1抗体部分包含与pd-l1特异性结合的单域抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条重链和/或轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条重链和/或轻链的n末端和/或c末端任选地经由接头(如包含72-80的氨基酸序列的接头)融合。
41.本技术提供了与各种参考抗体(例如，抗cldn18.2单克隆抗体imab362)相比，与cldn18.2和pd-l1均结合的多特异性构建体(如实例所示的各种抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)表现出有利的技术效果，如更强的cdc和adcc效果。例如，示例性双特异性抗体，cldn18l-e-pdl1a和pdl1a-e-cldn18l，在抗cldn18.2诱导的cdc分析中表现出的ec
50
远低于参考抗体imab362表现出的ec
50
。
42.还提供了组合物、套件和制品，及其制造方法，这些组合物、套件和制品包含与本文所述的密蛋白-18(如抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)结合的多特异性分子。i.定义
43.术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体和其抗原结合片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
44.全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。可以分别将重链和轻链的可变结构域称为“v
h”和“v
l”。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(cdr)(包括lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3的轻链(lc)cdr，包括hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3的重链(hc)cdr)。可以通过kabat、chothia或al-lazikani的公约来定义或鉴定本文披露的抗体和抗原结合片段的cdr边界(al-lazikani 1997；chothia 1985；chothia 1987；chothia1989；kabat 1987；kabat 1991)。重链或轻链的三个cdr位于称为框架区(fr)的侧翼段之间，该框架区比cdr更高度保守并形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现各种效应子功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型是iga、igd、ige、igg和igm，其特征分别是存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别被分成亚类，如lgg1(γ1重链)、lgg2(γ2重链)、lgg3(γ3重链)、lgg4(γ4重链)、lga1(α1重链)或lga2(α2重链)。
45.如本文所用的，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链fv(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个cdr的抗体的一部分形成的多特异性抗体、单域抗体(例如骆驼化单域抗体)、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scfv)结合的相同抗原结合。在一些实施例中，抗原结合片段可包含来自特定人抗体的一个或多个cdr，所述cdr嫁接到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
[0046]“单链fv”(也缩写为“sfv”或“scfv”)是包含连接到单个多肽链的vh和v
l
抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，scfv多肽进一步包含在vh和v
l
结构域之间的一种多肽接头，该多肽接头使得scfv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scfv的综述，参见pl
ü
ckthun于the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。
[0047]
如本文所用的，术语“cdr”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由以下描述：kabat等人,j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等人,u.s.dept.of health and human services,“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；al-lazikani b.等人,j.mol.biol.,273:927-948(1997)；maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)；abhinandan和martin,mol.immunol.,45:3832-3839(2008)；lefranc m.p.等人,dev.comp.immunol.,27:55-77(2003)；和honegger与pl
ü
ckthun,j.mol.biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括氨基酸残基相互比较时的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的cdr旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。作为比较，下表1中列出了涵盖上述引用的每个参考文献所定义的cdr的氨基酸残基。cdr预测算法和接口是本领域已知的，包括，例如，abhinandan和martin,mol.immunol.,45:3832-3839(2008)；ehrenmann f.等人,nucleic acids res.,38:d301-d307(2010)；和adolf-bryfogle j.等人,nucleic acids res.,43:d432-d438(2015)。此段落中引用的参考文献内容通过引用以其全文并入本文，以用于在本技术中使用并可能包含在本文的一条或多条权利要求中。表1：cdr定义1残基编号遵循kabat等人,同上的命名法2残基编号遵循chothia等人,同上的命名法3残基编号遵循maccallum等人,同上的命名法4残基编号遵循lefranc等人,同上的命名法5残基编号遵循honegger和pl
ü
ckthun,同上的命名法
[0048]
表述“如kabat中的可变域残基编号”或“如kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于上文kabat等人的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的fr或高变区(hvr)的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变域可以包含在h2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据kabat的残基52a)以及在重链fr残基82之后的插入残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的kabat编号。
[0049]
除非本文另有说明，否则免疫球蛋白重链中的残基编号是如上文kabat等人所述的eu索引的编号，但略做修改。简而言之，我们在重链cdr1之前的超可变环中添加了5个以上的残基。“如kabat所述的eu索引”是指人igg1 eu抗体的残基编号。
[0050]“框架”或“fr”残基是除如本文定义的cdr残基之外的那些可变结构域残基。
[0051]
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式为含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者高变区(hvr)的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有所希望的抗体特异性、亲和力和能力的高变区(供体抗体)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未在受者抗体中或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、并且通常两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的fr是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常地是人免疫球蛋白的至少一部分。关于进一步细节，参见jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。
[0052]“人抗体”是这样一种抗体，其具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用如本文披露的任何用于制造人抗体的技术来产生。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在cole等人,monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,第77页(1985)；boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)。另请参见van dijk和van de winkel,curr.opin.pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，已免疫的异种小鼠(xenomice))来制备(参见，例如，有关xenomouse
tm
技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如li等人,proc.natl.acad.sci.usa,103:3557-3562(2006)。
[0053]
将关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在比对序列(将任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与所比
较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，例如blast、blast-2、align、megalign(dnastar)或muscle软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序muscle生成氨基酸序列同一性％值(edgar,r.c.,nucleic acids research 32(5):1792-1797,2004；edgar,r.c.,bmc bioinformatics 5(1):113,2004)。
[0054]“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中两个的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个dna分子中的每一个的一个位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，那么两个序列是60％同源的。举例来说，dna序列attgcc和tatggc具有50％的同源性。通常，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
[0055]
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，该免疫球蛋白分子的一部分相对于免疫球蛋白的另一部分，即可变结构域，具有更保守的氨基酸序列，该氨基酸序列含有抗原结合位点。恒定结构域含有重链的ch1、ch2和ch3结构域(统称为ch)和轻链的chl(或c
l
)结构域。
[0056]
任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可以根据其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同的类型之一，分别称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)。
[0057]“ch1结构域”(也称为“h1”结构域的“c1”)通常从约氨基酸118至约氨基酸215(eu编号系统)。
[0058]“铰链区”通常定义为igg中对应于人igg1的glu216至pro230的区域(burton,molec.immunol.22:161-206(1985))。其他igg同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间s-s键的半胱氨酸残基置于相同位置而与igg1序列比对。
[0059]
人igg fc区(也称为“c2”结构域)的“ch2结构域”通常从约氨基酸231至约氨基酸340。ch2结构域是独特的，因为其不与另一个结构域紧密配对。而是，两个n连接的支链碳水化合物链插入完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定ch2结构域。burton,molec immunol.22:161-206(1985)。
[0060]“ch3结构域”(也称为“c2”结构域)包含fc区中靠ch2结构域c末端的残基区域(即从约氨基酸残基341至抗体序列的c末端(通常地在igg的氨基酸残基446或447处))。
[0061]
本文中的术语“fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区域，包括天然序列fc区和变体fc区。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可以变化，但是通常将人igg重链的fc区定义为从cys226位置处的氨基酸残基或从pro230延伸至其羧基末端。可以例如抗体的生产或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化来去除fc区的c末端赖氨酸(根据eu编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有k447残基的抗体群体，没有去除k447残基的抗体群体以及具有带有和不带有k447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适天然序列fc区包括人igg1、igg2(igg2a、
igg2b)、igg3和igg4。
[0062]“fc受体”或“fcr”描述结合抗体的fc区的受体。优选的fcr是天然序列人fcr。此外，优选的fcr是结合igg抗体(γ受体)并包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体的fcr，包括等位基因变体和可替代地这些受体的剪接形式，fcγrii受体包括fcγriia(“活化受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞内结构域。活化受体fcγriia在其胞内结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。抑制受体fcγriib在其胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。(参见m.annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。fcr综述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-92(1991)；capel等人,immunomethods 4:25-34(1994)；和de haas等人,j.lab.clin.med.126:330-41(1995)。本文的术语“fcr”涵盖其他fcr，包括将来鉴定的fcr。
[0063]
如本文所用的，术语“表位”是指抗体或抗体部分所结合的抗原上的特定原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗体部分对抗原具有竞争性结合，则它们可以结合抗原内的相同表位。
[0064]
如本文所用的，当在等摩尔浓度的第一抗体或其片段存在下，第一抗体或其片段将第二抗体或其片段的靶抗原结合抑制至少约50％(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任何一个)时，该第一抗体或其片段与该第二抗体或其片段“竞争”结合该靶抗原，或者反之亦然。在pct公开号wo 03/48731中描述了基于抗体的交叉竞争将这些抗体“分箱”的高通量方法。
[0065]
如本文所用的，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对
……
有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分是与该靶标结合的抗体或抗体部分，其亲和力、亲合力(avidity)、就绪性和/或持续时间优于与其他靶标的结合。在一些实施例中，抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(ria)测量的抗体与靶标的结合的约10％。在一些实施例中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(kd)≤10-5
m、≤10-6
m、≤10-7
m、≤10-8
m、≤10-9
m、≤10-10
m、≤10-11
m、或≤10-12
m。在一些实施例中，抗体特异性结合对来自不同物种的蛋白来说是保守的蛋白上的表位。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、elisa-、ria-、ecl-、irma-、eia-、biacore
tm-检验和肽扫描。
[0066]“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽不与其产生环境中的所有其他组分缔合。
[0067]
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是与在其生产环境中从通常与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。优选地，分离的核酸不跟与产生环境有关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于天然存在的形式或背景。因此，分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
[0068]
