慢病毒载体的制作方法

1.本发明涉及慢病毒载体及其生产。更具体而言，本发明涉及包括经修饰的病毒顺式作用序列的慢病毒载体基因组，其中病毒顺式作用序列中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。本发明还提供了一种慢病毒载体基因组，其缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者。本发明还包括涉及这种慢病毒载体基因组的方法和用途。


背景技术：

2.在过去的几十年中，在科学期刊和专利中详细记载了用于疫苗和人类基因治疗的病毒载体的开发和制造。使用工程改造的病毒递送转基因以达到治疗效果的用途十分广泛。基于rna病毒和dna病毒的现代基因治疗载体已经在越来越多的人类疾病适应症中显示出前景，其中rna病毒例如为γ-逆转录病毒和慢病毒(参见文献“muhlebach,m.d.et al.,2010,retroviruses:molecular biology,genomics and pathogenesis,13:347-370”；“antoniou,m.n.,skipper,k.a.&anakok,o.,2013,hum.gene ther.,24:363-374”)，而dna病毒例如为腺病毒(参见文献“capasso,c.et al.,2014,viruses,6:832-855”)和腺相关病毒(aav)(参见文献“kotterman,m.a.&schaffer,d.v.,2014,nat.rev.genet.,15:445-451”)。这些方法包括针对血液病对患者细胞进行的离体修饰(参见文献“morgan,r.a.&kakarla,s.,2014,cancer j.,20:145-150；touzot,f.et al.,2014,expert opin.biol.ther.,14:789-798”)以及针对眼科(参见文献“balaggan,k.s.&ali,r.r.,2012,gene ther.,19:145-153”)、心血管(参见文献“katz,m.g.et al.,2013,hum.gene ther.,24:914-927”)、神经退行性疾病(参见文献“coune,p.g.,schneider,b.l.&aebischer,p.,2012,cold spring harb.perspect.med.,4:a009431”)进行的体内治疗、以及肿瘤疗法(参见文献“pazarentzos,e.&mazarakis,n.d.,2014,adv.exp.med biol.,818:255-280”)。
3.随着这些方法在临床试验中的成功继续朝着监管批准和商业化方向发展，在将病毒载体施用至患者时(例如在疫苗接种和基因治疗的情况下)，所涉及的安全方面是特别重要的。
4.本领域一直需要具有改进的安全性的病毒载体。
5.此外，用于治疗效果的转基因的规模也在增加。因此，本领域一直需要增加病毒载体的容量，即病毒载体可以递送的转基因的大小(或有效载荷)。


技术实现要素：

6.在一个方面中，本发明基于慢病毒载体基因组中存在的病毒顺式作用序列如rev应答元件(rre)中的内部开放阅读框(orf)的破坏。本发明人出乎意料地发现，对病毒顺式作用序列进行修饰以破坏至少一个内部orf(例如通过使表示至少一个内部orf的开始的atg序列突变)是可接受的，使得经修饰的病毒顺式作用序列保留其功能，例如经修饰的rre
保留rev结合能力。
7.因此，在一个方面中，本发明提供了包括至少一个经修饰的病毒顺式作用序列的慢病毒载体基因组，其中病毒顺式作用序列中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。可以通过使至少一个atg序列(atg序列可作为翻译起始密码子)突变破坏至少一个内部orf。
8.在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为：
9.a)rev应答元件(rre)；和/或
10.b)土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)。
11.在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为rre。
12.在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为wpre。
13.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括如本文所述的经修饰的rre和如本文所述的经修饰的wpre。
14.在另一个方面中，本发明提供了一种慢病毒载体基因组，其包括经修饰的rev应答元件(rre)，其中rre中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。可以通过使至少一个atg序列(atg序列可作为翻译起始密码子)突变破坏至少一个内部orf。
15.在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中wpre中至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。可以通过使至少一个atg序列突变破坏至少一个内部orf。
16.在另一个方面中，本发明基于编码gag-p17的核苷酸序列的删除。本发明人出乎意料地发现，从慢病毒载体基因组骨架删除编码gag-p17的核苷酸序列在慢病毒载体生产期间不显著影响载体滴度。
17.因此，在另一个方面中，本发明提供了缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组。慢病毒载体基因组可以(例如)不表达gag-p17或其片段。
18.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括至少一个经修饰的病毒顺式作用序列，其中病毒顺式作用序列中的至少一个内部orf被破坏。至少一个病毒顺式作用序列可为rre。至少一个病毒顺式作用序列可为wpre。在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括经修饰的rre和经修饰的wpre，其中rre中的至少一个内部orf被破坏，并且wpre中的至少一个内部orf被破坏。可以通过使至少一个atg序列突变破坏至少一个内部orf。
19.在一些实施方案中，经修饰的rre包括少于八个atg序列。
20.在另一个方面中，本发明提供了一种慢病毒载体基因组，其包括经修饰的rev应答元件(rre)，其中经修饰的rre包括少于八个atg序列。
21.在一些实施方案中，rre为全长rre。在一些实施方案中，rre为最小rre。
22.在一些实施方案中，rre包括：
23.a)与seq id no:1具有至少80％同一性的序列；和/或
24.b)与seq id no:2具有至少80％同一性的序列；
25.在一些实施方案中，经修饰的rre包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或者包括与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％同一性的序列，其中选自组(a)至(h)的至少一个atg序列发生突变：
26.a)对应于seq id no:2的位置27至29的atg；
27.b)对应于seq id no:2的位置192至194的atg；
28.c)对应于seq id no:2的位置207至209的atg；
29.d)对应于seq id no:2的位置436至438的atg；
30.e)对应于seq id no:2的位置489至491的atg；
31.f)对应于seq id no:2的位置571至573的atg；
32.g)对应于seq id no:2的位置599至601的atg；
33.h)对应于seq id no:2的位置663至665的atg。
34.在一些实施方案中，经修饰的rre包括少于七个、少于六个、少于五个、少于四个、少于三个、少于两个或少于一个atg序列。
35.在一些实施方案中，经修饰的wpre包括少于七个atg序列。在一些实施方案中，经修饰的wpre包括少于六个atg序列。
36.在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中经修饰的wpre包括少于七个atg序列。
37.在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中经修饰的wpre包括少于六个atg序列。
38.在一些实施方案中，wpre包括：
39.a)与seq id no:11具有至少80％同一性的序列；和/或
40.b)与seq id no:12具有至少80％同一性的序列。
41.在一些实施方案中，经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中选自组(a)至(g)的至少一个atg序列发生突变：
42.a)对应于seq id no:11的位置53至55的atg；
43.b)对应于seq id no:11的位置72至74的atg；
44.c)对应于seq id no:11的位置91至93的atg；
45.d)对应于seq id no:11的位置104至106的atg；
46.e)对应于seq id no:11的位置121至123的atg；
47.f)对应于seq id no:11的位置170至172的atg；和/或
48.g)对应于seq id no:11的位置411至413的atg。
49.在一些实施方案中，经修饰的wpre包括少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个或少于1个atg序列。在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括编码gag的经修饰的核苷酸序列，其中编码gag的经修饰的核苷酸序列中的至少一个内部orf被破坏。可以通过使至少一个atg序列突变破坏编码gag的经修饰的核苷酸序列中的至少一个内部orf。
50.在一些实施方案中，编码gag的核苷酸序列包括与seq id no:6或seq id no:7具有至少80％同一性的序列。
51.在一些实施方案中，编码gag的经修饰的核苷酸序列包括少于三个atg序列(例如，少于两个或少于一个内部atg序列)。
52.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)
编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者。慢病毒载体基因组可以(例如)不表达gag-p17或其片段。
53.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组中的主要剪接供体位点失活。主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点也失活。
54.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组还包括可产生治疗效果的目的核苷酸。
55.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组还包括色氨酸rna结合衰减蛋白(trap)结合位点。
56.在一些实施方案中，慢病毒载体源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒(visna lentivirus)。
57.在一些实施方案中，慢病毒载体基因组为慢病毒载体的rna基因组。
58.在另一个方面中，本发明提供了包括本发明的慢病毒载体基因组的慢病毒载体。慢病毒载体可源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒。
59.在一些实施方案中，本发明的慢病毒载体为转基因表达盒。
60.在另一个方面中，本发明提供了编码本发明的慢病毒载体基因组的核苷酸序列。
61.在一些实施方案中，本发明的慢病毒载体基因组可适用于在用于载体生产的不依赖u3或tat的系统中的慢病毒载体。如本文所述，第三代慢病毒载体不依赖u3/tat，并且根据本发明的慢病毒载体基因组可用于第三代慢病毒载体的情况中。在一个实施方案中，慢病毒载体生产系统中不提供tat，例如不以反式提供tat。在一个实施方案中，如本文所述的细胞或载体或载体生产系统不包括tat蛋白。在一个实施方案中，hiv-1u3不存在于慢病毒载体生产系统中，例如不以顺式提供hiv-1u3从而驱动载体基因组表达盒的转录。
62.在一些实施方案中，本发明的慢病毒载体基因组：
63.a)用于不依赖tat的慢病毒载体；
64.b)在不存在tat时生产；
65.c)不依赖tat转录；
66.d)用于不依赖u3的慢病毒载体；
67.e)不依赖u3启动子转录；或
68.f)通过异源启动子转录。
69.在一些实施方案中，如本文所述的核苷酸序列的转录不依赖于u3的存在。核苷酸序列可以源自不依赖u3的转录事件。核苷酸序列可以源自异源启动子。如本文所述的核苷酸序列可不包括天然u3启动子。
70.在另一个方面中，本发明提供了包括本发明的核苷酸序列的表达盒。
71.在另一个方面中，本发明提供了包括一组核苷酸序列的病毒载体生产系统，其中核苷酸序列编码包括gag-pol、env、任选的rev、以及本发明的慢病毒载体基因组的载体组分。
72.在另一个方面中，本发明提供了包括本发明的慢病毒载体基因组、本发明的核苷酸序列、本发明的表达盒或本发明的病毒载体生产系统的细胞。
73.在另一个方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的细胞，其包括：
74.a)编码包括gag-pol和env、以及任选的rev的载体组分的核苷酸序列、以及本发明的核苷酸序列或本发明的表达盒；或
75.b)本发明的病毒载体生产系统；以及
76.c)任选的编码经修饰的u1 snrna的核苷酸序列和/或任选的编码trap的核苷酸序列。
77.在另一个方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
78.(i)将以下引入细胞：
79.a)编码包括gag-pol和env、以及任选的rev的载体组分的核苷酸序列、以及本发明的核苷酸序列或本发明的表达盒；或
80.b)本发明的病毒载体生产系统；以及
81.c)任选的编码经修饰的u1 snrna的核苷酸序列和/或任选的编码trap的核苷酸序列；
82.(ii)任选地，选择包括编码载体组分的核苷酸序列和慢病毒载体基因组的细胞；以及
83.(iii)在适于生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
84.在另一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法生产的慢病毒载体。
85.在另一个方面中，本发明提供了本发明的慢病毒载体基因组、本发明的核苷酸序列、本发明的表达盒、本发明的病毒载体生产系统、或本发明的细胞用于生产慢病毒载体的用途。
86.在另一个方面中，本发明提供了一种包括本文所述的经修饰的rre的核苷酸序列。
87.在另一个方面中，本发明提供了由本发明的慢病毒载体基因组或本发明的慢病毒载体转导的细胞。
88.在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括本文所述的慢病毒载体或用本文所述的病毒载体转导的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
89.在另一个方面中，本发明提供了通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中组合物包括治疗有效量的慢病毒载体。
90.在另一个方面中，本发明提供了本发明的慢病毒载体或用本发明的慢病毒载体转导的细胞或组织在治疗中的用途。
91.在另一个方面中，本发明提供了本发明的慢病毒载体、本发明的生产细胞或用本发明的慢病毒载体转导的细胞或组织在制备用于将目的核苷酸递送至需要其的靶位点的药品中的用途。
附图说明
92.图1
93.示出了除去慢病毒载体基因组中rre-cppt区域中的orf的示意图。上方的图示出了第三代慢病毒载体表达盒的典型配置(rna由5'r区域编码)。图例：ru5(ltr区域)、ψ(核心包装信号)、msd(主要剪接供体)、gag(作为更宽包装信号的一部分的gag orf的保留序列)、rre(rev应答元件)、sa7(hiv-1剪接受体7)、cppt(中央多嘌呤束)、pro(启动子)、noi(目的核苷酸，例如转基因orf)、pre(转录后调控元件)、ppt(多嘌呤束)。下方展开的是不同框架中rre-cppt序列内保留的全部子orf的聚焦视图；cppt还具有atg密码子和来自pol基
因的子orf。图中示出了所有atg序列及其各自的修饰。在标准当代慢病毒载体基因组中，rre(～800nt)基本上从野生型hiv-1基因组的3'端重新定位，在rre的天然环境中，rre与包膜orf重叠。直至本发明为止，还没有报道尝试除去剩余的包膜部分orf，可以想到的是，剩余的包膜部分orf可以由载体基因组rna翻译。“std-rrecppt”是在标准慢病毒载体基因组中发现的典型序列。变体“rre[6-atgko]”和“rre[8-atgko]”这两者都包括突变，使得＞7个残基的全部子orf被去除，包括cppt区域；然而，rre[8-atgko]也包括去除7个残基的两个子orf的突变。新的变体“最小rre[2-atgko]”(也具有cppt子orf去除)是仅为234nt的rre的截短版本，并且也去除子orf。
[0094]
图2
[0095]
经修饰以缺乏＞7个残基的全部子orf的rre变体是完全功能性的。通过瞬时转染在无血清的悬浮hek293t细胞中生产编码gfp的慢病毒载体，并通过转导细胞的流式细胞术滴定。标准载体(stdrrecppt)与包括变体rre[6-atgko]的载体和完全缺乏rre(但保留cppt)的载体一起生产。数据证明，尽管存在去除atg密码子的插入核苷酸阵列，但在rre和cppt中缺乏子orf的变体是完全功能性的。
[0096]
图3
[0097]
经修饰以缺乏＞7个残基的全部子orf的rre变体在经修饰的u1 snrna存在时是完全功能性的。通过瞬时转染在无血清的悬浮hek293t细胞中生产编码gfp的慢病毒载体，并通过转导细胞的流式细胞术滴定。标准载体(stdrrecppt)与包括变体rre[6-atgko]的载体一起生产，并且任选地共转染靶向载体基因组rna的经修饰的u1 snrna(-/+256u1)。已经示出了通过稳定rna，靶向载体基因组rna的经修饰的u1 snrna可以使滴度增加。数据表明，在rre和cppt中缺乏子orf的新变体是完全功能性的，并且保持对由经修饰的u1 snrna引起的滴度增加的响应，表明在标准rre和新rre元件之间产生相似水平的vrna。
[0098]
图4
[0099]
示出了除去慢病毒载体基因组中包装序列的gag区域的orf的示意图。上方的图示出了第三代慢病毒载体表达盒的典型配置(rna由5'r区域编码)。图例：ru5(ltr区域)、ψ(核心包装信号)、msd(主要剪接供体)、gag(作为更宽包装信号的一部分的gag orf的保留序列)、rre(rev应答元件)、sa7(hiv-1剪接受体7)、cppt(中央多嘌呤束)、pro(启动子)、noi(目的核苷酸，例如转基因orf)、pre(转录后调控元件)、ppt(多嘌呤束)。在标准当代慢病毒载体基因组中，已经努力通过在初始gag atg的下游引入(通常)移码突变(+cg)～45nt，从而产生21个残基的短orf(其中前15个源自gag)，由此限制可能的gag表达。下方展开的是不同框架中gag内保留的全部子orf以及p17不稳定性元件(p17-ins)的聚焦视图。图中示出了所有atg序列及其各自的修饰。标准当代慢病毒载体基因组具有“std-gag”配置，其保留了p17-ins。图中示出了对新变体“δgag[3-atgko]”和“δgag[2-atgko]δins”的修饰。予以注意，δgag[2-atgko]δins序列缺乏整个p17-ins序列，包括atg3，因此提供了～250nt的额外转基因能力。
[0100]
图5
[0101]
缺乏子orf并在p17-ins中删除的gag序列可功能性替换慢病毒载体的包装区域的gag序列。通过瞬时转染在无血清的悬浮hek293t细胞中生产编码gfp的慢病毒载体，并通过转导细胞的流式细胞术滴定。标准载体(std-gag+stdrrecppt)与包括rre[6-atgko]和“δ
gag[2-atgko]δins”新变体序列的载体一起生产，并且任选地共转染靶向载体基因组rna的经修饰的u1 snrna(-/+256u1)。已经示出了通过稳定rna，靶向载体基因组rna的经修饰的u1 snrna可以使滴度增加。此外，在具有天然主要剪接供体(wtmsd)或msd-突变体(2ko-m5)的标准慢病毒载体内进行这些比较。已经表明，msd在载体基因组中产生“异常”剪接产物，从而得到较小全长的可包装vrna；提供经修饰的u1 srna可恢复msd突变的慢病毒载体的滴度。数据表明，在gag中缺乏子orf的变体和在p17-ins中删除的变体可与rre变体配对(也缺乏＞7个残基的子orf)，同时保留载体功能/滴度。msd突变变体(2ko-m5)也保持对由经修饰的u1 snrna引起的滴度增加的响应，表明在标准和新gag-rrecppt元件之间产生相似水平的vrna。
[0102]
图6
[0103]
示出了除去慢病毒载体基因组中wpre中的orf的示意图。上方的图示出了第三代慢病毒载体表达盒的典型配置(rna由5'r区域编码)。图例：ru5(ltr区域)、ψ(核心包装信号)、msd(主要剪接供体)、gag(作为更宽包装信号的一部分的gag orf的保留序列)、rre(rev应答元件)、sa7(hiv-1剪接受体7)、cppt(中央多嘌呤束)、pro(启动子)、noi(目的核苷酸，例如转基因orf)、pre(转录后调控元件)、ppt(多嘌呤束)。在标准当代慢病毒载体基因组中，通常去除wpre x蛋白。然而，没有尝试去除其他子orf，最显著的是源自whv pol的～160个残基的orf(rnaseh结构域)。下方展开的是保留在“标准物”(其中去除x蛋白(wpre[x-ko]))中和变体“wpreδorf”(其中去除另外全部剩余的6个atg密码子)中的全部子orf的聚焦视图。
[0104]
图7
[0105]
经修饰以缺乏全部子orf的wpre变体是完全功能性的。通过瞬时转染在无血清的悬浮hek293t细胞中生产编码gfp的慢病毒载体，并通过转导细胞的流式细胞术滴定。标准载体(wpre[x-ko])与包括变体wpreδorf的载体和完全缺乏wpre的载体一起生产。数据证明，尽管插入的核苷酸阵列去除了atg密码子，但是出乎意料地，在wpre中缺乏子orf的变体是完全功能性的。
[0106]
图8
[0107]
u1 snrna分子的示意图以及如何修饰靶向序列的实例。内源性非编码rna u1 snrna在内含子剪接的早期阶段中通过5'-(ac)uuaccug-3'(灰色突出显示)天然剪接供体靶向序列与共有剪接供体位点(5'-maggurr-3')结合。茎环i与u1a-70k蛋白结合，该蛋白已被证明对polya抑制很重要。茎环ii与u1a蛋白结合，并且5'-auuugugg-3'序列与茎环iv一起与sm蛋白结合，sm蛋白对u1 snrna加工很重要。在本公开中，经修饰的u1 snrna可被修饰以在天然剪接供体靶向序列的位点处引入与载体基因组vrna分子内的靶序列互补的异源序列；在该图中，给出的实例将经修饰的u1 snrna定向至标准hiv-1慢病毒载体基因组的15个核苷酸(相对于载体基因组分子的第一个核苷酸为256-270，256u1)(如果是包装信号，则位于sl1环中)。
具体实施方式
[0108]
病毒顺式作用序列
[0109]
本发明提供了包括至少一个经修饰的病毒顺式作用序列的慢病毒载体基因组，其
中病毒顺式作用序列中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。可以通过使至少一个atg序列(atg序列可作为翻译起始密码子)突变从而破坏至少一个内部orf。
[0110]
例如，当发生从上游细胞启动子的通读转录(慢病毒载体靶向活性转录位点)时，存在于转导的(例如患者)细胞中递送的载体骨架中的orf可以被转录，从而导致位于患者细胞中的载体骨架中的遗传物质的潜在异常转录。在生产细胞中生产慢病毒载体期间，也可发生在通读转录后的位于载体骨架中的遗传物质的这种潜在异常转录。
[0111]
存在于慢病毒载体基因组中的至少一个病毒顺式作用序列可以包括多个内部orf。可以在病毒顺式作用序列的内部atg序列和紧接atg序列3'端的终止密码子之间发现这些内部orf。
[0112]
本发明人出乎意料地发现，例如通过使表示至少一个内部orf的开始的atg序列突变，对病毒顺式作用序列进行修饰以破坏至少一个内部orf是可接受的。因此，本文所述的经修饰的病毒顺式作用序列保留其功能性。
[0113]
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括至少两个(适宜地为至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个)经修饰的病毒顺式作用序列。
[0114]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列中的至少两个(适宜地为至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少十六个、至少十七个、至少十八个、至少十九个或至少二十个)内部orf可被破坏。在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列中的至少三个内部orf可被破坏。
