抗HPVT细胞受体和工程化细胞的制作方法

抗hpv t细胞受体和工程化细胞
1.对优先权的要求
2.本技术要求于2020年2月5日提交的国际申请号pct/cn2020/074366的权益。将前述申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及识别或结合癌症抗原的t细胞受体、工程化细胞和基于细胞的疗法。


背景技术：

4.癌症是由生物学和环境因素(诸如年龄、性别、基因突变、环境暴露(诸如uv辐射)、职业危险因素、致癌物、石棉、放射性物质和病毒感染(例如，hpv、ebv、hbv、hcv、htlv-1和kshv))引起的最广泛的细胞异常之一(margaret e等人,“viruses associated with human cancer,”biochimica et biophysica acta.1782:127
–
150(2008))。特别地，一些癌症(例如，宫颈癌)主要是由病毒(例如，人乳头状瘤病毒，hpv)感染引起的(stanley等人,“hpv:from infection to cancer.”biochemical society transactions:35:第6部分(2007))。
5.尽管诸如化学疗法等治疗取得了进步，但是针对包括hpv相关癌在内的各种癌症治疗的功效相对较差。因此，对于针对癌症的有效疗法存在未满足的需求。


技术实现要素：

6.本公开涉及识别或结合肿瘤抗原人乳头状瘤病毒(hpv)e6的t细胞受体、基因工程化细胞以及用于治疗hpv相关癌症的细胞疗法。
7.在一个方面，本公开涉及t细胞受体(tcr)或其抗原结合片段，所述tcr或其抗原结合片段包含含有可变α(va)区的α链和含有可变β(vb)区的β链。在一些实施方案中，所述va区包含互补决定区1(cdr-1)、互补决定区2(cdr-2)和互补决定区3(cdr-3)；在一些实施方案中，所述va区cdr-1包含与选择的va区cdr-1氨基酸序列相同的氨基酸序列，所述va区cdr-2包含与选择的va区cdr-2氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且所述va区cdr-3包含与选择的va区cdr-3氨基酸序列相同的氨基酸序列；并且在一些实施方案中，所述vb区包含互补决定区1(cdr-1)、互补决定区2(cdr-2)和互补决定区3(cdr-3)；在一些实施方案中，所述vb区cdr-1包含与选择的vb区cdr-1氨基酸序列相同的氨基酸序列，所述vb区cdr-2包含与选择的vb区cdr-2氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且所述vb区cdr-3包含与选择的vb区cdr-3氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述选择的va区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列和所述选择的vb区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列是以下中的一者：
8.(1)所述选择的va区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:5、6和7中列出，并且所述选择的vb区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:8、9和10中列出；
9.(2)所述选择的va区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:27、28和
29中列出，并且所述选择的vb区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:30、31和32中列出；
10.(3)所述选择的va区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:33、34和35中列出，并且所述选择的vb区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:36、37和38中列出；
11.(4)所述选择的va区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:39、40和41中列出，并且所述选择的vb区cdr-1、cdr-2和cdr-3氨基酸序列分别在seq id no:42、43和44中列出。
12.在一些实施方案中，所述va区包含具有分别在seq id no:5、6和7中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3；并且所述vb区包含具有分别在seq id no:8、9和10中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3。
13.在一些实施方案中，所述va区包含在seq id no:1中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vb区包含在seq id no:2中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.在一些实施方案中，所述va区包含具有分别在seq id no:27、28和29中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3；并且所述vb区包含具有分别在seq id no:30、31和32中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3。
15.在一些实施方案中，所述va区包含在seq id no:45中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vb区包含在seq id no:46中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，所述va区包含具有分别在seq id no:33、34和35中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3；并且所述vb区包含具有分别在seq id no:36、37和38中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3。
17.在一些实施方案中，所述va区包含在seq id no:47中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vb区包含在seq id no:48中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
18.在一些实施方案中，所述va区包含具有分别在seq id no:39、40和41中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3；并且所述vb区包含具有分别在seq id no:42、43和44中列出的氨基酸序列的cdr-1、cdr-2和cdr-3。
19.在一些实施方案中，所述va区包含在seq id no:49中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述vb区包含在seq id no:50中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％
或99％序列同一性的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，所述α链包含小鼠α链恒定区，并且所述β链包含小鼠β链恒定区。
21.在一些实施方案中，所述α链包含在seq id no:15中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述β链包含在seq id no:16中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，所述α链包含在seq id no:51中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述β链包含在seq id no:52中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
23.在一些实施方案中，所述α链包含在seq id no:53中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述β链包含在seq id no:54中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
24.在一些实施方案中，所述α链包含在seq id no:55中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述β链包含在seq id no:56中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
25.在一些实施方案中，tcr或其抗原结合片段结合或识别由主要组织相容性复合物(mhc)分子呈递的e6肽表位(seq id no:19)。
26.在一些实施方案中，mhc分子是hla-a2分子。
27.在一些实施方案中，tcr或其抗原结合片段当在t细胞表面上表达时刺激针对靶癌细胞的细胞毒性活性。
28.在一些实施方案中，靶癌细胞包含hpv dna序列或表达e6。
29.在一个方面，本公开涉及t细胞受体(tcr)或其抗原结合片段，所述tcr或其抗原结合片段包含含有可变α(va)区的α链和含有可变β(vb)区的β链；在一些实施方案中，所述va区包含互补决定区1(cdr1)、互补决定区2(cdr2)和互补决定区3(cdr3)，并且所述vb区包含cdr1、cdr2和cdr3；在一些实施方案中，
30.(1)所述va区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:1中的互补决定区1、2和3相同，并且所述vb区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:2中的互补决定区1、2和3相同；
31.(2)所述va区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:1中的互补决定区45、2和3相同，并且所述vb区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:2中的互补决定区1、46和3相同；
32.(3)所述va区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:47中的互补决定区1、2和3相同，并且所述vb区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:48中的互补决定区1、2和3相同；或
33.(4)所述va区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:49中的互补决定区1、2和3相同，并且所述vb区cdr1、cdr2和cdr3分别与seq id no:50中的互补决定区1、2和3相同。
34.在一个方面，本公开涉及载体，所述载体包含编码如本文所述的tcr或其抗原结合片段的核酸。
35.在一些实施方案中，所述载体是表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
36.在一个方面，本公开涉及载体，所述载体包括：a)编码包含人抗e6tcr的α链可变区和α链恒定区的tcrα链的第一核酸序列；和b)编码包含人抗e6 tcr的β链可变区和β链恒定区的tcrβ链的第二核酸序列。
37.在一些实施方案中，所述α链恒定区是人tcrα链恒定区，并且所述β链恒定区是人tcrβ链恒定区。
38.在一些实施方案中，所述α链恒定区是小鼠tcrα链恒定区，并且所述β链恒定区是小鼠tcrβ链恒定区。
39.在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过接头序列连接。在一些实施方案中，所述接头序列是p2a序列。
40.在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含在seq id no:17中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；并且所述第二核酸序列包含在seq id no:18中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含在seq id no:57中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列；所述第二核酸序列包含在seq id no:58中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含在seq id no:59中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；所述第二核酸序列包含在seq id no:60中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含在seq id no:61中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；并且所述第二核酸序列包含在seq id no:62中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。
41.在一些实施方案中，如本文所述的载体还包括编码检查点抑制剂的第三核酸序列。
42.在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体。
43.在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗pd-1抗体scfv或抗ctla4抗体scfv。
44.在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与seq id no:11为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；所述轻链可变结构域包含与seq id no:12为至
少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
45.在一些实施方案中，所述第三核酸序列包含与seq id no:13为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；以及与seq id no:14为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
46.在一些实施方案中，所述载体是表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是pmp71。
47.在一些实施方案中，所述载体包含(1)与seq id no:20为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；(2)与seq id no:63为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；(3)与seq id no:64为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；或(4)与seq id no:65为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
48.在一个方面，本公开涉及包含如本文所述的载体的工程化细胞。
49.在一个方面，本公开涉及包含如本文所述的tcr或其抗原结合片段的工程化细胞。
50.在一些实施方案中，所述tcr或其抗原结合片段与细胞异源。
51.在一些实施方案中，工程化细胞是细胞系。
52.在一些实施方案中，工程化细胞是从受试者(例如人受试者)获得的原代细胞。
53.在一些实施方案中，工程化细胞是t细胞。在一些实施方案中，t细胞是从人受试者中分离的。在一些实施方案中，t细胞是cd8+的。在一些实施方案中，t细胞是cd4+的。
54.在一个方面，本公开涉及用于生产工程化细胞的方法，所述方法包括将如本文所述的载体在体外或离体引入细胞中。
55.在一些实施方案中，载体是病毒载体，并且所述引入通过转导来进行。
56.在一个方面，本公开涉及治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括将如本文所述的工程化细胞施用至患有与hpv相关的疾病或障碍的受试者。
57.在一些实施方案中，与hpv相关的疾病或障碍是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是头颈癌、子宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。
58.在一个方面，本公开涉及治疗受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用(a)工程化t细胞，所述工程化t细胞包含：编码与hpv抗原特异性地结合的tcr或其抗原结合片段的核酸；和(b)检查点抑制剂。
59.在一些实施方案中，所述肿瘤是hpv诱导的肿瘤。
60.在一个方面，本公开涉及tcr或其抗原结合片段，所述tcr或其抗原结合片段与如本文所述的tcr或其抗原结合片段交叉竞争。
61.在一个方面，本公开提供了向患者施用有效量的基因工程化抗癌人t细胞以治疗所述患者的疾病、障碍或病症的方法，其中所述基因工程化抗癌人t细胞表达针对hpv e6抗原的抗肿瘤t细胞受体。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链由seq id no:3的核苷酸序列编码，并且β链由seq id no:4的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链由seq id no:78的核苷酸序列编码，并且β链由seq id no:79的核苷酸序列编
码。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链由seq id no:80的核苷酸序列编码，并且β链由seq id no:81的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链由seq id no:82的核苷酸序列编码，并且β链由seq id no:83的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链具有包含seq id no:1的氨基酸序列的可变α(vα)区，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有包含seq id no:2的氨基酸序列的可变β(vβ)区。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链具有包含seq id no:45的氨基酸序列的可变α(vα)区，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有包含seq id no:46的氨基酸序列的可变β(vβ)区。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链具有包含seq id no:47的氨基酸序列的可变α(vα)区，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有包含seq id no:48的氨基酸序列的可变β(vβ)区。在一些实施方案中，抗肿瘤t细胞受体的α链具有包含seq id no:49的氨基酸序列的可变α(vα)区，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有包含seq id no:50的氨基酸序列的可变β(vβ)区。所述疾病、障碍或病症可以是癌症相关的，所述癌症诸如宫颈癌、头颈癌、口咽癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌和外阴癌。
62.在一个方面，本公开还提供了t细胞受体。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的α链具有可变α(vα)区的序列(seq id no:1)，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有可变β(vβ)区的序列(seq id no:2)。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的α链具有可变α(vα)区的序列(seq id no:45)，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有可变β(vβ)区的序列(seq id no:46)。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的α链具有可变α(vα)区的序列(seq id no:47)，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有可变β(vβ)区的序列(seq id no:48)。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的α链具有可变α(vα)区的序列(seq id no:49)，并且抗肿瘤人t细胞受体的β链具有可变β(vβ)区的序列(seq id no:50)。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的可变α(vα)区与小鼠t细胞受体α链的恒定区融合。在一些情形下，抗肿瘤人t细胞受体的可变β(vβ)区与小鼠t细胞受体β链的恒定区融合。
63.在一个方面，本公开提供了工程化t细胞，所述工程化t细胞包含编码与人乳头状瘤病毒(hpv)抗原e6特异性地结合的基因工程化抗原受体的核酸。
64.在一个方面，本公开还提供了用于患者特异性t细胞疗法的方法，其中将基因进行工程化成患者特异性t细胞并作为治疗剂递送回患者体内。
65.本公开还提供了诊断疾病/病症的方法，其中所述病症可以包括癌症，并且其中可以通过分析由于t细胞受体与来自待诊断患者/哺乳动物的样品之间的接触而形成的复合物来诊断所述疾病，并且其中所述复合物可以通过本领域熟知的任何手段来检测。在一些实施方案中，所述结果可以用于确定细胞疗法是否将是有效的。