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌性前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的dna可操作地连接至该多肽的dna；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位以有助于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的dna序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读框中。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0069]
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入宿主细胞(载体已引入其中)基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
[0070]
如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是使用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
[0071]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的子代，不考虑传代次数。子代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，并且可能含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变子代包括在本文中。
[0072]
如本文所用的，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理结果(例如像，肿瘤体积)。本技术的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
[0073]
在癌症的语境中，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减轻全面肿瘤负担并改善与疾病相关的一种或多种症状。
[0074]
术语“抑制(“inhibition”或“inhibit”)”是指任何表型特征的减少或停止，或指该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。与参考相比，“降低”或“抑制”是指减少、降低或阻止活性、功能和/或量。在某些实施例中，“降低”或“抑制”是指引起全面减少20％或更大的能力。在另一实施例中，“降低”或“抑制”是指引起全面减少50％或更大的能力。在又一实施例中，“降低”或“抑制”是指引起全面减少75％、85％、90％、95％或更大的能力。
[0075]
如本文所用的，“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准或水平。参考可以从健康和/或未患病的样品中获得。在一些实例中，参考可以从未治疗的样品获得。在一些实例中，参考从个体的未患病或未治疗的样品获得。在一些实例中，参考是从不是该个人或患者的一个或多个健康个体获得的。
[0076]
如本文所用的，“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延迟缓疾病(例如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，足够的或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为该个体没有患上该疾病。例如，可能延迟晚期癌症(例如转移的发展)。
[0077]
如本文所用的，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未被诊断出患有该疾病的个体中该疾病的发生或复发提供预防。
[0078]
如本文所用，“抑制”功能或活性是与除感兴趣的条件或参数以外的其他相同条件相比，或者可替代地与另一条件相比，降低功能或活性。例如，与不存在抗体的情况下的肿瘤生长速度相比，抑制肿瘤生长的抗体降低了肿瘤的生长速度。
[0079]
如本文所用的，“基于”包括评估、确定、或测量如本文所述的个体的特征(并且优选地选择适合接受治疗的个体)。当将密蛋白-18畸变的状态“用作基础”用于选择、评估、测量或确定如本文所述的治疗方法时，临床医生使用在治疗之前和/或期间确定的密蛋白-18畸变，以及获得的状态(包括cldn18.2的存在、不存在、表达水平、活性水平和/或磷酸化水平)来评估以下中的任一项：(a)个体对最初接受一或多种治疗的可能(probable)或大概(likely)适合性；(b)个体对最初接受一或多种治疗的可能或大概不适合性；(c)对治疗的应答性；(d)个体对继续接受一或多种治疗的可能或大概适合性；(e)个体对继续接受一或多种治疗的可能或大概不适合性；(f)调整剂量；或(g)预测临床益处的可能性。
[0080]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类。在一些实施例中，个体是人。
[0081]
药剂的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量。特定的剂量可取决于以下中的一个或多个而变化：选择的特定药剂、要遵循的给药方案、是否与其他化合物组合施用、施用时间、要成像的组织以及携带其的物理递送系统。
[0082]
本技术的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据例如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发希望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。
[0083]
术语“药物配制品”和“药物组合物”是指制剂，该制剂的形式允许一种或多种活性成分的生物活性有效，并且其不包含对将被施用所述配制品的个体具有不可接受的毒性的其他组分。此类配制品可以是无菌的。
[0084]“药学上可接受的载体”是指在本领域中通常用于与治疗剂一起使用且一起构成用于施用给受试者的“药物组合物”的无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制助剂或载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所采用的配制品。
[0085]“无菌”配制品是经消毒的或基本不含活的微生物及其孢子。
[0086]
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并行)的和连续的施用或以任何顺序循序的施用。
[0087]
术语“并行”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用是在时间上重叠的或其中在施用一种治疗剂的短时间段内施用另一种治疗剂。例如，两种或更多种治疗剂以不超过约60分钟(如不超过约30、15、10、5、或1分钟中的任一个)的时间间隔施
l1抗体部分的多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该抗cldn18.2抗体部分包含与cldn18.2特异性结合的全长抗体，该抗pd-l1抗体部分包含与pd-l1结合的单域抗体，其中该单域抗体与该全长抗体的一条或两条轻链的c末端融合。
[0099]
在一些实施例中，提供了包含抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分的多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，其中该抗cldn18.2抗体部分与包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体部分竞争结合cldn18.2，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与单域抗体(sdab)竞争结合pd-l1，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链(例如，该一条或两条轻链的n和/或c末端)融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条重链(例如，该一条或两条重链的n和/或c末端)融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0100]
在一些实施例中，提供了包含抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分的多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该抗cldn18.2抗体部分与cldn18.2(例如，人cldn18.2)特异性结合，该抗pd-l1抗体部分与pd-l1(例如，人pd-l1)特异性结合，其中该抗cldn18.2抗体部分包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的全长抗体，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；其中该抗pd-l1抗体部分与该全长抗体的两条轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77
组成的组的氨基酸序列。
[0101]
在一些实施例中，提供了包含抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分的多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该抗cldn18.2抗体部分与cldn18.2(例如，人cldn18.2)特异性结合，该抗pd-l1抗体部分与pd-l1(例如，人pd-l1)特异性结合，其中该抗cldn18.2抗体部分包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的全长抗体，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；其中该抗pd-l1抗体部分与该全长抗体的两条重链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体。
[0102]
在一些实施例中，提供了多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该多特异性构建体包含与cldn18.2(例如，人cldn18.2)特异性结合的抗cldn18.2抗体部分和与pd-l1(例如，人pd-l1)特异性结合的抗pd-l1抗体部分，其中该抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体，并且其中该抗pd-l1抗体部分包含单域抗体，该单域抗体包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0103]
在一些实施例中，提供了多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该多特异性构建体包含与cldn18.2(例如，人cldn18.2)特异性结合的抗cldn18.2抗体部分和与pd-l1(例如，人pd-l1)特异性结合的抗pd-l1抗体部分，其中该抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体，并且其中该抗pd-l1抗体部分包含单域抗体，该单域抗体包含含有seq id no:15的氨基酸
序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0104]
在一些实施例中，提供了多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，该多特异性构建体包含与cldn18.2(例如，人cldn18.2)特异性结合的抗cldn18.2抗体部分和与pd-l1(例如，人pd-l1)特异性结合的抗pd-l1抗体部分，其中该抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体，并且其中该抗pd-l1抗体部分包含单域抗体，该单域抗体包含含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体经由接头融合。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头的长度为约四至约二十个氨基酸。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0105]
在一些实施例中，提供了包含抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分的多特异性构建体(例如，双特异性抗体)，其中该抗cldn18.2抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；并且其中该抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有
no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:80的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的
sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:80的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其
变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:73的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:74的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:75的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:76
的序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，其中第二抗体与全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:77的序列。
[0107]
在一些实施例中，上述氨基酸取代限于本技术的表2所示的“示例性取代”。在一些实施例中，氨基酸取代限于本技术的表2所示的“优选的取代”。抗cldn18.2抗体部分
[0108]
本技术中描述的抗cldn18.2抗体部分包括特异性结合密蛋白-18同种型2(“cldn18.2”)的任何抗体部分。密蛋白18.2(cldn18.2)
[0109]
密蛋白是紧密连接膜蛋白家族，其在上皮细胞和内皮细胞中表达并形成决定紧密连接渗透性的细胞旁屏障和孔。术语“密蛋白18”或“cldn18”优选地是指人cldn18，并且包括cldn 18的任何剪接变体，如cldn 18.1和cldn18.2。cldn 18.1和cldn18.2在包含第一跨膜(tm)区和环1的n末端部分上有所不同，而c末端的一级蛋白序列相同。
[0110]
密蛋白18同种型2(cldn 18.2)，密蛋白18蛋白的剪接变体，是在短寿命的分化胃上皮细胞上表达的胃谱系抗原。通常地，cldn18.2的表达在其他健康人组织中未能检测到。然而，cldn18.2在多种人癌症(包括胃食管癌和胰腺癌)中以显著水平异位表达(sahin等人(2008)clin cancer res,14(23):7624-34)。cldn18.2在胃癌转移中也常检测出。
[0111]
在一些实施例中，cldn18.2是人cldn18.2。
[0112]
在一些实施例中，cldn18.2包含seq id no:99所示的氨基酸序列或其变体。示例性抗cldn18.2抗体部分
[0113]
在一些实施例中，所述抗cldn18.2抗体部分与一个抗体部分竞争结合cldn18.2，该抗体部分包含a)重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。
[0114]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含a)hc-cdr1、hc-cdr2、和hc-cdr3，其分别包含具有seq id no:7所示的序列，或与seq id no:7所示的序列具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体的重链可变区(vh)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列；以及b)lc-cdr1、lc-cdr2、和lc-cdr3，其分别包含具有seq id no:8所示的序列，或与seq id no:8所示的序列具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体的轻链可变区(v
l
)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列。
[0115]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或在这些hc-cdr中
含有总共多达约5、4、3、2、或1个氨基酸取代的其变体；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或在这些lc-cdr中含有总共多达约5、4、3、2、或1个氨基酸取代的其变体。
[0116]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，或在该hc-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，或在该hc-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或在该hc-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，或在该lc-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，或在该lc-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或在该lc-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。
[0117]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。
[0118]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：该vh包含seq id no:7的氨基酸序列，或与seq id no:7具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体；和/或该v
l