[0115]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列中的一个(适宜地为两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个)内部orf可被破坏。
[0116]
在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不翻译。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf翻译。因此，存在于转导细胞中递送的载体骨架中的经修饰的病毒顺式作用序列中的至少一个内部orf可被破坏，使得当存在来自上游细胞启动子的通读转录时，防止内部orf的异常转录。
[0117]
在一个实施方案中，可以通过使至少一个atg序列突变破坏至少一个内部orf。atg序列的“突变”可以包括一个或多个核苷酸删除、添加或取代。
[0118]
在一个实施方案中，在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可以突变为选自由以下组成的组中的序列：
[0119]
a)attg序列；
[0120]
b)acg序列；
[0121]
c)a-g序列；
[0122]
d)aag序列；
[0123]
e)ttg序列；和/或
[0124]
f)att序列。
[0125]
在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为attg序列。在经修饰
的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为acg序列。在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为a-g序列。在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为aag序列。在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为ttg序列。在经修饰的病毒顺式作用序列中，至少一个atg序列可突变为att序列。
[0126]
在一个实施方案中，至少一个经修饰的病毒顺式作用元件可缺乏atg序列。
[0127]
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组中病毒顺式作用序列中的全部atg序列突变。
[0128]
慢病毒载体通常包括多种病毒顺式作用序列。病毒顺式作用序列的实例包括rev应答元件(rre)、中央多嘌呤束(cppt)和土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)。
[0129]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列可为至少一个慢病毒顺式作用序列。慢病毒顺式作用序列的实例包括rre和cppt。
[0130]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列可为至少一个非慢病毒顺式作用序列。
[0131]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列可为至少一个慢病毒顺式作用序列和至少一个非慢病毒顺式作用序列。
[0132]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为：
[0133]
a)rev应答元件(rre)；和/或
[0134]
b)土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)。
[0135]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为rre。
[0136]
在一些实施方案中，至少一个病毒顺式作用序列为wpre。
[0137]
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括至少两个(适宜地为至少3个、至少4个、至少5个)经修饰的病毒顺式作用序列。
[0138]
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组包括本文所述的经修饰的rre和本文所述的经修饰的wpre。
[0139]
慢病毒载体基因组还可包括编码gag的经修饰的核苷酸序列，其中破坏编码gag的经修饰的核苷酸序列中至少一个内部orf。至少一个内部orf可被破坏使得内部orf不表达。因此，在转导细胞中递送的载体骨架中编码gag的经修饰的核苷酸序列中存在的至少一个内部orf可被破坏，使得当存在来自上游细胞启动子的连读转录时，防止内部orf的异常转录。
[0140]
可以通过使至少一个atg序列突变破坏编码gag的经修饰的核苷酸序列中的至少一个内部orf。atg序列的“突变”可以包括一个或多个核苷酸删除、添加或取代。
[0141]
在一个实施方案中，在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为选自由以下组成的组中的序列：
[0142]
a)attg序列；
[0143]
b)acg序列；
[0144]
c)a-g序列；
[0145]
d)aag序列；
[0146]
e)ttg序列；和/或
[0147]
f)att序列。
[0148]
在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为attg序列。在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为acg序列。在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变成a-g序列。在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为aag序列。在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为ttg序列。在编码gag的经修饰的核苷酸序列中，至少一个atg序列可以突变为att序列。
[0149]
编码gag的核苷酸序列可为编码gag的一部分的截短核苷酸序列。编码gag的核苷酸序列可为编码gag的一部分的最小截短核苷酸序列。gag的一部分可为连续序列。编码gag的一部分的截短核苷酸序列或最小截短核苷酸序列也可以包括至少一个移码突变。
[0150]
编码gag的一部分并且在位置45至46处包括移码突变的截短核苷酸序列的实例如下：
[0151]
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagagggagagcaaaacaaaagtaaga(seq id no:6)。
[0152]
编码gag的一部分并且在位置45至46处包括移码突变的最小截短核苷酸序列的实例如下：
[0153]
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaaga(sed id no:7)。
[0154]
编码gag的核苷酸序列可以例如包括：
[0155]
a)与seq id no:6具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列；或
[0156]
b)与seq id no:7具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0157]
编码gag的核苷酸序列可包括与seq id no:6具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0158]
编码gag的核苷酸序列可包括与seq id no:7具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0159]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可以包括：
[0160]
a)与seq id no:6具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列；或
[0161]
b)与seq id no:7具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的
序列。
[0162]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括与seq id no:6具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0163]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括与seq id no:7具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0164]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括seq id no:6或seq id no:7所示的序列，或与seq id no:6或seq id no:7所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中选自(a)至(c)的至少一个atg序列突变：
[0165]
a)对应于seq id no:6的位置1至3的atg；
[0166]
b)对应于seq id no:6的位置47至49的atg；和/或
[0167]
c)对应于seq id no:6的位置107至109的atg。
[0168]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括seq id no:6或seq id no:7所示的序列，或与seq id no:6或seq id no:7所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:6的位置1至3的atg突变。
[0169]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括seq id no:6或seq id no:7所示的序列，或与seq id no:6或seq id no:7所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:6的位置47至49的atg突变。
[0170]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括如seq id no:6或seq id no:7所示的序列，或与seq id no:6或seq id no:7所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:6的位置107至109的atg突变。
[0171]
编码gag的一部分并并且包括移码突变的经修饰的截短核苷酸序列的实例如下：
[0172]
acgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgattgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtattgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagagggagagcaaaacaaaagtaaga(seq id no:8)。
[0173]
编码gag的一部分并且包括移码突变的经修饰的最小截短核苷酸序列的实例如下：
[0174]
acgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgattgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaaga(sed id no:9)。
[0175]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括seq id no:8所示的序列，或与seq id no:8所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。该序列可包
括少于三个(适宜地为少于两个或少于一个)atg序列。
[0176]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括seq id no:9所示的序列，或与seq id no:9所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。该序列可包括少于两个(适宜地为少于一个)atg序列。
[0177]
编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括少于三个atg序列。适宜地为编码gag的经修饰的核苷酸序列可包括少于两个或少于一个atg序列。编码gag的经修饰的核苷酸序列可缺乏atg序列。
[0178]
本文所述的慢病毒载体基因组可缺乏编码gag-p17或其片段的核苷酸序列。慢病毒载体基因组可例如不表达gag-p17或其片段。在一个实施方案中，慢病毒载体基因组可缺乏seq id no:10所示的序列。
[0179]
慢病毒载体基因组可为慢病毒载体的rna基因组。
[0180]
本文所述的慢病毒载体可为转基因表达盒。
[0181]
在一个实施方案中，慢病毒载体源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒。
[0182]
在一个实施方案中，本文所述的慢病毒载体基因组在载体基因组骨架中缺乏atg序列。在一个实施方案中，除了noi(转基因)之外，本文所述的慢病毒载体基因组缺乏atg序列。
[0183]
在另一个方面中，本发明提供编码本文所述的慢病毒载体基因组的核苷酸序列。
[0184]
在另一个方面中，本发明提供了包括至少一个经修饰的病毒顺式作用序列的慢病毒载体基因组，其中去除病毒顺式作用序列中的至少一个内部开放阅读框(orf)。
[0185]
在另一个方面中，本发明提供了包括至少一个经修饰的病毒顺式作用序列的慢病毒载体基因组，其中病毒顺式作用序列中的至少一个内部开放阅读框(orf)沉默。
[0186]
经修饰的rev应答元件(rre)
[0187]
本发明提供了包括经修饰的rev应答元件(rre)的慢病毒载体基因组，其中rre中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。
[0188]
例如，当发生从上游细胞启动子的通读转录(慢病毒载体靶向活性转录位点)时，存在于转导的(例如患者)细胞中递送的载体骨架中的orf可以被转录，从而导致位于患者细胞中的载体骨架中的遗传物质的潜在异常转录。在生产细胞中生产慢病毒载体期间，也可发生在通读转录后的位于载体骨架中的遗传物质的这种潜在异常转录。
[0189]
rre是一种在慢病毒载体和不同的野生型hiv-1分离株中都非常保守的必需病毒rna元件。存在于慢病毒载体基因组中的rre可包括多个内部orf。可以在rre的内部atg序列和紧接atg序列3'端的终止密码子之间发现这些内部orf。
[0190]
存在于慢病毒载体基因组中的rre通常嵌入包括朝向rna的5'区域(5'utr)的高度结构化rna的包装区域。5'utr结构由通过小连接子连接的一系列茎-环结构组成。这些茎-环包括rre。因此，rre本身具有涉及rev结合的互补碱基配对的复杂二级结构。
[0191]
本发明人出乎意料地发现，例如通过使表示至少一个内部orf的开始的atg序列突变，对rre进行修饰以破坏至少一个内部orf是可接受的。因此，本文所述的经修饰的rre保留rev结合能力。
[0192]
在一些实施方案中，rre中的至少两个(适宜地为至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、或至少八个)内部orf可被破坏。在一些实施方案中，rre中的至少三个内部orf可被破坏。
[0193]
在一些实施方案中，rre中的一个(适宜地为两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个)内部orf可被破坏。
[0194]
在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不翻译。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf翻译。因此，可破坏存在于转导细胞中递送的载体骨架中的经修饰的rre中的至少一个内部orf，使得当存在来自上游细胞启动子的通读转录时，防止内部orf的异常转录。
[0195]
在一个实施方案中，可以通过使至少一个atg序列突变破坏至少一个内部orf。atg序列的“突变”可以包括一个或多个核苷酸删除、添加或取代。
[0196]
在一个实施方案中，在经修饰的rre中，至少一个atg序列可以突变为选自由以下组成的组中的序列：
[0197]
a)attg序列；
[0198]
b)acg序列；
[0199]
c)a-g序列；
[0200]
d)aag序列；
[0201]
e)ttg序列；和/或
[0202]
f)att序列。
[0203]
在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为attg序列。在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为acg序列。在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为a-g序列。在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为aag序列。在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为ttg序列。在经修饰的rre中，至少一个atg序列可突变为att序列。
[0204]
经修饰的rre可包括少于八个atg序列。
[0205]
因此，在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的rev应答元件(rre)的慢病毒载体基因组，其中经修饰的rre包括少于八个atg序列。
[0206]
适宜地，经修饰的rre可包括少于七个、少于六个、少于五个、少于四个、少于三个、少于两个或少于一个atg序列。经修饰的rre可以缺乏atg序列。
[0207]
rre可为最小功能性rre。最小功能性rre的实例如下：
[0208]
aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct(seq id no:1)。
[0209]“最小功能性rre”或“最小rre”是指保留全长rre的功能性的截短rre序列。因此，最小功能性rre保留rev结合能力。
[0210]
rre可为全长rre。全长rre的实例如下：
[0211]
tgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagta
gtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggac(seq id no:2)。
[0212]
rre可包括：
[0213]
a)与seq id no:1具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列；和/或
[0214]
b)与seq id no:2具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0215]
rre可包括与seq id no:1具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0216]
rre可包括与seq id no:2具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0217]
经修饰的rre可包括：
[0218]
a)与seq id no:1具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列；和/或
[0219]
b)与seq id no:2具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0220]
经修饰的rre可包括与seq id no:1具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0221]
经修饰的rre可包括与seq id no:2具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0222]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，
其中选自(a)至(h)的至少一个atg序列发生突变：
[0223]
a)对应于seq id no:2的位置27至29的atg；
[0224]
b)对应于seq id no:2的位置192至194的atg；
[0225]
c)对应于seq id no:2的位置207至209的atg；
[0226]
d)对应于seq id no:2的位置436至438的atg；
[0227]
e)对应于seq id no:2的位置489至491的atg；
[0228]
f)对应于seq id no:2的位置571至573的atg；
[0229]
g)对应于seq id no:2的位置599至601的atg；和/或
[0230]
h)对应于seq id no:2的位置663至665的atg。
[0231]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置27至29的atg突变。
[0232]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:2的位置192至194的atg突变。
[0233]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置207至209的atg突变。
[0234]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置436至438的atg突变。
[0235]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置489至491的atg突变。
[0236]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置571至573的atg突变。
[0237]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置599至601的atg突变。
[0238]
经修饰的rre可包括seq id no:1或seq id no:2所示的序列，或与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列，其中对应于seq id no:2的位置663至665的atg突变。
[0239]
经修饰的rre序列的实例如下：
[0240]
aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactattgggcgcagcgtcaattgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct(seq id no:3)。
[0241]
经修饰的rre序列的其他实例如下：
[0242]
tgatcttcagacctggaggaggagatattgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactattgggcgcagcgtcaattgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaattgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggattggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataattgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggac(seq id no:4)。
[0243]
缺乏atg序列的经修饰的rre序列的实例如下：
[0244]
tgatcttcagacctggaggaggagatattgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactattgggcgcagcgtcaattgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaattgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggattggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataattgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggac(seq id no:5)。
[0245]