66.本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含对人乳头状瘤病毒(hpv)抗原e6具有抗原特异性的工程化t细胞受体(tcr)或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
67.本公开还提供了用于用嵌合基因转染细胞的载体系统，其中所述载体系统包括编码人抗e6 tcr的α链的可变区的核酸序列、编码同一人抗e6tcr的β链的可变区的核酸序列和一个接头序列。
68.如本文所用，术语“约”是指可测量的值，诸如量、持续时间等，并且涵盖指定值的
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或
±
0.1％的变化。
69.如本文所用，术语“hpv抗原”是指源自人乳头状瘤病毒(hpv)的多肽分子。在一些
实施方案中，所述hpv是hpv1、hpv2、hpv3、hpv4、hpv6、hpv10、hpv11、hpv16、hpv18、hpv26、hpv27、hpv28、hpv29、hpv30、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv39、hpv40、hpv41、hpv42、hpv43、hpv45、hpv49、hpv51、hpv52、hpv54、hpv55、hpv56、hpv57、hpv58、hpv59、hpv68、或hpv69。特别地，hpv可以是高风险hpv，例如，hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68或hpv69。在一些实施方案中，hpv多肽分子选自e6。
70.如本文所用，术语“外周血细胞”是指通常在外周血中发现的细胞，包括但不限于嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、t细胞、单核细胞、k细胞、粒细胞和b细胞。
71.如本文所用，术语“基因工程化细胞”或“遗传修饰的细胞”是指在细胞中具有核酸序列的修饰的细胞，包括但不限于在其基因组中具有一个或多个核苷酸的插入、缺失、取代、或修饰的细胞、和具有外源核酸序列(例如载体)的细胞，其中所述外源核酸序列不一定整合到基因组中。
72.如本文所用，术语“癌症”或“癌细胞”是指以不受控制的方式分裂的细胞。此类细胞的实例包括具有以迅速增殖的细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。所述术语意在包括癌性生长(例如肿瘤)、致癌过程、转移性组织、以及恶性转化的细胞、组织或器官，而不管组织病理类型或浸润期。癌细胞可以在血液中形成实体瘤或过多的肿瘤细胞(例如血液癌)。另选地或另外地，其可以包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不管组织病理类型或浸润期。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤)、腺癌和癌，诸如累及肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤，诸如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺非小细胞癌、小肠癌和食管癌。可以通过本文所述的方法治疗的癌症的实例包括例如骨癌、胰腺癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)赘生物、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、和/或t细胞淋巴瘤。
73.如本文所用，术语“hpv相关的癌症”是指与hpv感染相关或由hpv感染引起的癌症。
74.如本文所用，术语“载体”是指可以通过其将多核苷酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞中以便获得所引入的核苷酸序列的所需基因表达的运载体。克隆载体可以包括例如质粒、噬菌体、病毒等。载体的最流行类型是“质粒”，其是指可以将包含目的基因的额外dna区段连接到其中的闭合环状双链dna环。载体的另一种类型是将要运输的核酸构建体连接到病毒基因组中的病毒载体。病毒载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制，或者可以将它们自身整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。在一些实施方案中，载体是病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
75.如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或非人动物。在一些实施方案中，向其施用细胞、细胞群或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如狗、猫、马、啮齿动物、大鼠或小鼠。
76.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于在本发明中使用的方法和材料，也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是说明性的，而不意图进行限制。本文提及的全部出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均全文以引用方式并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
77.根据以下具体实施方式和附图以及根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
78.在附图中展示了示例性实施方案。旨在将本文公开的实施方案和附图视为说明性的而非限制性的。
79.图1是显示pmp71逆转录病毒载体构建体的示意图。p2a编码2a自切割肽；va编码人抗e6 tcr的α链的可变区；vb编码同一人抗e6 tcr的β链的可变区；ca编码小鼠tcrα链的恒定区；cb编码小鼠tcrβ链的恒定区。ψ表示病毒rna上的包装序列。5’ltr和3’ltr是长末端重复序列。
80.图2a显示了tcr在未转导的人原代t细胞中的表达。nt是未转导的对照。在培养48小时之后，通过对小鼠tcrβ链染色来检测重组tcr的表达。使用了活的cd3
+
淋巴细胞门控策略。
81.图2b显示了在用e202构建体转导的人原代t细胞中的e202 tcr表达。在培养48小时之后，通过对小鼠tcrβ链染色来检测重组tcr的表达。使用了活的cd3
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淋巴细胞门控策略。
82.图3a是显示在抗原特异性刺激后未转导的人t细胞的细胞内ifn-γ表达的图。nt是未转导的对照。将未转导的人t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1的效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
83.图3b是显示在抗原特异性刺激后e202 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达的图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
84.图4是显示含有e202 tcr的tcr-t细胞的激活曲线的图。将tcr-t细胞与不同浓度的hpv肽脉冲apc以1:1效应子/靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
85.图5是显示e202 tcr-t细胞对靶细胞的特异性杀伤百分比和e:t比率的关系的图。用cfse对表达hpv e6抗原的靶细胞进行预染色，然后将其与tcr-t细胞以1:2、1:1、3:1和10:1的效应子与靶标比率共培养过夜。通过7-aad染色来测量t细胞对靶细胞的细胞毒性。nt是未转导的对照。
86.图6a是显示pmp71逆转录病毒载体构建体的示意图。p2a编码2a自切割肽；va编码人抗hpv16 e6 tcr的α链的可变区；vb编码同一人抗hpv16 e6 tcr的β链的可变区；ca编码小鼠tcrα链的恒定区；cb编码小鼠tcrβ链的恒定区。ψ表示病毒rna上的包装序列。5’ltr和3’ltr是长末端重复序列。
87.图6b是显示pmp71逆转录病毒载体构建体(e202p03)的示意图。p2a和t2a编码2a自切割肽；va编码人抗hpv16 e6 tcr的α链的可变区；vb编码同一人抗hpv16 e6 tcr的β链的可变区；ca编码小鼠tcrα链的恒定区；cb编码小鼠tcrβ链的恒定区；vh编码免疫检查点抑制剂(ici)的重链的可变区；vl编码免疫检查点抑制剂(ici)的轻链的可变区。vh和vl通过gs接头来连接。ψ表示病毒rna上的包装序列。5’ltr和3’ltr是长末端重复序列。
88.图7a显示了tcr在未转导的人原代t细胞中的表达。nt是未转导的对照。在培养13天之后，通过对小鼠tcrβ链染色来检测重组tcr的表达。使用了活的cd3
+
淋巴细胞门控策略。
89.图7b显示了在用e202构建体转导的人原代t细胞中的e202 tcr表达。在培养13天之后，通过对小鼠tcrβ链染色来检测重组tcr的表达。使用了活的cd3
+
淋巴细胞门控策略。
90.图7c显示了在用e202p03构建体转导的人原代t细胞中的e202p03 tcr表达。在培养13天之后，通过对小鼠tcrβ链染色来检测重组tcr的表达。使用了活的cd3
+
淋巴细胞门控策略。
91.图8a是显示在抗原特异性刺激后未转导的人t细胞的细胞内ifn-γ表达的图。nt是未转导的对照。将未转导的人t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1的效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
92.图8b是显示在抗原特异性刺激后e202 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达的图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
93.图8c是显示在抗原特异性刺激后e202p03 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达的图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
94.图9是显示在细胞培养上清液中抗原特异性刺激后e202和e202p03 tcr-t细胞的ifn-γ表达的直方图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以指定的效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集细胞培养上清液，并测量上清液中的ifn-γ表达。nt是未转导的对照。
95.图10a是显示在抗原特异性刺激后未转导的人t细胞的cd107a表达的图。nt是未转导的对照。将未转导的人t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1的效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定在cd8亚群中的cd107a表达。
96.图10b是显示在抗原特异性刺激后e202 tcr-t细胞的cd107a表达的图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定在cd8亚群中的cd107a表达。
97.图10c是显示在抗原特异性刺激后e202p03 tcr-t细胞的cd107a表达的图。将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术确定在cd8亚群中的cd107a表达。
tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
115.图14i显示了在没有抗原特异性刺激的情况下人cd4+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。
116.图14j显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
117.图14k显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
118.图14l显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
119.图14m显示了在没有抗原特异性刺激的情况下人cd4+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。
120.图14n显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
121.图14o显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
122.图14p显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd4+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
123.图15a显示了在没有抗原特异性刺激的情况下未转导的(ut)人cd8+t细胞的细胞内ifn-γ表达。
124.图15b显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的未转导的(ut)人cd8+t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
125.图15c显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的未转导的(ut)人cd8+t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
126.图15d显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的未转导的(ut)人cd8+t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
127.图15e显示了在没有抗原特异性刺激的情况下人cd8+e203 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。
128.图15f显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e203 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
129.图15g显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e203 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
130.图15h显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e203 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
131.图15i显示了在没有抗原特异性刺激的情况下人cd8+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。
132.图15j显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
133.图15k显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
134.图15l显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e204 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
135.图15m显示了在没有抗原特异性刺激的情况下人cd8+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。
136.图15n显示了与ca ski e6/e7细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
137.图15o显示了与ca ski细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
138.图15p显示了与293t细胞以1:2的效应子与靶细胞比率共培养过夜的人cd8+e205 tcr-t细胞的细胞内ifn-γ表达。通过流式细胞术确定细胞内ifn-γ表达。
139.图16a显示了未转导的(ut)、e203、e204和e205 tcr-t细胞对ca ski e6/e7细胞的绝对杀伤效力。将celltrace
tm cfse标记的ca ski e6/e7细胞和celltrace
tm
紫色标记的293t细胞混合，并与tcr-t细胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效应子与靶细胞比率共培养。添加珠作为流式细胞术分析的参考。
140.图16b显示了未转导的(ut)、e203、e204和e205 tcr-t细胞对ca ski e6/e7细胞的竞争性杀伤效力。将celltrace
tm cfse标记的ca ski e6/e7细胞和celltrace
tm
紫色标记的293t细胞混合，并与tcr-t细胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效应子与靶细胞比率共培养。
141.图17a显示了含有e203 tcr的cd8+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
142.图17b显示了含有e203 tcr的cd4+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
143.图18a显示了含有e204 tcr的cd8+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
144.图18b显示了含有e204 tcr的cd4+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
145.图19a显示了含有e205 tcr的cd8+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
146.图19b显示了含有e205 tcr的cd4+tcr-t细胞的激活曲线。测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
147.图20是显示e202、e203、e204和e205 tcr的序列的表。cdr1α、cdr2α和cdr3α分别是tcrα链可变结构域的cdr1、cdr2和cdr3。cdr1β、cdr2β和cdr3β分别是tcrβ链可变结构域的cdr1、cdr2和cdr3。tra_vj是编码tcrα链可变结构域的重新排列的v和j区段。trb_vdj是编码tcrβ链可变结构域的重新排列的v、d和j区段。
148.图21提供了如本公开所描述的几个序列。
具体实施方式
149.人乳头状瘤病毒(hpv)是小的(大约8000对碱基)双链dna病毒，其感染鳞状上皮并诱导增生性病变，诸如皮肤疣(xavier,“natural history and epidemiology of hpv infection and cervical cancer”.gynecologic oncology 110(2008)s4
–
s7；hausen等
人,"human papilloma viruses."annu.rev.microbial.1994.48；427-47)。hpv具有良好保守的遗传组织，并且所有潜在的开放阅读框(orf)都位于一条dna链中，所述dna链的阅读框被指定为早期(e)或晚期(l)基因。早期基因(e1-e8)在感染后立即被激活，而晚期基因则编码在上皮颗粒层中表达的结构蛋白。早期基因的基因产物参与控制病毒dna的复制和表达(mannarini等人.“human papilloma virus(hpv)in head and neck region:review of literature”.acta otorhinolaryngol ital 2009；29:119-126)。
150.嵌合抗原受体(car)t细胞是具有融合了细胞内t细胞信号传导和共刺激结构域的细胞外抗原识别结构域的工程化细胞。car能以独立于主要组织相容性类别(mhc)的方式直接地和选择性地识别细胞表面肿瘤相关抗原(taa)。尽管已记录car t细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中取得了成功，但在实体瘤中仅观察到适度的反应。这可以部分归因于在实体瘤中免疫抑制性微环境的建立。这种环境涉及由t细胞中的与其在肿瘤内的相关配体反应的抑制性受体(ir)的表达增加介导的几种内在抑制途径的上调(ping等人,"t-cell receptor-engineered t cells for cancer treatment:current status and future directions."protein&cell 9.3(2018):254-266.)。
151.过继细胞转移(act)是已在治疗血液系统恶性肿瘤和恶性黑色素瘤方面表现出显著成功的一种癌症免疫疗法形式。act的一种特别有效的形式(其使用表达嵌合抗原受体(car)的基因修饰的t细胞来特异性地靶向肿瘤相关抗原(taa)，诸如cd19和gd2)已经在治疗诸如b细胞恶性肿瘤和神经母细胞瘤等疾病的临床试验中显示出令人鼓舞的结果(simon等人,"car-t cell therapy in melanoma:a future success story？."experimental dermatology 27.12(2018):1315-1321)。多年来，使用经修饰的tcr来治疗不同疾病已实现显著的成果，并且已成为许多研究的重点领域。
152.本公开提供了可以用于细胞疗法的t细胞受体(tcr)工程化t细胞。工程化t细胞受体能够识别在细胞受体上的表面抗原，其原本不被正常的t细胞识别。工程化t细胞可以用于针对多种靶标，诸如表达适当抗原的癌细胞。