包含seq id no:8的氨基酸序列，或与seq id no:8具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体。
[0119]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，全长抗体具有选自下组的fc片段，该组由以下组成：来自igg、iga、igd、ige、igm的fc片段及其组合和杂合物。在一些实施例中，fc片段选自由以下组成的组：来自igg1、igg2、igg3、igg4的fc片段及其组合和杂合物。在一些实施例中，fc片段是igg1或igg4 fc片段。
[0120]
在一些实施例中，与野生型相比，fc片段具有降低的fcγr结合亲和力。在一些实施例中，全长抗体具有igg4同种型，并且包含s228p突变和/或l235e突变。在一些实施例中，fc片段包含seq id no:97所示的氨基序列。抗pd-l1抗体部分
[0121]
本技术中描述的抗pd-l1抗体部分包括特异性结合pd-l1的任何抗体部分。
[0122]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，全长抗体具有选自下组的fc片段，该组由以下组成：来自igg、iga、igd、ige、igm的fc片段及其组合和杂合物。在一些实施例中，fc片段选自由以下组成的组：来自igg1、igg2、igg3、igg4的fc片段及其组合和杂合物。在一些实施例中，fc片段是igg1或igg4 fc片段。在一些实施例中，与野生型相比，fc片段具有降低的fcγr结合亲和
力。在一些实施例中，全长抗体具有igg4同种型，并且包含s228p突变和/或l235e突变。
[0123]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含与pd-l1结合的单域抗体。在一些实施例中，pd-l1是人pd-l1。示例性抗pd-l1抗体部分
[0124]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与包含单域抗体(sdab)的抗体部分竞争结合pd-l1，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15或19的氨基酸序列的sdab-cdr1；b)含有seq id no:16、18或20的氨基酸序列的sdab-cdr2；和c)含有seq id no:17或21的氨基酸序列的sdab-cdr3。在一些实施例中，该单域抗体包含a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。
[0125]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3，该sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3分别包含具有seq id no:22-24中任一个所示的氨基酸序列，或与seq id no:22-24中任一个所示的序列具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体的单个单体可变抗体结构域内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列。
[0126]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15或19的氨基酸序列的sdab-cdr1，或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；b)含有seq id no:16、18或20的氨基酸序列的sdab-cdr2，或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；和c)含有seq id no:17或21的氨基酸序列的sdab-cdr3，或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。
[0127]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1，或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；b)含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2，或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；和c)含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。
[0128]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1，或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；b)含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2，或在该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；和c)含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。
[0129]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1，或在该sdab-cdr1中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；b)含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2，或在
该sdab-cdr2中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体；和c)含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3，或在该sdab-cdr3中含有至多约3个(如约1、2、3中的任一个)氨基酸取代的其变体。
[0130]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。
[0131]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含seq id no:22-24中任一个的氨基酸序列，或与seq id no:22-24中的任一个具有至少约80％(包括例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体。构建体中的抗体部分(例如，抗cldn18.2或抗pd-l1抗体部分)
[0132]
本文所述的抗体部分(如抗cldn18.2抗体部分或抗pd-l1抗体部分)可以具有下文所述特征中的任何一种或多种。
[0133]
在一些实施例中，抗体部分包含fc片段。在一些实施例中，抗体部分包含scfv。在一些实施例中，抗体部分包含与fc片段融合的scfv。在一些实施例中，抗体部分包含经由肽接头与fc片段融合的scfv。在某些实施例中，fc片段是人igg1fc片段。在一些实施例中，fc片段包含一个或多个突变以增加清除率或减少半衰期。
[0134]
在一些实施例中，fc片段包含免疫球蛋白igg重链恒定区，该免疫球蛋白igg重链恒定区包含铰链区(从cys226开始)、igg ch2结构域和ch3结构域。如本文所用的，术语“铰链区”或“铰链序列”是指位于接头和ch2结构域之间的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含含有铰链区的fc片段。在一些实施例中，融合蛋白的fc片段始于铰链区并延伸至igg重链的c末端。在一些实施例中，融合蛋白包含不包含铰链区的fc片段。
[0135]
在一些实施例中，抗体部分包含选自下组的fc片段，该组由以下组成：来自igg、iga、igd、ige、igm的fc片段及其组合和杂合物。在一些实施例中，fc片段源自人igg。在一些实施例中，fc片段包含人igg1、igg2、igg3、igg4或组合或杂合igg的fc区。在一些实施例中，fc片段是igg1 fc片段。在一些实施例中，fc片段包含igg1的ch2和ch3结构域。在某些实施例中，fc片段是igg4 fc片段。在一些实施例中，fc片段包含igg4的ch2和ch3结构域。已知igg4 fc的效应子活性低于igg1 fc，因此对于某些应用可能是理想的。在一些实施例中，fc片段源自小鼠免疫球蛋白。
[0136]
在一些实施例中，igg ch2结构域始于ala231。在一些实施例中，ch3结构域始于gly341。可以理解，人igg的c末端lys残基可以任选地不存在。还应理解的是，在不影响fc的所需结构和/或稳定性的情况下，fc区的保守氨基酸取代被认为在本发明的范围内。
[0137]
可通过本领域已知的方法促进抗体部分的fc片段中不同多肽的异源二聚化，这些方法包括但不限于通过杵臼(knob-into-hole)技术进行异源二聚化。杵臼技术的结构和组装方法可以在例如us 5,821,333、us 7,642,228、us 201 1/0287009和pct/us 2012/059810中找到，其全部内容通过引用并入本文。这项技术通过以下步骤开展：在一个fc的
ch3结构域中通过用大的氨基酸残基替代小的氨基酸残基从而引入“杵(knob)”(或突起)，以及在另一个fc的ch3结构域中通过用较小的氨基酸残基替代一个或多个大的氨基酸残基从而引入“臼(hole)”(或空腔)。在一些实施例中，融合蛋白中fc片段的一条链包含杵，并且fc片段的第二条链包含臼。
[0138]
用于形成杵的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施例中，用于形成杵的原始残基具有小的侧链体积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。用于形成杵的ch3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于t366w、t366y或f405w取代。
[0139]
用于形成臼的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。在一个实施例中，用于形成臼的原始残基具有大的侧链体积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。用于产生臼的ch3结构域中的示例性氨基酸取代包括但不限于t366s、l368a、f405a、y407a、y407t和y407v取代。在某些实施例中，杵包含t366w取代，并且臼包含t366s/l368a/y407v取代。应当理解，有助于异源二聚化的本领域已知的对fc区的其他修饰也被本技术考虑并包括在内。
[0140]
考虑了其他抗体部分变体，包括本文所述的变体中的任一种(例如，fc变体、效应子功能变体、糖基化变体、半胱氨酸工程化变体)，或其组合。a)抗体亲和力
[0141]
抗体部分的结合特异性可以由本领域已知的方法通过实验确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、elisa-、ria-、ecl-、irma-、eia-、biacoretm-检验和肽扫描。
[0142]
在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的kd为约10-7
m至约10-12
m、约10-7
m至约10-8
m、约10-8
m至约10-9
m、约10-9
m至约10-10
m、约10-10
m至约10-11
m、约10-11
m至约10-12
m、约10-7
m至约10-12
m、约10-8
m至约10-12
m、约10-9
m至约10-12
m、约10-10
m至约10-12
m、约10-7
m至约10-11
m、约10-8
m至约10-11
m、约10-9
m至约10-11
m、约10-7
m至约10-10
m、约10-8
m至约10-10
m、或约10-7
m至约10-9
m。在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间的结合的kd比约10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、或10-12
m中的任一个都强。在一些实施例中，靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)是人抗原。
[0143]
在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的k
on
为约103m-1
s-1
至约108m-1
s-1
、约103m-1
s-1
至约104m-1
s-1
、约104m-1
s-1
至约105m-1
s-1
、约105m-1
s-1
至约106m-1
s-1
、约106m-1
s-1
至约107m-1
s-1
、或约107m-1
s-1
至约108m-1
s-1
。在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的k
on
为约103m-1
s-1
至约105m-1
s-1
、约104m-1
s-1
至约106m-1
s-1
、约105m-1
s-1
至约107m-1
s-1
、约106m-1
s-1
至约108m-1
s-1
、约104m-1
s-1
至约107m-1
s-1
、或约105m-1
s-1
至约108m-1
s-1
。在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的k
on
不超过约103m-1
s-1
、104m-1
s-1
、105m-1
s-1
、106m-1
s-1
、107m-1
s-1
或108m-1
s-1
中的任一个。在一些实施例中，靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)是人抗原。
[0144]
在一些实施例中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的k
off
为约1s-1
至约10-6
s-1
、约1s-1
至约10-2
s-1
、约10-2
s-1
至约10-3
s-1
、约10-3
s-1
至约10-4
s-1
、约10-4
s-1
至约10-5
s-1
、约10-5
s-1
至约10-6
s-1
、约1s-1
至约10-5
s-1
、约10-2
s-1
至约10-6
s-1
、约10-3
s-1
至约10-6
s-1
、约10-4
s-1
至约10-6
s-1
、约10-2
s-1
至约10-5
s-1
、或约10-3
s-1
至约10-5
s-1
。在一些实施例
中，抗体部分与靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)之间结合的k
off
为至少约1s-1
、10-2
s-1
、10-3
s-1
、10-4
s-1
、10-5
s-1
或10-6
s-1
中的任一个。在一些实施例中，靶抗原(例如，cldn18.2或pd-l1)是人抗原。b)嵌合或人源化抗体
[0145]
在一些实施例中，抗体部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984)中。在一些实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0146]
在一些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体进行人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中hvr，例如cdr，(或其部分)源自非人抗体，而fr(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体还将可以任选地包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些fr残基被来自非人抗体(例如，源自hvr残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0147]
人源化抗体及其制造方法综述于例如almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008)中，并在例如以下中进一步描述：riechmann等人,nature 332:323-329(1988)；queen等人,proc.nat’l acad.sci.usa 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；kashmiri等人,methods 36:25-34(2005)(描述了sdr(a-cdr)移植)；padlan,mol.immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；dall’acqua等人,methods 36:43-60(2005)(描述“fr改组”)；以及osbourn等人,methods 36:61-68(2005)和klimka等人,br.j.cancer,83:252-260(2000)(描述fr改组的“导向选择”方法)。
[0148]
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，sims等人j.immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，carter等人proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；和presta等人j.immunol.,151:2623(1993))；人类成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))；以及源自筛选fr文库的框架区(参见例如，baca等人,j.biol.chem.272:10678-10684(1997)和rosok等人,j.biol.chem.271:22611-22618(1996))。c)人抗体
[0149]
在一些实施例中，抗体部分是人抗体(称为人结构域抗体、或人dab)。人抗体可以使用本领域已知的不同技术产生。人抗体一般在以下中描述：van dijk和van de winkel,curr.opin.pharmacol.5:368-74(2001)、lonberg,curr.opin.immunol.20:450-459(2008)、和chen,mol.immunol.47(4):912-21(2010)。能够产生完全人单结构域抗体(或dab)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，us 20090307787 a1、美国专利号8,754,287、us 20150289489 a1、us 20100122358 a1、和wo 2004049794。
[0150]
可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如人dab)，该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常