经修饰的rre可包括seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5所示的序列，或与seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。该序列可包括少于八个(适宜地为少于七个、少于六个、少于五个、少于四个、少于三个、少于两个或少于一个)atg序列。
[0246]
土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)
[0247]
在一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中wpre中的至少一个内部开放阅读框(orf)被破坏。
[0248]
wpre可增强来自包括慢病毒载体的许多不同载体类型的表达(参见文献“美国专利no.6,136,597、no.6,287,814”；“zufferey,r.,et al.(1999)j.virol.73:2886-92”)。不希望受理论束缚，认为这种增强是由于处于转录后水平的rna加工得以改善，从而使得核转录物水平增加。mrna稳定性的两倍增加也有助于这种增强(参见文献“zufferey,r.,et al.,”，出处同上)。据报道，与不包括wpre的转录物相比，包括wpre的转录物的蛋白质表达增强水平为约2倍至5倍，并与转录物水平的增加密切相关。这已经用许多不同的转基因得以证明(参见文献“zufferey,r.,et al.,”，出处同上)。
[0249]
wpre包括三种对其增强表达水平的功能性重要的顺式作用序列。此外，wpre包括具有whv x蛋白orf(全长orf为425bp)的5'端的约180bp的片段，以及与该片段相关的启动子。全长x蛋白与肿瘤发生有关(参见文献“flajolet,m.et al,(1998)j.virol.72:6175-6180”)。从x启动子起始的转录物的翻译使得形成代表x蛋白的nh2端60个氨基酸的蛋白质。这种截短x蛋白可促进肿瘤发生，特别是当截短x蛋白序列整合至宿主细胞基因组的特定位点时(参见文献“balsano,c.et al,(1991)biochem.biophys res.commun.176:985-92”；“flajolet,m.et al,(1998)j.virol.72:6175-80”；“zheng,y.w.,et al,(1994)j.biol.chem.269:22593-8；runkel,l.,et al,(1993)virology 197:529-36”)。因此，当将截短x蛋白递送至目的细胞时，截短x蛋白的表达可促进肿瘤发生，从而阻碍了野生型wpre序列的安全使用。
[0250]
us 2005/0002907公开了对应于x蛋白orf的wpre的区域的突变去除了x蛋白的致瘤活性，从而使得wpre安全地用于逆转录病毒和慢病毒表达载体以增强目的异源基因或核苷酸的表达水平。
[0251]
如本文所用，将wpre的“x区域”定义为包括x蛋白orf的至少前60个氨基酸，包括翻译起始密码子及其相关启动子。在本文中，将“功能性”x蛋白定义为这样的截短x蛋白，当该截短x蛋白在目的细胞中表达时，其能够促进肿瘤发生或表型转化。在本技术的上下文中，将“非功能性”x蛋白定义为不能促进目的细胞中肿瘤发生的x蛋白。
[0252]
本文所述的经修饰的wpre保留了增强慢病毒载体表达的能力。
[0253]
在一些实施方案中，wpre中的至少两个(适宜地为至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、或至少七个)内部orf可被破坏。在一些实施方案中，wpre中的至少三个内部orf可被破坏。
[0254]
在一些实施方案中，wpre中的一个(适宜地为两个、三个、四个、五个、六个或七个)内部orf可被破坏。
[0255]
在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得内部orf不翻译。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf表达。在一些实施方案中，至少一个内部orf可被破坏，使得没有蛋白质从内部orf翻译。因此，存在于转导细胞中递送的载体骨架中的经修饰的wpre中的至少一个内部orf可被破坏，使得当存在来自上游细胞启动子的通读转录时，防止内部orf的异常转录。
[0256]
在一个实施方案中，可以通过使至少一个atg序列突变破坏至少一个内部orf。atg序列的“突变”可以包括一个或多个核苷酸删除、添加或取代。
[0257]
在一个实施方案中，在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可以突变为选自由以下
组成的组中的序列：
[0258]
a)attg序列；
[0259]
b)acg序列；
[0260]
c)a-g序列；
[0261]
d)aag序列；
[0262]
e)ttg序列；和/或
[0263]
f)att序列。
[0264]
在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为attg序列。在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为acg序列。在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为a-g序列。在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为aag序列。在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为ttg序列。在经修饰的wpre中，至少一个atg序列可突变为att序列。
[0265]
经修饰的wpre可包括少于七个atg序列。经修饰的wpre可包括少于六个atg序列。
[0266]
因此，在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中经修饰的wpre包括少于七个atg序列。
[0267]
在另一个方面中，本发明提供了包括经修饰的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)的慢病毒载体基因组，其中经修饰的wpre包括少于六个atg序列。
[0268]
适宜地，经修饰的wpre可包括少于七个、少于六个、少于五个、少于四个、少于三个、少于两个或少于一个atg序列。经修饰的wpre可缺乏atg序列。
[0269]
在一些实施方案中，wpre的x区域中的至少一个atg序列突变，由此阻止功能性x蛋白的表达。在优选的实施方案中，突变发生在x区域的翻译起始密码子中。由于至少一个atg序列突变，因此x蛋白可不表达。
[0270]
在一些实施方案中，经修饰的wpre在wpre的x区域的atg序列中不包括突变。
[0271]
wpre序列的实例如下：
[0272]
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcc(seq id no:11)。
[0273]
包括经破坏的x蛋白orf的wpre序列的实例如下：
[0274]
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcg
gcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcc(seq id no:12)。
[0275]
wpre可包括：
[0276]
a)与seq id no:11具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列；和/或
[0277]
b)与seq id no:12具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0278]
wpre可包括与seq id no:11具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0279]
wpre可包括与seq id no:12具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0280]
经修饰的wpre可包括与seq id no:11具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0281]
经修饰的wpre可包括与seq id no:12具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
[0282]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中选自组(a)至(g)的至少一个atg序列发生突变：
[0283]
a)对应于seq id no:11的位置53至55的atg；
[0284]
b)对应于seq id no:11的位置72至74的atg；
[0285]
c)对应于seq id no:11的位置91至93的atg；
[0286]
d)对应于seq id no:11的位置104至106的atg；
[0287]
e)对应于seq id no:11的位置121至123的atg；
[0288]
f)对应于seq id no:11的位置170至172的atg；和/或
[0289]
g)对应于seq id no:11的位置411至413的atg。
[0290]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置53至55的atg突变。
[0291]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置72至74的atg突变。
[0292]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置91至93的atg突变。
[0293]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置104至106的atg突变；
[0294]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置121至123的atg突变；
[0295]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置170至172的atg突变；和/或
[0296]
经修饰的wpre可包括seq id no:11或seq id no:12所示的序列，或与seq id no:11或seq id no:12所示的序列具有至少80％同一性(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)的序列，其中对应于seq id no:11的位置411至413的atg突变。
[0297]
wrpe通常包括保留的pol orf。保留的pol orf序列的实例如下：
[0298]
atgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcc(seq id no:13)。
[0299]
在一个实施方案中，在wpre中保留的pol orf序列中的至少一个(适宜地为至少两个或至少三个)atg序列突变。在一个实施方案中，在wpre中保留的pol orf序列中的全部atg序列突变。
[0300]
在一个实施方案中，经修饰的wpre包括在wpre中保留的pol orf序列中的少于三个(适宜地为少于两个或少于一个)atg序列。在一个实施方案中，经修饰的wpre缺乏在wpre中保留的pol orf序列中的atg序列。
[0301]
保留的pol orf中的全部atg密码子突变的经修饰的wpre序列的实例如下：
[0302]
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcattgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttattgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttcccc
ctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcc(seq id no:14)。
[0303]
缺乏atg序列的经修饰的wpre序列的实例如下：
[0304]
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactattgttgctccttttacgctattgtggatacgctgctttaattgcctttgtatcattgctattgcttcccgtattggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttattgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctcc(seq id no:15)。
[0305]
经修饰的wpre可包括seq id no:14或seq id no:15所示的序列，或与seq id no:14或seq id no:15所示的序列具有至少80％(适宜地为至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。该序列可包括少于六个(适宜地为少于五个、少于四个、少于三个、少于两个或少于一个)atg序列。
[0306]
病毒gag-p17蛋白
[0307]
本发明提供了一种慢病毒载体基因组，其缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者。
[0308]
病毒蛋白gag-p17围绕慢病毒载体颗粒的衣壳，并且又由包膜蛋白围绕。在过去，编码gag-p17的核苷酸序列已经包括在用于生产治疗性慢病毒载体的慢病毒载体基因组中。慢病毒载体基因组中编码gag-p17的核苷酸序列通常嵌入包括朝向rna的5'区域(5'utr)的高度结构化rna的包装区域。编码gag-p17的核苷酸序列通常包括rna不稳定序列(ins)，在本文中称为p17-ins。
[0309]
本发明人出乎意料地发现，在慢病毒载体生产期间，从慢病毒载体基因组的骨架删除p17-ins不会显著影响载体滴度。
[0310]
与包括编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的慢病毒载体基因组相比，缺乏编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的慢病毒载体基因组的大小更小。因此，当使用缺乏编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的慢病毒载体基因组时，转导细胞中递送的病毒载体骨架内所含的病毒dna的量减少。此外，与使用包括编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的慢病毒载体基因组递送的转基因相比，缺乏编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的慢病毒载体基因组可用于递送更大的转基因。因此，存在可能需要删除载体骨架中编码gag-p17或p17-ins的核苷酸序列的几个原因。
[0311]
本发明提供了缺乏编码p17-ins或其片段的核苷酸序列的慢病毒载体基因组。
[0312]
p17-ins的实例如下：
[0313]
aaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagagggagagcaaaacaaaagta(seq id no:10)。
[0314]
在一个实施方案中，慢病毒载体基因组可缺乏seq id no:10所示的序列。
[0315]
在一个实施方案中，编码gag-p17的核苷酸序列的片段为编码gag-p17的全长核苷酸序列的一部分。在一个实施方案中，该片段包括至少约10个核苷酸(适宜地为至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、至少约350个核苷酸)或由上述核苷酸组成。
[0316]
在一个实施方案中，编码gag-p17的核苷酸序列的片段的长度可在编码gag-p17的全长核苷酸序列的1％和99％之间。适宜地，编码gag-p17的核苷酸序列的片段的长度可为编码gag-p17的全长核苷酸序列如编码gag-p17的天然核苷酸序列的至少约10％(适宜地为至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％)。该片段可为编码gag-p17的全长核苷酸序列的连续区域，例如编码gag-p17的天然核苷酸序列。
[0317]
在一个实施方案中，编码gag-p17的核苷酸序列的片段的长度可在编码p17-ins的全长核苷酸序列的1％和99％之间。适宜地，编码gag-p17的核苷酸序列的片段的长度可为编码p17-ins的全长核苷酸序列如编码p17-ins的天然核苷酸序列(例如seq id no:10)的至少约10％(适宜地为至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％)。该片段可为编码p17-ins的全长核苷酸序列的连续区域，例如编码p17-ins的天然核苷酸序列(例如seq id no:10)。
[0318]
在一个实施方案中，编码gag-p17的核苷酸序列的片段包括位于编码gag-p17的核苷酸序列中的ins或由上述ins组成。
[0319]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括至少一个如本文所述的经修饰的病毒顺式作用序列。
[0320]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的rre。
[0321]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的wpre。
[0322]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的rre和本文所述的经修饰的wpre。
[0323]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括如本文所述的编码gag的经修
饰的核苷酸序列。
[0324]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的rre和本文所述的编码gag的经修饰的核苷酸序列。
[0325]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的wpre和本文所述的编码gag的经修饰的核苷酸序列。
[0326]
在一个实施方案中，缺乏(i)编码gag-p17的核苷酸序列或(ii)编码gag-p17的核苷酸序列的片段这两者中的一者的慢病毒载体基因组可包括本文所述的经修饰的rre、本文所述的经修饰的wpre和本文所述的编码gag的经修饰的核苷酸序列。
[0327]
慢病毒载体基因组可为慢病毒载体的rna基因组。
[0328]
在一个实施方案中，慢病毒载体源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒。
[0329]
在另一个方面中，本发明提供了编码本文所述的慢病毒载体基因组的核苷酸序列。
[0330]
载体/表达盒
[0331]
载体是一种工具，其允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境。根据本发明，并以举例的方式，在重组核酸技术中使用的一些载体使得实体，如核酸区段(例如，异源性dna区段，如异源性cdna区段)，转移到靶细胞中并由靶细胞表达。载体可促进整合编码病毒载体组分的核苷酸序列，以维持编码病毒载体组分的核苷酸序列和其在靶细胞内的表达。
[0332]
载体可以是表达盒或可以包括表达盒(也称为表达构建体)。如本文所述的表达盒包括含有能够被转录的序列的核酸区域。因此，编码mrna、trna和rrna的序列包括在该定义中。
[0333]
载体可包括一种或以上可选择的标记基因(例如，新霉素抗性基因)和/或可追踪的标记基因(例如，编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因)。载体可用于例如感染和/或转导靶细胞。载体还可包括使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列，例如条件复制型溶瘤载体。
[0334]
术语“盒”，与诸如“偶联物”、“构建体”和“杂交体”之类的术语同义，包括直接或间接连接到启动子的多核苷酸序列。用于本发明的表达盒包括用于表达编码病毒载体组分的核苷酸序列的启动子和任选的编码病毒载体组分的核苷酸序列的调节子。优选地，所述盒至少包括能够连接至启动子的多核苷酸序列。
[0335]
表达盒(例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体)的选择通常取决于待引入的宿主细胞。表达盒可以是dna质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环dna(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包括目的区域的质粒dna、使用酶促dna扩增平台生成的dna，例如doggybone dna(dbdnatm)，其中使用的最终dna处于闭合连接形式，或该dna已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
[0336]
在另一个方面中，本发明提供了包括本文所述的慢病毒载体基因组的慢病毒载体。慢病毒载体可源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒。慢病毒载体可为慢病毒载体颗粒的形式。
[0337]
在另一个方面中，本发明提供了包括本发明的核苷酸序列的表达盒。
[0338]
慢病毒载体生产系统和细胞
[0339]
慢病毒载体生产系统包括一组核苷酸序列，其编码生产慢病毒载体所需的组分。因此，载体生产系统包括一组核苷酸序列，其编码产生慢病毒载体颗粒所必需的病毒载体组分。
[0340]“病毒载体生产系统”或“载体生产系统”或“生产系统”应理解为包括慢病毒载体生产所需组分的系统。
[0341]
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包括编码本文所述的慢病毒载体基因组、gag和gag/pol蛋白以及env蛋白的核苷酸序列。生产系统可任选地包括编码rev蛋白或其功能替代物的核苷酸序列。
[0342]
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包括模块化核酸构建体(模块化构建体)。模块化构建体是包括两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的dna表达构建体。模块化构建体可以是包括两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的dna质粒。质粒可以是细菌质粒。核酸可以编码例如gag-pol、rev、env、载体基因组。此外，设计用于生成包装和生产者细胞系的模块化构建体可能还需要编码转录调节蛋白(例如tetr、cymr)和/或翻译阻遏蛋白(例如，trap)和可选择的标记(例如，zeocin
tm
、潮霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、新霉素抗性基因)。用于本发明的适宜的模块化构建体在ep 3502260中进行了描述，该专利的全部内容通过引用并入本文。
[0343]
由于根据本发明使用的模块化构建体包括在一个构建体上编码两个或以上逆转录病毒组分的核酸序列，因此考虑了这些模块化构建体的安全性，并将额外的安全特征直接设计到构建体中。这些特征包括将绝缘子用于逆转录病毒载体组分的多个开放阅读框和/或在模块化构建体中使用逆转录病毒基因的特定方向和排列。据信，通过使用这些特征，将防止直接通读以生成具有复制能力的病毒颗粒。
[0344]
在模块化构建体中，编码病毒载体组分的核酸序列可以处于反向和/或交互的转录方向。因此，编码病毒载体组分的核酸序列不是以相同的5'到3'方向呈现，使得病毒载体组分不能由相同的mrna分子产生。反向可能意味着不同载体组分的至少两个编码序列以“头对头”和“尾对尾”转录方向存在。这可以通过在模块化构建体的一条链上提供一个载体组分(例如env)的编码序列并在模块化构建体的另一条链上提供另一个载体组分(例如rev)的编码序列来实现。优选地，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，至少两个编码序列以逆转录方向存在。因此，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，每个元件可以定向为使得它以与相邻的其他载体组分的所有相邻编码序列相反的5'到3'方向存在，即每个编码序列可采用交互的5'到3'(或转录)方向。
[0345]
根据本发明使用的模块化构建体可以包括编码以下载体组分中的两种或以上的核酸序列：如本文所述的慢病毒载体基因组、gag-pol、rev、env。模块化构建体可以包括编码载体组分的任何组合的核酸序列。在一个实施方案中，模块化构建体可以包括编码以下组分的核酸序列：
[0346]
i)逆转录病毒载体的rna基因组和rev或其功能替代物；
[0347]
ii)逆转录病毒载体的rna基因组和gag-pol；
