靶向自然杀伤细胞的嵌合抗原受体(CAR)的制作方法

靶向自然杀伤细胞的嵌合抗原受体(car)1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2020年5月8日提交的美国临时专利申请第63/022,149号的优先权，所述美国临时专利申请如同在本文中完全阐述一样以引用的方式整体并入本文。3.关于序列表的声明4.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是2hk4864_st25.txt。文本文件是273kb，于2021年5月7日创建，并且通过efs-web以电子方式提交。发明领域5.本公开提供了结合自然杀伤(nk)细胞表面标志物从而导致所结合的nk细胞破坏的嵌合抗原受体(car)。所述nk细胞表面标志物包括活化性nk细胞受体和抑制性nk细胞受体。还描述了经基因修饰以表达这些car的细胞以及所述car修饰细胞的用途。6.发明背景7.自然杀伤(nk)细胞是一种白细胞，其在免疫系统对肿瘤细胞和病毒感染细胞的反应中起着至关重要的作用。nk细胞响应于炎症介质如干扰素或细胞因子而被活化。nk细胞还表达多种活化性和抑制性受体以及共刺激受体，以识别和响应炎症或感染组织。这些受体结合细胞应激配体，这可导致nk细胞反应。重要的是，这些受体中有一些会阻止nk细胞活化，使得nk细胞不靶向健康组织。8.主要组织相容性复合物i类(mhci)和相关分子是允许nk细胞将健康细胞与应激细胞、感染细胞或赘生性细胞区分开来的生物学的一部分。mhc是指由多个基因和这些基因的多个变体编码的复合物，它允许生物体以免疫学方式从“不健康的或非自身细胞”(例如，生物体的病毒感染细胞和癌细胞或来自病原体的外源性细胞)中识别“健康的自身细胞”(例如，生物体的非病毒感染细胞和非癌细胞)。由mhc编码的分子还决定了生物体对由mhc分子呈递给免疫细胞的部分蛋白质、毒素和/或外来物质的整体免疫反应。9.nk细胞通过从nk细胞内部释放分子(如穿孔素和颗粒酶)对靶细胞发挥细胞毒性功能。当nk细胞接触到要破坏的靶细胞时，从nk细胞释放的穿孔素在靶细胞的细胞膜上形成孔，颗粒酶和相关分子可以通过这些孔进入，从而诱导靶细胞的细胞死亡。10.虽然nk细胞通常是有益的，但也可能与基于nk细胞的癌症相关。nk细胞赘生物，包括nk/t细胞淋巴瘤和侵袭性nk细胞白血病，是罕见的恶性肿瘤。在美国，发病率为0.8/1,000,000，而在南美和亚洲，这一发病率高出3至10倍。观察到高死亡率，总中位生存期为17至20个月，但复发/难治性nk/t淋巴瘤和侵袭性nk细胞白血病的预后变得更糟。这些恶性肿瘤通常与爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus，ebv)感染相关。恶性肿瘤可进一步分为鼻、非鼻和侵袭性淋巴瘤/白血病亚型。大多数鼻nk细胞淋巴瘤表现为i/ii期疾病。i/ii期疾病可进行放射治疗；然而，如果放疗失败或恶性肿瘤已进展超过i/ii期，可能需要同时进行化疗。大剂量化疗联合造血干细胞移植对部分患者可能有益。11.nk细胞也可能具有抑制性表型，在一些情况下可能限制对某些恶性肿瘤和感染的免疫反应。nk细胞抑制性表型可以包括：nk细胞上抑制性受体表达增多；nk细胞活性受抑制；nk细胞溶解靶细胞的能力下降；和/或与正常功能的nk细胞或无抑制性表型的nk细胞相比，nk细胞对炎症细胞、感染细胞、肿瘤细胞和/或其他需要被破坏的细胞的免疫反应降低。肿瘤细胞可以利用这种抑制性表型，例如，通过过表达一种结合nk细胞上的抑制性受体ngk2a的配体(人白细胞抗原e，hla-e)，从而阻断nk细胞杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞上的hla-e表达与不良预后相关。12.一些非nk细胞恶性肿瘤异常表达nk细胞受体。例如，患有塞扎里综合征(sezarysyndrome)(一种侵袭性皮肤t细胞淋巴瘤)的患者在其外周血恶性cd4+t淋巴细胞的细胞表面上表达nkp46nk受体(bensussan等人(2011)jinvestdermatol.131:969–976)。