153.理论上，t细胞受体可以对任何hpv抗原具有抗原特异性。hpv中的e6和e7癌蛋白对于细胞的恶性转化是必需的。hpv e7蛋白主要通过灭活视网膜母细胞瘤蛋白来促进癌症的发展，从而导致组成型癌细胞周期激活。在一些实施方案中，经修饰的t细胞能够以mhc依赖性方式识别hpv的表位(例如，hpv的高风险血清型(诸如hpv-16)的hla-a02:01-限制性表位)。在这种情况下，hpv抗原阳性肿瘤细胞可以被工程化tcr-t细胞杀死。
154.t细胞受体和结合分子
155.t细胞是通常在胸腺中发育并在免疫应答中发挥主要作用的一种淋巴细胞类型。其在“适应性免疫应答”中起重要作用。通过在细胞表面上t细胞受体的存在，可以将t细胞与其他淋巴细胞区分开。分化的t细胞在控制免疫应答中具有重要作用。cd8+t细胞(也称为“杀伤细胞”)具有细胞毒性。一旦它们识别出靶细胞，它们便能够直接杀死靶细胞(例如，病毒感染的细胞或癌细胞)。cd8+t细胞还可以产生细胞因子并募集其他细胞(例如，巨噬细胞和自然杀伤(nk)细胞)以启动免疫应答。cd4+t细胞(也称为“辅助细胞”)可以例如通过促进b细胞成熟为浆细胞和记忆b细胞以及激活细胞毒性t细胞和巨噬细胞而间接地杀死靶细胞。当辅助t细胞被mhc ii类分子与肽抗原一起呈递时，它们变成激活的，所述mhc ii类分子在抗原呈递细胞(apc)的表面上表达。一旦激活，它们便迅速地分裂并分泌调节或协助免
疫应答的细胞因子。调节性t细胞对于耐受性很重要，从而阻止或抑制自身免疫应答。调节性t细胞的主要作用是在免疫应答结束时关闭t细胞介导的免疫力，并抑制逃避在胸腺中的负选择过程的自身反应性t细胞。
156.t细胞在癌症免疫力方面起重要作用，其中来自癌细胞的抗原被吸收并呈递到被称为抗原呈递细胞(apc)的特殊免疫细胞的细胞表面上，从而使其他免疫细胞可以识别所关注的抗原。在淋巴结中，apc激活t细胞并激活它们以识别肿瘤细胞。然后，激活的t细胞可以穿过血管到达肿瘤，使其浸润，识别癌细胞并杀死它们。
157.t细胞的激活需要t细胞受体。“t细胞受体”或“tcr”是含有可变a(或α)链和b(或β)链(分别称为tcr和tcr)或可变g(或γ)链和d(或δ)链(也分别称为tcr和tcr)或其抗原结合部分并且能够特异性地结合抗原(例如，与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽抗原或肽表位)的一种分子。
158.本公开提供了t细胞受体(tcr)或其抗原结合片段、以及衍生自tcr的结合分子。在一些实施方案中，tcr呈ab形式。以和形式存在的tcr通常在结构上相似，但是表达它们的t细胞可能具有独特的解剖位置或功能。通常，tcr发现于t细胞(或t淋巴细胞)的表面，在此处其通常负责识别抗原(诸如与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽)。
159.在一些实施方案中，tcr是完整或全长tcr，诸如含有a链和b链的tcr。在一些实施方案中，tcr是小于全长tcr但与结合在mhc分子中的特定肽结合(诸如与mhc-肽复合物结合)的抗原结合部分。在一些情况下，tcr的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整tcr的结构性结构域的一部分，但仍能够结合完整tcr所结合的肽表位(诸如mhc-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有tcr的可变结构域(诸如tcr的可变a(va或vα)链和可变b(vb或vβ)链)、或其足以形成用于与特定的mhc-肽复合物结合的结合位点的抗原结合片段。
160.tcr的可变结构域含有互补决定区(cdr)，其通常是抗原识别以及肽、mhc和/或mhc-肽复合物的结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，tcr的cdr或其组合形成给定tcr分子的全部或基本上全部抗原结合位点。在tcr链的可变区内的各种cdr通常被框架区(fr)隔开，所述框架区与cdr相比在tcr分子之间通常显示出较小的变异性。在一些实施方案中，cdr3是负责抗原结合或特异性的主要cdr，或者在给定tcr可变区上的三个cdr中对于抗原识别和/或对于与肽-mhc复合物的加工过的肽部分相互作用而言是最重要的。在一些情境下，α链的cdr1可以与某些抗原肽的n末端部分相互作用。在一些情况下，β链的cdr1可以与肽的c末端部分相互作用。在一些情境下，cdr2最有力地促进了与mhc-肽复合物的mhc部分的相互作用或对mhc-肽复合物的mhc部分的识别，或者是负责与mhc-肽复合物的mhc部分相互作用或识别mhc-肽复合物的mhc部分的主要cdr。
161.tcr的a链和/或b链还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾巴。在一些方面，tcr的每条链(例如α或β)可以拥有一个n末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在c末端的短细胞质尾巴。在一些实施方案中，tcr例如经由细胞质尾巴与参与介导信号转导的cd3复合物的不变蛋白质相关。在一些情况下，所述结构允许tcr与其他分子如cd3及其亚基缔合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的tcr可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与cd3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。cd3信号传导亚基(例如cd3γ、cd3δ、cd3e和cd3z链)的细胞内尾巴含有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam，并且通常参与tcr复合物的信号传导能力。
162.结构域或区域的确切位点可以根据用于描述特定结构域的特定结构或同源性建模或其他特征而有所不同。应当理解，提及氨基酸(包括用于描述tcr的结构域组织的以seq id no列出的特定序列)是出于说明性目的，并不意味着限制所提供的实施方案的范围。在一些情况下，特定结构域(例如可变或恒定)可以是更长或更短的几个氨基酸(诸如一个、两个、三个或四个)。在一些方面，tcr的残基是已知的或可以根据国际免疫遗传学信息系统(international immunogenetics information system，imgt)编号系统来鉴定(参见例如www.imgt.org；lefranc等人."imgt unique numbering for immunoglobulin and t cell receptor variable domains and ig superfamily v-like domains."developmental&comparative immunology 27.1(2003):55-77)。tcr的结构和变化是本领域已知的，并且描述于例如wo 2019/195486中，将所述专利全文以引用方式并入本文。
163.在一些实施方案中，tcr的a链和b链各自还含有恒定结构域。在一些实施方案中，a链恒定结构域(ca)和b链恒定结构域(cb)单独地是哺乳动物恒定结构域，诸如是人恒定结构域或非人恒定结构域(例如，小鼠恒定结构域)。在一些实施方案中，恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的tcr的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有cdr。
164.在一些方面，如本文所述的tcr可以含有人恒定区，诸如含有人ca区的α链和含有人cb区的β链。在一些实施方案中，tcr是完全人的。在一些实施方案中，tcr的表达和/或活性，诸如当在人细胞(例如人t细胞，诸如原代人t细胞)中表达时，不受或基本上不受内源性人tcr的影响。
165.在一些实施方案中，与在相似的人细胞(但其中内源性tcr的表达已经被降低或被消除)中的相同tcr的表达水平、功能活性和/或抗肿瘤活性相比，当工程化tcr被含有或表达内源性人tcr的人细胞(诸如人t细胞)表达时，所述工程化tcr在细胞表面上以相似或改善的水平表达，表现出相似或更高的功能活性(例如，细胞溶解活性)和/或表现出相似或更高的抗肿瘤活性。在一些实例中，当在人t细胞中表达时，如本文所述的工程化tcr在细胞表面上以如下的水平表达，所述水平为当在相似的人t细胞(但其中内源性tcr的表达已经被降低或被消除)中表达时的相同tcr的表达水平的至少或至少约80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％。
166.在一些实施方案中，ca结构域和cb结构域中的每一者都是人的。在一些实施方案中，ca由trac基因(imgt命名法)编码或为其变体。在一些实施方案中，ca的变体含有至少一个非天然半胱氨酸的替代。
167.在一些实施方案中，tcr可以是诸如通过一个或多个二硫键连接的两条链a和b的异二聚体。在一些实施方案中，tcr的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接tcr的两条链。在一些实施方案中，tcr可以在a链和b链的每一者中具有另外的半胱氨酸残基，使得tcr在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定结构域和可变结构域中的每一者都含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
168.在一些实施方案中，tcr包含cdr、va和/或vb以及如本文所述的恒定区序列。
169.在一些实施方案中，tcr是二聚体tcr(dtcr)。在一些实施方案中，dtcr含有其中与所提供的tcr a链可变区序列对应的序列融合至与tcr a链恒定区细胞外序列对应的序列的n末端的第一多肽、以及其中与所提供的tcr b链可变区序列对应的序列融合至与tcr b
链恒定区细胞外序列对应的序列的n末端的第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键连接。
170.在一些实施方案中，tcr可以是细胞结合的或呈可溶的形式。在一些实施方案中，tcr呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
171.在一些实施方案中，tcr是单链tcr(sctcr)。sctcr是含有能够与mhc-肽复合物结合的a链和b链的一条单氨基酸链。通常，可以使用本领域技术人员已知的方法来产生sctcr。这些方法描述于例如wo 96/13593、wo 96/18105、w099/18129、wo 04/033685、w02006/037960、wo2011/044186；wo 2019/195486；美国专利号7,569,664中；将所述专利中每一者全文以引用方式并入本文。
172.tcr、其抗原结合片段和tcr衍生的结合分子可以结合或识别与所关注的抗原(例如，癌症抗原)相关的肽表位。在一些实施方案中，抗原可以是在癌细胞和/或感染病毒(例如hpv)的细胞的表面上表达的肽表位。在一些实施方案中，在mhc分子的背景下呈递抗原。此类结合分子包括例如t细胞受体(tcr)及其抗原结合片段、抗体及其抗原结合片段、和tcr样car。它们表现出结合或识别此类肽表位的抗原特异性。在一些方面，表达所提供的结合分子(例如tcr或抗原结合片段)的工程化细胞对表达肽表位的靶细胞(诸如癌细胞或感染hpv的细胞)表现出细胞毒性活性。
173.在一些方面，tcr、其抗原结合片段和tcr衍生的结合分子识别或结合在mhc分子(诸如mhc i类分子或mhc ii类分子)的背景下的表位。mhc i类分子或mhc ii类分子两者都是人白细胞抗原(hla)。它们扮演着适应性免疫系统的重要组分。hla表达受位于6号染色体上的基因的控制。其编码专门向t细胞上的t细胞受体呈递抗原肽的细胞表面分子。
174.在一些实施方案中，tcr、其抗原结合片段和tcr衍生的结合分子识别或结合在mhc i类分子的背景下的表位。mhc i类分子是人白细胞抗原(hla)-a2分子，包括其任何一种或多种亚型，例如hla-a*020l、*0202、*0203、*0206或*0207。人白细胞抗原a2(hla-a2)是最常见的人血清型之一。在一些情况下，不同群体之间亚型的频率可能有所不同。例如，hla-a2阳性的白种人群中超过95％是hla-a*020l，然而据报道在中国人群中，hla-a*020l的频率为大约23％、hla-a*0207的频率为45％，hla-a*0206的频率为8％、并且hla-a*0203的频率为23％。在一些实施方案中，mhc分子是hla-a*020l。在一些实施方案中，本公开提供了结合hpv-eb6/hla-a2复合物的tcr或其抗原结合片段。
175.在一些实施方案中，结合分子(例如tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子)是分离的或纯化的，或者是重组的。在一些方面，结合分子(例如tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子)是完全人的。在一些实施方案中，结合分子是单克隆的。在一些方面，结合分子是单链。在其他实施方案中，结合分子含有两条链。在一些实施方案中，结合分子(例如tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子)在细胞表面上表达。
176.tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以具有va和vb、或与va相似的区域和与vb相似的区域。在一些实施方案中，va区包含在seq id no:1、45、47、49中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，vb区包含在seq id no:2、46、48、50中任一者中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，va
区包含一个或多个如本文所述的va cdr序列。在一些实施方案中，vb区包含一个或多个如本文所述的vb cdr序列。
177.在一些实施方案中，tcr、tcr衍生的结合分子或其抗原结合片段，包含含有可变α(va)区的α链和含有可变β(vb)区的β链，其中所述va区可以具有互补决定区(cdr)1、2、3，其中所述cdr1区包含或由与选择的va cdr1氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，所述cdr2区包含或由与选择的va cdr2氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，并且所述cdr3区包含或由与选择的va cdr3氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，并且可变β(vb)区包含cdr 1、2、3，其中所述cdr1区包含或由与选择的vb cdr1氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，所述cdr2区包含或由与选择的vb cdr2氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，并且所述cdr3区包含或由与选择的vb cdr3氨基酸序列为至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。所述选择的va cdr 1、2、3氨基酸序列以及所述选择的vb cdr 1、2、3氨基酸序列显示在图20中。
178.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以含有可变区(例如，va)，所述可变区(例如，va)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:5；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:6；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:7的cdr中的一者、两者或三者。
179.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以包含可变区(例如，vb)，所述可变区(例如，vb)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:8；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:9；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:10的cdr中的一者、两者或三者。
180.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以含有可变区(例如，va)，所述可变区(例如，va)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:27；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:28；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:29的cdr中的一者、两者或三者。
181.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以包含可变区(例如，vb)，所述可变区(例如，vb)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:30；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:31；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:32的cdr中的一者、两者或三者。
182.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以含有可变区(例如，va)，所述可变区(例如，va)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:33；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:34；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:35的cdr中的一者、两者或三者。
183.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以包含可变区(例如，vb)，所述可变区(例如，vb)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:36；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:37；
具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:38的cdr中的一者、两者或三者。
184.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以含有可变区(例如，va)，所述可变区(例如，va)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:39；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:40；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:41的cdr中的一者、两者或三者。
185.在一些实施方案中，本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以包含可变区(例如，vb)，所述可变区(例如，vb)含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:42；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:43；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的seq id no:44的cdr中的一者、两者或三者。
186.本公开还提供了如本文所述的tcr a(α)和/或b(β)链。在一些实施方案中，所述a链包含在seq id no:15、51、53、55中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述b链包含在seq id no:16、52、54、56中列出的氨基酸序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述a链包含一个或多个如本文所述的va cdr序列。在一些实施方案中，所述b链包含一个或多个如本文所述的vb cdr序列。
187.在一些实施方案中，tcr可能是诸如通过一个或多个二硫键连接的两条链a和b的异二聚体。在一些实施方案中，tcr的恒定结构域可能含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接tcr的两条链。在一些实施方案中，tcr可能在a链和b链的每一者中具有另外的半胱氨酸残基，使得tcr在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定结构域和可变结构域中的每一者都含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
188.在一些实施方案中，天然二硫键不存在。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸(例如在a链和b链的恒定结构域中)被取代为另一种残基，诸如取代为丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过将在α链和β链上(诸如在a链和b链的恒定结构域中)的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。tcr a链和b链中相对的半胱氨酸提供了一个二硫键，所述二硫键将经取代的tcr的tcr a链和b链的恒定区彼此连接并且在包含其中存在天然二硫键的未经取代的恒定区(诸如未经取代的天然人恒定区或未经取代的天然小鼠恒定区)的tcr中不存在。在一些实施方案中，在重组tcr中非天然半胱氨酸残基的存在(例如导致一个或多个非天然二硫键)可能有利于在引入其的细胞中产生所需的重组tcr，而不是含有天然tcr链的错配的tcr对的表达。
189.在一些实施方案中，编码α链的核酸和编码β链的核酸可以通过接头(诸如本文其他地方所描述的任何接头)连接。