[0348]
iii)逆转录病毒载体的rna基因组和env；
[0349]
iv)gag-pol和rev或其功能替代物；
[0350]
v)gag-pol和env；
[0351]
vi)env和rev或其功能替代物；
[0352]
vii)逆转录病毒载体的rna基因组、rev或其功能替代物以及gag-pol；
[0353]
viii)逆转录病毒载体的rna基因组、rev或其功能替代物以及env；
[0354]
ix)逆转录病毒载体的rna基因组、gag-pol和env；或者
[0355]
x)gag-pol、rev或其功能替代物以及env，
[0356]
其中核酸序列处于反向和/或交互方向。
[0357]
在一个实施方案中，用于生产逆转录病毒载体的细胞可包括编码上述i)至x)组合中任一种的核酸序列，其中所述核酸序列位于同一遗传基因座并处于反向和/或交互方向。同一遗传基因座可以指细胞中的单个染色体外基因座，例如细胞基因组中的单个质粒或单个基因座(即单个插入位点)。细胞可以是用于生产逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)的稳定或瞬时细胞。在一个方面中，细胞不包括tat。
[0358]
dna表达构建体可以是dna质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环dna(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包括目的区域的质粒dna、使用酶促dna扩增平台产生的dna，例如doggybone dna(dbdna
tm
)，其中使用的最终dna处于闭合连接形式，或者该dna已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
[0359]
在另一个方面中，本发明提供了包括本发明的慢病毒载体基因组、本发明的核苷酸序列、本发明的表达盒或本发明的病毒载体生产系统的细胞。
[0360]
在另一个方面中，本发明提供了用于生产慢病毒载体的细胞，其包括：
[0361]
a)编码包括gag-pol和env、以及任选的rev的载体组分的核苷酸序列、以及本发明的核苷酸序列或本发明的表达盒；或
[0362]
b)本发明的病毒载体生产系统；以及
[0363]
c)任选的编码经修饰的u1 snrna的核苷酸序列和/或任选的编码trap的核苷酸序列。
[0364]
在另一个方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
[0365]
(i)将以下引入细胞：
[0366]
a)编码包括gag-pol和env、以及任选的rev的载体组分的核苷酸序列、以及本发明的核苷酸序列或本发明的表达盒；或
[0367]
b)本发明的病毒载体生产系统；以及
[0368]
c)任选的编码经修饰的u1 snrna的核苷酸序列和/或任选的编码trap的核苷酸序列；
[0369]
(ii)任选地，选择包括编码载体组分的核苷酸序列和慢病毒载体基因组的细胞；以及
[0370]
(iii)在适于生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
[0371]
在另一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法生产的慢病毒载体。慢病毒载体包括如本文所述的慢病毒载体基因组。
[0372]
在另一个方面中，本发明提供了本发明的慢病毒载体基因组、本发明的核苷酸序
列、本发明的表达盒、本发明的病毒载体生产系统或本发明的细胞用于生产慢病毒载体的用途。
[0373]“病毒载体生产细胞”、“载体生产细胞”或“生产细胞”应理解为能够生产慢病毒载体或慢病毒载体颗粒的细胞。慢病毒载体生产细胞可以是“生产者细胞”或“包装细胞”。病毒载体系统的一种或以上dna构建体可以稳定整合或以游离体保持在病毒载体生产细胞内。或者，可以将病毒载体系统的所有dna组分瞬时转染到病毒载体生产细胞中。在另一个替代方案中，稳定表达一些组分的生产细胞可用载体生产所需的剩余组分瞬时转染。
[0374]
如本文所用，术语“包装细胞”是指含有生产慢病毒载体颗粒所必需的元件但缺乏载体基因组的细胞。任选地，此类包装细胞含有一种或以上能够表达病毒结构蛋白(例如gag、gag/pol和env)的表达盒。
[0375]
生产者细胞/包装细胞可以是任何适宜的细胞类型。生产者细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞。
[0376]
如本文所用，术语“生产者/生产细胞”或“载体生产细胞(vector producing/production cell)”是指包括生产慢病毒载体颗粒所需的所有元件的细胞。生产者细胞可以是稳定生产者细胞系或瞬时衍生的，或者可以是稳定的包装细胞，其中逆转录病毒基因组是瞬时表达的。
[0377]
在本发明的方法中，当病毒载体为慢病毒载体时，载体组分可以包括慢病毒载体的gag、env、rev和/或rna基因组。编码载体组分的核苷酸序列可以同时或以任何顺序依次引入细胞。
[0378]
载体生产细胞可为在体外培养的细胞，例如组织培养细胞系。在本发明的方法和用途的一些实施方案中，适宜的生产细胞或用于生产慢病毒载体的细胞是在适当条件下培养时能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。因此，细胞通常包括编码载体组分的核苷酸序列，载体组分可包括如本文所述的慢病毒载体的rna基因组、gag、env和rev。适宜的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，例如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。它们通常是哺乳类，包括人类细胞，例如hek293t、hek293、cap、cap-t或cho细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞，例如sf9细胞。优选地，载体生产细胞源自人类细胞系。因此，此类适宜的生产细胞可用于本发明的任何方法或用途中。
[0379]
将核苷酸序列引入细胞的方法是本领域众所周知的并且之前已经描述过。因此，使用在本领域技术人员能力范围内的分子和细胞生物学中的常规技术，将编码包括慢病毒载体的gag、env、rev和rna基因组的载体组分的核苷酸序列引入细胞中。
[0380]
稳定生产细胞可以是包装细胞或生产者细胞。为了从包装细胞产生生产者细胞，可以稳定地或瞬时地引入载体基因组dna构建体。可以通过用逆转录病毒载体转导适宜的细胞系，从而产生包装细胞/生产者细胞，所述逆转录病毒载体表达载体组分(即基因组、gag-pol组分和的包膜)之一，如wo 2004/022761中所述。
[0381]
可选地，可以将核苷酸序列转染到细胞中，然后偶尔随机地整合到生产细胞基因组中。转染方法可以使用本领域公知的方法进行。例如，稳定的转染过程可以使用已经被工程改造以帮助串联(concatemerisation)的构建体。在另一个例子中，转染过程可以使用磷酸钙或市售可得的制剂如lipofectamine
tm 2000cd(invitrogen，ca)、hd或聚乙烯亚胺(pei)。或者，可以通过电穿孔将核苷酸序列引入生产细胞。技术人员将知晓促进核
苷酸序列整合到生产细胞中的方法。例如，如果核酸构建体是天然环状的，则将该核酸构建体线形化可能会有所帮助。较少随机整合的方法可能涉及这样的核酸构建体，该核酸构建体包括与哺乳动物宿主细胞的内源性染色体具有共享同源性的区域，以指导整合到内源性基因组内的选定位点。此外，如果构建体上存在重组位点，则这些位点可用于靶向重组。例如，核酸构建体可包括loxp位点，当与cre重组酶结合时(即，使用源自p1噬菌体的cre/lox系统)，该位点允许进行靶向整合。可选地或另外地，重组位点是att位点(例如，来自λ噬菌体)，其中att位点允许在存在λ整合酶的情况下进行位点定向整合。这将允许逆转录病毒基因靶向宿主细胞基因组内的基因座，从而允许较高和/或稳定的表达。
[0382]
靶向整合的其他方法是本领域公知的。例如，诱导基因组dna靶向切割的方法可用于促进在选定的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用方法或系统来诱导双链断裂(dsb)，例如，在内源性基因组中的切口，以通过非同源端连接(nhej)等生理机制诱导断裂修复。可以通过使用特异性核酸酶，如工程改造的锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)，使用利用工程改造的crrna/tracr rna(“单向导rna”)以引导特异性切割的crispr/cas9系统，和/或使用基于argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热链球菌(t.thermophilus))进行切割。
[0383]
可以通过使用仅慢病毒转导或仅核酸转染的方法整合核苷酸序列，或者使用两者的组合，从而产生包装细胞系/生产者细胞系。
[0384]
wo 2009/153563中描述了从生产细胞产生逆转录病毒载体的方法，特别是逆转录病毒载体的加工。
[0385]
在一个实施方案中，生产细胞可包括rna结合蛋白(例如色氨酸rna结合减弱蛋白，trap)和/或tet阻遏蛋白(tetr)蛋白或其他调节蛋白(例如，cymr)。
[0386]
从生产细胞生产慢病毒载体可以通过转染方法，从稳定细胞系生产可以包括诱导步骤(例如强力霉素诱导)或通过两者的组合。可以使用本领域公知的方法进行转染方法，并且此前已经描述了实例。
[0387]
生产细胞，无论是包装细胞系或生产者细胞系，还是用慢病毒载体编码组分瞬时转染的细胞，都可以进行培养以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或生产根据本发明的目的病毒载体。这可以通过本领域技术人员公知的方法完成，包括但不限于例如在适当的培养基中为细胞提供营养。所述方法可包括贴壁于表面上生长、悬浮生长或它们的组合。例如，可以使用分批、补料分批、连续系统等在组织培养瓶、组织培养多孔板、培养皿、滚瓶、波浪袋或生物反应器中进行培养。为了通过细胞培养实现病毒载体的大规模生产，本领域优选具有能够悬浮生长的细胞。培养细胞的适宜条件是已知的(参见文献(例如)“tissue culture,academic press,kruse and paterson,editors(1973)”,和“r.i.freshney,culture of animal cells:a manual of basic technique,fourth edition(wiley-liss inc.,2000,isbn 0-471-34889-9)”)。
[0388]
优选地，细胞最初在组织培养瓶或生物反应器中“堆积”并且随后在多层培养容器或大型生物反应器(大于50l)中生长，以产生用于本发明的载体生产细胞。
[0389]
优选地，细胞以悬浮模式生长，以产生用于本发明的载体生产细胞。
[0390]
慢病毒载体
[0391]
慢病毒是较大一类的逆转录病毒的一部分。慢病毒的详细列表可以参见coffin等
(1997)(参见文献
““
retroviruses”cold spring harbour laboratory press eds:jm coffin,sm hughes,he varmus pp 758-763”)。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物类和非灵长类动物类。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(hiv)，即人类自身免疫缺陷综合征(aids)的病原体，和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。非灵长类动物慢病毒类包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒(vmv)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血症病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、梅迪维斯纳病病毒(maedi visna virus，mvv)和牛免疫缺陷病毒(biv)。在一个实施方案中，慢病毒载体源自hiv-1、hiv-2、siv、fiv、biv、eiav、caev或维斯纳慢病毒(visna lentivirus)。
[0392]
慢病毒科和逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(参见文献“lewis et al(1992)embo j 11(8):3053-3058”和“lewis and emerman(1994)j virol 68(1):510-516”)。相反，其它逆转录病毒(如mlv)不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，例如组成诸如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。
[0393]
如本文所用，慢病毒载体是包括至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染或转导靶细胞以及表达noi的生物学机制。
[0394]
慢病毒载体可用于在体外的相容靶细胞中复制noi。因此，本文描述了通过将本发明的载体引入体外相容的靶细胞，并在引起noi表达的条件下使靶细胞生长以体外制备蛋白质的方法。可以通过本领域公知的方法从靶细胞回收蛋白质和noi。适宜的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其他真核细胞系。
[0395]
在一些方面中，载体可以具有“绝缘子”，即，阻断启动子和增强子之间的相互作用并充当屏障以减少从相邻基因通读的基因序列。
[0396]
在一个实施方案中，绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间以防止启动子干扰和从相邻基因通读。如果绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间的载体中，则这些绝缘基因中的每一个都可以排列为单独的表达单位。
[0397]
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，如5'ltr和3'ltr，在它们之间或内部具有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到靶细胞基因组中的整合位点、和编码包装组分的gag/pol和env基因，所述包装组分是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有其他的特征，如hiv中的rev基因和rre序列，它们使得整合的原病毒的rna转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核输出到细胞质。
[0398]
在原病毒中，这些基因的两端的侧翼是称作长末端重复(ltrs)的区域。ltr负责原病毒整合和转录。ltr也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。
[0399]
ltr自身是可以被分为三种元件的相同的序列，称作u3、r和u5。u3源自rna的3'端特有的序列。r源自在rna的两端重复的序列，并且u5源自rna的5'端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。
[0400]
在如本文所述的典型逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去一种或以上编码复制所必需的区域的蛋白的至少一部分；例如，可以不存在gag/pol和env基因或者这些基因是功能丧失的。这使病毒载体成为复制缺陷型病毒。
[0401]
慢病毒载体可以源自灵长类慢病毒(例如hiv-1)或非灵长类慢病毒(例如eiav)。
[0402]
一般地，典型的逆转录病毒载体生产系统涉及从必要的病毒包装功能体中分离病毒基因组。这些病毒载体组分通常以单独的dna表达盒(或者被称为质粒、表达质粒、dna构
建体或表达构建体)的方式被提供给生产细胞。
[0403]
载体基因组包括noi。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、含有noi的内部表达盒、(任选的)后转录元件(pre)、常规的中央多嘌呤束(cppt)、3'-ppu和自失活(sin)ltr。r-u5区域是载体基因组rna和noi mrna进行正确的多腺苷酸化、以及逆转录加工所必需的。载体基因组可选地包括开放阅读框，如在wo2003/064665中有所描述，这允许在没有rev的情况下生产载体。
[0404]
包装功能体包括gag/pol和env基因。这些基因是生产细胞产生载体颗粒所必需的。以反式向基因组提供这些功能体有利于产生复制缺陷型病毒载体。
[0405]
γ逆转录病毒载体的生产系统通常是需要基因组、gag/pol和env表达构建体的3组分系统。基于hiv-1的慢病毒载体的生产系统还可以需要提供辅助基因rev，并且对于载体基因组而言，要包括rev-应答元件(rre)。如果基因组中存在开放阅读框(orf)，则不需要以反式向基于eiav的慢病毒载体提供rev(参见wo 2003/064665)。
[0406]
通常来说，在载体基因组盒内编码的“外部”启动子(其驱动载体基因组盒)和“内部”启动子(其驱动noi盒)是强的真核或病毒启动子，就像驱动其他载体系统元件的那些启动子一样。这类启动子的实例包括cmv、ef1α、pgk、cag、tk、sv40和泛素启动子。强“合成”启动子，如由dna文库产生的那些启动子(例如，jet启动子)，还可以用于驱动转录。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，这些启动子例如视紫红质(rho)、视紫红质激酶(rhok)、含视锥-视杆同源框基因(crx)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(nrl)、卵黄样黄斑营养不良2(vmd2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(nse)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(gfap)启动子、人α1抗胰蛋白酶(haat)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pepck)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、flt-1启动子、inf-β启动子、mb启动子、sp-b启动子、syn1启动子、wasp启动子、sv40/halb启动子、sv40/cd43、sv40/cd45、nse/ru5'启动子、icam-2启动子、gpiib启动子、gfap启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、cd68启动子、cd14启动子和b29启动子。
[0407]
逆转录病毒载体的生产涉及利用这些dna组分对生产细胞的瞬时共转染，或者稳定生产细胞系的使用，其中所有这些组分稳定整合到生产细胞基因组内(例如，stewart hj,fong-wong l,strickland i,chipchase d,kelleher m,stevenson l,thoree v,mccarthy j,ralph gs,mitrophanous ka and radcliffe pa.(2011).hum gene ther.mar；22(3):357-69)。可替代的途径是使用稳定的包装细胞(其中已经稳定地整合有包装组分)，然后根据需要在载体基因组质粒中进行瞬时转染(例如，stewart,h.j.,m.a.leroux-carlucci,c.j.sion,k.a.mitrophanous and p.a.radcliffe(2009).gene ther.jun；16(6):805-14)。可以产生可供选择的、不完整的包装细胞系(仅将一个或两个包装组分稳定整合至细胞系中)，并将所产生的缺失组分的载体瞬时转染，这也是可行的。生产细胞还可以表达调节蛋白，如转录调节子的tet阻遏物(tetr)蛋白组的成员(例如，t-rex、tet-on和tet-off)、转录调节子的4-异丙基苯甲酸(cumate)诱导型开关系统组的成员(例如，4-异丙基苯甲酸阻遏物(cymr)蛋白)或者rna结合蛋白(例如，trap-色氨酸激活的rna结合蛋白)。
[0408]
在本发明的一个实施方案中，病毒载体源自eiav。eiav具有慢病毒的最简单的基因组结构，因此特别优选用于本发明。除了gag/pol和env基因之外，eiav还编码其他三种基
因：tat、rev和s2。tat充当病毒ltr的转录激活物(参见文献“derse and newbold(1993)virology 194(2):530-536”和“maury et al(1994)virology 200(2):632-642”)，以及rev通过rev-应答元件(rre)调节和协调病毒基因的表达(参见文献“martarano et al.(1994)j virol 68(5):3102-3111”)。据认为这两种蛋白质的作用机制大体上相似于灵长类动物病毒中的类似机制(参见文献“martarano et al.(1994)j virol 68(5):3102-3111”)。s2的功能未知。另外，已鉴定了称为ttm的eiav蛋白，它由在跨膜蛋白起始处被剪接到env编码序列的tat的第一个外显子编码。在本发明一个可选的实施方案中，病毒载体源自hiv：hiv与eiav的差异在于它不编码s2，但是与eiav不同，它编码vif、vpr、vpu和nef。
[0409]
术语“重组逆转录病毒或慢病毒载体”(rrv)指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒遗传信息，以让rna基因组在包装组分的存在下得以包装到能够转导靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的转导可包括逆转录、以及整合到靶细胞基因组中。rrv携带着要通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。rrv不能够进行独立复制以在靶细胞中产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，rrv缺乏复制所必需的功能性gag/pol基因和/或env基因和/或其他基因。
[0410]
优选地，本发明的rrv载体具有最低限度的病毒基因组。
[0411]
本文所用的术语“最低限度的病毒基因组”意指病毒载体已经过操作，从而去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导和递送noi到靶细胞所需的功能性。这个策略的更多细节可参见wo 1998/17815和wo 99/32646。最低限度eiav载体缺乏tat、rev和s2基因，并且这些基因也都没有以反式出现在生产系统中。最低限度hiv载体缺乏vif、vpr、vpu、tat和nef。
[0412]
用于在生产细胞内生产载体基因组的表达质粒可包括能够连接于逆转录病毒基因组的转录调控序列，从而在生产细胞/包装细胞内直接转录基因组。所有第3代慢病毒载体都在5'u3增强子-启动子区域中被删除，并且载体基因组rna的转录由例如另一个病毒启动子等的异源启动子驱动，例如cmv启动子，如下所述。此特征能够使载体生产不依赖tat。一些慢病毒载体基因组为了有效的产生病毒，因此需要额外的序列。例如，特别在hiv的情况中，可以包括rre序列。然而，可以通过gagpol orf的密码子优化以减少或去除(独立的)gagpol盒对于rre的需求(以及对以反式提供的rev的依赖性)。这一策略的进一步细节可以参见wo 2001/79518。
[0413]
与rev/rre系统执行相同功能的可替代的序列也是已知的。例如，在mason pfizer猴病毒中发现了rev/rre系统的功能性类似物。这被称为组成型转运元件(cte)，并且在基因组内包括据信与被感染的细胞中的因子相互作用的rre型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，cte可被用作rev/rre系统的替代。rev蛋白的任何已知的或者可获得的其他功能性等价物都可以与本发明相关。例如，还已知，htlv-i的rex蛋白能够功能性地代替hiv-1的rev蛋白。在本发明方法中使用的载体中，rev和rre可以不存在或者是无功能的；在可替代的方案中，可以存在rev和rre或功能性等价系统。
[0414]
如本文所用，术语“功能性替代物”是指具有替代序列的蛋白质或序列，该替代序列执行与另一蛋白质或序列相同的功能。术语“功能性替代物”在本文中与具有相同含义的“功能性等同物”和“功能性类似物”可互换使用。
[0415]
sin载体
[0416]
如本文所使用的慢病毒载体可用于自失活(sin)结构中，其中已经删除了病毒增
强子和启动子序列。sin载体可以在体内、离体或体外以类似于非sin载体的效率产生并转导非分裂靶细胞。sin原病毒的长末端重复(ltr)的转录失活将会抑制vrna的代谢，并且是进一步降低形成具有复制能力的病毒的可能性的特征。这通过去除ltr的任意顺式作用效果，还能够调节由内部启动子启动的基因表达。