另一实例是，已经观察到20％的成熟t细胞赘生物，包括t细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病和alk+间变性大细胞淋巴瘤，异常表达nkp46受体(freud等人(2013)amjclinpathol.140:853–866)。13.循环或组织nk细胞的变化也可能与nk介导的自身免疫和同种免疫有关，其中健康的自身或非自身组织受到人体免疫系统的攻击。与nk细胞功能相关的自身免疫性病症包括：干燥症(sjogren’sdisease)；抗磷脂综合征；寻常型天疱疮；脊柱关节病；皮肤病，包括牛皮癣；多发性硬化症；系统性硬化症；i型糖尿病；幼年特发性关节炎；类风湿性关节炎；炎症性肠病；自身免疫性肝病；和系统性红斑狼疮(sle)。与nk细胞功能相关的同种免疫性疾病包括：胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症(fnait)，其中母体对胎儿血小板抗原的免疫反应可导致如流产和宫内生长受限等并发症；造血干细胞排斥；实体组织移植排斥；以及器官移植后的慢性同种异体移植物损伤。14.自身免疫和同种免疫的主要治疗方法包括改变受试者的免疫系统以改善炎症和控制过度活跃的免疫反应。实例包括免疫抑制药物、类固醇、非甾体抗炎药、血浆置换、免疫吸附、b细胞减少和脾切除术。还经常使用治疗如疼痛、肿胀、疲劳和皮疹等症状的药物。15.鉴于nk细胞在各种病理状况中的作用，有必要开发疗法用于需要消除或减少nk细胞的情况中，例如在nk细胞恶性肿瘤中，在表达nk细胞受体的非nk恶性肿瘤中，在nk细胞抑制阻止有效的免疫反应且增加nk细胞功能可能有益的疾患中，以及在nk细胞介导的自身免疫性或同种免疫性病症中。技术实现要素：16.本公开提供了包括结合自然杀伤(nk)细胞表面标志物的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)。所述nk细胞表面标志物包括活化性nk细胞受体、抑制性nk细胞受体，或两者。在特定实施方案中，活化性nk细胞受体包括nkp30、nkp44和nkp46。在特定实施方案中，活化性nk细胞受体包括nkp46。在特定实施方案中，抑制性nk细胞受体包括nkg2a和杀伤免疫球蛋白受体(kir)。在特定实施方案中，抑制性nk细胞受体包括nkg2a。在特定实施方案中，nkp46结合结构域包括源自nkp46抗体的单链可变片段(scfv)。在特定实施方案中，nkg2a结合结构域包括人工hla-e模拟物。免疫细胞可以经基因修饰以表达car从而靶向nk细胞。在特定实施方案中，经基因修饰的免疫细胞是t细胞、nk细胞、巨噬细胞、造血干细胞(hsc)或造血祖细胞(hpc)。17.经修饰以表达抗nkcar的免疫细胞可用于体内消耗表达活化性nk受体和/或抑制car和抗cd19car的细胞内细胞因子表达幅度相似。供体a(图4a)和供体b(图4b)的结果是相似的。25.图5.抗nkp46cart细胞对nkp46+细胞的杀伤。单独的表达nkp46的k562细胞的流式细胞术图(左)。流式细胞术分析前与抗cd19cart细胞以2:1比率混合24小时的表达nkp46的k562细胞(中)。流式细胞术分析前与抗nkp46cart细胞以2:1比率混合24小时的表达nkp46的k562细胞(右)。靶细胞位于图的右侧(cd3lo)。t细胞更靠右，上部t细胞表达car，如通过bfp表达所评定。cart细胞存在下的活靶细胞的百分比从抗cd19cart细胞存在下的16.2％下降到抗nkp46cart细胞存在下的4.85％。这表示在抗nkp46car存在下nkp46+靶细胞减少了70％。靶细胞以黑色圈出。表达bfp的t细胞是推定的cart细胞，用黑色圈出并用星号表示。26.图6.抗nkp46cart细胞在与自体nk细胞混合时被活化。图6显示，如通过流式细胞术所评估，当抗nkp46cart细胞与自体nk细胞混合时，抗nkp46cart细胞上的cd137表达上调。