含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，它们取代了内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。对于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见lonberg,nat.biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述xenomouse
tm
技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述k-m技术的美国专利号7,041,870，和描述技术的美国专利申请公开号us 2007/0061900。来自这类动物产生的完整抗体的人可变区可以(例如通过与不同的人恒定区结合)被进一步修饰。
[0151]
人抗体(例如人dab)也可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，kozbor j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人,monoclonal antibody production techniques and applications,第51-63页(marcel dekker,inc.,new york,1987)；和boerner等人,j.immunol.,147:86(1991))。li等人,proc.natl.acad.sci.usa,103:3557-3562(2006)中还描述了经由人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人igm抗体)和ni,xiandai mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(trioma技术)也描述于vollmers和brandlein,histology and histopathology,20(3):927-937(2005)和vollmers和brandlein,methods and findings in experimental and clinical pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
[0152]
人抗体(例如人dab)也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。从抗体库中选择人抗体的技术描述如下。d)文库衍生的抗体
[0153]
可以通过筛选具有所希望的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离抗体部分。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和筛选具有所希望的结合特征的抗体的此类文库的多种方法。此类方法综述于例如，hoogenboom等人,methods in molecular biology 178:1-37(o’brien等人,编辑,human press,totowa,nj,2001)中，并进一步描述于例如，以下中：mccafferty等人,nature 348:552-554；clackson等人,nature 352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；marks和bradbury,methods in molecular biology 248:161-175(lo,编辑,human press,totowa,nj,2003)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa 101(34):12467-12472(2004)；和lee等人,j.immunol.methods 284(1-2):119-132(2004)。已经描述了用于构建单结构域抗体文库的方法，例如，参见美国专利号7371849。
[0154]
在某些噬菌体展示方法中，将vh和v
l
基因库通过聚合酶链反应(pcr)来分别克隆并在噬菌体文库中随机重组，然后可以将其针对抗原结合噬菌体筛选，如以下中所述的：winter等人,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常以scfv片段或fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以(例如，从人)克隆原始库，为提供针对多种非自身抗原以及自身抗原
的单一抗体来源，而无需任何免疫，如由以下中所述的：griffiths等人,embo j,12:725-734(1993)。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的v基因片段，并使用含有随机序列的pcr引物来编码高度可变的cdr3区域并完成体外重排来合成原始文库，如由以下中所述的：hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936、和2009/0002360。
[0155]
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。e)取代、插入、缺失和变体
[0156]
在一些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目的位点包括hvr(或cdr)和fr。保守取代示于标题为“优选的取代”的表2中。标题为“示例性取代”的表2中提供了更实质的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸取代可以引入目的抗体中，并针对所希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的adcc或cdc)筛选产物。表2.氨基酸取代原始残基示例性取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp、lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu
[0157]
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
[0158]
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
[0159]
取代变体的一种类型涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)。简而言之，一个或多个hvr残基突变并且变体抗体在噬菌体上展示并针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)来筛选。
[0160]
可以在hvr中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体的亲和力。可在hvr“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，chowdhury,methods mol.biol.207:179-196(2008))和/或sdr(a-cdr)中进行此类改变，其中测试所得变体vh或vl的结合亲和力。通过从二级文库中构建和重新选择的亲和力成熟描述于例如：hoogenboom等人methods in molecular biology178:1-37中(o’brien等人,编辑,human press,totowa,nj,(2001))。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所希望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及hvr导向的方法，其中将几个hvr残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的hvr残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，cdr-h3和cdr-l3经常被靶向。
[0161]
在一些实施例中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个hvr内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在hvr中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以在hvr“热点”或cdr之外。在以上提供的变体vh序列的一些实施例中，每个hvr是未改变的或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
[0162]
如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗原的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定靶残基的残基或残基组(例如，带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys、和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗原结合与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以被靶向或消除作为取代候选。可以筛选变体以确定它们是否含有所希望的特性。
[0163]
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的n末端或c末端与增加该抗体的血清半衰期的酶(例如，对于adept)或多肽融合。f)糖基化变体
[0164]
在一些实施例中，改变抗体部分以增加或减少构建体糖基化的程度。向抗体中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
[0165]
当抗体部分包含fc区时，与其附接的碳水化合物可以发生改变。由哺乳动物细胞
产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过n-键附接至fc区ch2结构域的asn297。参见例如，wright等人tibtech 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于glcnac的岩藻糖。在一些实施例中，可以对抗体部分中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
[0166]
在一些实施例中，抗体部分具有碳水化合物结构，该碳水化合物结构缺少(直接或间接)附接至fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算asn297糖链中岩藻糖的平均量来确定的，相对于通过maldi-tof质谱测量的与asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，如wo 2008/077546中所述。asn297是指位于fc区中约297位的天冬酰胺残基(fc区残基的eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，asn297也可位于位置297上游或下游约
±
3个氨基酸，即在位置294和300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的adcc功能。参见例如，美国专利公开号us 2003/0157108(presta,l.)；us 2004/0093621(kyowa hakko kogyo co.,ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物实例包括：us 2003/0157108；wo 2000/61739；wo 2001/29246；us 2003/0115614；us 2002/0164328；us 2004/0093621；us 2004/0132140；us 2004/0110704；us 2004/0110282；us 2004/0109865；wo 2003/085119；wo 2003/084570；wo 2005/035586；wo 2005/035778；wo 2005/053742；wo 2002/031140；okazaki等人j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化作用缺陷型的lec13 cho细胞(ripka等人arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号us 2003/0157108 a1,presta,l；和wo 2004/056312 a1,adams等人，尤其是实例11)，以及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8，敲除cho细胞(参见例如，yamane-ohnuki等人biotech.bioeng.87:614(2004)；kanda,y.等人,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；和wo 2003/085107)。
[0167]
在一些实施例中，抗体部分具有二等分的寡糖，例如其中附接于抗体的fc区的双触角寡糖被glcnac二等分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能。此类抗体变体的实例描述于例如wo 2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利号6,602,684(umana等人)；和us 2005/0123546(umana等人)。还提供了在寡糖上具有至少一个附接至fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的cdc功能。此类抗体变体描述于例如wo 1997/30087(patel等人)；wo 1998/58964(raju,s.)；和wo 1999/22764(raju,s.)。g)fc区变体
[0168]
在一些实施例中，可将一个或多个氨基酸修饰引入抗体部分的fc区内，从而生成fc区变体。fc区变体可包含人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区)，该序列包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如，取代)。
[0169]
在一些实施例中，fc片段具有一些(但非全部)效应子功能，这类功能使该抗体变体成为适合应用的理想候选物，在所述应用中，抗体部分的体内半衰期很重要，但某些效应子功能(例如，补体和adcc)是非必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定确认
cdc和/或adcc活性的降低/消耗。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定确保抗体没有fcγr结合能力(因此可能缺乏adcc活性)，但可以保留fcrn结合能力。用于介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结在ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464页的表2中。评估目的分子的adcc活性的体外测定的非限制性实例在以下中描述：美国专利号5,500,362(参见例如hellstrom,i.等人proc.nat’l acad.sci.usa 83:7059-7063(1986))和hellstrom,i等人,proc.nat’l acad.sci.usa 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(例如，参见用于流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.mountain view，ca；以及cytotox非放射性细胞毒性测定(promega，madison，wi))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可以在体内评估目的分子的adcc活性，例如在动物模型中，如clynes等人,proc.nat’l acad.sci.usa 95:652-656(1998)中披露的。还可以进行c1q结合测定确认抗体不能结合c1q，并且因此缺乏cdc活性。例如，参见在wo 2006/029879和wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体活化，可以进行cdc测定(参见，例如gazzano-santoro等人，j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.等人,blood 101:1045-1052(2003)；以及cragg,m.s.和m.j.glennie,blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行fcrn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如petkova,s.b.等人,int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0170]
具有降低的效应子功能的抗体包括具有对fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括取代氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个的fc突变体，包括残基265和297被丙氨酸取代的称为“dana”的fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0171]
描述了与fcr结合提高或降低的某些抗体变体(参见，例如美国专利号6,737,056；wo 2004/056312，以及shields等人,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001))。
[0172]
在一些实施例中，fc片段是igg1 fc片段。在一些实施例中，igg1 fc片段包含l234a突变和/或l235a突变。在一些实施例中，fc片段是igg2或igg4 fc片段。在一些实施例中，fc片段是包含s228p、f234a和/或l235a突变的igg4 fc片段。
[0173]
在一些实施例中，抗体部分包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，这些取代(例如，fc区内的位置298、333和/或334处的取代(残基的eu编号))改善adcc。
[0174]
在一些实施例中，fc区内发生改变，导致c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)发生改变(即，提高或降低)，例如，如美国专利号6,194,551、wo 99/51642和idusogie等人,j.immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。
[0175]