[0417]
举例来说，自失活的逆转录病毒载体系统已经被构建为删除了转录增强子或3'ltr的u3区域内的增强子或启动子。在载体逆转录和整合一轮之后，这些变化将被拷贝到产生无转录活性的“原病毒”的5'ltr和3'ltr中。然而，在这种载体中的ltr的任意内部启动子将仍然保持转录活性。这一策略已被用来去除病毒ltr内的增强子和启动子对由内部放置的基因的转录的影响。这些影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可用于去除从3'ltr下游转录成基因组dna。在人类基因治疗中，这是受到特别关注的，在该治疗中，重要的是防止任何内源致癌基因的外来激活。参见文献“yu et al.,(1986)pnas 83:3194-98；marty et al.,(1990)biochimie 72:885-7；naviaux et al.,(1996)j.virol.70:5701-5”；“iwakuma et al.,(1999)virol.261:120-32；deglon et al.,(2000)human gene therapy 11:179-90”。sin慢病毒载体在us 6,924,123和us 7,056,699中有所描述。
[0418]
复制缺陷型慢病毒载体
[0419]
在复制缺陷型慢病毒载体的基因组中，gag/pol和/或env的序列可以突变和/或没有功能。
[0420]
在如本文所述的典型慢病毒载体中，可以从载体中除去病毒复制所必需的蛋白质的一个或以上编码区的至少一部分。这使得病毒载体为复制缺陷型。病毒基因组的部分也可以由noi替换，以产生包括noi的载体，该noi能够转导非分裂靶细胞和/或将它的基因组整合到靶细胞基因组中。
[0421]
在一个实施方案中，如wo 2006/010834和wo 2007/071994中所描述的那样，慢病毒载体是非整合型载体。
[0422]
在另一实施方案中，载体具有递送没有或缺少病毒rna序列的能力。在另一实施方案中，位于待递送的rna上的异源结合域(与gag异源)和位于gag或gagpol上的同源结合域可以被用来确保待递送rna的包装。这些载体在wo 2007/072056中有所描述。
[0423]
noi和多核苷酸
[0424]
本发明的多核苷酸可包括dna或rna。它们可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可以编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术进行核苷酸置换，以反映在其中表达本发明多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用，该置换不会影响由本发明的多核苷酸所编码的多肽序列。
[0425]
多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0426]
多核苷酸如dna多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们还可通过标准的技术进行克隆。
[0427]
通常使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(pcr)克隆技术。这涉及到制备一对能侧接于需要克隆的靶序列的引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mrna或cdna接触，在能引起所需区域扩增的条件下进行pcr，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的dna。可将
引物设计成含有适宜的限制酶识别位点，使得扩增的dna可被克隆到适宜的载体中。
[0428]
常见的逆转录病毒载体元件
[0429]
启动子和增强子
[0430]
可以使用控制序列控制noi和多核苷酸的表达，所述控制序列例如为转录调节元件或翻译阻遏元件，包括启动子、增强子和其他表达调节信号(例如tet阻遏物(tetr)系统)或载体生产细胞中的转基因阻遏系统(trip)或本文描述的noi的其他调节子。
[0431]
可以使用原核生物启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。还可使用包括来自两种或以上不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
[0432]
适宜的启动序列是强启动子，包括那些源自病毒(如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(cmv)、逆转录病毒和猿猴病毒40(sv40))的基因组的启动子，或者源自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子、ef1α、cag、tk、sv40、泛素、pgk或核糖体蛋白启动子)的启动子。可选地，可以使用以下组织特异性启动子来驱动转录，如视紫红质(rho)、视紫红质激酶(rhok)、含视锥-视杆同源框基因(crx)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(nrl)、卵黄样黄斑营养不良2(vmd2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(nse)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(gfap)启动子、人α1抗胰蛋白酶(haat)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pepck)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、flt-1启动子、inf-β启动子、mb启动子、sp-b启动子、syn1启动子、wasp启动子、sv40/halb启动子、sv40/cd43、sv40/cd45、nse/ru5'启动子、icam-2启动子、gpiib启动子、gfap启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、cd68启动子、cd14启动子和b29启动子。
[0433]
可通过将增强子序列插入到载体中进一步提高noi的转录。增强子相对地不依赖于取向和位置；但是，可以采用来自真核细胞病毒的增强子，如sv40增强子和cmv早期启动子增强子。增强子可在相对于启动子的5'或3'的位置处、但优选位于相对于启动子的5'位点被剪接到载体中。
[0434]
启动子可另外包括用以确保或提高在适宜的靶细胞中表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，例如pribnow框或tata框。启动子可含有用以影响(如维持、提高或降低)核苷酸序列的表达水平的其他序列。适宜的其他序列包括sh1内含子或adh内含子。其他序列包括可诱导元件，如温度、化学、光和应激可诱导元件。还可存在用以提高转录或翻译的适宜元件。
[0435]
noi的调节子
[0436]
在产生逆转录病毒包装/生产者细胞系和逆转录病毒载体生产中的复杂因素是某些逆转录病毒载体组分和noi的组成型表达具有细胞毒性从而导致表达这些组分的细胞的死亡，因而不能生产载体。因此，必须调节这些组分(例如，gag-pol和包膜蛋白，如vsv-g)的表达。还可以调节其他非细胞毒性载体组分(例如rev)的表达以使细胞的代谢负担最小化。如本文所述的模块化构建体和/或细胞可以包括与至少一种调节元件结合的细胞毒性载体组分和/或非细胞毒性载体组分。如本文所用，术语“调节元件”指能够影响(增加或减少)相关基因或蛋白的表达的任何元件。调节元件包括基因开关系统、转录调节元件和翻译阻遏元件。
[0437]
很多原核调节系统已被用于在哺乳动物细胞中产生基因开关。很多逆转录病毒包装和生产者细胞系已使用基因开关系统(例如，四环素和4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统)进行控制，因此能够在载体生产时开启一种或以上逆转录病毒载体组分的表达。基因开关系统包括转录调节子(tetr)蛋白组的那些(例如，t-rex、tet-on和tet-off)、以及转录调节子的4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统组的那些(例如，cymr蛋白)和涉及rna结合蛋白的那些(例如，trap)。
[0438]
一种此类四环素诱导型系统是基于t-rex
tm
系统的四环素阻遏物(tetr)系统。举例来说，在此类系统中，将四环素操纵子(teto2)置于这样的位置，以使得第一个核苷酸距离人巨细胞病毒主要即时早期启动子(hcmvp)的tatataa元件最后一个核苷酸的3'端10bp，如此tetr能够独自作为阻遏物起作用(参见文献“yao f,svensjo t,winkler t,lu m,eriksson c,eriksson e.,tetracycline repressor,tetr,rather than the tetr-mammalian cell transcription factor fusion derivatives,regulates inducible gene expression in mammalian cells.1998.hum gene ther；9:1939-1950”)。在此类系统中，noi的表达能够由cmv启动子控制，cmv启动子已串联插入teto2序列的两个拷贝。在缺乏诱导剂(四环素或其类似物多西环素[dox])的情况下，tetr同型二聚体与teto2序列结合并物理阻断来自上游cmv启动子的转录。当存在诱导剂时，诱导剂与tetr同型二聚体结合，引起变构变化，使其不再与teto2序列结合，从而引起基因表达。tetr基因可以进行密码子优化，因为密码子优化可以改进翻译效率，从而可以更严格地控制teto2控制的基因表达。
[0439]
在wo 2015/092440中描述了trip系统，并提供了在载体生产期间阻遏noi在生产细胞中表达的另一种方法。当需要组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)驱动转基因时，且特别地当在生产细胞中表达转基因蛋白导致载体滴度降低和/或由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时，trap结合序列(例如，trap-tbs)相互作用形成用于生产逆转录病毒载体的转基因蛋白阻遏系统的基础(参见文献“maunder et al,nat commun.(2017)mar 27；8”)。
[0440]
简言之，trap-tbs相互作用形成了翻译阻断，从而阻遏转基因蛋白的翻译(参见文献“maunder et al,nat commun.(2017)mar 27；8”)。翻译阻断仅在生产细胞中有效，因此不会阻碍基于dna或rna的载体系统。当从组成型和/或强启动子，包括来自单顺反子或多顺反子mrna的组织特异性启动子表达转基因蛋白时，trip系统能够阻遏翻译。已经证明，转基因蛋白的表达不能调节会降低载体滴度并影响载体产品质量。对于瞬时和稳定的pacl/pcl载体生产系统，在下述情况下，转基因蛋白的阻遏对于生产细胞防止载体滴度降低是有利的：当毒性或分子负荷问题可能导致细胞应激时；由于转基因来源蛋白的病毒载体递送，使转基因蛋白在体内激发免疫应答时；使用基因编辑转基因可能导致影响靶点开/关时；转基因蛋白可能会影响载体和/或包膜糖蛋白排斥时。
[0441]
包膜和假型化
[0442]
在一个优选的方面，如本文所述的慢病毒载体已经被假型化。在这一点上，假型化可以赋予一个或以上优点。例如，基于hiv的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作cd4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其他有包膜病毒的env序列置换，那么它们可能具有更宽的感染谱(verma and somia(1997)nature 389(6648):239-242)。举例来说，工作者已经用来自vsv的糖蛋白对基于hiv的载体进行了假型
化(verma and somia(1997)nature 389(6648):239-242)。
[0443]
在另一种可选的方案中，env蛋白可以是经修饰的env蛋白，如突变的或工程改造的env蛋白。可以进行修饰或对修饰进行选择，以引入靶向能力或减少毒性或用于其他它目的(参见文献“valsesia-wittman et al 1996j virol 70:2056-64；nilson et al(1996)gene ther 3(4):280-286；和fielding et al(1998)blood 91(5):1802-1809”；及其中引用的参考文献)。
[0444]
可以用任何选择的分子使载体假型化。
[0445]
如本文所用，“env”应指如本文所述的内源性慢病毒包膜或异源包膜。
[0446]
vsv-g
[0447]
水疱性口腔炎病毒(vsv，一种棒状病毒)的包膜糖蛋白(g)是已被证实能够对某些包膜病毒和病毒载体病毒颗粒进行假型化的包膜蛋白。
[0448]
emi et al.(1991)journal of virology 65:1202-1207首先证明了在不存在任何逆转录病毒包膜蛋白的情况下，它对基于momlv的逆转录病毒载体进行假型化的能力。wo 1994/294440教导了逆转录病毒载体可成功地用vsv-g进行假型化。这些经假型化的vsv-g载体可用于转导广范围的哺乳动物细胞。最近，abe et al.(1998)j virol 72(8)6356-6361教导了可通过添加vsv-g使非感染性逆转录病毒颗粒变成感染性。
[0449]
burns et al.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:8033-7成功地用vsv-g对逆转录病毒mlv进行假型化，这产生了与天然形式的mlv相比改变了宿主范围的载体。已经证实vsv-g假型化的载体不仅感染哺乳动物细胞，而且还感染源自鱼类、爬行动物和昆虫的细胞系(参见文献“burns et al.(1993)”，出处同上)。还证实了它们对于多种细胞系而言比传统的兼嗜性包膜更有效(参见文献“yee et al.,(1994)proc.natl.acad.sci.usa 91:9564-9568”；“emi et al.(1991)journal of virology 65:1202-1207”)。vsv-g蛋白可用于对某些逆转录病毒进行假型化，因为它的胞质尾巴能够与逆转录病毒核心发生相互作用。
[0450]
提供非逆转录病毒假型化包膜(如vsv-g蛋白)可产生这样的优点，即载体颗粒能被浓缩至高滴度而不损失感染性(参见文献“akkina et al.(1996)j.virol.70:2581-5”)。逆转录病毒包膜蛋白显然不能够承受超离心过程中的剪切力，这很可能是因为它们由两个非共价连接的亚单位组成。离心可破坏亚单位之间的相互作用。相比之下，vsv糖蛋白由单一单位组成。因此，vsv-g蛋白假型化可以为有效的靶细胞感染/转导和制造过程提供潜在的优势。
[0451]
wo 2000/52188描述了由具有水疱性口腔炎病毒g蛋白(vsv-g)作为膜结合性病毒包膜蛋白的稳定生产者细胞系产生假型化的逆转录病毒载体，并提供了vsv-g蛋白的基因序列。
[0452]
罗斯河病毒
[0453]
用罗斯河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(fiv)进行假型化，随后为主要转导肝的系统施用(参见文献“kang et al.,2002,j.virol.,76:9378-9388”)。据报道，效率比用vsv-g假型化载体获得的效率高20倍，并且通过测量提示肝中毒的肝酶血清水平得知，所产生的毒性更低。
[0454]
杆状病毒gp64
[0455]
已经证明了杆状病毒gp64蛋白是vsv-g的替代物，其用于在临床和商业应用所需的高滴度病毒的大规模生产中使用的病毒载体(参见文献“kumar m,bradow bp,zimmerberg j(2003)hum gene ther.14(1):67-77”)。与vsv-g假型化载体相比，gp64假型化载体具有相似的广泛嗜性和相似的天然滴度。由于gp64的表达不杀死细胞，因此可以制备组成型表达gp64的基于hek293t的细胞系。
[0456]
可供选择的包膜
[0457]
当用于假型化eiav时，提供适宜的滴度的其他包膜包括莫科拉病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒和lcmv(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。向小鼠体内静脉输注利用4070a进行假型化的慢病毒引起在肝脏内具有最大的基因表达。
[0458]
包装序列
[0459]
在本发明的语境中所使用的术语“包装信号”可与“包装序列”或“psi”互换使用，其用来指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒rna链的衣壳化作用所需的非编码、顺式作用序列。在hiv-1中，该序列已被定位于从主要剪接供体位点(sd)上游至少延伸到gag起始密码子(可以包括部分或全部gag到核苷酸688的5'序列)的基因座。在eiav中，包装信号包括r区域到gag的5'编码区域。
[0460]
本文所使用的术语“延伸的包装信号”或“延伸的包装序列”指在psi序列的周围使用进一步延伸到gag基因中的序列。包括这些额外的包装序列可增加载体rna插入到病毒颗粒中的效率。
[0461]
已经证明猫免疫缺陷病毒(fiv)rna的衣壳化作用决定簇是离散的、非连续的，其包括位于基因组mrna的5'端的一个区域(r-u5)和定位在gag的大约311nt中的另一个区域(参见文献“kaye et al.,j virol.oct；69(10):6588-92(1995)”)。
[0462]
内部核糖体进入位点(ires)
[0463]
res元件的插入允许由单一启动子启动多个编码区域的表达(参见文献“adam et al(同上)”；“koo et al(1992)virology 186:669-675”；“chen et al 1993j.virol 67:2142-2148”)。ires元件首次发现于小核糖核酸病毒的非翻译5'端，在此它们促进病毒蛋白的不依赖于帽的翻译(参见文献“jang et al(1990)enzyme 44:292-309”)。当在rna中位于开放阅读框之间时，ires元件通过促进在ires元件处的核糖体进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
[0464]
mountford和smith介绍了关于ires的综述(参见文献“tig may 1995vol 11,no 5:179-184”)。许多不同的ires序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(emcv)(参见文献“ghattas,i.r.,et al.,mol.cell.biol.,11:5848-5859(1991)”)；bip蛋白[参见文献“macejak and sarnow,nature 353:91(1991)”]；果蝇触角足基因(外显子d和e)[参见文献“oh,et al.,genes&development,6:1643-1653(1992)”]的那些，以及在脊髓灰质炎病毒(pv)[参见文献“pelletier and sonenberg,nature 334:320-325(1988)”；还参见文献“mountford and smith,tig 11,179-184(1985)”]中的那些序列。
[0465]
来自pv、emcv和猪水疱病病毒的ires元件之前被用于逆转录病毒载体中(参见文献“coffin等”，如上述)。
[0466]
术语“ires”包括发挥ires功能或改进ires功能的任何序列或序列的组合。ires可以是病毒来源的(如emcv ires、pv ires或fmdv 2a样序列)或细胞来源的(如fgf2 ires、
nrf ires、notch 2ires或eif4 ires)。
[0467]
为了使ires能够启动每个多核苷酸的翻译，它应该位于模块化构建体中的多核苷酸之间或之前。
[0468]
用于开发稳定细胞系的核苷酸序列需要添加选择性标记物，以选择发生稳定整合的细胞。这些选择性标记物可以表达为核苷酸序列中的单个转录单位，或者可能更优选的是使用ires元件启动多顺反子信息中选择性标记物的翻译(参见文献“adam et al 1991j.virol.65,4985”)。
[0469]
基因方向和绝缘子
[0470]
众所周知，核酸是有方向性的，这最终会影响细胞中诸如转录和复制等的机制。因此，当作为同一核酸构建体的一部分时，基因可以相对于彼此具有相对的方向。
[0471]
在本发明的某些实施方案中，存在于细胞或构建体中相同基因座上的至少两个核酸序列可以处于反向和/或交互方向。换言之，在本发明的某些实施方案中，在这个特定基因座上，连续基因对将不具有相同方向。当该区域在宿主细胞的同一物理位置内表达时，这可以帮助防止转录和翻译通读。
[0472]
当载体生产所需的核酸是基于细胞内相同的遗传基因座时，交互方向有利于逆转录病毒载体的生产。这转而也能够改进所得构建体的安全性，以防止产生具有复制能力的逆转录病毒载体。
[0473]
当核酸序列处于相反和/或交互方向时，使用绝缘子能够防止noi在其遗传环境中表达不当或沉默。
[0474]
术语“绝缘子”是指当与绝缘子结合蛋白结合时具有保护基因免受周围调节子信号影响能力的一类dna序列元件。有两种类型的绝缘子：增强子阻断功能和染色质屏障功能。当绝缘子位于启动子和增强子之间时，绝缘子的增强子阻断功能使启动子免受增强子的加强转录的影响(参见文献“geyer和corces 1992”；“kellum和schedl 1992”)。染色质屏障绝缘子通过阻止附近浓缩染色质的前进而起作用，其会引起转录活性染色质区域变成转录无效染色质区域并导致基因表达沉默。抑制异染色质扩散从而抑制基因沉默的绝缘子会募集参与组蛋白修饰的酶，以阻止这一过程(参见文献“yang j,corces vg.2011；110:43-76”；“huang,li et al.2007”；“dhillon,raab et al.2009”)。绝缘子可以具有这两种功能中的一种或两种，并且鸡β-珠蛋白绝缘子(chs4)就是一个这样的实例。这种绝缘子是研究最广泛的脊椎动物绝缘子，富含g+c，并且具有增强子阻断和异染色质屏障功能(参见文献“chung j h,whitely m,felsenfeld g.cell.1993；74:505
–
514”)。具有增强子阻断功能的其他此类绝缘子不限于但包括下述：人β-珠蛋白绝缘子5(hs5)、人β-珠蛋白绝缘子1(hs1)和鸡β-珠蛋白绝缘子(chs3)(参见文献“farrell cm1,west ag,felsenfeld g.,mol cell biol.2002jun；22(11):3820-31”；“j ellis et al.embo j.1996feb 1；15(3):562
–
568”)。除了减少不需要的远端相互作用以外，绝缘子还有助于防止临近逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单位的启动子损害相邻转录单位的表达)。如果在每个逆转录病毒载体核酸序列之间使用绝缘子，则直接通读的减少将有助于防止具有复制能力的逆转录病毒载体颗粒的形成。
[0475]
绝缘子可以存在于每个逆转录病毒核酸序列之间。在一个实施方案中，使用绝缘子可以防止来自一个noi表达盒的启动子-增强子相互作用与编码载体组分的核苷酸序列
中的另一个noi表达盒发生相互作用。
[0476]
载体基因组和gag-pol序列之间可以存在绝缘子。因此，这限制了产生具有复制能力的逆转录病毒载体和类似“野生型”dna转录物的可能性，从而改进了构建体的安全性性质。moriarity et al,nucleic acids res.2013apr；41(8):e92中引用了使用绝缘子元件改进稳定整合的多基因载体表达的方法。
[0477]
载体滴度
[0478]
技术人员将理解的是，存在很多不同的确定病毒载体滴度的方法。通常将滴度描述为转导单位/ml(tu/ml)。可以通过增加载体颗粒的数量和通过增加载体制备物的比活性来增加滴度。
[0479]
治疗用途
[0480]
如本文所述的慢病毒载体或用如本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于医药。
[0481]
此外，本文所述的慢病毒载体、本发明的生产细胞或用本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于制备药物，以将目的核苷酸递送至有此需要的靶位点。如前所述，本发明的慢病毒载体或转导细胞的此类用途可用于治疗或诊断目的。
[0482]
因此，提供了由如本文所述的慢病毒载体转导的细胞。
[0483]“由病毒载体颗粒转导的细胞”或“由慢病毒载体转导的细胞”应理解为是一种已经转入了由病毒载体颗粒携带的核酸的细胞，特别是靶细胞。
[0484]
在本发明的一个实施方案中，目的核苷酸在缺乏trap的靶细胞中被翻译。
[0485]“靶细胞”应理解为是这样的细胞，期望的是其能表达noi。利用本发明的病毒载体将noi引入到靶细胞中。递送至靶细胞可以在体内、离体(ex vivo)或体外进行。
[0486]
在优选的实施方案中，目的核苷酸产生治疗效果。
[0487]