190.本公开还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含tcr a链可变区、tcr b链可变区、免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区。可变区包含如图20所示的cdr。当多肽与对应的多肽(例如，对应的a链可变区或对应的b链可变区)配对时，所述配对的多肽与所关注的抗原(例如，hpv e6)结合。
191.在一些实施方案中，通过与所关注的抗原结合，tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以激活t细胞(例如，通过激活tcr信号传导途径)。在一些实施方案中，激活可以上调免疫应答，增加细胞因子(例如ifnγ)和/或cd107a的表达，促进t细胞增殖和t细胞介导的杀伤。
192.在一些实施方案中，如本文所述的tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以使t细胞的免疫应答、活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些实施方案中，当存在所关注的抗原时，tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子可以增加ifn-γ的血清浓度。在一些实施方案中，激活可以诱导ifn-γ的血清浓度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施方案中，激活可以诱导对靶细胞的特异性杀伤增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些实施方案中，使用本文所述的方法，通过对靶细胞(例如用hpv肽脉冲的apc)的绝对或竞争性杀伤效力来确定对靶细胞的特异性杀伤。
193.在一些方面，提供的重组tcr包括至少部分地独立于cd8的tcr。在一些方面，提供的重组tcr包括至少部分地依赖于cd8的tcr。
194.在一些实施方案中，如本文所述的tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子特异性地结合hpv e6表位。在一些实施方案中，表位具有seq id no:19的序列。在一些实施方案中，表位具有hpv e6(seq id no:75)的氨基酸29-38的序列。可以从动力学速率常数的商(kd＝k
解离
/k
缔合
)推导结合亲和力。在一些实施方案中，kd为小于1x10-6
m、小于1x10-7
m、小于1x10-8
m、小于1x10-9
m或小于1x10-10
m。在一些实施方案中，kd为小于50nm、30nm、20nm、15nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm。在一些实施方案中，kd为大于1x10-7
m、大于1x10-8
m、大于1x10-9
m、大于1x10-10
m、大于1x10-11
m或大于1x10-12
m。用于测量结合分子对抗原的亲和力的一般技术包括例如elisa、ria和表面等离振子共振(spr)。
195.在一些实施方案中，表达如本文所述的tcr、其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子的t细胞特异性地结合hpv肽脉冲的apc。在一些实施方案中，将t细胞和apc以1:1的效应子与靶细胞比率共培养。在一些实施方案中，可以通过测量细胞内ifn-γ表达来确定ec50。在一些实施方案中，在cd4+t细胞群体中确定ec50。在一些实施方案中，在cd8+t细胞群体中确定ec50。在一些实施方案中，ec50为小于50ng/ml、小于45ng/ml、小于40ng/ml、小于35ng/ml、小于30ng/ml、小于25ng/ml、小于20ng/ml、小于15ng/ml、小于10ng/ml、小于5ng/ml、小于4ng/ml、小于3ng/ml、小于2ng/ml、或小于1ng/ml。
196.在一些实施方案中，tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子具有相对高的表达效率。例如，在相同条件下，本文所述的tcr或其抗原结合片段或tcr衍生的结合分子的表达效率可以比参考分子(例如，内源性tcr)高至少10％、20％、30％、40％、50％或100％。
197.在一些实施方案中，结合分子(例如tcr)不表现出交叉反应性或脱靶结合，诸如不期望的脱靶结合，例如与健康或正常组织或细胞中存在的抗原的脱靶结合。
198.在一些实施方案中，va区的cdr由来自人trav基因区段和人traj基因区段的序列编码。在一些实施方案中，trav基因区段是trav38-2/dv8(例如，trav38-2/dv8*01)、trav4(例如，trav4*01)或trav27(trav27*01)。在一些实施方案中，traj基因区段是traj18(例如，traj18*01)、traj12(例如，traj12*01)、traj17(例如，traj17*01)、或traj31(例如，
traj31*01)。在一些实施方案中，vb区的cdr由来自人trbv基因区段、人trbd基因区段和人trbj基因区段的序列编码。在一些实施方案中，trbv基因区段是trbv12-4(例如，trbv12-4*01)或trbv29-1(例如，trbv29-1*01)。在一些实施方案中，trbd基因区段是trbd2(例如，trbd2*02)。在一些实施方案中，trbj基因区段是trbj1-1(例如，trbj1-1*01)。
199.在一些实施方案中，tcr的va区的cdr由来自人trav38-2/dv8(例如，trav38-2/dv8*01)基因区段和人traj18(例如，traj18*01)基因区段的序列编码。在一些实施方案中，tcr的vb区的cdr由来自人trbv28(例如，trav28*01)基因区段、人trbd1(例如，trbd1*01)基因区段、和人trbj1-1(例如，traj1-1*01)基因片段。
200.在一些实施方案中，tcr的va区的cdr由来自人trav4(例如，trav4*01)基因区段和人traj12(例如，traj12*01)基因区段的序列编码。在一些实施方案中，tcr的vb区的cdr由来自人trbv12-4(例如，trav12-4*01)基因区段、人trbd2(例如，trbd2*02)基因区段、和人trbj1-1(例如，traj1-1*01)基因区段的序列编码。
201.在一些实施方案中，tcr的va区的cdr由来自人trav4(例如，trav4*01)基因区段和人traj17(例如，traj17*01)基因区段的序列编码。在一些实施方案中，tcr的vb区的cdr由来自人trbv12-4(例如，trav12-4*01)基因区段、人trbd2(例如，trbd2*02)基因区段、和人trbj1-1(例如，traj1-1*01)基因区段的序列编码。
202.在一些实施方案中，tcr的va区的cdr由来自人trav27(例如，trav27*01)基因区段和人traj31(例如，traj31*01)基因区段的序列编码。在一些实施方案中，tcr的vb区的cdr由来自人trbv29-1(例如，trav29-1*01)基因区段、人trbd2(例如，trbd2*02)基因区段、和人trbj1-1(例如，traj1-1*01)基因区段的序列编码。
203.hpv感染和癌症
204.人乳头状瘤病毒(hpv)感染是人类最常见的性传播病毒感染类型之一。在大多数情况下，hpv感染的症状温和并且会自然消退；然而，长期感染可能导致生殖器疣和癌症。与hpv相关的已知癌症类型包括宫颈癌、头颈癌、口咽癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌和外阴癌。
205.hpv属于由小型无包膜的脱氧核糖核酸(dna)病毒组成的乳头状瘤病毒科(papillomaviridae)。hpv基因组由双链dna组成，并且编码六个早期蛋白(e1、e2、e4、e5、e6和e7)和两个晚期蛋白(l1和l2)的dna序列。e1和e2蛋白是病毒复制和翻译所需的早期病毒蛋白，e2也调节e6和e7的表达，e4和e5参与病毒组装和生长刺激，然而晚期蛋白l1和l2是次要和主要的衣壳蛋白。hpv有超过100种病毒株，并且基于它们的序列，它们可以被分为α、β、γ、δ和μ。感染子宫颈和口咽的大多数乳头状瘤病毒属于甲病毒属。此外，取决于其致癌潜力，这些病毒可以被分为高风险和低风险hpv类型。其中，hpv 16被认为具有最高的致癌能力。
206.hpv的e6和e7基因产物促进了癌症的发病机理。hpv病毒整合到细胞核内的宿主dna中，并且从而使癌蛋白e6和e7的表达失调。e6诱导p53降解，从而导致p53活性丧失。其降解通过在p53、e6和e6ap之间形成复合物来实现(bernard等人"proteasomal degradation of p53 by human papillomavirus e6 oncoprotein relies on the structural integrity of p53 core domain."plos one 6.10(2011):e25981)。在生理状态下，p53的功能是将细胞阻滞在细胞周期的g1期以修复宿主dna，并且在严重dna损伤的条件下，p53还可以诱导细胞凋亡。除了抑制p53外，e7还与某些细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂结合，从
而导致细胞周期控制进一步丧失。
207.hpv通常感染具有增殖能力的鳞状上皮细胞，并且在创伤或擦伤期间也可进入基底细胞。在基底细胞中，hpv感染诱导协助病毒复制的病毒基因表达。
208.尽管hpv最普遍是通过性传播的，但已经知道会发生通过污染物的非性传播和偶发性传播。可能促进hpv感染的风险因素可能是过早开始性活动、多个性伴侣以及口服避孕药的使用。此外，已经报道，低社会经济地位和吸烟习惯会增加获得感染的风险。尽管在大多数情况下，感染是亚临床的，并且可以通过免疫系统清除，但是持续性感染与肿瘤发生有关联。
209.检测hpv感染的各种方法是本领域已知的。可以通过靶标扩增、信号放大和探针扩增来检测hpv感染。靶标扩增是基于靶标基因序列中hpv dna片段的重复。靶标扩增技术包括病毒基因(例如，衣壳l1基因)的聚合酶链反应(pcr)、amplicor人乳头状瘤病毒测试、线性阵列人乳头状瘤病毒基因分型测试、乳头检查、实时聚合酶链反应、和aptima人乳头状瘤病毒测定。信号放大技术利用dna技术或杂交捕获将dna信号增加到可检测的水平。这些包括杂交捕获、care人乳头状瘤病毒测试以及cervista(一种可以检测14种高风险hpv类型的fda批准的基因分型测试)。探针扩增方法利用可以与指定的hpv dna序列杂交的标记的分子探针。
210.hpv和癌症之间的关系以及各种hpv检测方法在以下文献中有进一步描述：bansal等人,“human papillomavirus-associated cancers:a growing global problem,”international journal of applied and basic medical research6.2(2016):84；brianti等人,“review of hpv-related diseases and cancers,”new microbiol 40.2(2017):80-85；chan等人,“human papillomavirus infection and cervical cancer:epidemiology,screening,and vaccination—review of current perspectives,”journal of oncology 2019(2019)；将所述文献中每一者全文以引用方式并入本文。
211.在一些方面，本公开提供了预防或降低处于hpv感染风险中的受试者的hpv感染和hpv相关癌症的风险的方法。在一些方面，本公开还提供了预防或降低在表现出hpv感染的受试者中发展出hpv相关癌症的风险的方法。
212.在一些实施方案中，tcr、其抗原结合片段和tcr衍生的结合分子可以结合由hpv编码的抗原。除了其他变体以外，hpv亚型可以选自hpv1、hpv2、hpv3、hpv4、hpv6、hpv10、hpv11、hpv16、hpv18、hpv26、hpv27、hpv28、hpv29、hpv30、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv39、hpv40、hpv41、hpv42、hpv43、hpv45、hpv49、hpv51、hpv52、hpv54、hpv55、hpv56、hpv57、hpv58、hpv59、hpv68和hpv69。在一些实施方案中，被结合分子靶向的hpv的亚型选自至少一种高风险hpv：例如，hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68和hpv69。
213.在一些实施方案中，hpv抗原包括但不限于e1、e2、e3、e4、e6、e7、l1和l2蛋白。在一些实施方案中，抗原是e6抗原。在又另一个实施方案中，抗原是e7抗原。在一些实施方案中，抗原是hpv16 e6抗原。在一些实施方案中，识别的表位是e6抗原肽，并且具有seq id no:19的序列。
214.工程化细胞
215.本公开提供了工程化细胞(例如，t细胞)，其包含如本文所述的tcr或其抗原结合
片段、或其他类似的抗原结合分子。这些工程化细胞可以用于治疗如本文所述的各种障碍或疾病(例如，病毒感染、癌症、病毒诱导的障碍)。
216.在各种实施方案中，被工程化的细胞可以从例如人和非人动物中获得。在各种实施方案中，被工程化的细胞可以从细菌、真菌、人、大鼠、小鼠、兔、猴、猪或任何其他物种获得。优选地，所述细胞来自人、大鼠或小鼠。更优选地，所述细胞获自人。在各种实施方案中，被工程化的细胞是血细胞。优选地，所述细胞是白细胞(例如t细胞)、淋巴细胞或任何其他合适的血细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞是外周血细胞。在一些实施方案中，所述细胞是t细胞、b细胞或nk细胞。
217.在一些实施方案中，所述细胞是t细胞。在一些实施方案中，t细胞可以表达识别靶细胞表面上的特异性抗原部分的细胞表面受体。细胞表面受体可以是野生型或重组t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)或能够识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其他表面受体。t细胞可以通过本领域已知的各种方法获得，例如，通过从患者中分离的t细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞)的体外培养获得。可以通过用病毒载体转导t细胞(例如，从患者外周血中分离的)来获得tcr基因修饰的t细胞。在一些实施方案中，t细胞是tcr基因修饰的t细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd4+t细胞、cd8+t细胞或调节性t细胞。在一些实施方案中，t细胞是1型t辅助细胞和2型t辅助细胞。在一些实施方案中，表达此受体的t细胞是αβ-t细胞。在替代性实施方案中，表达此受体的t细胞是γδ-t细胞。
218.在一些实施方案中，所述细胞是nk细胞。在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或来源的生物样品)中分离用于引入结合分子(例如tcr)的细胞。在一些实施方案中，从其分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法、或将向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如针对其分离、处理细胞和/或对细胞进行工程化的过继细胞疗法)的人。
219.在一些实施方案中，所述细胞是干细胞，诸如多潜能和多能干细胞，包括诱导的多能干细胞(ipsc)。所述细胞可以是原代细胞，诸如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方案中，将干细胞与另外的分化因子一起培养以获得所需的细胞类型(例如t细胞)。
220.可以从适当的分离方法中获得不同的细胞类型。所述分离方法包括基于一种或多种特定分子(诸如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记、或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用基于此类标记的任何已知的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括例如基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平，通过与特异性地结合此类标记的抗体或结合伴侣一起孵育，随后通常是洗涤步骤和将已经结合抗体或结合伴侣的细胞从未结合抗体或结合伴侣的细胞分开而分离细胞和细胞群。
221.此类分离步骤可以是基于阳性选择，其中已经结合试剂的细胞被保留以供进一步使用，和/或基于阴性选择，其中未结合抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两个级分均被保留供进一步使用。在一些方面，在没有可用的抗体特异性地鉴定异源群体中的细胞类型，使得最好基于由除所需群体以外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可能特别有用。
222.还提供了用于表达结合分子并用于生产表达此类结合分子的基因工程化细胞的方法、核酸、组合物和试剂盒。基因工程化通常涉及诸如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码治疗分子(例如tcr、car，例如tcr样car、多肽、融合蛋白)的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，通过以下方式来实现基因转移：首先刺激细胞，诸如通过将其与诱导反应(诸如增殖、存活和/或激活，例如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，随后转导激活的细胞并在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
223.在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(诸如，例如源自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体)，将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(诸如γ-逆转录病毒载体)，将重组核酸转移到t细胞中。在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增生性肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)或脾病灶形成病毒(sffv)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括衍生自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干个物种的宿主细胞。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到t细胞中。在一些实施方案中，重组核酸通过转座转移到t细胞中。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击和磷酸锶dna共沉淀。例如在wo2019195486中描述了这些方法中的许多，将所述专利全文以引用方式并入本文。
224.在一些方面，人源化和/或完全人源重组tcr的开发提出了技术挑战。例如，在一些方面，人源化和/或完全人源
225.重组tcr受体当被工程化为人t细胞时可以与内源性tcr复合物竞争和/或可以与内源性tcra链和/或tcrb链形成错误配对，这在某些方面可能降低重组tcr信号传导、活性和/或表达，并最终导致工程化细胞的活性降低。可以对工程化细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，工程化细胞可以包含t细胞受体α恒定(trac)基因和/或t细胞受体β恒定(trbc)基因的遗传破坏。在一些实施方案中，trbc基因是t细胞受体β恒定1(trbcj)或t细胞受体β恒定2(trbc2)基因中的一者或两者。在一些实施方案中，工程化细胞不表达内源性tcr a链和/或trc b链。在一些其他方面，使用非人恒定结构域，例如啮齿动物(例如小鼠)恒定结构域。使用非人恒定结构域可以有效地降低配对错误的可能性。
226.还提供了工程化细胞群、含有此类细胞和/或富集此类细胞(诸如其中表达结合分子的细胞组成至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比的在组合物中的总细胞或某种类型的细胞(诸如t细胞、cd8+或cd4+细胞))的组合物。
227.重组载体
228.本公开还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、向其中引入重组载体(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)的宿主细胞、以及通过重组技术生产重组多肽或其片段。
229.如本文所用，“载体”是当将载体引入宿主细胞时能够将一种或多种目的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已经引入表达载体的宿主细胞中递送一
种或多种目的多核苷酸和将其表达为编码的多肽。因此，通过在目的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼与载体内或宿主细胞基因组中的调控元件诸如启动子、增强子和/或聚a尾巴可操作地连接使得目的多核苷酸将在与表达载体一起引入的宿主细胞中翻译，将目的多核苷酸定位在载体中用于表达。
230.可以通过本领域已知的方法将载体引入宿主细胞中，例如电穿孔、化学转染(例如deae-葡聚糖)、转化、转染、以及感染和/或转导(例如用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可以用于产生重组病毒)、裸dna或rna、质粒、粘粒、噬菌体载体、以及与阳离子缩合剂相关的dna或rna表达载体。
231.本公开提供了包含适合于对细胞进行遗传修饰的核酸构建体的重组载体，其可以用于治疗病理性疾病或病症。