在一些实施例中，抗体部分变体包含变体fc区，该变体fc区包含一个或多个改变半衰期和/或改变与新生儿fc受体(fcrn)的结合的氨基酸取代。具有延长的半衰期和与新生儿fc受体(fcrn)的结合改善的抗体，其负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人,j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994))，描述于us 2005/0014934 a1(hinton等人)中。那些抗体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，其中这些取代改变了fc区与fcrn的结合。此类fc变体包括在一个或多个fc区残基上具有取代(例如
fc区残基434的取代)的那些变体(美国专利号7,371,826)。
[0176]
还参见duncan&winter,nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及关于fc区变体的其他实例的wo 94/29351。h)半胱氨酸工程化的抗体变体
[0177]
在一些实施例中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体部分，例如“thiomab”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点，并可用于将抗体与其他部分，例如药物部分或接头-药物部分偶联，以产生免疫偶联物，如本文进一步所述。在一些实施例中，以下任何一个或多个残基可以被半胱氨酸取代：重链的a118(eu编号)；以及重链fc区的s400(eu编号)。半胱氨酸工程化抗体部分可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。i)抗体衍生物
[0178]
在一些实施例中，本文所述的抗体部分可以被进一步修饰以包含本领域已知且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)，乙二醇/丙二醇，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。附接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果附接的聚合物多于一种，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定，这些因素包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能，是否将抗体衍生物用于确定的诊断条件等。
[0179]
在一些实施例中，抗体部分可以被进一步修饰以包含一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段。如本文可互换使用的，“生物活性的”或“具有生物学活性的”是指在体内显示出执行特定功能的生物学活性。例如，它可能意味着与特定生物分子(例如蛋白质、dna等)结合，然后促进或抑制这种生物分子的活性。在一些实施例中，生物活性蛋白或其片段包括：作为活性药物物质施用给患者的蛋白和多肽；用于预防或治疗疾病或病症、以及用于诊断目的的蛋白和多肽(例如诊断测试或体外测定中使用的酶)；以及为预防疾病而施用给患者的蛋白质和多肽(例如疫苗)。多特异性构建体的形式
[0180]
本文所述的多特异性构建体可以具有任何形式，只要该构建体保持其与cldn18.2和pd-l1同时结合的功能。
[0181]
在一些实施例中，cldn18.2抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条重链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与全长抗体的一条或
两条轻链的c末端融合。
[0182]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条重链融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的n末端融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条重链的c末端融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的n末端融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体的一条或两条轻链的c末端融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分是scfv抗体，如包含以下的scfv抗体：含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1、含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2、含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3、含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1、含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2、和含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。
[0183]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分和抗cldn18.2抗体部分均包含全长抗体。
[0184]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分和抗cldn18.2抗体部分均不包含全长抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体或单链可变片段(scfv)抗体。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含单域抗体或单链可变片段(scfv)抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含单域抗体，如本文所述的那些中的任一种。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分和抗cldn18.2经由本文所述的接头融合在一起。接头
[0185]
在一些实施例中，本文所述的多特异性构建体包含两个部分(例如，抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分)之间的一个或多个接头。双特异性抗体中使用的一个或多个接头的长度、灵活性和/或其他特性可能对特性有一些影响，这些特性包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。例如，可以选择更长的接头以确保两个相邻的结构域在空间上不会彼此干扰。在某些实施例中，接头(例如肽接头)包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻的结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。在一些实施例中，接头是非肽接头。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头是不可切割的接头。在一些实施例中，接头是可切割的接头。
[0186]
其他接头考虑因素包括对所得化合物的物理或药代动力学特性的影响，例如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性，稳定性(更稳定或更不稳定以及计划的降解)、刚性、柔性、免疫原性，抗体结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
[0187]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含全长抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分(如单域抗体)与全长抗体经由接头融合。
[0188]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含全长抗体。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与全长抗体经由接头融合。
[0189]
在一些实施例中，接头是如下所述的肽接头。在一些实施例中，肽接头的长度为约一至约五十、约二至约四十、约三至约三十、或约四至约二十个氨基酸。
[0190]
在一些实施例中，接头是可切割的接头。在一些实施例中，接头是不可切割的接头。
[0191]
在一些实施例中，接头是gs接头。
[0192]
在一些实施例中，接头包含seq id no:72-80和90-96中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含seq id no:72-80中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含seq id no:72-77中任一个的氨基酸序列。肽接头
[0193]
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见，例如，wo 1996/34103。
[0194]
肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，肽接头的长度为至少约以下中的任何一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为不超过约以下中的任何一者：100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸。在一些实施例中，肽接头的长度为以下中的任一个：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
[0195]
这种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接头的特征(其包含二级结构促进作用的缺失)在本领域中已知，并且在例如dall’acqua等人(biochem.(1998)37,9266-9273)、cheadle等人(mol immunol(1992)29,21-30)以及raag和whitlow(faseb(1995)9(1),73-80)中有描述。就“肽接头”而言，特别优选的氨基酸是gly。此外，也不促进任何二级结构的肽接头是优选的。结构域彼此之间的联接可以通过例如基因工程来提供。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并将其在哺乳动物细胞或细菌中表达的方法是本领域众所周知的(例如，wo 99/54440,ausubel,current protocols in molecular biology,green publishing associates and wiley interscience,n.y.1989和1994或sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,2001)。
[0196]
肽接头可以是稳定的接头，其不能被蛋白酶尤其是被基质金属蛋白酶(mmp)切割。
[0197]
接头也可以是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(g)n(seq id no:93)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(gs)n(seq id no:94)、(gsggs)n(seq id no:95)、(ggggs)n(seq id no:90)、和(gggs)n(seq id no:96)，其中n是至少是一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化，并且因此可能能够作为组分之间的中性系链。甘氨酸比丙氨酸可到达显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基所受限制小得多(scheraga,rev.computational chem.11:173-142(1992))。本领域普通技术人员将认识到，抗体融合蛋白的设计可以包括全部或部分为柔性的接头，使得该接头可以包括柔性接头部分以及赋予较小的柔性结构以提供所希望的抗体融合蛋白结构的一个或多个部分。在一些实施例中，接头是gs接头。在一些实施例中，接头具有选自由seq id no:78-80组成的组的氨基酸序列。
[0198]
在一些实施例中，肽接头包含igg的铰链区，如人igg1的铰链区。在一些实施例中，肽接头包含源自igg的铰链区(如人igg1的铰链区)的经修饰的序列。在一些实施例中，接头
具有选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0199]
在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分和抗pd-l1抗体部分通过足够长度的接头连接在一起，以使抗cldn18.2和抗pd-l1抗原结合结构域能够以允许结合cldn18.2和pd-l1的方式折叠。示例性接头包括例如，seq id no:72-80所示的序列中的任一个。在一些实施例中，接头具有(ggggs)n(seq id no:90)的氨基酸序列，其中n是1与8之间的整数，例如(ggggs)3(seq id no:79；下文称为“(g4s)3”或“gs3”)，或(ggggs)6(seq id no:91；下文称为“(g4s)6”或“gs6”)。在一些实施例中，肽接头包含(gstsgsgkpgsgegs)n(seq id no:92)的氨基酸序列，其中n是1与3之间的整数。在一些实施例中，肽接头包含erkssvesppsp(seq id no:74)的氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头包含eskygppsppsp(seq id no:76)的氨基酸序列。非肽接头
[0200]
两个部分的偶联可以通过以下任何化学反应来完成：该化学反应将两个分子结合，只要这两个组分均保持各自的活性，例如，分别结合至抗cldn18.2和抗pd-l1。该联接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、配位结合和络合。在一些实施例中，结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的并入来实现。在这种情况下，许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白质分子。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该清单并非旨在穷尽本领域中已知的各种偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例(参见killen和lindstrom,jour.immun.133:1335-2549(1984)；jansen等人,immunological reviews 62:185-216(1982)；和vitetta等人,science 238:1098(1987))。
[0201]
可以在本技术中应用的接头在文献中有所描述(参见，例如，ramakrishnan,s.等人,cancer res.44:201-208(1984)，其描述mbs(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。在一些实施例中，本文使用的非肽接头包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)smpt(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(pierce chem.co.,目录号21558g))；(iii)spdp(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(pierce chem.co.,目录号21651g)；(iv)磺基-lc-spdp(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸酯(pierce chem.co.目录号2165-g；以及(v)缀合至edc的磺基-nhs(n-羟基磺基-琥珀酰亚胺:pierce chem.co.,目录号24510)。
[0202]
上述接头含有具有不同属性的组分，因此可能导致具有不同理化特性的双特异性抗体。例如，烷基羧酸盐的磺基-nhs酯比芳香族羧酸盐的磺基-nhs酯更稳定。含nhs酯的接头的可溶性不如磺基-nhs酯。此外，接头smpt含有空间受阻的二硫键，并且可以形成具有增强的稳定性的抗体融合蛋白。二硫键通常比其他键不稳定，因为二硫键在体外被切割，导致可用的抗体融合蛋白更少。特别地，磺基-nhs可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-nhs配合使用时，碳二亚胺偶联(例如edc)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解的抵抗力更大的酯。核酸
[0203]
本文还涉及编码本文所述的多特异性构建体或各种抗体部分的核酸分子。在一些实施例中，提供了编码多特异性构建体或各种抗体部分中的一种或多种多肽的核酸(或一组核酸)。在一些实施例中，提供了编码多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异
press,1986))。也参见实例1中的骆驼免疫。
[0213]
免疫剂将通常包括抗原蛋白或其融合变体。通常，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“pbl”)，或者如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。goding,monoclonal antibodies:principles and practice,academic press(1986),第59-103页。
[0214]
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中播种并生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt或hprt)，杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(hat培养基)，这些是阻止hgprt缺陷型细胞的生长的物质。
[0215]