noi可具有治疗或诊断应用。适宜的noi包括但不限于编码以下物质的序列：酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶，以及它们的衍生物(如带有相关报告基团的衍生物)。noi还可以编码微rna。不愿受到理论的束缚，认为微rna的加工受到trap的抑制。
[0488]
在一个实施方案中，noi可用于治疗神经退行性疾病。
[0489]
在另一个实施方案中，noi用于治疗帕金森病。
[0490]
在另一个实施方案中，noi可以编码一种或多种参与多巴胺合成的酶。例如，该酶可以是以下之一者或多者：酪氨酸羟化酶、gtp环式水解酶i和/或芳族氨基酸多巴脱羧酶。所有这三个基因的序列是可得的(登录号分别是x05290、u19523和m76180)。
[0491]
在另一个实施方案中，noi可以编码囊泡单胺转运子2(vmat2)。在一个可选的实施方案中，病毒基因组可以包括编码芳族氨基酸多巴脱羧酶的noi和编码vmat2的noi。这种基因组可用于治疗帕金森病，特别是联合外周施用l-dopa。
[0492]
在另一个实施方案中，noi可以编码治疗性蛋白或治疗性蛋白的组合。
[0493]
在另一个实施方案中，noi可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白：神
经胶质细胞衍生的神经营养因子(gdnf)、脑衍生的神经营养因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、神经营养因子-3(nt-3)、酸性成纤维细胞生长因子(afgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、白细胞介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、胰岛素生长因子-2、vegf-a、vegf-b、vegf-c/vegf-2、vegf-d、vegf-e、pdgf-a、pdgf-b、pdfg-a和pdfg-b的异源二聚体和同源二聚体。
[0494]
在另一个实施方案中，noi可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种抗血管生成蛋白：血管生成抑制素、内皮抑素、血小板因子4、色素上皮衍生因子(pedf)、胎盘生长因子、列斯蛋白(restin)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白、gro-β和tubedown-1、白细胞介素-1(il-1)、il-12、视黄酸、抗vegf抗体或其片段/变体、例如阿柏西普、血小板反应蛋白、vegf受体蛋白(如us 5,952,199和us 6,100,071中描述的那些)和抗vegf受体抗体。
[0495]
在另一个实施方案中，noi可以编码选自由以下组成的组中的抗炎蛋白、抗体或蛋白质或抗体的片段/变体：nf-kb抑制剂、il1β抑制剂、tgfβ抑制剂、il-6抑制剂、il-23抑制剂、il-18抑制剂、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、淋巴毒素α和淋巴毒素β、light抑制剂、α突触核蛋白抑制剂、tau抑制剂，β淀粉样蛋白抑制剂、il-17抑制剂。
[0496]
在另一个实施方案中，noi可以编码囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)。
[0497]
在另一个实施方案中，noi可以编码通常在视觉细胞中表达的蛋白。
[0498]
在另一个实施方案中，noi可以编码通常在光感受器细胞和/或视网膜色素上皮细胞中表达的蛋白。
[0499]
在另一个实施方案中，noi可以编码选自包括以下物质的组中的蛋白质：rpe65、芳基烃相互作用受体蛋白样1(aipl1)、crb1、卵磷脂视网膜乙酰转移酶(lrat)、光受体特异性同源盒(crx)、视网膜鸟苷酸环化酶(gucy2d)、rpgr相互作用蛋白1(rpgrip1)、lca2、lca3、lca5、抗肌萎缩蛋白、prph2、cntf、abcr/abca4、emp1、timp3、mertk、elovl4、myo7a、ush2a、vmd2、rlbp1、cox-2、fpr、harmonin、rab护卫蛋白1、cngb2、cnga3、cep 290、rpgr、rs1、rp1、prelp、谷胱甘肽途径酶和opticin。
[0500]
在其他实施方案中，noi可以编码人凝血因子viii或因子ix。
[0501]
在其他实施方案中，noi可以编码一种或多种参与代谢的蛋白质，选自包括以下物质的组：苯丙氨酸羟化酶(pah)、甲基丙二酰辅酶a变位酶、丙酰辅酶a羧化酶、异戊酰辅酶a脱氢酶、支链酮酸脱氢酶复合物、戊二酰辅酶a脱氢酶、乙酰辅酶a羧化酶、丙酰辅酶a羧化酶、3甲基巴豆酰辅酶a羧化酶、丙酮酸羧化酶、氨甲酰磷酸合成酶氨、鸟氨酸转氨甲酰酶、葡糖神经酰胺酶β、α半乳糖苷酶a、葡糖神经酰胺酶β、胱氨酸、葡萄糖胺(n-乙酰基)-6-硫酸酯酶、n-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、n-磺基氨基葡萄糖磺基水解酶、半乳糖胺-6硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶a、细胞色素b-245β、abcd1、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶1、丙氨酸乙醇酸氨基转移酶(alanine glycoxhylate amino transferase)、atp结合盒和亚族b成员。
[0502]
在其他实施方案中，noi可以编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在一个实施方案中，car是抗5t4 car。在其他实施方案中，noi可以编码b细胞成熟抗原(bcma)、cd19、cd22、cd20、cd138、cd30、cd33、cd123、cd70、前列腺特异性膜抗原(psma)、lewis y抗原(ley)、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ror1)、粘蛋白1、细胞表面相关蛋白(muc1)、上皮细胞贴壁分子(epcam)、内皮生长因子受体(egfr)、胰岛素、蛋白酪氨酸磷酸酶、非受体型22、白
细胞介素2受体α、解旋酶c结构域1诱导的干扰素、人表皮生长因子受体(her2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、二唾液酸神经节苷脂(gd2)、间皮素(mesiothelin)、囊泡内皮生长因子受体2(vegfr2)。
[0503]
在其他实施方案中，noi可以编码针对nkg2d配体的嵌合抗原受体(car)，nkg2d配体选自由ulbp1、ulbp2、ulbp3、h60、rae-1a、rae-1b、rae-1g、rae-1d、mica、micb组成的组。
[0504]
在另一实施方案中，noi可以编码sgsh、sumf1、gaa、常见的γ链(cd132)、腺苷脱氨酶、was蛋白、球蛋白、α半乳糖苷酶a，δ-氨基乙酰丙酸(ala)合酶、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(alad)、羟甲基胆色烷(hmb)合酶、尿卟啉原(uro)合酶、尿卟啉原(uro)脱羧酶、粪卟啉原(copro)氧化酶、原卟啉原(proto)氧化酶、亚铁螯合酶、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、n-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶、3n-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、n-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶和透明质酸酶。
[0505]
除了noi以外，载体还可包括或编码sirna、shrna或者经调节的shrna(参见文献“dickins et al.(2005)nature genetics 37:1289-1295；silva et al.(2005)nature genetics 37:1281-1288”)。
[0506]
适应症
[0507]
根据本发明的载体(包括逆转录病毒和aav载体)可用于递送一种或以上可用于治疗wo 1998/05635、wo 1998/07859、wo 1998/09985中列举的疾病的noi。目的核苷酸可以是dna或rna。这类疾病的例子给出如下：
[0508]
能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用于治疗包括感染人免疫缺陷病毒之类的免疫缺陷；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，和预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病，以及神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或t细胞抑制活性、以及由此而来的抗炎活性；抗免疫活性(即，对细胞和/或体液免疫应答、包括与炎症不相关的应答的抑制作用)；抑制巨噬细胞和t细胞贴壁于胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及t细胞中的上调的fas受体表达。
[0509]
恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移；腹水和恶性胸腔积液。
[0510]
自身免疫性疾病，包括关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病。
[0511]
血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病。
[0512]
胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病。
[0513]
肝病，包括肝纤维化、肝硬化。
[0514]
遗传性代谢障碍，包括苯丙酮尿症pku、威尔逊病、有机酸血症、尿素循环障碍、胆
汁淤积和其他疾病。
[0515]
肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病。
[0516]
耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病。
[0517]
牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病。
[0518]
睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病。
[0519]
妇科疾病，包括胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病。
[0520]
眼科疾病，例如包括lca10等的莱伯先天性黑蒙(lca)；后葡萄膜炎；中间葡萄膜炎；前葡萄膜炎；结膜炎；脉络视网膜炎；葡萄膜视网膜炎；视神经炎；青光眼，包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼；眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿；交感性眼炎；巩膜炎；色素性视网膜炎；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(amd)和青少年黄斑变性，包括贝斯特病、贝斯特卵黄样黄斑变性、斯特格氏病；尤塞氏综合征；多恩氏蜂窝状视网膜营养失调；sorby黄斑营养失调；青年性视网膜劈裂症；视锥-视杆营养失调；角膜营养失调；fuch营养失调；莱伯氏先天性黑内障；莱伯氏遗传性视神经病变(lhon)；艾迪综合征；小口氏病；退行性眼底病；视觉损伤；由感染引起的眼睛炎症；增殖性玻璃体-视网膜病变；急性局部缺血性视神经病变；过度疤痕，例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥；和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、rlbp1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲。
[0521]
神经疾病和神经退行性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、aids相关痴呆综合症、hiv相关脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、cns的病症或失调、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、法布里病、戈谢病、胱氨酸病、庞贝氏病、异染性脑白质营养不良、wiscott aldrich综合征、肾上腺脑白质营养不良、β-地中海贫血、镰状细胞贫血病、格林-巴利综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、cns压缩或cns创伤或cns的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或失调、运动神经元疾病，包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤。
[0522]
其他的疾病和病症，例如囊性纤维化；粘多糖贮积症，包括sanfilipo综合征a、sanfilipo综合征b、sanfilipo综合征c、sanfilipo综合征d、亨特综合征、hurler-scheie综合征、莫尔丘综合征；ada-scid；x相关的scid；x相关的慢性肉芽肿病；卟啉症；血友病a；血友病b；外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答；恶病质；厌食症；急性感染；脓毒性休克；传染性疾病；糖尿病；手术的并发症或副作用；骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的并发症和副作用，例如由于感染病毒载体、或者aids，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
[0523]
sirna、微rna和shrna
[0524]
在某些其他的实施方案中，noi包括微rna。微rna是生物体中天然产生的非常大的一组小rna，其中至少一些能调节靶基因的表达。微rna家族的基础成员是let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的rna种类，该rna种类在蠕虫发育过程中调节内源蛋白编码
基因的表达。该活性rna种类最初被转录为约70nt的前体，该前体在转录后被加工为成熟的约21nt的形式。let-7和lin-4两者都被转录成发夹rna前体，所述前体由dicer酶加工成它们的成熟形式。
[0525]
除了noi之外，所述载体还可包括或编码sirna、shrna或者经调节的shrna(参见文献“dickins et al.(2005)nature genetics 37:1289-1295”；“silva et al.(2005)nature genetics 37:1281-1288”)。
[0526]
由双链rna(dsrna)介导的转录后基因沉默(ptgs)是控制外来基因表达的保守的细胞防御机制。据认为，元件(例如转座子)或病毒的随机整合会引起dsrna的表达，该dsrna能激活同源单链mrna或病毒基因组rna的序列特异性降解。这种沉默作用称为rna干扰(rnai)(参见文献“ralph et al.(2005)nature medicine 11:429-433”)。rnai的机制涉及将长的dsrna加工成大约21至25个核苷酸(nt)的rna的双链体。这些产物称为小干扰rna或沉默rna(sirna)，它们是mrna降解的序列特异性媒介物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现＞30bp的dsrna能激活干扰素应答，从而导致蛋白质合成的停止和非特异性的mrna降解(参见文献“stark et al.,annu rev biochem 67:227-64(1998)”)。但是，可用21nt sirna双链体来绕过该应答(参见文献“elbashir et al.,embo j.dec 3；20(23):6877-88(2001)”；“hutvagner et al.,science.aug 3,293(5531):834-8.eupub jul 12(2001)”)，使得可以在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。
[0527]
药物组合物
[0528]
本发明提供了一种药物组合物，其包括本文所述的慢病毒载体或者用本文所述的病毒载体转导的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0529]
本发明提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的慢病毒载体。该药物组合物可用于人或动物用途。
[0530]
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定的给药途径和标准的药物实践来进行。所述药物组合物可以包含、或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含：任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或增加载体进入靶位点的其他载体试剂(诸如脂质递送系统)。
[0531]
在适宜的情况下，所述组合物可以通过以下任何一种或以上方式施用：吸入；栓剂或阴道栓剂形式；以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式局部施用；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或与赋形剂混合的胶囊剂或胚珠剂(ovule)形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮剂形式；或它们可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内、颅内、眼内、腹腔内或皮下注射。对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖，从而使得溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给药，所述组合物可以用常规方法配制的片剂或锭剂形式施用。
[0532]
本文所述的慢病毒载体可用于离体转导靶细胞或靶组织，然后将所述靶细胞或靶组织转移到需要治疗的患者体内。这种细胞的实例可以为自体t细胞，并且这种组织的实例可以是供体角膜。
[0533]
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
[0534]
除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖使用它们的变体、衍生
物、类似物、同源物和片段。
[0535]
在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式进行了修饰：所涉及的多肽或多核苷酸保持了其内源功能中的至少一种。可通过对天然蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、删除、置换、修饰、替换和/或改变，来获得变体序列。
[0536]
与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对序列的一个(或以上)氨基酸残基进行的任何置换、改变、修饰、替换、删除和/或添加，只要所产生的蛋白质或多肽能保持其内源功能中的至少一种即可。
[0537]
与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模仿物，即这样的化合物，它具有其所模仿的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
[0538]
通常，可进行(例如)1、2或3至10或20个置换以进行氨基酸置换，只要被修饰的序列能保持所需的活性或能力即可。氨基酸置换可包括非天然类似物的使用。
[0539]
用于本发明的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基删除、插入或置换，即删除、插入或置换能产生沉默的变化并产生功能上等同的蛋白质。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的性质相似性的基础上做出谨慎的氨基酸置换，只要内源性功能得以保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含有无电荷极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
[0540]
例如可按照下表做出保守置换。第二列同一格中的氨基酸、优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：
[0541][0542]
术语“同源物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有特定同源性的实体。术语“同源性”可以与“同一性”等同。
[0543]
在本文中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％或99％的同一性。通常，同源性包括与题述氨基酸序列相同的活性位点等。虽然还可根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的情况中，优选根据序列同一性来表示同源性。
[0544]
在本发明的情况中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％、98％或99％的同一性。虽然还可根据相似性来考虑同源性，但在本文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
[0545]
同源性比较可以借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售可得的计算机程序可以计算出两个或以上序列之间的同源性或同一性百分
率。
[0546]
同源性百分率可以对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅对相对短数目的残基进行。
[0547]
虽然这是一种非常简单而相容的方法，但它没有考虑到例如在其他方面相同的一对序列中，核苷酸序列中的一个插入或缺失将引起随后的密码子不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法被设计为产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和缺失，而不会过多地扣除整体同源性分值。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来实现这一点。
[0548]
然而，这些更为复杂的方法为在比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位并反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。“affine空位罚分”通常用来对存在空位处以相对高的罚分，而对该空位中的每种后来残基的处罚较低。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位处罚会产生具有较少空位的最佳比对。大多数的比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用gcg wisconsin bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，每个延长为-4。
[0549]
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种比对的适宜计算机程序是gcg wisconsin bestfit软件包(参见文献“university of wisconsin,u.s.a.；devereux et al.(1984)nucleic acids research 12:387”)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于blast软件包(参见文献“ausubel et al.(1999)”出处同上
–