cart细胞与靶细胞以2:1比率混合，6小时后通过流式细胞术进行评估。通过对单个表达bfp的活cd3+淋巴细胞进行门控，测量car细胞中的cd137表达。靶细胞是富集nk细胞的自体细胞(40％-50％nk细胞)。27.图7.抗nkp46cart细胞杀伤自体nk细胞。富集自体nk细胞并用细胞示踪剂进行染色，接着与抗nkp46cart细胞、对照cart细胞(抗cd19cart细胞)或模拟t细胞以2car比1靶细胞的比率混合24小时，并且接着通过流式细胞术进行评估。通过对cd3阴性细胞示踪剂橙细胞进行门控来定量nk细胞。在抗nkp46cart细胞存在下，nk细胞的百分比在抗nkp46cart细胞存在下降低了72％，而在对照cart细胞(抗cd19car)存在下仅降低了9％。指示图中显示细胞百分比：淋巴细胞＝70.4(y轴是ssc-a)；单峰(单细胞)＝92.2(y轴是fsc-h)；活细胞＝89.4(y轴是ssc-a)；靶标群体＝100.0(y轴是comp-pe-a)；和nk细胞(cd3阴性)＝45(y轴是comp-pe-a)。28.图8.nk细胞通过与抗nkp46cart细胞接触而被活化。将富集nk细胞的自体靶细胞与抗nkp46cart细胞以2car细胞:1靶细胞比率混合24小时，并且通过流式细胞术评定细胞内细胞因子表达。对nk细胞的门控表明，当nk细胞与抗nkp46cart细胞混合时，细胞因子表达增加，但当nk细胞与模拟t细胞或抗cd19cart细胞混合时，细胞因子表达并未增加。表达ifn-γ或tnf-α的nk细胞的百分比增加了2-3倍，而表达il-2的nk细胞的百分比似乎没有增加。ifn-γ或tnf-α是通常由活化的nk细胞产生的细胞因子。29.图9.自体nk细胞杀伤抗nkp46cart细胞。将抗nkp46或抗cd19cart细胞与自体nk细胞混合，并且在6小时通过流式细胞术进行评定。自体nk细胞载有细胞示踪剂，以帮助区分靶细胞。通过对细胞示踪剂阴性细胞(非靶标)、cd3+(非nk细胞)和bfp(car+细胞)进行门控来评估cart细胞。图显示侧向散射(ssc)与bfp。在自体nk细胞存在下，bfp+抗nkp46细胞的百分比下降了35％(10.2％至6.6％)(上图)；而在自体nk细胞存在下，bfp+抗cd19cart细胞的百分比未下降(下图)。抗nkp46cart细胞的下降似乎在表达最多bfp的细胞中最为明显。30.图10a至图10c.实施例2中描述的抗nkcar设计和car构建。(图10a)抗nkp46和αnkg2acar的细胞外和跨膜结构域的图。在所描述的实施方案中，αnkp46car通过cd8α链铰链和跨膜结构域锚定在膜中，而αnkg2acar使用hla-e跨膜和细胞内结构域。tm，跨膜；scfv，对nkp46受体蛋白具有特异性的单链可变区；b2m，β-2-微球蛋白。(图10b)在源自γ逆转录病毒的mnd增强子-启动子下克隆到prrl骨架中的完整αnkp46和αnkg2acar构建体的示意图。cd8a铰链和tm，cd8a铰链和跨膜结构域；4-1bb，细胞内共刺激结构域；cd3z，刺激性结构域；2a，自裂解肽；bfp，蓝色荧光蛋白。(图10c)描绘模拟物、αnkp46car、αnkg2acar和αcd19对照car中的bfp报告物表达的代表性流图。31.图11a至图11f.αnkp46cart细胞的表型和对nkp46+k562细胞的细胞毒性。(图11a)柱状图显示经分别转导以表达任一受体的骨髓细胞系k562中的nkp46和cd19表达。fmo＝荧光减一对照。(图11b)αnkp46cart细胞表面cd137的概述和(图11c)针对nkp46+k562的细胞内细胞因子上调。将表达bfp的αnkp46cart细胞与nkp46+k562细胞以2:1e:t比率培养24小时并针对cd137染色，或者培养6小时并针对tnfα、ifnγ和il-2表达染色。数据表示三个供体的三个(cd137)或五个(细胞因子)单独实验的平均值+-s.d.。显著性通过双边学生t检验来计算。