优选的永生化骨髓瘤细胞是有效融合、支持选择的产生抗体的细胞稳定高水平产生抗体、并且对培养基(如hat培养基)敏感的那些。其中，优选的是鼠类骨髓瘤细胞系，例如源自以下的那些细胞系：从美国加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分布中心(salk institute cell distribution center)获得的mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤，以及从美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得的sp-2细胞(及其衍生物，例如x63-ag8-653)。还描述了人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人,monoclonal antibody production techniques and applications,第51-63页(marcel dekker,inc.,new york,1987))。
[0216]
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中的针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或体外结合测定(如放射免疫测定法(ria)或酶联免疫吸附测定法(elisa))来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
[0217]
可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(ria)或酶联测定法(elisa)来确定。此类技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过munson等人,anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析来确定。
[0218]
鉴定出可产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释程序进行亚克隆，并通过标准方法培养(goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如d-mem或rpmi-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中在体内作为肿瘤生长。
[0219]
通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如像，蛋白a-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)来从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
[0220]
单克隆抗体也可以通过重组dna方法来制备，例如美国专利号4,816,567中描述的并且如上所述的那些。使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，容易地对编码单克隆抗体的dna进行分离和测序。杂交瘤细胞用作这种dna的优选来源。一旦被分离，dna可以被置于表达载体中，然后将这些载
体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在这种重组宿主细胞中合成单克隆抗体。在细菌中重组表达编码抗体的dna的评论文章包括skerra等人,curr.opinion in immunol.,5:256-262(1993)和pl
ü
ckthun,immunol.revs.130:151-188(1992)。
[0221]
在另一个实施例中，可以使用mccafferty等人,nature,348:552-554(1990)中所述技术从生成的抗体噬菌体文库中分离抗体。clackson等人.,nature,352:624-628(1991)和marks等人.,j.mol.biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(marks等人,bio/technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建超大型噬菌体文库的策略(waterhouse等人.,nucl.acids res.,21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nm范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
[0222]
还可以如下来修饰dna：例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；morrison,等人,proc.natl acad.sci.usa,81:6851(1984))，或通过共价结合非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列到免疫球蛋白编码序列。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
[0223]
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在fc区中的任何点截短重链以防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。体外方法也适于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来完成消化抗体以产生其片段(特别是fab片段)。
[0224]
也可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备嵌合或杂合抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。双特异性抗体
[0225]
本文还提供了制备本文所述的双特异性抗体的方法。可以使用本领域已知的或如本文所述的任何方法(如实例1)来制备双特异性抗体。
[0226]
制备本技术的双特异性抗体的方法包括在wo 2008119353(genmab)、wo 2011131746(genmab)和由van der neut-kolfschoten等人(science.2007sep 14；317(5844):1554-7)的报道中描述的那些。可用于制备双特异性抗体的其他平台的实例包括但不限于bite(micromet)、dart(macrogenics)、fcab和mab2(f-star)、fc工程化的iggl(xencor)或duobody(基于fab臂交换，genmab，该应用如下所述)。
[0227]
还可以使用传统方法，如杂交杂交瘤和化学缀合方法(marvin和zhu(2005)acta pharmacol sin 26:649)。在宿主细胞中两种组分(如表3所示的多肽)的共表达导致除了所需的双特异性抗体外还可能存在抗体产物的混合物，该双特异性抗体然后可以通过例如亲和色谱法或类似方法分离。编码抗体部分的核酸分子
[0228]
在一些实施例中，提供了编码本文所述的多特异性构建体或抗体部分中的任一种的多核苷酸。在一些实施例中，提供了使用本文所述的任何一种方法制备的多核苷酸。在一些实施例中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗cldn18.2抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施例中，核酸分子同时包含编码抗体部分(例如，抗cldn18.2抗体部分)的重链的多核苷酸和编码其轻链的多核苷酸。在一些实施例中，第一核酸分子包括编码重链的第一多核苷酸，并且第二核酸分子包括编码轻链的第二多核苷酸。
[0229]
在一些实施例中，重链和轻链从一个核酸分子表达或从两个单独的核酸分子表达为两个单独的多肽。在一些实施例中，单个多核苷酸编码同时包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
[0230]
在一些实施例中，编码抗体部分(例如，抗cldn18.2抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，该前导序列在翻译时位于该重链或轻链的n末端。如上所述，前导序列可以是天然的重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源的前导序列。
[0231]
在一些实施例中，多核苷酸是dna。在一些实施例中，多核苷酸是rna。在一些实施例中，rna是mrna。在一些实施例中，多核苷酸包含与seq id no:50-71中的任一个的核酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的核酸序列。
[0232]
核酸分子可以使用本领域常规的重组dna技术构建。在一些实施例中，核酸分子是适合在所选宿主细胞中表达的表达载体。核酸构建体
[0233]
在一些实施例中，提供了包含本文所述的任何一种多核苷酸的核酸构建体。在一些实施例中，提供了使用本文所述的任何方法制备的核酸构建体。
[0234]
在一些实施例中，核酸构建体进一步包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。在一些实施例中，多核苷酸对应于基因，其中启动子是基因的野生型启动子。载体
[0235]
在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的抗体部分或多特异性构建体的任一种或本文所述的核酸构建体的任何多核苷酸的载体。在一些实施例中，提供了使用本文所述的任何方法制备的载体。还提供了包含编码本文所述的抗体部分或多特异性构建体(如抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)中的任一种的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于，dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施例中，载体包含a)第一多核苷酸序列，该第一多核苷酸序列编码与结合pd-l1的单域抗体融合的抗cldn18.2全长抗体的重链或轻链，和b)第二多核苷酸序列，该第二多核苷酸序列编码与第一核苷酸配对的抗cldn18.2全长抗体的轻链或重链。在一些实施例中，将第一载体和第二载体以相似的量(例如相似的摩尔量或相似的质量)转染到宿主细胞内。在一些实施例中，将第一载体和第二载体以在5:1和1:5之间的摩尔比或质量比转染到宿主细胞中。在一些实施例中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用在1:1和1:5之间的质量比。在一些实施例中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用1:2的质量比。
[0236]
在一些实施例中，选择针对cho或cho来源的细胞(例如，cho-3e7细胞)或nso细胞中的多肽表达进行优化的载体。示例性的此类载体描述于例如running deer等人,
biotechnol.prog.20:880-889(2004)。宿主细胞
[0237]
在一些实施例中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施例中，提供了使用本文所述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞在发酵条件下能够产生本文所述的任何抗体部分或多特异性构建体。
[0238]
在一些实施例中，本文所述的抗体部分和多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)可以在原核细胞，如细菌细胞中表达；或在真核细胞(例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞(括cos 7细胞)；293细胞(包括293-6e细胞)；cho细胞(包括cho-s、cho-3e7、dg44、lec13 cho细胞和fut8 cho细胞)；per.细胞(crucell)；和nso细胞。在一些实施例中，本文所述的抗体部分和多特异性构建体可以在酵母中表达。参见，例如，美国公开号us 2006/0270045 a1。在一些实施例中，基于对抗体部分的重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施例中，cho细胞产生的多肽具有比293细胞中产生的相同多肽更高的唾液酸化水平。
[0239]
可以通过任何方法完成将一种或多种核酸引入所需宿主细胞，包括但不限于磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第3版cold spring harbor laboratory press(2001)。核酸可以根据任何合适的方法在所需的宿主细胞中进行瞬时或稳定地转染。
[0240]
本发明还提供了包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施例中，本发明提供了包含多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的宿主细胞。能够过度表达异源dna的任何宿主细胞都可以用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实施例包括但不限于cos、hela和cho细胞。也参见pct公开号wo 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(s.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(k.lactis))。
[0241]
在一些实施例中，抗体部分在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如sitaraman等人,methods mol.biol.498:229-44(2009)；spirin,trends biotechnol.22:538-45(2004)；endo等人,biotechnol.adv.21:695-713(2003)。培养基
[0242]
在一些实施例中，提供了包含本文所述的任何抗体部分、多核苷酸、多特异性构建体、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施例中，提供了使用本文所述的任何方法制备的培养基。
[0243]
在一些实施例中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，hat培养基)。在一些实施例中，培养基不包含血清。在一些实施例中，培养基包含血清。在一些实施例中，培养基是d-mem或rpmi-1640培养基。抗体部分的纯化可以通过任何合适的方法纯化多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特
异性抗体)。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱。合适的亲和配体包括ror1 ecd和结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可用于结合恒定区并纯化包含fc片段的多特异性构建体。疏水相互作用色谱，例如丁基或苯基柱，也可以适用于纯化某些多肽，例如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可以适用于纯化某些多肽，例如抗体。混合模式色谱(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可以适用于纯化某些多肽，例如抗体。纯化多肽的许多方法是本领域已知的。v.治疗方法
[0244]
本文还提供了治疗个体疾病或病症的方法。这些方法包括将本文所述的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)施用于个体(例如，哺乳动物，如人)。
[0245]
在一些实施例中，提供了治疗个体疾病或病症(例如，胃癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)，该多特异性构建体包含a)与cldn18.2结合的抗体部分，和b)与pd-l1结合的抗体部分。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分是全长抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分是单域抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条重链的n末端和/或c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条轻链的n末端和/或c末端融合。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分与一个抗体部分竞争结合cldn18.2，该抗体部分包含a)重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分包含a)hc-cdr1、hc-cdr2、和hc-cdr3，其分别包含具有seq id no:7所示的序列的重链可变区(vh)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列；和b)lc-cdr1、lc-cdr2、和lc-cdr3，其分别包含具有seq id no:8所示的序列的轻链可变区(vl)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列。
[0246]
在一些实施例中，提供了治疗个体疾病或病症(例如，胃癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)，该多特异性构建体包含a)与cldn18.2结合的抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体；并且b)该v
l
包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，以及iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3，或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体(根据kabat编号)；和b)与pd-l1结合的抗体部分。在一些实施例中，氨基酸取代限于本技术的表2所示的“示例性取代”。在一些实施例中，氨基酸取代限于本技术的表2所示的“优选的取代”。在一些实施例中，抗cldn18.2抗体部分是全长抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分是单域抗体。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部
分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条重链的n末端和/或c末端融合。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与抗cldn18.2全长抗体的一条或两条轻链的n末端和/或c末端融合。在一些实施例中，vh包含seq id no:7的氨基酸序列，或与seq id no:7具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体；和/或v