232.任何载体或载体类型均可以用于将遗传物质递送至细胞。这些载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)和人类人工染色体(hac)。病毒载体可以包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、泡沫病毒载体、重组腺相关病毒(aav)载体、杂交载体、和质粒转座子(例如，睡美人(sleeping beauty)转座子系统和piggybac转座子系统)或基于整合酶的载体系统。也可以结合本文所述的方法使用本领域已知的其他载体。
233.在一些实施方案中，载体是病毒载体。可以将病毒载体在对病毒载体制造具有特异性的培养基中生长。根据本文所述的实施方案，可以使用任何合适的生长培养基和/或用于使病毒载体生长的补充剂。
234.在一些实施方案中，所用的载体是重组逆转录病毒载体。逆转录病毒载体能够指导目的核酸分子的表达。逆转录病毒以rna形式存在于其病毒膜中，并且当在宿主细胞中复制时形成双链dna中间体。类似地，逆转录病毒载体以rna和双链dna两种形式存在。逆转录病毒载体还包括含有重组dna片段的dna形式和含有重组rna片段的rna形式。载体可以包括至少一种转录启动子/增强子、或控制基因表达的其他元件。此类载体还可以包括包装信号、长末端重复序列(ltr)或其部分、以及适合于所使用的逆转录病毒的正链和负链引物结合位点。长末端重复序列(ltr)是在逆转录转座子或通过逆转录病毒rna的逆转录形成的前病毒dna的末端发现的重复许多次(例如数百或数千次)的相同的dna序列。病毒使用它们将其遗传物质插入宿主基因组中。任选地，载体还可以包括指导聚腺苷酸化的信号、可选择标记(诸如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、tk、潮霉素抗性、腐草霉素抗性、组氨醇抗性、或dhfr)、以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。例如，此类载体可以包括5'ltr、前导序列、trna结合位点、包装信号、第二链dna合成的起点、和3'ltr或其一部分。另外，本文所用的逆转录病毒载体还可以是指通过去除逆转录病毒gag、pol和env基因并用目的基因替代而产生的重组载体。
235.在一些实施方案中，使用mp71载体。使用标准分子生物学技术产生mp71逆转录病毒载体构建体。在一些实施方案中，mp71逆转录病毒载体含有通过p2a序列连接的两个基因：(1)与小鼠tcrα链恒定区融合的人抗e6 tcr的α链可变区；(2)与小鼠tcrβ链恒定区融合的同一人抗e6 tcr的β链可变区。(图1)
236.在一些实施方案中，载体可以包括编码抑制蛋白(例如，检查点抑制剂)的另外的核酸。在各种实施方案中，细胞表达基因工程化抗原受体和抑制蛋白。在各种实施方案中，
组成型表达抑制蛋白。
237.在一些实施方案中，载体或构建体可以含有驱动一个或多个核酸分子的表达的单个启动子。在一些实施方案中，此类启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子)。例如，在一些实施方案中，转录单元可以是工程化为含有ires(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的消息共表达基因产物(例如编码tcr的α链和/或β链)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导rna的表达，所述rna在单一开放阅读框(orf)中含有两个或三个基因(例如，编码tcr的α链和/或β链)，所述两个或三个基因通过编码自切割肽(例如p2a或t2a)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，orf编码单个多蛋白，所述多蛋白在翻译期间(在2a(例如t2a)的情况下)或之后被切割成单个蛋白质。在一些情况下，肽(诸如t2a)可以引起核糖体跳过2a元件c末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，从而导致在2a序列末端与下游相邻肽之间分开。
238.可以结合如本文所述的载体使用各种细胞系。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos 7细胞；293细胞，包括293-6e细胞；cho细胞，包括cho-s、dg44。lec13 cho细胞和fut8 cho细胞；per.c6？细胞；和nso细胞。在一些实施方案中，特定的真核宿主细胞基于其对结合分子进行所需的翻译后修饰的能力来选择。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中产生的相同多肽。
239.在一个方面，本公开还涉及包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：
240.(1)含有a链可变区(va)的tcr a链或其片段，所述va包含分别含有在seq id no:5、6和7中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述va当与含有在seq id no:2中列出的氨基酸序列的b链可变区(vb)配对时与e6结合；
241.(2)含有b链可变区(vb)的tcr b链或其片段，所述vb包含分别含有在seq id no:8、9和10中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述vb当与含有在seq id no:1中列出的氨基酸序列的a链可变区(va)配对时与e6结合；
242.(3)含有a链可变区(va)的tcr a链或其片段，所述va包含分别含有在seq id no:27、28和29中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述va当与含有在seq id no:46中列出的氨基酸序列的b链可变区(vb)配对时与e6结合；
243.(4)含有b链可变区(vb)的tcr b链或其片段，所述vb包含分别含有在seq id no:30、31或32中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述vb当与含有在seq id no:45中列出的氨基酸序列的a链可变区(va)配对时与e6结合；
244.(5)含有a链可变区(va)的tcr a链或其片段，所述va包含分别含有在seq id no:33、34或35中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述va当与含有在seq id no:48中列出的氨基酸序列的b链可变区(vb)配对时与e6结合；
245.(6)含有b链可变区(vb)的tcr b链或其片段，所述vb包含分别含有在seq id no:36、37或38中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述vb当与含有在seq id no:47中列出的氨基酸序列的a链可变区(va)配对时与e6结合；
246.(7)含有a链可变区(va)的tcr a链或其片段，所述va包含分别含有在seq id no:39、40或41中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述va当与含有在seq id no:50中列出的氨基酸序列的b链可变区(vb)配对时与e6结合；或
247.(8)含有b链可变区(vb)的tcr b链或其片段，所述vb包含分别含有在seq id no:
42、43或44中列出的氨基酸序列的互补决定区(cdr)1、2和3，并且其中所述vb当与含有在seq id no:49中列出的氨基酸序列的a链可变区(va)配对时与e6结合。
248.在一些实施方案中，所述vh当与vl配对时与hpv e6特异性地结合，或者所述vl当与vh配对时与hpv e6特异性地结合。在一些实施方案中，核酸是cdna。
249.在一个方面，本公开涉及包含一种或多种如本文所述的核酸的载体。在一个方面，本公开还涉及包含两种如本文所述的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体编码一起结合hpv抗原的va区和vb区。
250.在一个方面，本公开涉及载体对，其中每个载体包含一种如本文所述的核酸，其中所述所述载体对一起编码一起与hpv抗原结合的所述va区和所述vb区。
251.在一个方面，本公开涉及包含如本文所述的载体或载体对的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是t细胞。
252.在一些情况下，某些tcr可能表现出不良的表达或活性，部分原因是与内源性tcr链的错误配对和/或竞争和/或其他因素。解决这些挑战的一种方法是设计具有小鼠恒定结构域的重组tcr，以防止与内源性人tcr a链或b链错误配对。然而，将重组tcr与小鼠序列一起使用可能带来免疫应答的风险。在一些实施方案中，例如通过基因编辑在编码一个或多个tcr链的内源基因上引入遗传破坏。
253.如图1中所示，将核酸构建体克隆到逆转录病毒载体pmp71中，所述逆转录病毒载体pmp71含有通过p2a序列连接的两个基因：(1)与小鼠tcrα链恒定区融合的人抗e6 tcr的α链可变区；(2)与小鼠tcrβ链恒定区融合的同一人抗e6 tcr的β链可变区。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的序列。
254.参考图6b，核酸构建体包含三个序列，其中所述三个序列包括：(a)与小鼠tcrα链的恒定区融合的人tcrα链的可变区，标识为“va-ca”，其中va对应于人tcrα链的可变区并且ca对应于小鼠tcrα链的恒定区；(b)与小鼠tcrβ链的恒定区融合的同一人tcrβ链的可变区，标识为“vb-cb”，其中vb对应于同一人tcrβ链的可变区并且cb对应于小鼠tcrβ链的恒定区；以及(c)用gs接头(例如，seq id no:76)连接的免疫检查点抑制剂(ici)的重链和轻链的可变区。在一些实施方案中，核酸构建体还包含编码信号肽的序列。在一些实施方案中，tcr是抗e6 tcr。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体scfv。核酸构建体还可以包括可以协助和/或实现构建体的转染、转导、整合、复制、转录、翻译、表达和/或稳定的其他序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含连接序列(a)、(b)和/或(c)的接头序列，例如，p2a和/或t2a序列。
255.在一些实施方案中，gs接头包含至少或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，gs接头包含至少或约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、30或40个甘氨酸残基。在一些实施方案中，gs接头包含至少或约1、2、3、4、5、6、7或8个丝氨酸残基。在一些实施方案中，gs接头包含或由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，gs接头包含以下序列或由以下序列组成：所述序列与ggggsggggsggggs(seq id no:76)为至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％或100％相同。在一些实施方案中，gs接头包含ggggs(seq id no:77)的至少1、2、3、4、5、6、7或8个重复。在一些实施方案中，gs接头具有不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50个氨基酸残基。
256.本公开还提供了编码如本文所述的tcr a链和/或b链的核酸。在一些实施方案中，编码a链的核酸包含在seq id no:15、51、53、55中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码b链的核酸包含在seq id no:16、52、54、56中列出的序列、或者与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述a链包含一个或多个如本文所述的va cdr序列。在一些实施方案中，所述b链包含一个或多个如本文所述的vb cdr序列。在一些实施方案中，载体包含与seq id no:20、63、64、65、26、66、67或68为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
257.在一些实施方案中，抑制蛋白是抗pd-1抗体(例如，抗pd-1scfv)。
258.在一些实施方案中，抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与seq id no:11为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；所述轻链可变结构域包含与seq id no:12为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
259.在一些实施方案中，载体包含编码抗pd-1scfv的序列。在一些实施方案中，载体包含编码与seq id no:24、69、70或71为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，载体包含与seq id no:25、72、73或74为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
260.如本文所用，术语“接头”(l)或“接头结构域”或“接头区域”是指将任何结构域/区域连接在一起的长度为约1至100个氨基酸的寡聚或多肽区域。接头可以由柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)构成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域彼此之间不发生空间干扰时，可以使用较长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的实例包括2a接头(例如p2a、t2a)、2a样接头或其功能等同物、以及它们的组合。在一些实施方案中，接头包括小核糖核酸病毒2a样接头；猪捷申病毒(p2a)、明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea asigna virus)(t2a)的chysel序列；或它们的组合、变体和功能等同物。其他接头对本领域技术人员将是显而易见的，并且可以在本文所述的方法中使用。
261.本公开还提供了核酸序列，所述核酸序列包含编码任何tcr、其抗原结合片段、和/或tcr衍生的结合分子(包括例如本文所述的其功能部分和功能变体、多肽或蛋白质)的核苷酸序列。如本文所用，“核酸”可以包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指dna或rna的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或获得自天然来源，其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。此外，核酸包含互补dna(cdna)。通常优选的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所讨论的，在一些情形下，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代可能是合适的。
262.可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应来构建如本文所述的核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸来化学地合成核酸。在一些任何此类实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
263.本公开还提供了核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的
核苷酸序列或者在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
264.在一些实施方案中，编码α链的核苷酸序列和编码β链的核苷酸序列被引起核糖体跳跃的肽序列分开。在一些实施方案中，引起核糖体跳跃的肽是p2a或t2a肽。在一些实施方案中，核酸是合成的。在一些实施方案中，核酸是cdna。
265.在一些实施方案中，载体可以另外包括编码检查点抑制剂(cpi)(例如抑制蛋白)的核酸序列。在一些实施方案中，检查点抑制剂是例如本文所述的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合pd-1、pd-l1、pd-l2、2b4(cd244)、4-1bb、a2ar、b7.1、b7.2、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、btla、嗜乳脂蛋白、cd160、cd48、ctla4、gitr、gp49b、hhla2、hvem、icos、ilt-2、ilt-4、kir家族受体、lag-3、ox-40、pir-b、sirpα(cd47)、tfm-4、tigit、tim-1、tim-3、tim-4、或vista。在一些实施方案中，抑制蛋白是scfv(例如抗pd-1scfv)。在一些实施方案中，抗pd-1scfv具有与seq id no:22为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。本公开还提供了编码抗pd-1scfv的核酸序列。在一些实施方案中，核酸具有与seq id no:23为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
266.在一些实施方案中，载体可以另外包括编码双功能陷阱融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向pd-1和tgf-β二者。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向pd-l1和tgf-β二者。在一些实施方案中，双功能融合蛋白设计成阻断pd-l1和螯合(sequester)tgf-β。基于人igg1单克隆抗体(mab)阿维鲁单抗(avelumab)，m7824(msb0011395c)包含与人抗pd-l1 scfv的c末端连接的人tgf-β受体ii(tgfβrii)的细胞外结构域。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含与人抗pd-1scfv的c末端连接的人tgf-β受体ii(tgfβrii)的细胞外结构域。
267.在一些任何此类实施方案中，tcr或其抗原结合片段由已经进行密码子优化的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，α链和/或β链还包含信号肽。在特定实施方案中，tcr或其抗原结合片段是分离的或纯化的或者是重组的。在一些任何此类实施方案中，tcr或抗原结合片段是重组的。在一些任何此类实施方案中，tcr或其抗原结合片段是人的。
268.本公开还提供了与本文所述的任何核苷酸序列为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、以及与本文所述的任何氨基酸序列为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列、或由本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。
269.在一些实施方案中，核酸序列为至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一些实施方案中，氨基酸序列为至少或约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸残基。在一些实施方案中，核酸序列为小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600个核苷酸。在一
些实施方案中，氨基酸序列为小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸残基。
270.为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入缺口以进行最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置是相同的。考虑了缺口数量和每个缺口的长度(需要将其引入以实现两个序列的最佳比对)，两个序列之间的同一性百分比是由序列所共享的相同位置的数量的函数。
271.产生t细胞受体和tcr样分子的方法
272.本公开还提供了鉴定和产生可以识别靶抗原的t细胞受体的方法。在一些方面，所述方法涉及使含有t细胞(诸如原代t细胞)的生物样品(包括来自正常供体或患有所关注的疾病或病症的患者的那些生物样品)经受多轮抗原暴露和评估。在一些方面，所述多轮涉及使用人工或工程化抗原呈递细胞，诸如自体树突状细胞或用所需肽抗原脉冲的其他apc来促进在mhc(诸如i类或ii类mhc)上的呈递。
273.在一些方面，进行多轮抗原暴露，并且在一些方面，例如基于结合所需抗原(诸如肽-mhc四聚体)的能力，在一轮或多轮之后分选t细胞。
274.可以通过本领域已知的方法例如流式细胞术进行分选。例如，通过单细胞测序方法分析了可以与所需抗原结合的细胞(阳性级分)和不能与所需抗原有效地结合的细胞(阴性级分)。在一些实施方案中，进行测序以在单细胞水平上鉴定每个样品中存在的tcr对。在一些方面，所述方法可以定量在样品中存在的给定tcr对的拷贝数，并且因此可以评估在给定样品中给定tcr的丰度、和/或其在另一样品中的富集，诸如例如经过一轮或多轮，例如与阴性级分相比，在阳性(抗原结合)级分中的富集或丰度。可以进行此类测定以产生抗原特异性t细胞受体(tcr)。在一些方面，产生克隆t细胞系，并且使用高通量配对tcr测序在单细胞的基础上确定各个群体中单个配对tcrα链和β链的序列及其丰度。
275.可以进一步修饰tcr或其抗原结合片段。在一些实施方案中，与结合分子(例如本文所述的任何tcr)的序列相比，结合分子(例如tcr或其抗原结合片段)包括一个或多个氨基酸变异，例如取代、缺失、插入和/或突变。示例性变体包括设计用于改善结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性的那些变体。可以通过将适当的修饰引入编码结合分子的核苷酸序列中或通过肽合成来制备结合分子的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如结合分子氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体拥有所需的特征，例如与抗原特异性地结合。