(图11d)表示与nkp46+k562细胞一起培养的αcd19或αnkp46cart细胞的细胞因子表达谱的饼图。每个阴影表示所表达的细胞因子的特定组合。饼图的每个区域表示具有相应细胞因子表达谱的cart细胞的比例。弧长表示每一所测细胞因子的表达频率。(图11e)左，显示与αnkp46和αcd19cart细胞共培养24小时后溶解的nkp46+k562细胞的百分比的剂量反应曲线。右，以递增效应物剂量与αnkp46或αcd19cart细胞共培养24小时后剩余的nkp46+与cd19+k562细胞的比率。在这些测定中，nkp46+和cd19+k562细胞等数量地与αnkp46或αcd19cart细胞以2:1e:t比率铺板。(图11f)cart细胞特异性杀伤靶细胞的代表性流图。nkp46+和cd19+k562细胞单独地，与模拟物、αnkp46或αcd19cart细胞以2:1e:t比率培养24小时。32.图12a至图12h.αnkp46、αnkg2acart细胞表型和对nk细胞的细胞毒性。(图12a)上：与cart细胞产生同时发生的自体nk细胞分离和扩增的示意图。下图：来自一项代表性实验的点图，显示经由利用nkmacs培养基的nk扩增方案的nk细胞纯度。(图12b)描绘在nkmacs培养基中生长14天时选自pbmc的nk细胞上pbmc的nkp46+和nkg2a表达的代表性直方图。(图12c)描绘nk92细胞上nkp46+和nkg2a表达的代表性直方图。与自体原代nk/t靶标混合物或nk92细胞培养24小时(cd137)或6小时(细胞因子)后表达表面cd137的cart细胞百分比(图12d)或细胞内细胞因子的cart细胞百分比(图12e)。(图12f)表示与自体nk/t细胞混合物或nk92细胞一起培养的cart细胞的细胞因子表达谱的饼图。每个阴影表示所表达的细胞因子的特定组合。饼图的每个区域表示具有相应细胞因子表达谱的cart细胞的比例。弧长表示每一所测细胞因子的表达频率。(图12g)显示与cart细胞共培养6小时后溶解的自体nk细胞的百分比的剂量反应曲线。(图12h)描绘与cart细胞一起培养时细胞示踪剂(celltracker)染色的自体nk细胞的清除的代表性点图。33.图13a至图13e.nk细胞细胞毒性和αnkp46car保护。(图13a)nk细胞对αnkp46cart细胞的细胞毒性和αnkg2acar共表达下的减轻的示意图。(图13b)上，与自体原代nk细胞共培养4小时后剩余的cart细胞的分数(bfpt细胞％)。值被归一化，使得cart细胞仅对照下的bfp+细胞的百分比等于1。下，与自体原代nk细胞共培养4小时后cart细胞的相对bfp平均荧光强度(mfi)。值被归一化，使得cart细胞单独条件下的相对bfpmfi为1。(图13c)上，与nkp46+k562细胞共培养4小时后剩余的αnkp46cart细胞的分数(bfpt细胞％)。值被归一化，使得αnkp46cart细胞仅对照下的bfp+细胞的百分比等于1。下，与nkp46+k562细胞共培养4小时后αnkp46cart细胞的相对bfpmfi。值被归一化，使得αnkp46cart细胞单独条件下的相对bfpmfi为1。(图13d)显示单独培养(上)或与自体原代nk细胞以2:1e:t比率一起培养(下)4小时后的cart细胞的bfp表达的代表性密度图。这些图显示仅αnkp46cart细胞下加入nk细胞后bfp表达％和bfpmfi两者均有所下降。(图13e)在以2:1t:nk细胞比率培养时，针对cart细胞表达细胞内细胞因子的自体原代nk细胞的百分比。34.图14.本公开的示例性序列包括：35.36.37.38.39.具体实施方式40.自然杀伤(nk)细胞是一种白细胞，其在免疫系统对肿瘤细胞和病毒感染细胞的反应中起着至关重要的作用。nk细胞响应于炎症介质如干扰素或细胞因子而被活化。nk细胞还表达多种活化性和抑制性受体以及共刺激受体，以识别和响应炎症或感染组织。这些受体结合细胞应激配体，这可导致nk细胞反应。41.nk细胞通过从nk细胞内部释放特殊分子(如穿孔素和颗粒酶)对靶细胞发挥细胞毒性功能。