ch.18)、fasta(参见文献“atschul et al.(1990)j.mol.biol.403-410”)和geneworks比较工具程序组。blast和fasta都可用于线下和在线搜索(参见文献“ausubel et al.(1999)”，出处同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于一些应用而言，优选使用gcg bestfit程序。另一种称为blast 2序列的工具也可用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见文献“fems microbiol lett(1999)174(2):247-50；fems microbiol lett(1999)177(1):187-8”)。
[0550]
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是blosum62矩阵-blast程序组的默认矩阵。gcg wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果提供的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用gcg软件包的公共默认值，或在其他软件的情况中，使用默认矩阵，例如blosum62。
[0551]
一旦软件产生了最佳比对，则可以计算出同源性百分率，优选序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数值结果。
[0552]“片段”也是变体，并且这个术语通常指在功能上或者在(例如)试验中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此“片段”指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0553]
这类变体可用标准的重组dna技术如定点诱变来制备。在要进行插入的情况中，可以制备合成dna，其编码该插入以及对应于该插入位点任一侧的天然序列的5'和3'侧翼区域。所述侧翼区域含有对应于天然序列中的位点的便利的限制位点，使得该序列可用适宜的酶进行切割，并且所述合成dna可连接到该切口中。然后按照本发明表达dna以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是举例说明许多本领域已知的用于操作dna序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
[0554]
密码子优化
[0555]
本发明中所用的多核苷酸(包括noi和/或载体生产系统的组分)可经过密码子优化。之前，密码子优化在wo 1999/41397和wo 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对具体密码子的使用上存在差异。这种密码子偏好对应于特定trna在该细胞类型中的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，将它们定制成匹配相应的trna的相对丰度，可以增加表达。同样地，通过有意选择相应的trna已知在特定细胞类型中稀有的密码子，可以减少表达。因此，可以更大程度地进行翻译控制。
[0556]
许多病毒(包括逆转录病毒)使用大量的稀有密码子，并且通过改变这些密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现目的基因(例如noi或包装组分)在哺乳动物生产细胞中的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子用法表。
[0557]
病毒载体组分的密码子优化具有许多其他优点。对于编码在生产者细胞/包装细胞中病毒颗粒的装配所必需的病毒颗粒包装组分的核苷酸序列，由于它们的序列的改变，可使rna不稳定性序列(ins)从中去除。同时，保留了包装组分的氨基酸序列编码序列，从而使得由所述序列编码的病毒组分保持相同或至少充分相似，从而使包装组分的功能不受损害。在慢病毒载体中，密码子优化还能克服输出对rev/rre的需要，从而使得经优化的序列不依赖于rev。密码子优化还能减少载体系统中的不同构建体之间(例如gag-pol开放阅读框和env开放阅读框的重叠区域之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体效果是病毒滴度明显增加和安全性改进。
[0558]
在一个实施方案中，仅对与ins相关的密码子进行密码子优化。但是，在更为优选和实用的实施方案中，对序列全部都进行密码子优化，但有一些例外，例如包括gag-pol的移码位点的序列(参见下文)。
[0559]
慢病毒载体的gag-pol基因包括编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达都依赖于翻译过程中的移码。该移码是因为核糖体在翻译过程中“滑动”而产生的。这个滑动据认为至少部分地由核糖体停靠(ribosome-stalling)rna二级结构造成。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于hiv，重叠区域从gag起始端下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag atg的a)延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，横跨两个阅读框的移码位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段将使得能够更有效地表达gag-pol蛋白。对于eiav，据认为重叠的起始端是nt 1262(其中核苷酸1为gag atg的a)，并且重叠的末端是nt 1461。为了确保保留移码位点和gag-pol重叠，已保留了野生型序列的nt1156至1465。
[0560]
可作出与最佳密码子用法的偏差以(例如)适应便利的限制位点，并且可将保守氨基酸变化引入到gag-pol蛋白中。
[0561]
在一个实施方案中，密码子优化基于轻表达的(lightly expressed)哺乳动物基
因。可改变第三个碱基，有时可改变第二和第三个碱基。
[0562]
由于遗传密码的简并性，应理解，技术人员可获得许多种gag-pol序列。另外，有许多所描述的逆转录病毒变体可用作用于产生经密码子优化的gag-pol序列的起始点。慢病毒基因组可以是十分可变的。例如，存在着许多仍能发挥功能的hiv-1类似物质。对于eiav情况也是一样。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。hiv-1变体的例子可在los alamos national security公司运营的hiv数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中找到。有关eiav克隆的细节可在地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov的美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中找到。
[0563]
用于经密码子优化的gag-pol序列的策略可针对任意逆转录病毒使用。这将适用于所有的慢病毒，包括eiav、fiv、biv、caev、vmr、siv、hiv-1和hiv-2。另外，这个方法可用于增加来自htlv-1、htlv-2、hfv、hsrv和人内源逆转录病毒(herv)、mlv及其他逆转录病毒的基因的表达。
[0564]
密码子优化可使gag-pol表达不依赖于rev。但是，为了使得能够在慢病毒载体中使用抗rev或rre因子，有必要使病毒载体生产系统完全不依赖于rev/rre。因此，基因组还需要加以修饰。这通过优化载体基因组组分来实现。有利地，这些修饰还导致在生产者细胞和被转导的细胞中产生了不存在所有额外蛋白的更安全的系统。
[0565]
核苷酸编号
[0566]
在本发明中，可以采用本发明中使用的经修饰的rre和编码gag的经修饰的核苷酸序列中的核苷酸位置的特定编号。通过使样品rre的核苷酸序列与由seq id no:2限定的rre的核苷酸序列对齐，可以将一个编号分配到与本公开的seq id no:2所示的核苷酸序列的核苷酸位置或编号相对应的所述样品rre中的核苷酸位置。类似地，使编码gag的样品rre的核苷酸序列与由seq id no:6限定的编码gag的核苷酸序列对齐，可以将一个编号分配到与本公开的seq id no:6所示的核苷酸序列的核苷酸位置或编号相对应的所述编码gag的核苷酸样品中的核苷酸位置。类似地，使样品wpre的核苷酸序列与由seq id no:11限定的wpre的核苷酸序列对齐，可以将一个编号分配到与本公开的seq id no:11所示的核苷酸序列的核苷酸位置或编号相对应的所述样品wpre中的核苷酸位置。
[0567]
描述本技术所用核苷酸编号的可供选择的方式是，由与“对应于”seq id no:2、seq id no:6或seq id no:11所示的核苷酸序列中特定位置的这些核苷酸位置识别核苷酸位置。这不应当解释为本发明的序列必须包括seq id no:2、seq id no:6或seq id no:11所示的核苷酸序列的含义。技术人员将容易理解，rre和编码gag的核苷酸序列在不同的慢病毒载体中是不同的。参考seq id no:2、seq id no:6或seq id no:11所示的核苷酸序列仅用于识别任何特定rre或编码gag的核苷酸序列内的特定核苷酸位置。可以使用序列对齐程序常规识别这种核苷酸位置，序列对齐程序的使用是本领域众所周知的。
[0568]
rna剪接
[0569]
本文所述的慢病毒载体基因组中的主要剪接供体位点可失活。本文所述的慢病毒载体基因组中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点可失活。本文所述的慢病毒载体基因组中的主要剪接供体位点和位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点可失活。
[0570]
rna剪接由被称为剪接体的大型rna蛋白质复合物催化，剪接体由五个小核核糖核蛋白(snrnp)组成。内含子和外显子之间的边界由前体mrna内的特定核苷酸序列标记，它描
述了剪接发生的位置。这种边界被称为“剪接位点”。术语“剪接位点”是指能够被真核细胞的剪接机制识别为适合切割和/或连接到另一个剪接位点的多核苷酸。
[0571]
剪接位点允许切除存在于前体mrna转录物中的内含子。通常，5'剪接边界被称为“剪接供体位点”或“5'剪接位点”，3'剪接边界被称为“剪接受体位点”或“3'剪接位点”。剪接位点包括，例如，天然存在的剪接位点、工程改造或合成的剪接位点、标准的或共有剪接位点和/或非典型剪接位点，例如，隐蔽剪接位点。
[0572]
术语“典型剪接位点”或“共有剪接位点”可以互换使用，指的是跨物种保守的剪接位点。
[0573]
用于真核rna剪接的5'供体剪接位点和3'受体剪接位点的共有序列是本领域公知的。这些共有序列在内含子的每一端包括几乎不变的二核苷酸：内含子的5'端的gt、以及内含子3'端的ag。
[0574]
典型剪接供体位点共有序列可以是(对于dna)ag/gtragt(其中a是腺苷，t是胸腺嘧啶，g是鸟嘌呤，c是胞嘧啶，r是嘌呤以及“/”表示切割位点)。这符合本文所述的更通用的剪接供体共有序列maggurr。本领域众所周知，剪接供体可能偏离该共有序列，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制因素影响同一序列，例如在vrna包装区域内的二级结构。非典型剪接位点在本领域中也是众所周知的，尽管与典型剪接供体共有序列相比，它们很少出现。
[0575]“主要剪接供体位点”是指病毒载体基因组中的第一个(显性)剪接供体位点，其编码并嵌入通常位于病毒载体核苷酸序列的5'区域的天然病毒rna包装序列中。
[0576]
在一个方面中，慢病毒载体基因组不包括活性主要剪接供体位点，即所述慢病毒载体基因组中的主要剪接供体位点不发生剪接，并且去除了主要剪接供体位点的剪接活性。
[0577]
主要剪接供体位点位于慢病毒基因组的5'包装区域。
[0578]
对于hiv-1病毒，主要的剪接供体共有序列是(对于dna)tg/gtragt(其中a是腺苷，t是胸腺嘧啶，g是鸟嘌呤，c是胞嘧啶，r是嘌呤以及“/”表示切割位点)。
[0579]
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点可以具有以下共有序列，其中r为嘌呤,“/”为切割位点：
[0580]
tg/gtragt(seq id no:16)。
[0581]
在一个方面中，r可为鸟嘌呤(g)。
[0582]
在本发明的一个方面中，主要剪接供体和隐蔽剪接供体区域可具有以下核心序列，其中“/”是主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点处的切割位点：
[0583]
/gtga/gta(seq id no:17)。
[0584]
在本发明的一个方面中，msd突变的载体基因组可以在主要剪接供体和隐蔽剪接供体“区域”(seq id no:17)中具有至少两个突变，其中第一个和第二个“gt”核苷酸分别紧邻主要剪接供体和隐蔽剪接供体核苷酸的3'端。
[0585]
在本发明的一个方面中，主要剪接供体共有序列是ctggt(seq id no:18)。主要剪接供体位点可包括序列ctggt。
[0586]
在一个方面中，在剪接位点失活之前，核苷酸序列包括seq id no:16、17、18和/或19中的任一者所示的序列。
[0587]
在一个方面中，慢病毒基因组包括失活的主要剪接供体位点，否则该位点将在对
应于seq id no:16的核苷酸2和3的核苷酸之间具有切割位点。
[0588]
根据本文所述的本发明，慢病毒基因组还包括无活性的隐蔽剪接供体位点。在一个方面中，慢病毒基因组不包括与主要剪接供体位点(3')相邻的活性隐蔽剪接供体位点，也就是说，不从相邻的隐蔽剪接供体位点发生剪接，并且去除了从隐蔽剪接供体位点的剪接。
[0589]
术语“隐蔽剪接供体位点”是指这样的核酸序列，该核酸序列通常不作为剪接供体位点发挥作用或由于相邻序列的情况(例如，附近存在“优选的”剪接供体)而作为剪接供体位点利用效率较低，但可以通过相邻序列的突变(例如，附近“优选的”剪接供体的突变)而被激活，从而变成更有效的功能性剪接供体位点。
[0590]
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点是主要剪接供体的3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
[0591]
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体位点的3'侧的主要剪接供体位点的6个核苷酸内。优选地，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体切割位点的4或5个核苷酸以内，优选4个核苷酸以内。
[0592]
在本发明的一个方面中，隐蔽剪接供体位点具有共有序列tgagt(seq id no:19)。
[0593]
在一个方面中，慢病毒载体基因组包括失活的隐蔽剪接供体位点，否则该位点将在对应于seq id no:16的核苷酸6和7的核苷酸之间具有切割位点。
[0594]
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和/或相邻的隐蔽剪接供体位点包括“gt”基序。在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点这两者均含有突变的“gt”基序。突变的gt基序可能会使主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点这两者的剪接活性失活。
[0595]
可以将各种不同类型的突变引入慢病毒载体基因组，以使主要隐蔽剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点失活。
[0596]
在一个方面中，突变是去除或抑制剪接区域中的剪接活性的功能性突变。如本文所述的慢病毒载体基因组可以在seq id no:16、17、18和/或19任一者中的任何核苷酸中包括突变或缺失。适宜的突变是本领域技术人员已知的，并在此进行了描述。
[0597]
例如，可以在核酸序列中引入点突变。如本文所用，术语“点突变”是指对单个核苷酸的任何改变。点突变包括例如缺失、转变和颠换；当存在于蛋白质编码序列中时，这些突变可以被分类为无义突变、错义突变或沉默突变。“无义”突变产生终止密码子。“错义”突变产生编码不同氨基酸的密码子。“沉默”突变产生的密码子编码相同的氨基酸、或不改变蛋白质功能的不同氨基酸。可以将一个或以上点突变引入包括隐蔽剪接供体位点的慢病毒载体基因组。例如，包括主要剪接位点和/或隐蔽剪接位点的慢病毒载体基因组可以通过在其中引入两个或以上点突变从而产生突变。
[0598]
可以在包括主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点的核酸序列内的几个位置中引入至少两个点突变，以实现剪接供体区域剪接的减弱。在一个方面中，突变可以在剪接供体切割位点的四个核苷酸内；在典型剪接供体共有序列中，这是a1g2/g3t4，其中“/”是切割位点。本领域众所周知，剪接供体切割位点可能偏离这种共有，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制对同一序列产生影响，例如在vrna包装区域内的二级结构。众所周知，g3t4二核苷酸通常是典型剪接供体共有序列中可变性最小的序列，因而对g3和/或t4的突变最有可能实现最
大的减弱效果。例如，对于hiv-1病毒载体基因组中的主要剪接供体位点，这可以是t1g2/g3t4，其中“/”是切割位点。例如，对于hiv-1病毒载体基因组中的隐蔽剪接供体位点，这可以是g1a2/g3t4，其中“/”是切割位点。此外，可以在剪接供体位点附近引入一个或多个点突变。例如，可以在剪接供体位点的上游或下游引入点突变。在慢病毒载体基因组包括通过在其中引入多个点突变从而产生突变的主要剪接供体位点和/或隐蔽剪接供体位点的实施方案中，可以将点突变引入隐蔽剪接供体位点的上游和/或下游。
[0599]
在一个实施方案中，删除了主要剪接供体位点和/或隐蔽剪接供体位点。
[0600]
剪接位点突变体的构建
[0601]
可以使用多种技术构建用于本发明的剪接位点突变体。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸从而在特定基因座处引入突变，突变序列的侧翼是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得的重建序列包括具有所需核苷酸插入、置换或删除的衍生物。
[0602]
允许改变dna序列的其他已知技术包括重组方法，例如gibson组装、golden-gate克隆和in-fusion。
[0603]
可供选择地，可以使用寡核苷酸定向的位点特异性(或区段特异性)诱变程序来根据所需的置换、删除或插入提供改变的序列。也可以通过利用与所需删除相邻的方便的限制性内切核酸酶位点来构建剪接位点突变体的删除或截短衍生物。
[0604]
在限制之后，可以填充突出端，并重新连接dna。
[0605]
sambrook等人公开了进行上述改变的示例性方法。(参见文献“molecular cloning:a laboratory manual,2d ed.,cold spring harbor laboratory press,1989”)。
[0606]
剪接位点突变体也可以利用pcr诱变、化学诱变、通过强制核苷酸错误掺入(例如，参见文献“liao和wise，1990”)或通过使用随机诱变的寡核苷酸(参见文献“horwitz等，1989”)的化学诱变(参见文献“drinkwater和klinedinst，1986”)技术进行构建。
[0607]
与经修饰的u1组合以改进载体滴度
[0608]
可以通过共表达基于u1 snrnas的非编码rna增强慢病毒载体的输出滴度，其中u1 snrna已经过修饰，使其不再靶向内源序列(剪接供体位点)，而现在靶向vrna分子内的序列。msd突变的第三代(即不依赖u3/tat的)lv可以通过在生产期间通过共表达定向于结合载体基因组rna的5'包装区域的经修饰的u1 snrna而产生高滴度。
[0609]
在导致滴度降低的主要剪接供体区域内具有广泛的突变类型(点突变、区域删除和序列替换)的载体基因组可以与经修饰的u1snrna组合使用。该方法可以包括在载体生产过程中经修饰的u1snrna与其他载体组分一起的共表达。经修饰的u1 snrna设计为使得与共有剪接供体位点的结合，该共有剪接供体位点已通过用与载体基因组vrna内的靶序列互补的异源序列替换而被去除。
[0610]
在本文所述的本发明的一个方面中，慢病毒载体基因组可以与经修饰的u1 snrna组合使用。
[0611]
剪接所需的前体mrna内元件包括5'剪接供体信号、分支点周围的序列和3'剪接受体信号。与这三个元件相互作用的是剪接体，它由五种小核rna(snrna)形成，包括u1 snrna和相关的核蛋白(snrnp)。u1 snrna由聚合酶ii启动子表达，并且存在于大多数真核细胞中
(参见文献“lund et al.,1984,j.biol.chem.,259:2013-2021”)。人u1 snrna(小核rna)长164nt，具有由四个茎环构成的明确结构(参见文献“west,s.,2012,biochemical society transactions,40:846-849”)。u1 snrna在其5'端包括一个短序列，其与外显子-内含子连接处的5'剪接供体位点广泛互补。u1 snrna通过与5'剪接供体位点的碱基配对参与剪接位点选择和剪接体组装。
[0612]
人u1 snrna(小核rna)长164nt，具有由四个茎环组成的明确结构(参见图8)。内源性非编码rna(u1 snrna)通过天然剪接供体退火序列(例如，5'-acuuaccug-3')在内含子剪接的早期阶段与共有5'剪接供体位点(例如，5'-maggurr-3'，其中m为a或c并且r为a或g)结合。如本文所述，根据本发明使用的经修饰的u1 snrna被修饰以在天然剪接供体靶向/退火序列的位点处引入与载体基因组vrna分子内的靶序列互补的异源序列(参见图8)。
[0613]
如本文所用，术语“经修饰的u1 snrna”、“重新定向的u1 snrna”、“重新靶向的u1 snrna”、“重新设计的u1 snrna”和“突变的u1 snrna”是指已经对u1 snrna进行修饰使其不再结合用于启动靶基因的剪接过程的共有5'剪接供体位点序列(例如5'-maggurr-3')。因此，经修饰的u1 snrna是经过修饰后不再与剪接供体位点序列(例如5'-maggurr-3')互补的u1 snrna。相反，经修饰的u1 snrna被设计为靶向在msd突变的慢病毒载体基因组分子(靶位点)的包装区域内具有独特rna序列的核苷酸序列(即与vrna的剪接无关的序列)或与所述核苷酸序列互补。
[0614]
如本文所用，术语“天然剪接供体退火序列”和“天然剪接供体靶向序列”是指内源性u1 snrna的5'端的短序列，其与内含子的共有5'剪接供体位点广泛互补。天然剪接供体退火序列可以为5'-acuuaccug-3'。
[0615]
如本文所用，术语“共有5'剪接供体位点”是指用于剪接位点选择的内含子5'端的共有rna序列，例如具有序列5'-maggurr-3'。
[0616]
如本文所用，术语“msd突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列”、“靶序列”和“靶位点”是指具有在msd突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域内的特定rna序列的位点，其被预选为结合/退火经修饰的u1 snrna的靶位点。
[0617]
如本文所用，术语“msd突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域”和“msd突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域”是指msd突变的慢病毒载体基因组的5'端的从5'u5结构域开始到源自gag基因的序列的末端的区域。因此，msd突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域包括5'u5结构域、pbs元件、茎环(sl)1元件、sl2元件、sl3ψ元件、sl4元件和源自gag基因的序列。本领域技术人员将理解，当在慢病毒载体生产期间以反式提供完整的gag基因时，术语“慢病毒载体基因组分子的包装区域”可以指msd突变的慢病毒载体基因组分子的5'端的从5'u5结构域开始、经过sl3ψ元件处的“核心”包装信号以及来自atg密码子(存在于sl4中)的天然gag核苷酸序列、到存在于载体基因组上的保留的gag核苷酸序列的末端的区域。
[0618]
如本文所用，术语“源自gag基因的序列”是指可能存在于(例如保留在)载体基因组中的源自atg密码子的gag基因至核苷酸688的任何天然序列(参见文献“kharytonchyk,s.et.al.,2018,j.mol.biol.,430:2066-79”)。
[0619]
如本文所用，术语“在天然剪接供体退火序列中引入异源序列”和“在u1 snrna的5'端的天然剪接供体退火序列中引入异源序列”包括用所述异源序列替换天然剪接供体退
火序列的全部或一部分，或修饰天然剪接供体退火序列以使其具有与所述异源序列相同的序列。
[0620]
如本文所用，术语“提高慢病毒载体滴度”包括“增加慢病毒载体滴度”、“恢复慢病毒载体滴度”和“改进慢病毒载体滴度”。
[0621]