276.各种结合分子可以由tcr制成。与本文所述的结合分子(例如tcr)序列相比和/或与天然库(例如人类库)的序列相比，结合分子(例如tcr或其抗原结合片段)可以包括一个或多个氨基酸取代。取代诱变的所关注位点包括cdr、fr和/或恒定区。可以将氨基酸取代引入所关注的结合分子中，并且针对所需活性(例如，保留/改善的抗原亲和力或亲合力、降低的免疫原性、改善的半衰期、独立于cd8的结合或活性、表面表达、促进tcr链配对和/或其他改善的特性或功能)筛选产物。
277.在一些实施方案中，母体结合分子(例如tcr)的cdr内的一个或多个残基被取代。
在一些实施方案中，进行取代以将序列或序列中的位置还原为种系序列，诸如在种系(例如人种系)中发现的结合分子序列，例如，以便例如在向人受试者施用后降低免疫原性的可能性。
278.在一些实施方案中，功能变体由tcr或tcr衍生的结合分子制成。如本文所用，术语“功能变体”是指与母体分子具有足够或显著的序列同一性的结合分子。此外，功能变体保留了与母体蛋白质相同的生物活性。功能变体涵盖本文所述的tcr蛋白(母体tcr、多肽或蛋白质)的那些变体，其保留了与母体tcr具有抗原特异性或母体多肽或蛋白质特异性地结合的hpv表位特异性地结合的能力。此外，功能变体的结合区域(例如，可变结构域)可以为与母体tcr蛋白相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于母体tcr、多肽或蛋白质，功能变体可以例如与母体tcr、多肽或蛋白质在氨基酸序列上为至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。
279.可以对一个或多个cdr进行取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低结合分子(例如tcr或其抗原结合片段)结合抗原的能力即可。例如，可以在cdr中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以例如在cdr中的抗原接触残基之外。在本文提供的可变序列的某些实施方案中，每个cdr要么不改变，要么含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
280.tcr衍生的抗体
281.本公开还提供了含有如上所述的任何一个或多个cdr的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有可变的重链和轻链，所述可变的重链和轻链包含在α链中含有的cdr1、cdr2和/或cdr3以及在β链中含有的cdr1、cdr2和/或cdr3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与图20中的cdr序列为至少为或约80％、85％、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的一个或多个cdr。
282.在一些实施方案中，所述抗体和其抗原结合片段(例如tcr样抗体)特异性地识别在mhc分子(诸如mhc i类)的背景下的肽表位(例如，hpv抗原)。在一些情况下，mhc i类分子是hla-a2分子，例如hla-a2*01。
283.在一些实施方案中，所述抗体及其抗原结合片段可以特异性地识别以独立于mhc分子的方式的肽表位(例如，hpv抗原)。
284.通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链组成：轻链和重链。本公开的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四条免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型(包括igm、igg、ige、iga或igd)或亚同种型(包括igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3、igg4、ige1、ige2等)。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可以包含两个相同拷贝的轻链和两个相同拷贝的重链。重链(每一条重链含有一个可变结构域(或可变区，vh)和多个恒定结构域(或恒定区))在其恒定结构域内通过二硫键彼此结合以形成抗体的“茎”。轻链(每一条轻链含有一个可变结构域(或可变区，vl)和一个恒定结构域(或恒定区))各自通过二硫键结合至一条重链。每条轻链的可变区与其所结合的重链的可变区对齐。轻链和重链二者的可变区均含有夹在更保守的框架区(fr)之间的三个高变区。
285.在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm、igd、ige、iga)。igg亚类(igg1、igg2、igg3和igg4)是高度保守的，区别在于它们的恒定区，尤其是它们的铰链和上部ch2结构域。igg亚类的序列和差异是本领域已知的，并
且例如在以下文献中进行了描述：vidarsson,等人,“igg subclasses and allotypes:from structure to effector functions.”frontiers in immunology 5(2014)；irani,等人“molecular properties of human igg subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.”molecular immunology 67.2(2015):171-182；shakib,farouk,编辑the human igg subclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.elsevier,2016；将所述文献中每一者全文以引用方式并入本文。
286.抗体也可以是源自任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、骆驼科动物)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体、和包括与另一个多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留了完整抗体的特异性结合活性的抗体的一部分，即能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性地结合的任何抗体部分。其包括例如fab、fab'、f(ab')2以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scfv、fv、fd、dab、双特异性抗体、双特异性scfv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体、以及包含是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括例如完整抗体的重链和/或轻链cdr、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链、或来自完整抗体重链或轻链的单个cdr。
287.在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(car)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是与cd3-ζ跨膜结构域和胞内结构域融合的、如本文所述的单链可变片段(scfv)的融合物。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，cd28、41bb、icos)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域(例如cd3z-cd28-41bb或cd3z-cd28-ox40)以增加效力。因此，在一个方面，本公开还提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如t细胞)。
288.在一些实施方案中，scfv包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。在一些实施方案中，scfv包含两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域。
289.tcr衍生的car
290.所述抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(诸如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非tcr抗原受体，诸如嵌合抗原受体(car)。通常，含有表现出针对在mhc分子的背景下的肽的tcr样特异性的抗体或抗原结合片段的car也可以被称为tcr样car。因此，所提供的结合分子(例如hpv结合分子)包括抗原受体，诸如包括所提供的抗体之一(例如tcr样抗体)的那些抗原受体。在一些实施方案中，抗原受体和其他嵌合受体与抗原(例如tcr样抗体)的区域或表位特异性地结合。抗原受体包括功能性非tcr抗原受体，诸如嵌合抗原受体(car)。还提供了表达car的细胞及其在过继细胞疗法中的用途，所述过继细胞疗法诸如与hpv抗原表达相关的疾病和障碍的治疗。
291.含有非tcr分子的tcr样car当在mhc分子的背景下显示或呈现时表现出t细胞受体特异性，诸如对t细胞表位或肽表位。在一些实施方案中，tcr样car可以含有抗体或其抗原结合部分，例如tcr样抗体，诸如本文所述的。在一些实施方案中，抗体或其抗体结合部分对在mhc分子的背景下的特定肽表位具有反应性，其中所述抗体或抗体片段可以将在mhc分子的背景下的特异性肽与单独的mhc分子、单独的特异性肽、以及在一些情况下在mhc分子的
背景下的不相关肽区分开。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分可以表现出比t细胞受体更高的结合亲和力。
292.示例性抗原受体(包括car)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法，包括描述于例如us2002/131960、us2013/287748、us2013/0149337、u.s.6,451,995、u.s.7,446,190、u.s.8,252,592中的那些；将所述专利中每一者全文以引用方式并入本文。
293.在一些实施方案中，car通常包括在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接的对肽具有特异性的细胞外抗原(或配体)结合结构域，包括例如抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近通过天然抗原受体(诸如tcr)的信号，以及任选地通过与共刺激受体组合的这样的受体的信号。
294.在一些实施方案中，car通常在其细胞外部分中包括一个或多个抗原结合分子，诸如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分、或一个或多个抗体可变结构域、和/或抗体分子。在一些实施方案中，car包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如从单克隆抗体(mah)的可变重链(vh)和可变轻链(vl)衍生的单链抗体片段(scfv)。在一些实施方案中，car含有tcr样抗体，诸如特异性地识别存在于细胞表面上的在mhc分子的背景下的肽表位的抗体或抗原结合片段(例如，scfv)。
295.在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与cd3(例如，cd3ζ)细胞内结构域连接的cd28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与cd3ζ细胞内结构域连接的嵌合cd28和cd137(4-lbb、tnfrsf9)共刺激结构域。
296.在一些实施方案中，结合分子还可以是基因工程化t细胞受体(tcr)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)、c型凝集素受体、白细胞免疫球蛋白样受体(lilr)、1型细胞因子受体、2型细胞因子受体、肿瘤坏死因子家族、tgfβ受体、趋化因子受体、或免疫球蛋白超家族(igsf)的成员。
297.在一些实施方案中，以任何数量的方式进一步修饰工程化细胞，使得其治疗或预防功效增加。例如，被群体表达的工程化tcr或其他结合分子可以通过接头直接或间接地偶联至靶向部分。将结合分子(例如car或tcr)缀合至靶向部分的实践是本领域已知的，并且例如在以下文献中进行了描述：wadhwa等人“receptor mediated glycotargeting.”journal of drug targeting 3.2(1995):111-127；以及美国专利号5,087,616；将所述文献全文以引用方式并入本文。
298.用于制备工程化细胞的方法
299.本公开提供了用于制备、制造工程化细胞和/或使用工程化细胞来治疗病理性疾病或病症的方法或过程。
300.可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或来源的生物样品)中分离用于引入结合分子(例如tcr)的细胞。在一些实施方案中，从其分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法、或将向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如针对其分离、处理细胞和/或对细胞进行工程化的过继细胞疗法)的人。
301.因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(诸如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源
获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的经处理样品。
302.在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
303.在一些实施方案中，所述细胞衍生自细胞系，例如t细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、或非人灵长类动物。
304.在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，通过半自动化“流通式”离心完成洗涤步骤。在一些方面，通过切向流过滤(tff)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(诸如，例如不含ca
2+
/mg
2+
的pbs)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过percoll或ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
305.在一些实施方案中，所述方法包括以下中的一个或多个步骤：例如，从患者血液中分离t细胞；用病毒载体转导群体t细胞，所述病毒载体包括编码基因工程化抗原受体的核酸构建体；体外扩增经转导的细胞；和/或将扩增的细胞输注到患者体内，在那里工程化t细胞将寻找并破坏抗原阳性的肿瘤细胞。在一些实施方案中，核酸构建体还包括编码抑制蛋白的序列。在一些实施方案中，这些工程化t细胞可以阻断pd-1/pd-l1免疫抑制并增强抗肿瘤免疫应答。所述方法还包括：用含有核酸构建体的病毒载体转染t细胞。
306.在一些实施方案中，所述方法涉及将本文所述的任何载体体外或离体引入细胞中。在一些实施方案中，载体是病毒载体，并且所述引入通过转导来进行。在一些实施方案中，所述方法还涉及将一种或多种药剂引入细胞中，其中所述一种或多种药剂中的每一种独立地能够诱导t细胞受体α链恒定区(trac)基因和/或t细胞受体β链恒定区(trbc)基因的遗传破坏。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂是抑制核酸(例如sirna)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂是包含dna靶向蛋白和核酸酶或rna指导的核酸酶的融合蛋白(例如，成簇的规律间隔短回文核酸(crispr)相关的核酸酶)。
307.熟练技术人员通过使用任何标准方法诸如磷酸钙、电穿孔、脂质体介导的转移、显微注射、生物弹颗粒递送系统、或任何其他已知方法可以实现t细胞的转染。在一些实施方案中，使用磷酸钙方法进行t细胞的转染。
308.根据本文所述的各种实施方案，本公开提供了针对肿瘤(特别是hpv相关癌症)的免疫疗法。工程化t细胞识别肿瘤相关的hpv抗原，并同时分泌阻断程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的单链抗体(scfv)融合蛋白。这些工程化t细胞表现出更强的抗肿瘤反应和减少的t细胞衰竭。从实验上已经发现，pd-1检查点阻断在本文所述的方法中更有效，因为抗pd-1药剂的递送位于肿瘤部位，因此在肿瘤部位具有更高的浓度。而且，因为抗pd-1药物的递送位
于肿瘤部位，因此降低了由于非特异性炎症引起的毒性。本公开提供了与现有替代方案相比，抗hpv tcr和抗pd-1抗体的组合改善了t细胞激活和/或防止了t细胞衰竭。
309.本公开提供了创建个性化抗肿瘤免疫疗法的方法。基因工程化t细胞可以从患者的血细胞产生。然后，将这些工程化t细胞作为细胞疗法产品重新输注到患者体内。该产品可以应用于患有hpv相关肿瘤的任何患者，所述hpv相关肿瘤包括但不限于宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌。
310.制备工程化细胞并将这些工程化细胞施用至受试者的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号10,174,098和draper等人“targeting of hpv-16+epithelial cancer cells by tcr gene engineered t cells directed against e6.”clinical cancer research 21.19(2015):4431-4439中，将所述文献中的二者全文以引用方式并入。
311.治疗方法
312.本文公开的方法可以用于各种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者的癌症的方法，降低受试者中肿瘤体积随时间增加的速率的方法，降低发生转移的风险的方法、或降低受试者中发生额外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可以导致受试者中癌症的一种或多种症状的数量、严重性和/或持续时间的减少。
313.在一个方面，本公开的特征在于方法，其包括将治疗有效量的表达tcr、其抗原结合片段和tcr衍生的结合分子的工程化细胞施用至有需要的受试者(例如，患有或鉴定为或诊断为患有癌症(例如hpv相关的癌症)的受试者)。在一些实施方案中，所述hpv相关的癌症是宫颈癌、头颈癌、口咽癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌。
314.在一些实施方案中，所述受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，所述受试者患有乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。
315.在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可以用于治疗处于患癌症风险的患者。癌症患者可以通过本领域已知的各种方法来鉴定。
316.此外，本公开提供了用于治疗受试者的感染或感染相关病症的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制疾病的进展。这些方法通常涉及将治疗有效量的本文公开的基因工程化细胞施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是感染性疾病或病症，诸如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、人乳头状瘤病毒(hpv)、巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。
317.如本文所用，“有效量”意指足以实现有益或期望结果(包括停止、减慢、延缓或抑制疾病(例如癌症)的进展)的量或剂量。有效量将根据例如将要向其施用治疗剂和/或治疗组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重性和施用途径而变化，并且因此可以在个体基础上确定施用。
318.如本文所用，术语“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或
延期疾病(例如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，诸如转移的发展。
319.有效量可以在一次或多次给药中进行施用。举例来说，组合物的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减慢和/或延迟患者癌症进展的量，或者是足以在体外改善、停止、稳定、逆转、减慢和/或延迟细胞(例如，活检的细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如癌细胞系))的增殖的量。如本领域中所理解的，有效量可以根据尤其是患者病史以及其他因素诸如所使用的组合物的类型(和/或剂量)而变化。
320.可以根据经验确定施用的有效量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受治疗的哺乳动物、施用途径、向哺乳动物施用的治疗剂和其他药物的特定类型而变化。选择适当剂量的指南可以在文献中找到。此外，治疗不一定导致对疾病或病症的100％或完全治疗或预防。有多种具有不同程度治疗效果的治疗/预防方法可用，本领域普通技术人员将其视为潜在有利的治疗手段。