当nk细胞接触到要破坏的靶细胞时，从nk细胞释放的穿孔素在靶细胞的细胞膜上形成孔，颗粒酶和相关分子可以通过这些孔进入，从而诱导靶细胞的细胞死亡。42.nk细胞不会不加区别地杀死正常细胞，因为nk细胞表达几种受体，这些受体可识别在正常细胞上表达的主要组织相容性复合物(mhc)i类分子。重要的是，这些受体中有一些可阻止nk细胞活化，使得nk细胞不靶向健康组织。主要组织相容性复合物i类(mhci)和相关分子是允许nk细胞将健康自身细胞与应激细胞、感染细胞、外源性细胞或赘生性细胞区分开来的生物学的一部分。靶细胞上一个或多个mhci类等位基因的表达缺乏导致nk介导的靶细胞溶解。例如，在细胞、组织或器官移植中，供体和接受体之间mhci分子的错配可导致抗体识别错配，以及nk细胞通过抗体依赖性细胞毒性破坏供体细胞、组织或器官。43.nk细胞通常是有益的；然而，nk细胞恶性肿瘤也会发生。自然杀伤(nk)细胞肿瘤的有效治疗选择有限且死亡率高(campo等人blood117,5019–5032(2011)；matutes,e.int.j.lab.hematol.40,97–103(2018))。世界卫生组织(who)将nk细胞恶性肿瘤分为两种主要类型：结外nk/t细胞淋巴瘤鼻型(enk/tl)和侵袭性nk细胞白血病(ankl)，两者都与爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)密切相关(campo等人blood117,5019–5032(2011)；matutes,e.int.j.lab.hematol.40,97–103(2018)；saleem&natkunam.int.j.mol.sci.21,1501(2020))。nk细胞肿瘤分类示于图1中。这些肿瘤的特征可以是血管浸润和/或血管破坏；细胞质嗜天青颗粒(通过romanowsky染色)；和/或cd2+/cd3-/ccd3ε+/cd56+表型。这些占全球所有非霍奇金淋巴瘤的≥2％，但在亚洲和南美洲地区的流行率高出3-10倍(perry等人haematologica101,1244–1250(2016))。在非流行的资源匮乏的国家，它们与不成比例的疾病负担相关(sánchez-romero等人headneckpathol.13,624–634(2019))。尽管低风险i/ii期enktl的预后已变得更加有利(90％持久缓解)，但高风险和晚期enktl的治疗仍具有挑战性(tse&kwong.bestpract.res.clin.haematol.32,253–261(2019))，复发/难治性enktl的中位生存期为6个月(lim等人(2017)annalsofoncology,28(9),2199-2205)。ankl的预后很差，据报告中位生存期为2个月(kwong,y.-l.leukemia19,2186–2194(2005)；suzuki等人(2004).leukemia,18(4),763-770)，指的是在没有干细胞移植的情况下(hamadani等人2017)biologyofbloodandmarrowtransplantation,23(5),853-856)。为此，迫切需要针对nk细胞恶性肿瘤的创新的且更有效的治疗。44.循环或组织nk细胞的变化也与自身免疫性和同种免疫性疾病有关。自身免疫是对自身抗原的免疫反应。与nk细胞功能相关的自身免疫性病症包括：干燥症；抗磷脂综合征；寻常型天疱疮；脊柱关节病；皮肤病，包括牛皮癣；多发性硬化症；系统性硬化症；i型糖尿病(gur等人nat.immunol.11,121–128(2010))；幼年特发性关节炎；类风湿性关节炎；炎症性肠病；自身免疫性肝病；和系统性红斑狼疮(sle)。45.同种免疫(有时称为同族免疫)是对来自同一物种成员的非自身抗原的免疫反应。非自身抗原称为同种异体抗原或异抗原。两种主要类型的同种异体抗原是血型抗原和组织相容性抗原。在同种免疫中，身体会产生针对同种异体抗原的抗体，攻击输血、同种异体移植组织和胎儿。同种免疫反应可导致移植物排斥，表现为移植物功能恶化或完全丧失。