l
包含seq id no:8的氨基酸序列，或与seq id no:8具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体。
[0247]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分与包含单域抗体(sdab)的抗体部分竞争结合pd-l1，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。
[0248]
在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含含有sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3的单域抗体(sdab)，该sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3分别包含单个单体可变抗体结构域内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列，该单个单体可变抗体结构域具有seq id no:22-24中任一个所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗pd-l1抗体部分包含a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体，以及含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3或含有至多约3个(如3、2、或1个)氨基酸取代的其变体。在一些实施例中，氨基酸取代限于本技术的表2所示的“示例性取代”。在一些实施例中，氨基酸取代限于本技术的表2所示的“优选的取代”。在一些实施例中，单域抗体包含seq id no:22-24中任一个的氨基酸序列，或与seq id no:22-24中的任一个具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％中任一个)序列同一性的其变体。
[0249]
在一些实施例中，个体是哺乳动物(例如，人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，个体是人。在一些实施例中，个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，个体年龄小于约60岁(包括例如小于约50、40、30、25、20、15或10岁中的任一个)。在一些实施例中，个体年龄大于约60岁(包括例如大于70、80、90或100岁中的任一个)。在一些实施例中，个体被诊断患有或遗传上倾向于本文所述的一种或多种疾病或障碍(如癌症、自身免疫性疾病或移植)。在一些实施例中，个体具有与本文所述的一种或多种疾病或障碍相关的一种或多种危险因素。
[0250]
在一些实施例中，个体在开始治疗之前具有密蛋白-18畸变。在一些实施例中，密蛋白-18畸变包含cldn18中的遗传变异。在一些实施例中，cldn18中的畸变包含cldn18中的突变，该突变包括但不限于缺失、移码、插入、插入缺失、错义突变、无义突变、点突变、沉默突变、剪接位点突变、剪接变体、和易位。在一些实施例中，密蛋白-18畸变包含cldn18的拷贝数变异。
[0251]
在一些实施例中，密蛋白-18畸变包含密蛋白-18同种型2(cldn18.2)的异常表达水平。在一些实施例中，密蛋白-18畸变包含cldn18.2的异常活性水平或磷酸化水平。
[0252]
在“开始治疗前或开始治疗时”确定的密蛋白-18畸变是在个体接受本文所述治疗方式的第一次施用前或施用时确定的密蛋白-18畸变。“密蛋白-18畸变”是指cldn18中的遗传畸变、cldn18.2的异常表达水平和/或异常活性水平。cldn18中的遗传畸变是通过与对照或参考，如参考序列(如核酸序列或蛋白序列)的比较确定的。异常表达或活性水平是指cldn18.2的活性水平或表达水平增加到高于参考活性水平或范围的水平，如至少高于参考活性水平或参考活性范围中位数的约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更大中的任一个。在一些实施例中，参考活性水平是标准化测试中临床上可接受的正常活性水平，或健康个体(或从该个体中分离出的组织或细胞)中无密蛋白-18畸变的活性水平。
[0253]
在一些实施例中，基于个体的密蛋白-18畸变状态来选择用于治疗的个体。
[0254]
在一些实施例中，该方法进一步包括评估个体的密蛋白-18畸变。在一些实施例中，该方法进一步包括基于个体的密蛋白-18畸变状态来鉴定或选择用于治疗的个体。疾病或病症
[0255]
本文所述的多特异性构建体可用于治疗任何疾病或病症。在一些实施例中，该疾病或病症是癌症。
[0256]
在一些实施例中，多特异性构建体用于治疗癌症的方法中。可以使用本文所述的任何方法治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。如本技术中所述，用多特异性构建体治疗的癌症类型包括但不限于上皮癌、母细胞瘤、肉瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性瘤(例如肉瘤、上皮癌和黑素瘤)。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。在一些实施例中，该癌症是实体瘤。
[0257]
在一些实施例中，该癌症是胃癌。在一些实施例中，该癌症是食管胃结合部(gej)癌。在一些实施例中，所述胃癌是ebv(即，eb病毒)亚型。在一些实施例中，所述胃癌是msi(即，微卫星不稳定性)亚型。在一些实施例中，所述胃癌是gs(即，基因组稳定的)亚型。在一些实施例中，所述胃癌是cin(即，染色体不稳定性)亚型。参见sohn等人clin cancer res.:10.1158/1078-0432.ccr-16-2211。在一些实施例中，所述胃癌是弥漫性胃癌。在一些实施例中，所述胃癌是肠胃癌。
[0258]
在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌。
[0259]
在一些实施例中，所述癌症是her2阳性癌症。在一些实施例中，所述癌症是her2阴性癌症。
[0260]
在各种实施例中，所述癌症是早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症、缓解期癌症、复发性癌症、辅助治疗中的癌症、新辅助治疗中的癌症或基本上难以治疗的癌症。
多特异性构建体的给药与施用方法
[0261]
施用于个体的用于治疗本文所述疾病或障碍的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的剂量可以随特定的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)、施用方式以及正在治疗的疾病或病症的类型而变化。在一些实施例中，疾病或病症的类型是癌症。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是有效导致客观应答(如部分应答或完全应答)的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以导致个体中完全应答的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以导致个体中部分应答的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以在用该多特异性构建体治疗的个体的群体中产生大于约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％中任何一个的总应答率的量。可以例如基于recist水平来确定个体对本文所述方法的治疗的应答。
[0262]
在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以延长个体无进展存活期的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以延长个体总存活期的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是足以在用该多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)治疗的个体的群体的大于约50％、60％、70％、或77％的任何一个中产生临床益处的量。
[0263]
在一些实施例中，单独或与第二、第三和/或第四药剂组合的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是与治疗前相同受试者的相应肿瘤大小、癌细胞数量或肿瘤生长速率相比，或与未接受治疗的其他受试者(例如接受安慰剂治疗)的相应活性相比，足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数量、或降低肿瘤生长速率至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中任何一个的量。可以使用标准方法来测量所述效应的幅度，例如使用纯化酶的体外测定、基于细胞的测定、动物模型或人体测试。
[0264]
在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)有效量是低于诱导毒理学效应(即，高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平的量，或是在将组合物施用于个体时处于潜在副作用可受控或耐受的水平的量。
[0265]
在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是接近按照相同给药方案的组合物的最大耐受剂量(mtd)的量。在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量大于mtd的约80％、90％、95％、或98％中的任何一个。
[0266]
在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是与未接受治疗的个体相比，减缓或抑制疾病或病症进展(例如，减缓或抑制至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％)的量。
[0267]
在一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量是与未接受治疗的个体相比，减少病症(例如移植)的副作用(自身免疫应答)(例如，减少至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％)的量。
[0268]
在上述任一方面的一些实施例中，多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的有效量在总体重的约0.001μg/kg至约100mg/kg的范围内，例如，约0.005μg/kg至约50mg/kg、约0.01μg/kg至约10mg/kg或约0.01μg/kg至约1mg/kg。
[0269]
在一些实施例中，治疗包括多于一次施用多特异性构建体中的任一种(如约两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次施用该多特异性构建体)。在一些实施例中，在约一周内进行两次施用。在一些实施例中，在第一次施用完成后至少约1、2、3、4、5、6或7天进行第二次施用。
[0270]
可以通过各种途径(包括例如静脉内、动脉内、腹腔内、肺内、口服、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经粘膜和透皮)将多特异性构建体施用于个体(例如人)。在一些实施例中，多特异性构建体在施用于个体时被包含在药物组合物中。在一些实施例中，可以使用组合物的持续连续释放配制品。在一些实施例中，将组合物静脉内施用。在一些实施例中，将组合物腹腔内施用。在一些实施例中，将组合物肌内施用。在一些实施例中，将组合物皮下施用。在一些实施例中，将组合物口服施用。组合疗法
[0271]
本技术还提供了向个体施用多特异性构建体中的任一种以治疗疾病或病症(如癌症)的方法，其中该方法进一步包括施用第二药剂或疗法。在一些实施例中，第二药剂或疗法是治疗疾病或病症的标准的或常用的药剂或疗法。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含化学治疗剂。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含手术。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含放射疗法。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含免疫疗法。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含激素疗法。在一些实施例中，第二药剂或疗法包含酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施例中，第二药剂靶向her2(例如，抗her2抗体)。
[0272]
在一些实施例中，将多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)与第二药剂或疗法同时施用。在一些实施例中，将多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)与第二药剂或疗法并行施用。在一些实施例中，将多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)与第二药剂或疗法依次施用。在一些实施例中，将多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)以与第二药剂或疗法相同的单位剂型施用。在一些实施例中，将多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)以与第二药剂或疗法不同的单位剂型施用。vi.组合物、套件和制品
[0273]
本文还提供了组合物(如配制品)，这些组合物包含本文所述的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)中的任一个、编码这些多特异性构建体或其部分中的任一个的核酸、包含编码这些多特异性构建体中的一种的核酸的载体、或包含该核酸或载体的宿主细胞。
[0274]
合适的本文所述的多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)配制品可以通过将具有所需纯度的多特异性构建体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制品或水溶液的形式来获得(remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.ed.(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受者无毒。适用于皮下施用的冻干配制品描述于wo 97/04801。可以用合适的稀释剂将此类冻干配制品重构为高蛋白浓度，并且可以将该重构的配制品皮下施用给本文所述
要成像、诊断或治疗的个体。
[0275]
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这可以通过例如穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
[0276]
还提供了包含本文所述的任一个多特异性构建体(例如，抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体)的套件。所述套件可用于本文所述的治疗方法中的任一种。在一些实施例中，该套件进一步包含用于评估密蛋白-18畸变(例如，抗cldn18.2抗体)的药剂。
[0277]
在一些实施例中，该套件进一步包含能够将多特异性构建体递送至个体的装置。用于例如肠胃外递送应用的一种类型的装置是注射器，其用于将组合物注射到受试者体内。吸入装置也可用于某些应用。
[0278]
在一些实施例中，套件进一步包含用于治疗疾病或病症(例如癌症、传染病、自身免疫疾病或移植)的治疗剂。
[0279]
本技术的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐子、柔性包装(例如，密的聚酯薄膜或塑料袋)等。套件可以任选地提供其它组分，例如缓冲液和解释信息。
[0280]
因此，本技术还提供了制品。该制品可以包括容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。通常，容器容纳组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
[0281]
本领域技术人员将会认识到，在本发明的范围和精神内，多个实施例是可能的。现在将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。示例性实施例
[0282]
实施例1.一种多特异性构建体，该多特异性构建体包含a)与密蛋白-18同种型2(“cldn18.2”)特异性结合的第一抗体部分；和b)与pd-l1特异性结合的第二抗体部分。
[0283]
实施例2.如实施例1所述的多特异性构建体，其中该第一抗体部分包含全长抗体，该全长抗体包含两条重链和两条轻链。
[0284]
实施例3.如实施例1或实施例2所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分包含与pd-l1结合的单域抗体。
[0285]
实施例4.如实施例2或实施例3所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体的一条或两条重链融合。
[0286]
实施例5.如实施例4所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体的一条或两条重链的n末端融合。
[0287]
实施例6.如实施例4所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体的一条或两条重链的c末端融合。
[0288]
实施例7.如实施例2或实施例3所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体的一条或两条轻链融合。
[0289]
实施例8.如实施例7所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体的一条或两条轻链的n末端融合。
[0290]
实施例9.如实施例7所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体
的一条或两条轻链的c末端融合。
[0291]
实施例10.如实施例2-9中任一项所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分与该全长抗体经由接头融合。
[0292]
实施例11.如实施例10所述的多特异性构建体，其中该接头是肽接头。
[0293]