321.在一些方面，本公开还提供了诊断哺乳动物中的疾病/病症的方法，其中所述tcr、抗原结合片段、tcr衍生的结合分子与从受试者获得的一个或多个样品发生相互作用以形成复合物，其中所述样品可以包含一种或多种细胞、多肽、蛋白质、核酸、抗体、或抗原结合部分；血液、全细胞、其裂解物、或全细胞裂解物的级分，例如细胞核或细胞质级分、全蛋白级分、或其核酸级分，其中对复合物的检测指示哺乳动物中病症的存在，其中所述病症是癌症、hpv感染或hpv阳性初癌。此外，对复合物的检测可以通过任何数量的本领域已知的方式，但不限于elisa、流式细胞术、荧光原位杂交(fish)、聚合酶链反应(pcr)、微阵列、southern印迹、电泳、噬菌体分析、色谱等。因此，治疗方法可以还包括例如通过确定受试者是否患有hpv感染或hpv相关的癌症来确定受试者是否可以从本文公开的治疗中受益。
322.在本文所述的任何方法中，工程化细胞和、和/或至少一种另外的治疗剂可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用至受试者。在一些实施方案中，将至少两种不同的工程化细胞(例如表达不同结合分子的细胞)以同一组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，将工程化细胞和至少一种另外的治疗剂以同一组合物(例如液体组合物)施用。在一些实施方案中，将工程化细胞和至少一种另外的治疗剂以两种不同的组合物施用。在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂施用。在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂以持续释放的口服配制品施用。
323.在一些实施方案中，可以在将工程化细胞施用至受试者之前、同时或之后，将一种或多种另外的治疗剂施用至受试者。
324.在一些实施方案中，可以将一种或多种另外的治疗剂施用至受试者。所述另外的治疗剂可以是检查点抑制剂(cpi)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抑制蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。检查点抑制剂可以抑制或阻断一个或多个免疫检查点，包括例如pd-1、pd-l1、pd-l2、2b4(cd244)、4-1bb、a2ar、b7.1、b7.2、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h6、btla、嗜乳脂蛋白、cd160、cd48、ctla4、gitr、gp49b、hhla2、hvem、icos、ilt-2、ilt-4、kir家族受体、lag-3、ox-40、pir-b、sirpα(cd47)、tfm-4、tigit、tim-1、tim-3、tim-4、vista及其组合。在
一些实施方案中，抑制蛋白阻断pd-1或pd-ll。在各种实施方案中，抑制蛋白包含抗pd-1scfv。抑制蛋白能够导致群体的t细胞中pd-1或pd-l1的表达降低和/或抑制pd-1或pd-l1的上调、和/或在物理上阻碍pd-1/pd-l1复合物的形成和随后的信号转导。在一些实施方案中，抑制蛋白阻断pd-1。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗ox40抗体、抗pd-l1抗体、抗pd-l2抗体、抗lag-3抗体、抗tigit抗体、抗btla抗体、抗ctla-4抗体、或抗gitr抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗ctla4抗体(例如易普利姆玛)、抗cd20抗体(例如利妥昔单抗)、抗egfr抗体(例如西妥昔单抗)、抗cd319抗体(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))或抗pd1抗体(例如纳武单抗)。
325.在一些实施方案中，另外的治疗剂是双功能陷阱融合蛋白。双功能陷阱蛋白可以靶向免疫检查点和tgf-β负调控途径二者。除了表达免疫检查点外，肿瘤微环境还含有其他免疫抑制分子。特别令人感兴趣的是在癌症中具有多种功能的细胞因子tgf-β(tgfb)。tgf-β在肿瘤发展的早期阻止肿瘤细胞的增殖并促进分化和凋亡。然而，在肿瘤进展期间，由于tgf-β受体表达的丧失或下游信号传导元件的突变而引起肿瘤tgf-β不敏感性。然后，tgf-β通过其对血管生成、上皮-间充质转化(emt)的诱导和免疫抑制的作用来促进肿瘤进展。高的tgf-β血清水平和在肿瘤上tgf-β受体(tgfβr)表达的丧失与不良预后相关。tgfβ靶向疗法已展示出有限的临床活性。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向pd-1和tgf-β二者。在一些实施方案中，双功能陷阱蛋白靶向pd-l1和tgf-β二者。在一些实施方案中，双功能融合蛋白设计成阻断pd-l1和螯合(sequester)tgf-β。基于人igg1单克隆抗体(mab)阿维鲁单抗(avelumab)，m7824(msb0011395c)包含与人抗pd-l1 scfv的c末端连接的人tgf-β受体ii(tgfβrii)的细胞外结构域。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含与人抗pd-1scfv的c末端连接的人tgf-β受体ii(tgfβrii)的细胞外结构域。这些双功能陷阱融合蛋白描述于例如knudson,等人“m7824,a novel bifunctional anti-pd-l1/tgfβtrap fusion protein,promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine.”oncoimmunology 7.5(2018):e1426519；将所述文献全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，用表达本文所述的tcr或抗原结合分子的细胞和一种或多种双功能陷阱融合蛋白治疗受试者。
326.在一个一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含一种或多种抑制剂，所述一种或多种抑制剂选自由以下组成的组：b-raf的抑制剂、egfr抑制剂、mek抑制剂、erk抑制剂、k-ras抑制剂、c-met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂、磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)抑制剂、akt抑制剂、mtor抑制剂、pi3k/mtor双重抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂、以及异柠檬酸脱氢酶1(idh1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(idh2)的抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是吲哚胺2,3-二加氧酶-1)(ido1)的抑制剂(例如艾卡哚司他(epacadostat))。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含一种或多种抑制剂，所述一种或多种抑制剂选自由以下组成的组：her3抑制剂、lsd1抑制剂、mdm2抑制剂、bcl2抑制剂、chk1抑制剂、激活的hedgehog信号传导途径的抑制剂，以及选择性地降解雌激素受体的药剂。
327.在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含一种或多种治疗剂，所述一种或多种治疗剂选自由以下组成的组：曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、trebananib、帕唑帕尼、西地尼布、帕博昔布、依维莫司、氟嘧啶、ifl、瑞戈非尼、reolysin、
力比泰(alimta)、zykadia、索坦(sutent)、坦西莫司、阿昔替尼、依维莫司、索拉非尼、votrient、帕唑帕尼、ima-901、ags-003、卡博替尼、长春氟宁、hsp90抑制剂、ad-gm-csf、替莫唑胺(temazolomide)、il-2、ifna、长春碱、沙立度胺(thalomid)、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮杂胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林。
328.在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以包含一种或多种治疗剂，所述一种或多种治疗剂选自由以下组成的组：佐剂、tlr激动剂、肿瘤坏死因子(tnf)α、il-1、hmgb1、il-10拮抗剂、il-4拮抗剂、il-13拮抗剂、il-17拮抗剂、hvem拮抗剂、icos激动剂、靶向cx3cl1的治疗、靶向cxcl9的治疗、靶向cxcl10的治疗、靶向ccl5的治疗、lfa-1激动剂、icam1激动剂和选择素(selectin)激动剂。
329.在一些实施方案中，将卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、folfox或folfiri施用至受试者。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱和/或其组合。
330.组合物和配制品
331.本公开提供了含有通过本文公开的方法生产的工程化细胞及其群体的组合物(包括药物组合物和治疗组合物)。还提供了用于向受试者(例如患者)施用工程化细胞及其组合物的方法(例如治疗方法)。
332.提供了包括用于施用的工程化t细胞的组合物，包括药物组合物和配制品，诸如包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量的单位剂型组合物。药物组合物和配制品可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种另外的治疗剂。
333.药学上可接受的载体是指药物组合物中除活性成分以外的成分。药学上可接受的载体不干扰活性成分并且对受试者无毒。药学上可接受的载体可以包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药物配制品是指将不同的物质和/或药剂组合以产生最终药物产品的过程。配制品研究涉及开发对于患者可接受的药物制剂。另外，是这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
334.在一些实施方案中，载体的选择部分地由特定细胞(例如t细胞或nk细胞)和/或由施用方法来确定。多种合适的配制品是可用的。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些实施方案中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如remington’s pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨
酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。
335.合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些实施方案中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如以下文献中有更详细的描述：remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；第21版(2005年5月1日)。
336.配制品可以包括水性溶液。所述配制品或组合物还可以含有可用于正在用工程化细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的超过一种活性成分，优选地具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会彼此产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还可以包括其他药物活性药剂或药物，诸如检查点抑制剂、融合蛋白、化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
337.在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过细胞的单次推注施用、通过细胞的多次推注施用或通过细胞的连续输注施用来递送。
338.细胞和组合物可以使用标准给药技术、配制品和/或装置来施用。所述细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答t细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且在根据本文所述的各种实施方案将其进行遗传修饰之后，将其施用至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答t细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。通常，当施用治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
339.本文公开的配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外地施用所述细胞群。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞施用至受试者。
340.在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，所述无菌液体制剂例如为等渗水性溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的ph。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
341.无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物可以含有辅助物质，诸
如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
342.可以添加增强所述组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物作用。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
343.用于进行体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
344.本文所述的组合物或药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
345.施用方法
346.还提供了施用细胞、群体和组合物的方法，以及此类细胞、群体和组合物治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。在一些实施方案中，本文所述的方法可以降低发生本文所述的疾病、病症和障碍的风险。
347.在一些实施方案中，将本文所述的细胞、群体和组合物施用至受试者或患者，所述受试者或患者患有将要例如通过过继细胞疗法(诸如过继t细胞疗法)治疗的特定疾病或病症。在一些实施方案中，将通过所提供的方法制备的细胞和组合物(诸如孵育和/或其他处理步骤后的工程化组合物和最终生产组合物)施用至受试者，诸如患有疾病或病症或具有患上疾病或病症的风险的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病症(例如，改善疾病或病症的一种或多种症状)，诸如通过减轻表达由工程化t细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷来治疗。
348.用于施用过继细胞疗法的细胞的方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继t细胞疗法的方法描述于例如u.s.2003/0170238；美国专利号4,690,915；rosenberg,“cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know.”nature reviews clinical oncology 8.10(2011):577；themeli等人“generation of tumor-targeted human t lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.”nature biotechnology 31.10(2013):928；tsukahara等人“cd19 target-engineered t-cells accumulate at tumor lesions in human b-cell lymphoma xenograft mouse models.”biochemical and biophysical research communications 438.1(2013):84-89；davila等人“cd19 car-targeted t cells induce long-term remission and b cell aplasia in an immunocompetent mouse model of b cell acute lymphoblastic leukemia.”plos one 8.4(2013)；将所述文献中每一者全文以引用方式并入本文。
349.在一些实施方案中，通过自体转移进行细胞疗法(例如过继t细胞疗法)，其中从将要接受细胞疗法的受试者中或从衍生自这样的受试者的样品中分离和/或以其他方式制备t细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自于需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和处理后将所述细胞施用至同一受试者。
350.在一些实施方案中，通过同种异体转移进行细胞疗法(例如过继t细胞疗法)，其中
从除将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备t细胞。在此类实施方案中，细胞随后被施用至同一物种的不同受试者(例如第二受试者)。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的hla类别或超类型。
351.在一些实施方案中，在施用细胞或含有细胞的组合物之前，已经用靶向疾病或病症(例如肿瘤)的治疗剂对受试者进行过治疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂是难治的或无反应。在一些实施方案中，受试者例如在用另一种治疗性干预进行治疗后具有持续性或复发性疾病，所述治疗性干预包括化学疗法、放射线和/或造血干细胞移植(hsct)(例如同种异体hsct)。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生抗性，但施用仍有效地治疗受试者。
352.在一些实施方案中，受试者对其他治疗剂有反应，并且用所述治疗剂进行治疗降低了疾病负荷。在一些方面，受试者最初对所述治疗剂有反应，但是随着时间的推移展现出疾病或病症的复发。在一些实施方案中，受试者尚未复发。在一些此类实施方案中，确定受试者处于复发的风险中，诸如处于高复发风险中，因此预防性地施用细胞，例如以降低复发的可能性或防止复发。在一些实施方案中，受试者尚未接受用另一种治疗剂的先前治疗。
353.在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单个群体或亚型的比率，诸如cd4+与cd8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单个群体中的细胞或单个细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，剂量基于此类特征的组合，诸如所需的总细胞数、所需比率、和单个群体中所需的细胞总数。
354.在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(诸如所需剂量的t细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用细胞的群体或亚型(诸如cd8+和cd4+t细胞)。在一些实施方案中，所需剂量是所需细胞数或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数(例如细胞/kg)。在一些实施方案中，所需剂量等于或高于最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些实施方案中，在以所需剂量施用的总细胞中，单个群体或亚型以等于或接近所需输出比率(诸如cd4+与cd8+的比率)(例如在这种比率的一定耐受差异或误差内)存在。
355.在一些实施方案中，以所需剂量的一种或多种单个细胞群体或亚型(诸如所需剂量的cd4+细胞和/或所需剂量的cd8+细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用细胞。在一些实施方案中，所需剂量是所需的所述亚型或群体的细胞数或所需的被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数(例如细胞/kg)。在一些实施方案中，所需剂量等于或高于最小的所述群体或亚型的细胞数或每单位体重的最小的所述群体或亚型的细胞数。
356.因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞固定剂量和所需比率，和/或基于所需固定剂量的一种或多种(例如每一种)单个亚型或亚群。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需固定剂量或最小剂量的t细胞和所需的cd4+与cd8+细胞的比率，和/或基于所需固定剂量或最小剂量的cd4+和/或cd8+细胞。
357.在某些实施方案中，将细胞、或细胞的单个群体或亚型以约100万至约1000亿个细胞(诸如，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细
胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由前述值中的任两个值所限定的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由前述值中的任两个值所限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞或在这些范围之间的任何值)施用至受试者。