nk细胞与胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症(fnait)相关，在该病症中母体对胎儿血小板抗原的免疫反应可导致流产和宫内生长受限等并发症(yougbare等人(2017)natcommun.8(1):224)。观察到妊娠中期后子宫自然杀伤(unk)细胞的募集和存活导致nkp46和cd107表达升高、穿孔素释放和滋养层细胞凋亡。nk细胞还与造血干细胞排斥、实体组织移植排斥和肾移植后的慢性同种异体移植物损伤相关。46.尽管nkp46表达通常仅限于nk细胞，但已报告在非nk细胞恶性肿瘤中出现异常nkp46表达。例如，患有塞扎里综合征(一种侵袭性皮肤t细胞淋巴瘤)的患者在其外周血恶性cd4+t淋巴细胞的细胞表面上表达nkp46nk受体(bensussan等人(2011)jinvestdermatol.131:969–976)。另一实例是，已经观察到20％的成熟t细胞肿瘤，包括t细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病和alk+间变性大细胞淋巴瘤，异常表达nkp46受体(freud等人(2013)amjclinpathol.140:853–866)。47.鉴于nk细胞在各种病理状况中的作用，有必要开发疗法用于需要消除或减少nk细胞的情况中，例如在nk细胞恶性肿瘤、表达nk细胞受体的非nk恶性肿瘤、nk细胞介导的自身免疫性或同种免疫性病症中，以及在抑制性nk细胞表型占主导地位且增加nk细胞功能可能有益的疾患中(如恶性肿瘤，尤其是肿瘤微环境，以及在某些慢性感染中)。48.本公开提供了嵌合抗原受体(car)和经基因修饰以表达car的细胞作为nk细胞相关疾病的疗法。car是指一种融合多肽或一组多肽，当其在免疫细胞中表达时，为细胞提供对靶细胞(例如，nk细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在特定实施方案中，car的结合结构域与其靶细胞表面上的靶抗原的接合导致car簇集并将活化刺激递送至表达car的细胞。car的主要特征是它们能够重定向免疫细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或能够以mhc非依赖性方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡的分子的产生，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。49.在特定实施方案中，car包括：通过跨膜结构域连接至细胞内组分的细胞外组分。细胞外组分包括特异性地结合由靶向细胞(此处为nk细胞)表达的抗原的结合结构域。nk细胞不表达统一的细胞表面标志物(hudspeth等人(2013)frontiersinimmunology4:69)，因此开发了两种方法。一种是具有特异性地结合活化性nk受体的结合结构域的car。在特定实施方案中，活化性nk受体包括nkp46(也称为ncr1或cd335)，第二种是具有特异性地结合抑制性nk受体的结合结构域的car。在特定实施方案中，抑制性nk受体包括cd94/nkg2a。50.在特定实施方案中，结合结构域包括单链可变片段(scfv)。例如，结合结构域可以包括源自抗nkp46抗体的scfv(gauthier等人(2019)cell177(7):1701-1713；wo2016/207278)。结合cd94/nkg2a的结合结构域可以包括人工设计的hla-e模拟物，如gornalusse等人(2017)naturebiotechnology35(8):765中所述。51.car的细胞外组分通常包括另外的组分，如间隔区以增强构象柔性，和/或标签序列以在细胞制造过程中和/或在递送至受试者后控制car。52.在特定实施方案中，细胞内组分包括源自如本文所定义的刺激性分子和/或共刺激分子中一者或多者的细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)。