实施例12.如实施例11所述的多特异性构建体，其中该肽接头的长度为约四至约二十个氨基酸。
[0294]
实施例13.如实施例10-12中任一项所述的多特异性构建体，其中该接头是可切割的接头。
[0295]
实施例14.如实施例10-12中任一项所述的多特异性构建体，其中该接头是不可切割的接头。
[0296]
实施例15.如实施例10-12中任一项所述的多特异性构建体，其中该接头是gs接头。
[0297]
实施例16.如实施例10-12中任一项所述的多特异性构建体，其中该接头包含源自igg铰链区的经修饰的序列。
[0298]
实施例17.如实施例10-16中任一项所述的多特异性构建体，其中该接头具有选自由seq id no:72-80组成的组的氨基酸序列。
[0299]
实施例18.如实施例17所述的多特异性构建体，其中该接头具有选自由seq id no:72-77组成的组的氨基酸序列。
[0300]
实施例19.如实施例1-18中任一项所述的多特异性构建体，其中该cldn18.2是人cldn18.2。
[0301]
实施例20.如实施例1-19中任一项所述的多特异性构建体，其中该第一抗体部分包含：a)hc-cdr1、hc-cdr2、和hc-cdr3，其分别包含具有seq id no:7所示的序列的重链可变区(vh)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列；和b)lc-cdr1、lc-cdr2、和lc-cdr3，其分别包含具有seq id no:8所示的序列的轻链可变区(vl)内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序列。
[0302]
实施例21.如实施例1-20中任一项所述的多特异性构建体，其中该第一抗体部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3。
[0303]
实施例22.如实施例20或实施例21所述的多特异性构建体，其中该vh包含seq id no:7的氨基酸序列，或与seq id no:7具有至少约80％序列同一性的其变体；和/或该vl包含seq id no:8的氨基酸序列，或与seq id no:8具有至少约80％序列同一性的其变体。
[0304]
实施例23.如实施例1-22中任一项所述的多特异性构建体，其中该pd-l1是人pd-l1。
[0305]
实施例24.如实施例1-23中任一项所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分包含含有sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3的单域抗体(sdab)，该sdab-cdr1、sdab-cdr2、和sdab-cdr3分别包含单个单体可变抗体结构域内的cdr1、cdr2、和cdr3的氨基酸序
列，该单个单体可变抗体结构域具有seq id no:22-24中任一个所示的氨基酸序列。
[0306]
实施例25.如实施例1-24中任一项所述的多特异性构建体，其中该第二抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15或19的氨基酸序列的sdab-cdr1；b)含有seq id no:16、18或20的氨基酸序列的sdab-cdr2；和c)含有seq id no:17或21的氨基酸序列的sdab-cdr3。
[0307]
实施例26.如实施例25所述的多特异性构建体，其中该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3。
[0308]
实施例27.如实施例24-26中任一项所述的多特异性构建体，其中该单域抗体包含seq id no:22-24中任一个的氨基酸序列，或与seq id no:22-24中任一个具有至少约80％序列同一性的其变体。
[0309]
实施例28.如实施例2-27中任一项所述的多特异性构建体，其中：1)该全长抗体包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：a)该vh包含：i)含有seq id no:1的氨基酸序列的hc-cdr1，ii)含有seq id no:2的氨基酸序列的hc-cdr2，和iii)含有seq id no:3的氨基酸序列的hc-cdr3；并且b)该vl包含：i)含有seq id no:4的氨基酸序列的lc-cdr1，ii)含有seq id no:5的氨基酸序列的lc-cdr2，和iii)含有seq id no:6的氨基酸序列的lc-cdr3；和2)该第二抗体部分包含单域抗体(sdab)，该单域抗体包含：a)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；b)含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3；或c)含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3；其中该第二抗体部分与该全长抗体部分任选地经由肽接头融合，该肽接头的长度为约四至约二十个氨基酸。
[0310]
实施例29.如实施例28所述的多特异性构建体，其中：1)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；2)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:18的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；3)该第二抗体部分包含含有seq id no:19的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:20的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:21的氨基酸序列的sdab-cdr3，其
id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:72的序列；14)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；15)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条重链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；16)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:78的序列；17)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的n末端经由接头融合，该接头包含seq id no:79的序列；18)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:73的序列；19)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:74的序列；20)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:75的序列；21)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:76的序列；或22)该第二抗体部分包含含有seq id no:15的氨基酸序列的sdab-cdr1、含有seq id no:16的氨基酸序列的sdab-cdr2、和含有seq id no:17的氨基酸序列的sdab-cdr3，其中该第二抗体与该全长抗体的两条轻链的c末端经由接头融合，该接头包含seq id no:77的序列。
[0311]
实施例30.如实施例4-6和10-29中任一项所述的多特异性构建体，其中与该第二抗体部分融合的该全长抗体的两条重链各自包含seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
[0312]
实施例31.如实施例30所述的多特异性构建体，其中该全长抗体的两条轻链各自包含seq id no:10的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:10的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
[0313]
实施例32.如实施例和7-29中任一项所述的多特异性构建体，其中与该第二抗体部分融合的该全长抗体的两条轻链各自包含seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
[0314]
实施例33.如实施例32所述的多特异性构建体，其中该全长抗体的两条重链各自包含seq id no:9的氨基酸序列或变体，该变体包含与seq id no:9的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
[0315]
实施例34.如实施例30-33中任一项所述的多特异性构建体，其中：a)与该第二抗体部分融合的该全长抗体的两条重链各自包含选自seq id no:28-36中任一个的氨基酸序列，并且两条轻链各自包含seq id no:10的氨基酸序列；或b)与该第二抗体部分融合的该全长抗体的两条轻链各自包含选自seq id no:37-49中任一个的氨基酸序列，并且两条重链各自包含seq id no:9的氨基酸序列。
[0316]
实施例35.如实施例1-34中任一项所述的多特异性构建体，其中该构建体是双特异性抗体。
[0317]
实施例36.一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例1-35中任一项所述的构建体以及药学上可接受的载体。
[0318]
实施例37.一种核酸，该核酸编码如实施例1-35中任一项所述的构建体。
[0319]
实施例38.一种核酸，该核酸包含选自由seq id no:50-71组成的组的核酸序列。
[0320]
实施例39.一种载体，该载体包含如实施例37或实施例38所述的核酸。
[0321]
实施例40.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如实施例37或实施例38所述的核酸、或如实施例39所述的载体。
[0322]
实施例41.一种产生如实施例1-35中任一项所述的多特异性构建体的方法，该方法包括：a)在有效表达该多特异性构建体的条件下培养如实施例40所述的宿主细胞；以及b)从该宿主细胞获得所表达的构建体。
[0323]
实施例42.一种治疗个体疾病或病症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的如实施例1-35中任一项所述的多特异性构建体、或如实施例36所述的药物组合物。
[0324]
实施例43.如实施例42所述的方法，其中该疾病或病症是癌症。
[0325]
实施例44.如实施例43所述的方法，其中该癌症是胃癌。
[0326]
45.如实施例42-44中任一项所述的方法，其中该个体具有密蛋白-18畸变。
[0327]
实施例46.如实施例42-45中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括施用第二药剂。
[0328]
实施例47.如实施例46所述的方法，其中该第二药剂与her-2结合。
[0329]
实施例48.如实施例42-47中任一项所述的方法，其中将该构建体或药物组合物肠胃外施用至该个体内。
[0330]
实施例49.如实施例42-48中任一项所述的方法，其中该个体是人。
[0331]
实施例50.一种套件，该套件用于治疗疾病或病症，包含如实施例36所述的药物组合物、和说明书。实例
[0332]
以下实例仅是本技术的示例，因此不应视为以任何方式限制本技术。以下实例和详细描述是作为说明而并不是作为限制而提供的。实例1.抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体的构建与表达。
[0333]
使用cldn18.2单克隆抗体(mab)和pd-l1单域抗体(sdab)设计一系列cldn18.2/pd-l1双特异性抗体。将pd-l1 sdab分别与cldn18.2 mab的轻链/重链融合。将pd-l1 sdab与cldn18.2 mab的重链或轻链的n末端或c末端经由几种类型的融合用接头进行融合。每个构建体由一条融合多肽链和一条天然多肽链组成，并且将表达每个多肽链的dna序列插入ecori与hindiii限制位点之间的ptt5载体中。每个质粒还包括分泌到生长培养基中的蛋白质的分泌信号序列。将与具有位点突变(s228p和l235e)的igg4 fc部分的n末端融合的pd-l1 sdab用作体外生物测定的对照。表达各种构建体的质粒显示在下表3中。表3.抗cldn18.2/抗pd-l1双特异性抗体及其表达质粒
cldn18h、和pdl1a-g12-cldn18h、cldn18l-g15-pdl1a、cldn18l-g12-pdl1a、cldn18l-g9-pdl1a、cldn18l-e-pdl1a、cldn18l-e-pdl1b、pdl1a-e-cldn18l、pdl1a-g15-cldn18l、pdl1a-g12-cldn18l、cldn18l-ea-pdl1a、cldn18l-e2-pdl1a、cldn18l-e2a-pdl1a、cldn18l-e4-pdl1a、以及cldn18l-e4a-pdl1a。
[0337]
通过将sdab与具有称为igg4pe的位点突变(s228p和l235e)的人igg4 fc部分的n末端连接来构建sdab-fc融合蛋白，生成称为sdab-pdl1a-igg4pe、sdab-pdl1b-igg4pe和sdab-pdl1c-igg4pe的新的fc融合蛋白。实例2.双特异性抗体的表征。a.facs结合测定
[0338]
将在cho-k1细胞上表达的cldn18.2或pd-l1上的双特异性抗体的结合模式用3x连续稀释的抗体绘制，起始浓度为300nm。用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。用graphpad prism v6.02软件绘制原始数据，用四个参数、最佳拟合值程序分析ec
50
。
[0339]
对于pd-l1结合，与sdab-pdl1a-igg4pe、sdab-pdl1b-igg4pe和sdab-pdl1c-igg4pe的对照相比，大多数双特异性构建体显示出对pd-l1抗原相似的亲和力(参见图1、3、4和7)。
[0340]
对于cldn18.2结合，与cldn18.2 mab的重链/轻链的c末端融合的pd-l1 sdab不影响cldn18.2结合。参见图2、5和6。所有这种类型的双特异性构建体(包括cldn18h-e-pdl1a、cldn18h-e-pdl1b、cldn18h-e-pdl1c、cldn18h-g9-pdl1a、cldn18l-e-pdl1a)与亲本抗cldn18.2 mab相比，对cldn18.2抗原具有相似或更高的亲和力。当pd-l1 sdab与抗cldn18.2 mab的重链/轻链的n末端融合时，与抗cldn18.2 mab相比，最终构建体对cldn18.2抗原具有相对较低的亲和力。参见图2、5、6和8。
[0341]
对于cldn18.1结合，抗cldn18.2 mab或双特异性抗体均不与cldn18.1过表达的细胞结合。参见图9、10和11。b.体外生物测定
[0342]
分别通过pd-1/pd-l1阻断生物测定和抗cldn18.2抗体介导的adcc和cdc进行cldn18.2和pd-l1靶应答。1)pd-1/pd-l1阻断生物测定
[0343]
将来自promega的pd-1/pd-l1阻断生物测定系统用于测量旨在阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体和其他生物制剂的效力和稳定性。测定由两种基因工程化细胞系组成：pd-1效应细胞，这些pd-1效应细胞是表达人pd-1的jurkat t细胞和由nfat应答元件(nfat-re)驱动的荧光素酶报告细胞，以及pd-l1 aapc/cho-k1细胞，这些pd-l1 aapc/cho-k1细胞是表达人pd-l1的cho-k1细胞和旨在以非抗原依赖方式激活同源tcr的工程细胞表面蛋白。当两种细胞类型共同培养时，pd-1/pd-l1相互作用抑制tcr信号传导和nfat-re介导的发光。添加阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗pd-1或抗pd-l1抗体释放抑制信号，并导致tcr激活和nfat-re介导的发光。
[0344]
利用泰圣奇(tecentriq)生物类似物作为参考抗体。与sdab-fc对照相比，所有双特异性抗体都显示出相似的pd-l1阻断活性，尽管它们的活性略低于参考抗体泰圣奇生物类似物。参见图12和17。2)cdc分析
[0345]
对双特异性抗体进行cdc测定。培养并收获靶细胞系(cho-k1过表达人密蛋白18.2)，并将该靶细胞系以特定细胞密度接种在96孔板中。相应地将抗体样品添加到板中，并且将板在37℃/5％co2下孵育30min。然后将纯化的正常人血清添加到板中，并且将板再孵育4小时。将板从培养箱中取出，并且收集上清液，并用cell检测套件(目录号g7570，promega)分析。通过pherastar(bmg labtech)捕获发光数据用于细胞活力分析。将cdc测定结果以靶细胞裂解百分比对候选抗体浓度作图。
[0346]
对于双特异性抗体诱导的cdc分析，将imab362生物类似物用作参考抗体。如图13所示，cldn18l-e-pdl1a表现出最高的活性。同时，它还显示出与亲本抗cldn18.2 mab相似的cdc活性。此外，cldn18l-e-pdl1a和pdl1a-e-cldn18l显示出比参考抗体imab362更高的cdc活性。如图16所示，cldn18l-e4-pdl1a显示出最高的活性。同时，具有与抗cldn18.2 mab的重链的c末端融合的pd-l1 sdab的cldn18h-g15-pdl1a、cldn18h-g9-pdl1a和cldn18h-e-pdl1a显示出比亲本mab和其他双特异性抗体更低的活性。3)adcc测定
[0347]
比较了双特异性抗体对抗体依赖性细胞毒性(adcc)的影响。将adcc测定结果以靶细胞裂解百分比对双特异性抗体浓度作图。对于测定程序，培养、收获靶细胞系(cho-k1过表达人密蛋白18.2)，并将该靶细胞系以特定细胞密度接种在96孔板中。将与imab362(佐妥昔单抗(zolbetuximab))的相同氨基酸序列内部(in-house)合成的双特异性抗体样品或阳性对照添加到板中，并且将板在37℃/5％co2下孵育30min。将新鲜分离的人pbmc(外周血单核细胞)用作效应细胞并添加到板中，并且在相同条件下孵育6小时。取出测定板并将其短暂离心。按照制造商的说明(roche)，收集上清液，并将其转移到新的板上用于ldh活性测定。通过flexstation 3捕获吸光度数据，并通过graphpad prism 6.0对其进行分析。
[0348]
对于双特异性抗体诱导的adcc测定，将imab362生物类似物用作参考抗体。如图14、15和18所示，cldn18l-e-pdl1a、pdl1a-e-cldn18l、pdl1a-g15-cldn18h、cldn18l-g15-pdl1a、cldn18l-e4-pdl1a和亲本抗cldn18.2 mab表现出比参考抗体imab362更高的活性。同时，这些双特异性抗体显示出与亲本抗cldn18.2 mab相似的活性。序列表