358.在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或单个细胞亚群的剂量在以下范围内：在为或约104与为或约109个细胞/千克(kg)体重之间，诸如在105与106个细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或为或约1
×
10 5
个细胞/kg体重、1.5
×
105个细胞/kg体重、2
×
105个细胞/kg体重、或1
×
106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，以在为或约104与为或约109个t细胞/千克(kg)体重之间，诸如在105与106个t细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或者为或约1
×
105个t细胞/kg体重、1.5
×
105个t细胞/kg体重、2
×
105个t细胞/kg体重、或1
×
106个t细胞/kg体重，或在其一定误差范围内施用细胞。
359.在一些实施方案中，以在为或约104与为或约109个cd4+和/或cd8+细胞/千克(kg)体重之间，诸如在105与106个cd4+和/或cd8+细胞/kg体重之间，例如，至少或至少约或者为或约1
×
105个cd4+和/或cd8+细胞/kg体重、1.5
×
105个cd4+和/或cd8+细胞/kg体重、2
×
105个cd4+和/或cd8+细胞/kg体重、或1
×
106个cd4+和/或cd8+细胞/kg体重，或在其一定误差范围内施用细胞。
360.在一些实施方案中，以大于、和/或至少约1
×
106、约2.5
×
106、约5
×
106、约7.5
×
106、或约9
×
106个cd4+细胞、和/或至少约1
×
106、约2.5
×
106、约5
×
106、约7.5
×
106、或约9
×
106个cd8+细胞、和/或至少约1
×
106、约2.5
×
106、约5
×
106、约7.5
×
106、或约9
×
106个t细胞，或在其一定误差范围内施用细胞。在一些实施方案中，以在约108与10
12
个之间或在约10
10
与10
11
个之间的t细胞、在约108与10
12
个之间或在约10
10
与10
11
个之间的cd4+细胞，和/或在约108与10
12
个之间或在约10
10
与10
11
个之间的cd8+细胞，或在其一定误差范围内施用细胞。
361.在一些实施方案中，在多种细胞群或亚型(诸如cd4+和cd8+细胞或亚型)的所需输出比率的耐受范围下或在其耐受范围内施用细胞。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是比率范围。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，cd4+与cd8+细胞的比率)在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，或例如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括在这些范围之间的任何值。在一些方面，这里所述的tcr提供了改善的表达和活性，从而即使在低的效应子与靶标(e:t)比率下也提供治疗效果。
362.对疗法的最佳反应可能取决于工程化重组受体(诸如tcr)在细胞表面上一致且可
technique for assessing ctl-and nkt-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.”journal of immunological methods285.1(2004):25-40中。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(诸如cd107a、ifnγ、il-2和tnf)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面，通过评估临床结果(诸如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
367.给药时间表和治疗方案
368.提供了重复给药方法，其中给予第一剂量的细胞，随后给予一个或多个第二连续剂量。当以过继疗法方法施用至受试者时，通常设计细胞的多个剂量的时间安排和大小以增加如本文所述的工程化细胞的功效和/或活性和/或功能。在一些实施方案中，重复给药减少了当抑制性免疫分子(诸如pd-1和/或pd-l1)在工程化t细胞上被上调时可能发生的下调或抑制活性。所述方法涉及施用第一剂量，通常随后是一个或多个连续剂量，在不同剂量之间具有特定的时间范围。
369.在过继细胞疗法的情境下，给定“剂量”的施用包括以单一组合物和/或单次不间断给药的方式(例如以单次注射或连续输注的方式)施用给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段(例如不超过3天)内以在多种单独组合物或多次单独输注中提供的分割剂量的方式施用给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或开始的对指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情境下，将第一或连续剂量在受限的时间段(例如不超过三天)内以多次注射或输注的方式施用，诸如每天一次施用持续三天或两天或者通过在一天的时间段内多次输注的方式施用。
370.第一剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以单一药物组合物施用。
371.在一些实施方案中，第一剂量的细胞以共同含有第一剂量的细胞的多种组合物施用。在一些实施方案中，连续剂量的细胞以共同含有连续剂量的细胞的多种组合物施用。在一些方面，可以在不超过3天的时间段内以多种组合物施用另外的连续剂量。
372.术语“分割剂量”是指被分割使得其可以在超过一天的时间内施用的剂量。这种类型的给药涵盖在本发明的方法中，并且被认为是单剂量。因此，在一些实施方案中，第一剂量和/或一个或多个连续剂量可以作为分割剂量施用。例如，在一些实施方案中，可以在2天或3天内将剂量施用至受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用第一剂量的33％并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量分布不超过3天内。
373.关于先前剂量，诸如第一剂量，术语“连续剂量”是指在先前(例如第一)剂量之后暂时没有向受试者施用任何介入剂量的情况下向同一受试者施用的剂量。但是，所述术语不涵盖在单个分割剂量内包含的一系列输注或注射中的第二次、第三次和/或等等注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天、两天或三天时间段内的第二次输注不被视为如本文所用的“连续”剂量。同样，在“连续”剂量的意义的情境下，在分割剂量内的一系列多次剂量中的第二次、第三次等等也不被视为“介入”剂量。因此，除非另有说明，否则只要在第一或先前剂量开始后的三天时间段内发生了第二次或随后的注射或输注，即使受试者在第一剂量开始后接受了细胞的第二次或随后的注射或输注，在开始第一或先前剂量之后大于三
天的一定时间段内施用的剂量都被视为“连续”剂量。
374.因此，除非另有说明，否则在长达3天的时间段内多次施用相同细胞被视为单一剂量，并且在初次施用的3天内施用细胞不被视为连续剂量，并且也不被视为出于确定第二剂量是否与第一剂量“连续”的目的使用的介入剂量。
375.在一些实施方案中，在一些方面使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时间安排的相同的时间安排指南例如通过施用第一剂量和多个连续剂量来给予多个连续剂量，其中在抑制性免疫分子(诸如pd-1和/或pd-l1)已在受试者的细胞中从所施用的第一剂量开始被上调的一个时间段内给予每个连续剂量。诸如通过评估在来自外周血或其他体液的抗原表达细胞诸如tcr表达细胞中pd-1和/或pd-l1的水平来凭经验确定何时提供连续剂量是在本领域技术人员的水平之内。
376.在一些实施方案中，在第一剂量与第一连续剂量、或者第一与多个连续剂量之间的时间安排为使得在大于约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更长时间的时间段内给予每个连续剂量。在一些实施方案中，在施用第一剂量或紧接先前剂量之后少于约28天的时间段内给予连续剂量。另外的多个另外一个或多个连续剂量也被称为后续剂量或后续连续剂量。
377.将细胞的第一剂量和/或一个或多个连续剂量的大小通常设计为提供改善的功效和/或降低的毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的剂量量或大小是如上所述的任何剂量或量。在一些实施方案中，在第一剂量或任何连续剂量中的细胞数在约0.5
×
106个细胞/kg受试者体重与5
×
106个细胞/kg之间、在约0.75
×
106个细胞/kg与3
×
106个细胞/kg之间、或在约1
×
106个细胞/kg与2
×
106个细胞/kg之间。
378.如本文所用，“第一剂量”用于描述在施用连续或后续剂量之前的给定剂量的时间安排。所述术语不一定暗示受试者以前从未接受过一定剂量的细胞疗法或，或者甚至受试者以前没有接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。
379.在一些实施方案中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向受试者施用多个剂量。熟练的医疗专业人员可以使用本文所述的用于诊断或跟踪治疗有效性(例如观察至少一种癌症症状)的任何方法来确定治疗期的长度。
380.在一些实施方案中，由连续剂量中的细胞表达的工程化受体(例如tcr)含有至少一个免疫应答性表位作为由第一剂量的细胞表达的受体(例如tcr)。在一些实施方案中，由在连续剂量中施用的细胞表达的受体(例如tcr)与由第一剂量表达的受体(例如tcr)相同，或者与由在第一剂量中施用的细胞表达的受体(例如tcr)基本上相同。
381.由以各种剂量施用至受试者的细胞表达的受体(例如tcr)通常识别或特异性地结合在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或对所治疗的疾病或病症或其细胞具有特异性的分子。在与分子(例如抗原)特异性地结合后，受体通常将免疫刺激信号(诸如itam转导的信号)递送到细胞中，从而促进针对疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，第一剂量中的细胞表达特异性地结合所表达的抗原的tcr。
382.实施例
383.在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
384.实施例1：载体构建体、细胞系和培养基
385.对于e202 tcr-t细胞，产生了含有2个编码区的mp71逆转录病毒载体构建体：(1)与小鼠tcrα链的恒定区融合的人抗e6 tcr的α链的可变区；(2)与小鼠tcrβ链的恒定区融合的同一人抗e6 tcr的β链的可变区(图1)。所述序列在seq id no:20中列出。完整的载体序列在seq id no:26中列出。
386.hek-293t、ca ski和t2细胞购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。来自匿名供体的外周血单核细胞(pbmc)购自hemacare。ca ski e6/e7细胞是通过用过表达人e6和e7的载体逆转录病毒转导ca ski细胞而产生的。将细胞在dmem(达尔伯克改良的伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium)+10％fbs(胎牛血清)或rpmi(罗斯威尔公园纪念研究所培养基(roswell park memorial institute medium))+10％fbs中培养。
387.实施例2：逆转录病毒载体产生、t细胞转导和扩增、以及tcr染色
388.通过使用标准磷酸钙沉淀方案瞬时转染hek-293t细胞来制备逆转录病毒载体。在48小时之后收获病毒上清液，并将其用于转导t细胞。在逆转录病毒转导之前，通过与t细胞激活珠和人il-2一起培养将pbmc激活2天。为了进行转导，通过在32c下以2,000g离心2小时，将新鲜收获的逆转录病毒上清液旋转加载到每孔用15g retronectin涂覆的经非组织培养物处理过的24孔板上(clontech laboratories)。将激活的pbmc加载到板上，并在32c下以600g旋转30分钟。
389.将t细胞在37c和5％co2下孵育。每2天补充一次培养基。所有抗体均购自biolegend。转导后48小时检测到重组tcr的表达。小鼠tcrβ链被抗体染色，随后进行流式细胞术分析。同时进行cd3、cd4和cd8染色。结果表明抗e6 tcr在人t细胞中大量表达(图2a-2b)。
390.实施例3：体外tcr-t细胞内ifn-γ产生
391.将tcr-t细胞与hpv肽脉冲的t2细胞以各种效应子与靶标比率进行共培养。根据制造商的说明，通过流式细胞术测量细胞内ifn-γ表达。发现含有抗e6 tcr的tcr-t细胞可以被靶细胞特异性地激活，这可以通过细胞内ifn-γ表达来测量(图3a-3b)。
392.实施例4：通过肽滴定确定e202 tcr的ec50
393.将另外的tcr-t细胞与脉冲进入t2抗原呈递细胞中的不同浓度的hpv肽一起共培养过夜。将tcr-t细胞和apc细胞以1:1的效应子与靶标比率进行共培养。然后收集t细胞，并测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
394.如图4所示，e202 tcr-t细胞以0.045μg/ml的ec50识别用e6肽脉冲的apc。
395.实施例5：e202 tcr-t细胞的体外特异性杀伤
396.对于e202 tcr-t细胞杀伤测定，将ca ski e6/e7细胞用cfse(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)预染色，并且然后与未转导的或tcr转导的t细胞以1:2、1:1、3:1或10:1的效应子与靶标比率共培养过夜。通过膜联蛋白v/7-aad染色测量t细胞对靶细胞的细胞毒性。如图5所示，e202 tcr-t细胞以特定的方式杀死e6+靶细胞(ca ski e6/e7)。在较高e:t比率的情况下，tcr-t细胞具有较高的杀伤能力。
397.实施例6：构建体设计
398.对于e202p03 tcr-t细胞，使用标准分子生物学技术产生了含有3个编码区的mp71逆转录病毒载体构建体：(1)与小鼠tcrα链的恒定区融合的人抗hpv16 e6 tcrα链的可变区；(2)与小鼠tcrβ链的恒定区融合的同一人抗hpv16 e6 tcr的β链的可变区；(3)用gs接头连接的免疫检查点抑制剂(ici)的重链和轻链的可变区(图6a-6b)。e202p03的序列在seq id no:25中列出。
399.实施例7：tcr染色
400.用e202或e202p03 tcr的构建体转导原代t细胞。转导后13天检测到重组tcr的表达。小鼠tcrβ链被抗体染色，随后进行流式细胞术分析。同时进行cd3、cd4和cd8染色。结果显示在未转导的原代t细胞中，未检测到重组tcr(图7a)。抗e6 tcr在用e202或e202p03的构建体转导的人t细胞中大量表达(图7b-7c)。所有抗体均购自biolegend。使用了活的cd3
+
淋巴细胞门控策略。
401.实施例8：体外细胞内ifn-γ产生
402.将tcr-t细胞与hpv肽脉冲的t2细胞以各种效应子与靶标比率进行共培养。根据制造商的说明，通过流式细胞术测量细胞内ifn-γ表达。发现由e202或e202p03的构建体转导以表达抗e6 tcr的tcr-t细胞可以被靶细胞特异性地激活，这可以通过细胞内ifn-γ表达来测量(图8b-8c)。未转导的t细胞未被靶细胞激活(图8a)。
403.实施例9：体外tcr-t ifn-γ分泌
404.将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:0、1:1、3:1或10:1的效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集细胞培养上清液，并根据制造商的说明使用人ifn-γelisa试剂盒测量上清液中的ifn-γ表达(图9)。
405.含有e6 tcr的tcr-t细胞可以被靶细胞激活，如通过ifn-γ表达所测量的。通过肽脉冲的apc或e6+靶细胞(ca ski e6/e7)刺激，e202和e202p03 tcr-t细胞比未转导的t细胞具有高得多的ifn-γ产生。
406.实施例10：体外tcr-t cd107a表达
407.将tcr-t细胞与表达hpv e6抗原的靶细胞以1:1效应子与靶标比率共培养过夜。然后收集t细胞，并通过流式细胞术测量在cd8(图10a-10c)或cd4(图10d-10f)亚群中的cd107a表达。结果表明，cd107a在cd8亚群中表达，但在cd4亚群中不表达。
408.实施例11：e202或e202p03 tcr-t细胞的体外特异性杀伤
409.用cfse对表达hpv e6抗原的靶细胞进行预染色，然后将其与tcr-t细胞以1:1、3:1或10:1的效应子与靶标比率共培养过夜。通过7-aad染色来测量t细胞对靶细胞的细胞毒性。
410.e202和e202p03 tcr-t细胞均以特异性方式杀死lmp2+靶细胞(ca ski)。未转导的t细胞比e202和e202p03 tcr-t细胞更弱地杀死靶细胞(图11)。因此，e202和e202p03 tcr-t细胞比未转导的tcr-t细胞具有更高的杀伤能力。
411.实施例12：在e202p03 tcr-t细胞培养物中的体外抗pd-1scfv表达
412.将e202或e202p03 tcr-t细胞以3
×
106/ml接种到24孔板中持续48小时。然后从细胞培养物中收集上清液，并测量上清液中的抗pd-1表达。结果表明，e202p03 tcr-t细胞比e202 tcr-t细胞表达更多的抗pd-1 scfv(图12)。
413.实施例13：e203、e204和e205 tcr-t细胞的tcr染色
414.还使用如本文所述的方法产生逆转录病毒载体构建体，以表达e203、e204或e205 tcr。用e203、e204或e205 tcr的构建体转导人pbmc。转导后5天检测到重组tcr的表达。小鼠tcrβ链被抗体染色，随后进行流式细胞术分析。同时进行cd3染色。结果表明，在未转导的人pbmc中，未检测到重组tcr(图13a)。抗e6 tcr在用e203、e204或e205 tcr的构建体转导的人pbmc中大量表达(图13b-13d)。使用了活的cd3+淋巴细胞门控策略。
415.实施例14：e203、e204和e205 tcr-t细胞的体外细胞内ifn-γ产生
416.将0.2
×
106个未转导的(ut)、e203、e204或e205 tcr-t细胞与0.4
×
106个ca ski e6/e7细胞(hpv e6和e7过表达的ca ski细胞)、ca ski细胞或293t细胞一起共培养过夜。然后将细胞用布雷菲德菌素a和莫能菌素处理4小时，其后通过流式细胞术测量细胞内ifn-γ水平。分析了cd4+(图14a-14p)和cd8+(图15a-15p)t细胞群二者。特别是对于cd8+t细胞，结果表明，由e203或e205构建体转导以表达抗e6tcr的tcr-t细胞可以被ca ski e6/e7细胞特异性地激活，如通过细胞内ifn-γ表达所确定的(图15f和图15n)。相比之下，未转导的t细胞未被ca ski e6/e7细胞激活(图15b)。
417.实施例15：e203、e204或e205 tcr-t细胞的体外特异性杀伤
418.将0.03
×
106个ca ski e6/e7细胞用celltrace
tm cfse标记，并且将0.03
×
106个293t细胞用celltrace
tm
紫色标记。将标记的ca ski e6/e7细胞和标记的293t细胞混合，并与未转导的(ut)、e203、e204或e205tcr-t细胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效应子与靶细胞比率共培养过夜(在96孔板中重复4次)。此后，通过流式细胞术对ca ski e6/e7活细胞和293t活细胞进行定量。添加珠作为流式细胞术分析的参考。基于ca ski e6/e7活细胞与珠的比率来计算绝对杀伤效力(图16a)，并且基于ca ski e6/e7活细胞与293t活细胞的比率来计算竞争杀伤效力(图16b)。结果表明靶细胞(ca ski e6/e7)杀伤特异性排名为：e203 tcr-t细胞》e205 tcr-t细胞》e204 tcr-t细胞。
419.实施例16：通过肽滴定确定e203 tcr的ec50
420.将e203 tcr-t细胞与抗原呈递细胞(apc)以1:1的效应子与靶细胞比率共培养过夜。用不同浓度的hpv肽对apc进行脉冲处理。然后收集t细胞，并测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
421.如图17a所示，当使用cd8+e203 tcr-t细胞识别hpv肽脉冲的apc时，ec50为1.045ng/ml。如图17b所示，当使用cd4+e203 tcr-t细胞识别hpv肽脉冲的apc时，ec50为17.62ng/ml。
422.实施例17.通过肽滴定确定e204 tcr的ec50
423.将e204 tcr-t细胞与抗原呈递细胞(apc)以1:1的效应子与靶细胞比率共培养过夜。用不同浓度的hpv肽对apc进行脉冲处理。然后收集t细胞，并测量细胞内ifn-γ表达以确定ec50。
424.如图18a-18b所示，e204 tcr-t细胞(包括cd8+和cd4+t细胞)没有表现出hpv肽依赖性激活。未确定e204 tcr-t细胞的ec50。
425.实施例18：通过肽滴定确定e205 tcr的ec50
426.将e205 tcr-t细胞与抗原呈递细胞(apc)以1:1的效应子与靶细胞比率共培养过夜。用不同浓度的hpv肽对apc进行脉冲处理。然后收集t细胞，并测量细胞内ifn-γ表达以
确定ec50。
427.如图19a所示，当使用cd8+e205 tcr-t细胞识别hpv肽脉冲的apc时，ec50为0.9167ng/ml。如图19b所示，当使用cd4+e205 tcr-t细胞识别hpv肽脉冲的apc时，ec50为10.42ng/ml。
428.其他实施方案
429.应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。