在特定实施方案中，刺激性分子是与t细胞受体复合物相关的cd3zeta(cd3ζ)链。在特定实施方案中，细胞质信号传导结构域还包括源自如本文所定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在特定实施方案中，共刺激分子包括4-1bb(即cd137)或cd28。53.在特定实施方案中，结合本公开的抑制性nk受体的car(例如，抗nkg2acar)包括缺乏细胞内信号传导结构域的细胞内组分。包括缺乏细胞内信号传导结构域的hla-e或hla-e模拟物的结合抑制性nk受体的car(例如，抗nkg2acar)可以在开发现现成cart细胞疗法中带来益处。缺乏hla-a、hla-b和/或hla-c表达但过表达hla-e或hla-e模拟物的同种异体cart细胞产物可以避免宿主t和nk细胞介导的排斥(gornalusse等人nat.biotechnol.35,765–772(2017)；torikai等人blood122,1341–1349(2013))。在特定实施方案中，表达结合抑制性nk受体的car的细胞固有地受到保护以免受nk介导的细胞溶解。54.在特定实施方案中，细胞可以共表达结合抑制性nk受体的car和结合活化性nk受体的car以减轻由结合活化性nk受体的car所活化的靶nk细胞引起的car修饰细胞的细胞溶解。在特定实施方案中，表达结合活化性nk受体的car的抗nkcar修饰细胞可以避免在经基因修饰以表达结合抑制性nk受体的car的细胞存在下靶nk细胞引起的细胞溶解。在特定实施方案中，结合活化性nk受体的car包括抗nkp46car。在特定实施方案中，结合抑制性nk受体的car包括抗nkg2acar。在特定实施方案中，本公开的抗nkg2acar包括包含结合nkg2a受体的hla-e或hla-e模拟物的细胞外组分，并且具有细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，本公开的抗nkg2acar包括包含结合nkg2a受体的hla-e或hla-e模拟物的细胞外组分，并且缺乏细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，本公开的抗nkg2acar包括包含结合nkg2a受体的抗nkg2ascfv的细胞外组分，并且具有细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，本公开的抗nkg2acar包括包含结合nkg2a受体的抗ngk2ascfv的细胞外组分，并且缺乏细胞内信号传导结构域。55.在特定实施方案中，跨膜结构域包括cd8跨膜结构域。在特定实施方案中，跨膜结构域通过接头连接至细胞内组分。56.在特定实施方案中，car在car蛋白的氨基末端(n末端)包括任选的前导(即信号)序列。在特定实施方案中，car在细胞外结合结构域的n末端包括前导序列，其中在细胞加工和car定位到细胞膜期间，前导序列任选地从结合结构域裂解。在特定实施方案中，本公开的car的信号序列包括：seqidno:238所示的cd8信号肽序列；由seqidno:239编码的cd8信号肽；seqidno:130所示的β-2-微球蛋白(b2m)信号肽序列；和由seqidno:131、132和208编码的b2m信号肽序列。在特定实施方案中，分子可以与car共表达，这些分子包括例如转导标志物；充当安全开关的基因产物；归巢受体；趋化因子受体；和/或细胞因子受体。57.靶向nk细胞可以通过某些特征和生物学特性来识别，包括：大颗粒淋巴细胞(lgl)形态；特定表面抗原(包括cd16、cd56、cd57、nkr-p1、ly49d受体和/或gp42)的表达；细胞表面上α/β或γ/δtcr复合物的不存在；髓过氧化物酶(mpo)的不存在；通过活化特定细胞溶解酶结合并杀伤无法表达自身mhc/hla抗原的细胞的能力；杀伤表达nk活化性受体的配体的肿瘤细胞或其他病变细胞的能力；和/或释放可刺激或抑制免疫反应的称为细胞因子的蛋白质分子的能力。