因此，在一个实施方案中，经修饰的u1 snrna已被修饰以结合msd突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
[0622]
在一些实施方案中，经修饰的u1 snrna在相对于内源性u1 snrna的5'端被修饰，以引入与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
[0623]
在一些实施方案中，经修饰的u1 snrna在相对于内源性u1 snrna的5'端被修饰，以在天然剪接供体退火序列内引入与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
[0624]
经修饰的u1 snrna可以在相对于内源性u1 snrna的5'端被修饰，以用与所述核苷酸序列互补的异源序列替换包括天然剪接供体退火序列的序列。
[0625]
经修饰的u1 snrna可以是经修饰的u1 snrna变体。根据本发明的经修饰的u1 snrna变体可以是天然存在的u1 snrna变体、在茎环i区域内包括去除u1-70k蛋白结合的突变的u1 snrna变体、或在茎环ii区域内包括去除u1a蛋白结合的突变的u1 snrna变体。
[0626]
在一些实施方案中，本文所述的经修饰的u1 snrna包括与如本文所述的u1_256序列的主要u1 snrna序列[三叶草叶](nt 410-562)具有至少70％同一性(适宜地为至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的核苷酸序列。u1_256序列如下：
[0627]
taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaagggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcggttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgacatcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgctgcttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcgggttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctggaaagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggcgtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctcatttgccgtgcgcgcttgcaggggagataccatgatcacgaaggtggttttcccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgcgatttccccaaatgtgggaaactcgactgcataatttgtggtagtgggggactgcgttcgcgctttcccctggtttcaaaagtagactgtacgctaagggtcatatctttttttgttttggtttgtgtcttggttggcgtcttaaatgttaa(seq id no:20)。
[0628]
图例：仅大写＝u1 polii启动子(nt1-392)；小写＝重新定向区域(nt393-409)；小写粗体＝重新定向序列[在本例中针对野生型hiv-1包装信号的nt256-270](nt395-409)；大写斜体＝主要u1 snrna序列[三叶草叶](nt410-562)；大写下划线＝转录终止区域(nt563-652)。
[0629]
在一些实施方案中，经修饰的u1 snrna包括如本文所述的u1_256序列的主要u1 snrna序列[三叶草叶](nt 410-562)。u1_256序列(seq id no:20)的主要u1 snrna序列[三叶草叶](nt 410-562)如下：
[0630]
gcaggggagataccatgatcacgaaggtggttttcccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgcgatttccccaaatgtgggaaactcgactgcataatttgtggtagtgggggactgcgttcgcgctttcccctg(seq id no:21)。
[0631]
在一些实施方案中，经修饰的u1 snrna包括如表1所示的靶退火序列。
[0632]
表i.描述测试用经修饰的u1 snrna和对照u1 snrna中的靶退火序列(与靶序列互补的异源序列)的序列列表。核苷酸以dna形式呈现，因为它们将在“重新定向区域”的各自表达盒中进行编码。(at)基序存在于所有初始构建体中，在每种情况下形成u1 snrna分子的前两个核苷酸。靶序列号指的是hiv-1的nl4-3(genbank：m19921.2)或hxb2(genbank：k03455.1)菌株中指出的靶。
[0633][0634]
*相对于载体基因组rna序列编号
[0635]
**小写的靶序列用于(hxb2)，加下划线的靶序列是gag orf(u1 376)中的aa》cgcg移码
[0636]
在一些实施方案中，天然剪接供体退火序列可以全部或部分被异源序列替换，该异源序列与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补。适宜地，天然剪接供体退火序列的核酸1至11(适宜地为2至11、3至11、5至11、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)被替换为与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。在一个优选的实施方案中，整个天然剪接供体退火序列被替换为与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列，即根据本文所述的异源序列完全替换了天然剪接供体退火序列(例如5'-acuuaccug-3')。
[0637]
在一些实施方案中，与msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列
互补的异源序列包括与所述核苷酸序列互补的至少7个、至少9个或至少15个核苷酸。适宜地，用于本发明的异源序列可以包括7个至25个(适宜地为7个至20个、7个至15个、9个至15个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸。
[0638]
本文所述的经修饰的u1 snrna可以通过以下步骤进行设计：(a)在msd突变的慢病毒载体基因组的包装区域中选择用于结合经修饰的u1 snrna的靶位点(预选核苷酸位点)；(b)在u1 snrna的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-acuuaccug-3')中引入异源序列，该异源序列与在步骤(a)中选择的预选核苷酸位点互补。
[0639]
使用分子生物学中的常规技术在内源性u1 snrna的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-acuuaccug-3')中引入与靶位点互补的异源序列、或用与靶位点互补的异源序列代替天然剪接供体退火序列(例如5'-acuuaccug-3')在本领域普通技术人员的能力范围内。使用分子生物学中的常规技术在内源性u1 snrna的5'端修饰天然剪接供体退火序列(例如5'-acuuaccug-3')，使其具有与靶位点互补的异源序列相同的序列在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，适宜的方法包括定向诱变或随机诱变，然后选择提供根据本文所述的经修饰的u1 snrna的突变。
[0640]
本文所述的经修饰的u1 snrna可以根据本领域公知的方法制造。例如，经修饰的u1 snrna可以通过化学合成或重组dna/rna技术制造。
[0641]
在一个方面中，编码经修饰的u1 snrna的核苷酸序列可以在不同的核苷酸序列上，例如在不同的质粒上。
[0642]
trip系统
[0643]
wo2015/092440(通过引用并入本文)公开了在真核细胞培养物中使用异源翻译控制系统来抑制病毒载体生产期间目的核苷酸的翻译(抑制转基因表达)，并由此抑制或阻止由目的核苷酸编码的蛋白的表达。该系统被称为载体生产细胞中的转基因抑制系统或trip系统。在一种形式中，trip系统利用细菌trp操纵子调节蛋白、色氨酸rna结合衰减蛋白(trap)和trap结合位点/序列(tbs)来介导转基因抑制。该系统的使用不会阻碍可包装的载体基因组分子的产生，也不会阻碍载体病毒粒子的活性，并且不会干扰目的核苷酸在靶细胞中的长期表达。
[0644]
在一个方面中，慢病毒载体基因组包括tbs。
[0645]
在本发明的一些实施方案中，目的核苷酸有效连接至tbs。在一些实施方案中，目的核苷酸在缺乏trap的靶细胞中翻译。
[0646]
tbs可能能够与trap相互作用，使得在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
[0647]
色氨酸rna结合衰减蛋白(trap)
[0648]
色氨酸rna结合衰减蛋白(trap)是一种在枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)中广泛表征的细菌蛋白。它通过参与转录衰减或翻译控制机制，由trpedcfba操纵子指导来调控色氨酸生物合成(参见综述“gollnick,b.,antson,and yanofsky(2005)annual review of genetics 39:47
–
68”)。
[0649]
在自然情况下trap通过以下三个不同的机制调控色氨酸生物合成与运输：
[0650]
1.trpedcfba操纵子的转录衰减(参见文献“shimotsu h,k.m.,yanofsky c,
henner dj.(1986)journal of bacteriology 166:461
–
471”)。
[0651]
2.促进形成trpe和trpd shine-dalgarno阻断发夹(参见文献“yakhnin h,b.j.,yakhnin av,babitzke p.(2001)journal of bacteriology 183(20):5918-5926”)。
[0652]
3.阻断核糖体进入trpg和yhag核糖体结合位点(参见文献“yang m,d.s.a.,van loon apgm,gollnick p.(1995)journal of bacteriology 177:4272-4278”)。
[0653]
在枯草芽孢杆菌中，trap由单个基因(mtrb)编码，并且功能性蛋白由11个排列为螺旋形环(toroid ring)的相同的亚基构成(参见文献“antson aa,d.e.,dodson g,greaves rb,chen x,gollnick p.(1999)nature 401(6750):235-242”)。活化后，其通过与相邻亚基间的口袋内的多达11个色氨酸分子结合，从而与rna相互作用。靶rna缠绕在该四元环结构的外部(参见文献“babitzke p,s.j.,shire sj,yanofsky c.(1994)journal of biological chemistry 269:16597
–
16604”)。
[0654]
trap开放阅读框可以针对在哺乳动物(例如，人)细胞中的表达进行密码子优化，因为细菌基因序列对于在哺乳动物细胞中的表达可能不是最佳的。还可以通过去除潜在不稳定的序列和剪接位点来优化序列。使用在trap蛋白c末端表达的his标签似乎在翻译抑制方面提供了益处，并且可以任选地使用。该c末端his标签可以提高真核细胞内trap的可溶性或稳定性，尽管不能排除改进的功能性益处。尽管如此，具有his标签和不具有his标签的trap这两者都可以强效抑制转基因表达。trap转录单元内的某些顺式作用序列也可以优化；例如，在瞬时转染的情况下，与cmv启动子驱动的构建体相比，ef1α启动子驱动的构建体能够以低输入的trap质粒实现更好的抑制。
[0655]
在一个实施方案中，trap源自细菌。
[0656]
在本发明的一个实施方案中，trap源自芽孢杆菌属(bacillus species)物种，例如枯草芽孢杆菌。
[0657]
在一个实施方案中，trap源自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、寡食胺单胞菌(aminomonas paucivorans)、热液口脱硫肠杆菌(desulfotomaculum hydrothermale)、嗜热脂肪芽胞杆菌(b.stearothermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌s72n(b.stearothermophilus s72n)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)和生氢氧化碳嗜热菌(carboxydothermus hydrogenoformans)。
[0658]
在一个实施方案中，trap由色氨酸rna结合衰减蛋白基因家族mtrb编码(trpbp超家族，例如，ncbi保藏域数据库#cl03437)。
[0659]
在优选的实施方案中，trap在c端具有6个组氨酸标签(hisx6标签)。
[0660]
trap结合位点
[0661]
术语“结合位点”应理解为能够与某种蛋白相互作用的核酸序列。
[0662]
一种能够结合trap的共有trap结合位点序列是重复多次(例如6、7、8、9、10、11、12或更多次)的[kagnn]；这种序列存在于天然的trp操纵子中。在天然环境中，偶尔的aagnn是是能够被容许的，有时额外的“间隔”n核苷酸会产生功能序列。体外实验表明，trap-rna结合需要至少6个或更多个共有重复序列(参见文献“babitzke p,y.j.,campanelli d.(1996)journal of bacteriology 178(17):5159-5163”)。因此，在一个实施方案中，优选的是在tbs内存在6个或更多个连续的[kagn
≥2
]序列，其中k在dna中可以是t或g，在rna中可以是u或g。
[0663]
对于作为rna结合蛋白的trap，优选地，trip系统最大程度地使用包括至少8个kagnn重复序列的tbs序列，尽管可以使用7个重复序列仍然能获得强大的转基因抑制，并且可以使用6个重复序列也能够充分抑制转基因到可以挽救载体滴度的水平。虽然可以改变kagnn共有序列以维持trap介导的抑制，但优选地，可以优化选择的精确序列以确保在非抑制状态下的高水平翻译。例如，可以通过去除在没有trap的情况下(即在靶细胞中)可能会阻碍mrna的翻译效率的剪接位点、不稳定序列或茎环来优化tbs序列。关于给定tbs的kagnn重复序列的构型，kag重复序列之间的n个“间隔”核苷酸的数量优选为两个。然而，在至少两个kag重复序列之间包括两个以上n间隔的tbs是可以耐受的(根据体外结合研究的判断，多达50％的包括三个n的重复序列可能获得功能性tbs；参见文献“babitzke p,y.j.,campanelli d.(1996)journal of bacteriology 178(17):5159-5163”)。事实上，已经证明了11x kagnn tbs序列可以容忍多达三个kagnnn重复序列的替换，并且仍然保留一些与trap结合合作的潜在有用的翻译阻断活性。
[0664]
在本发明的一个实施方案中，trap结合位点或其部分包括序列kagn
≥2
(例如kagn
2-3
)。因此，为了避免产生疑问，该tbs或其部分包括例如以下任何重复序列：uagnn、gagnn、tagnn、uagnnn、gagnnn或tagnnn。
[0665]“n”应理解为序列中位于该位置的任意核苷酸。例如，这可以是g、a、t、c或u。此类核苷酸的数量优选为2，但最多为3个，例如1、2或3，11x重复tbs或其部分的kag重复序列可以被3个间隔核苷酸隔开，并且仍然保留一些导致翻译抑制的trap结合活性。优选地，在11x重复tbs或其部分中将使用不超过一个n3间隔子以保持导致翻译抑制的最大trap结合活性。
[0666]
在另一个实施方案中，tbs或其部分包括多个kagn
≥2
重复序列(例如kagn
2-3
的多个重复序列)。
[0667]
在另一个实施方案中，tbs或其部分包括多个序列kagn2的重复序列。
[0668]
在另一个实施方案中，tbs或其部分包括至少6个kagn
≥2
重复序列(例如至少6个kagn
2-3
重复序列)。
[0669]
在另一个实施方案中，tbs或其部分包括至少6个kagn2重复序列。例如，tbs或其部分可以包括6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或以上kagn2重复序列。
[0670]
在另一实施方案中，tbs或其部分包括至少8个kagn
≥2
重复序列(例如至少8个kagn
2-3
重复序列)。
[0671]
优选地，存在于tbs或其部分中的kagnnn重复序列的数量为1个或以下。
[0672]
在另一个实施方案中，tbs或其部分包括11个kagn
≥2
重复序列(例如11个kagn
2-3
重复序列)。优选地，存在于该tbs或其部分中的kagnnn重复序列的数量为3个或以下。
[0673]
在另一实施方案中，tbs或其部分包括12个kagn
≥2
重复序列(例如12个kagn
2-3
重复序列)。
[0674]
在一个优选的实施方案中，tbs或其部分包括8至11个kagn2重复序列(例如8、9、10或11个kagn2重复序列)。
[0675]“kagn
≥2
重复序列”应理解为通用kagn
≥2
(例如kagn
2-3
)基序被重复。可以连接满足该基序标准的不同kagn
≥2
序列以构成tbs或其部分。并非意在将所得的tbs或其部分限制为仅满足该基序要求的一个序列的重复序列，然而这种可能性包括在定义中。
approach,irl press”；和“d.m.j.lilley and j.e.dahlberg(1992)methods of enzymology:dna structure part a:synthesis and physical analysis of dna methods in enzymology,academic press”。这些文献的全部内容以引用方式并入本文。
[0690]
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0691]
应当理解，在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确说明，否则该区间也具体公开了该范围的上限和下限之间的各中间值，直至下限单位的十分之一。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开的内容中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且在较小范围内包括任何一个限值或包括或不包括两个限值的各个范围也都包括在在本公开内容内，但受限于所述范围内的任何明确排除的限值。在规定范围包括限值之一或两者的情况下，排除那些包括的限值之一或两者的范围也包括在本公开中。
[0692]
必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
[0693]
如本文所用的术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”、与“包括(including、includes)”或“含有(containing、contains)”同义，并且是包含式的或开放式的，因此不排除额外的、非列举的构件、元件或方法步骤。术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”还包括术语“由
……
组成(consisting of)”。
[0694]
本文所讨论的出版物仅为了提供它们在本技术的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0695]
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明并且不以任何方式限制本发明的范围。
[0696]
实施例
[0697]
方法
[0698]
贴壁细胞培养、转染和慢病毒载体生产
[0699]
hek293t.1-65s悬浮细胞在以下条件中生长：在振荡培养箱中(25mm轨道设置为190rpm)，在37℃，在5％co2中，在freestyle+0.1％clc(gibco)中。为了载体生产，通过离心将悬浮液中的1-65s细胞转移至贴壁模式，并重悬于适当体积的补充有10％热灭活的(fbs)(gibco)、2mm l-谷氨酰胺(sigma)和1％非必需氨基酸(neaa)(sigma)的dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)(sigma)中。在10cm培养皿中在以下条件下以贴壁模式标准规模生产hiv-1载体(当以其他形式进行时，全部条件以面积为标尺)：将重悬于完全培养基中的1-65s细胞以3.5
×
105个细胞/ml接种于10ml完全培养基中，并且在约24小时后，在每10cm平板使用下列质量比的质粒转染细胞：4.5μg基因组、1.4μg gag-pol、1.1μg rev、0.7μg vsv-g和在0.01μg和2μg之间的经修饰的u1snrna质粒。
[0700]
按照制造商的方案(life technologies)，通过在opti-mem中将dna与lipofectamine 2000cd混合介导转染。添加丁酸钠(sigma)～18小时后达到10mm终浓度，持续5小时至6小时，之后用10ml新鲜无血清培养基更换转染培养基。通常，20小时至24小时后
配对，并将两者克隆到含有完整的主要剪接供体(msd)的表达gfp的慢病毒载体基因组中。此外，还将该变体克隆到msd突变的慢病毒载体基因组中，称为“2ko-m5”。msd突变载体与标准载体不同，在载体生产过程中不产生异常剪接的rna，但其滴度降低。已经示出，靶向载体基因组rna的重新定向的u1 snrna的表达能够完全挽救这种缺陷。我们希望在含msd和msd突变载体基因组这两者中测试组合gag-rre变体，并通过经修饰的u1 snrna测试它们的潜在挽救。用这种新变体或标准载体基因组构建体以及包装组分和+/-经修饰的u1 snrna转染无血清的悬浮hek293t细胞，并且通过转导细胞的流式细胞术滴定所得载体上清液(图5)。结果证明，最小gag序列变体δgag[2-atgko]δins能够产生与标准载体相当的载体滴度，并与新rre变体组合使用。组合变体也对经修饰的u1 snrna完全响应，因为与msd突变载体基因组中的标准gag-rre序列相比，同等地挽救了msd突变形式的滴度。因此，不仅可去除全部编码＞7个残基的肽/蛋白的子orf(包括编码病毒蛋白的一部分的子orf)，而且通过删除p17-ins序列产生约250nt的额外载体容量。
[0709]
实施例3：全部子orf完全去除的功能性wpre的开发
[0710]
土拨鼠肝炎病毒转录调控元件(wpre)为顺式作用rna序列，其表现出功能性所必需的功能性保守的二级结构。该元件促进了whv的未剪接rna的细胞质积累，而与任何病毒蛋白无关。此外，已经证明将wpre插入异源mrna显著提高了基因表达水平。这些属性导致wpre包括在大多数标准慢病毒载体平台(第三代)的3'utr中。慢病毒载体包括的wpre元件序列通常由核苷酸1093-1685(genbank登录no.j04514的核苷酸编号方案)组成。该序列保留了whv x-蛋白的pre活性以及启动子和前60个氨基酸所需的三联元件。在标准慢病毒载体中，通过使atg经过删除获得tg使初始密码子突变，去除了x-蛋白的起始密码子，从而改善了载体的安全性。然而，在wpre内编码至少三个orf的其他atg序列保持完整。这包括源自对应于rnase h结构域的whv pol蛋白的160个残基的orf。
[0711]
在该实施例中，全部其他atg通过突变成attg从wpre中除去(图6)。这样做是为了进一步去除wpre中任何潜在编码的orf，从而改善慢病毒载体平台的安全性特征。在此工作之前，这些突变对wpre功能性和载体滴度的影响是未知的。wpre rna是高度结构化的，并且已知至少一个茎环对于其作为转录后调控元件的功能是重要的。然而，wpre的全部活性似乎需要整个元件，这表明存在多个因子结合位点和/或尚未确定的更高级结构这两者中的一者或两者。因此，核苷酸序列的破坏可潜在破坏rna的二级结构，并因此不利地影响wpre的功能性。为了评估这一点，生产了第3代慢病毒载体，其具有去除了x蛋白orf的标准wpre元件(wpre[x-ko])、全部额外的atg都突变成attg的wpre[x-ko](wpreδorf)或没有wpre(图7)这三者中的一者。在hiv-1rev蛋白的存在和不存在这两种情况下生产这些载体，其中通过结合rre元件而促进未剪接的hiv-1rna的细胞质积累。在不存在rev的情况下，全部载体的滴度都低，这证明需要rev-rre介导的载体基因组rna的输出，而与其wpre状态无关。在rev存在的情况下，没有wpre的载体的滴度比使用标准x-ko wpre的载体的滴度低超过1/5。这证明了wpre在慢病毒载体平台中的功能性意义。在x-ko wpre(wpreδorf)中具有全部额外atg去除的慢病毒载体产生与标准wpre x-ko载体相似的滴度。这证明wpre内的全部atg序列的突变不影响其提高慢病毒载体滴度的功能性。