使用本领域中众所周知的方法，任何这些特征和活性都可用于鉴定nk细胞。58.在特定实施方案中，本公开描述了靶向nk恶性肿瘤的cart细胞。在不同的nk细胞亚群中nkp46和/或nkg2a表达有所不同。在nk细胞恶性肿瘤中，大多数似乎表达nkp46(freud等人(2013)americanjournalofclinicalpathology140(6):853-866；uemura等人(2018)cancerscience109(4):1254-1262)。nkg2a在许多nk恶性肿瘤中表达，但表达nkg2a的nk恶性肿瘤的百分比没有充分确定(haedicke等人(2000)blood95(11):3628-3630；dukers等人j.clin.path54(3):224-228))。此外，nk细胞在一些自身免疫性和同种免疫性炎症和疾病中发挥作用(poggi&zocchi(2014)frontiersinimmunology5:27)，这使得他们适合用抗nkcart细胞治疗。nk细胞引起的自身免疫或同种免疫可以通过消耗表达活化性受体(如nkp46)的nk细胞来选择性地抑制。相反，当需要nk和t细胞免疫时，也可以通过消耗表达高水平抑制性受体的nk和t细胞来增强nk和t细胞免疫，这有点类似于抗nkg2a单克隆抗体，如莫纳利珠单抗(monalizumab)，其正在作为检查点抑制剂进行测试以治疗癌症(creelan&antonia(2019)nat.rev.clin.onc.16(5):277-278；andré等人(2018)cell175(7):1731-1743)。莫纳利珠单抗是一种人源化igg4抗体，其靶向表达于肿瘤浸润性细胞毒性nk和cd8t淋巴细胞上的nkg2a抑制性受体(innatepharmasa,marseille,france)。59.本文所述的组合物和方法可以完全或部分消耗nk细胞，可能持续一段延长的时间。然而，个体可以忍受nk缺乏期，例如在干细胞移植和其他程序期间。还有一些人已知有nk细胞缺陷(综述于orangejallergyclinimmunol(2013)132(3):515-525中)。然而，这些个体最终会发生病毒感染(尤其是人疱疹病毒)和病毒相关的恶性肿瘤。因此，一旦根除病变的nk细胞群体，重新引入健康的nk细胞群体可能是有益的。在特定实施方案中，利用抗nkcar修饰细胞的治疗也可以与抗病毒治疗或防治联合进行。在特定实施方案中，调节(即，打开或关闭)抗nkcar修饰细胞以控制毒性，例如利用分子安全开关。60.与当前公开相关的以下方面和选项现在更详细地描述如下：(i)car结合结构域和靶向nk细胞标志物；(ii)car细胞内组分；(iii)car跨膜结构域；(iv)car接头；(v)car检测和控制元件；(vi)经基因修饰以表达car的细胞；(vii)离体和体内收集和修饰细胞的方法；(viii)car的产生；(ix)表征表达car的细胞的测定；(x)表征靶nk细胞的测定；(xi)组合物和制剂；(xii)使用方法；(xiii)药盒；(xiv)变体；(xv)示例性实施方案；(xvi)实验实施例；和(xvii)结束段落。这些标题仅提供用于组织目的，并不限制本公开的范围或解释。61.(i)car结合结构域和靶向nk细胞标志物.在特定实施方案中，car可以包括结合由nk细胞表达的细胞标志物的细胞外抗原结合结构域(即结合结构域)。在特定实施方案中，细胞标志物是活化性nk受体。活化性nk受体包括nk细胞表面上在受到刺激时引起本领域已知的与nk活性相关的任何特性或活性的可测量增加的任何分子，这些特性或活性如细胞因子的产生(例如，干扰素γ(ifnγ)和肿瘤坏死因子α(tnfα))，细胞内游离钙水平的增加，和/或在重定向杀伤测定中靶向细胞的能力。在特定实施方案中，nk活化性受体可以通过基于胞质酪氨酸的基序发出信号。在特定实施方案中，nk活化性受体包括：cd2；cd44；分形趋化因子(fractalkine)受体；cd27；cd160；cd137；自然杀伤细胞组2d(nkg2d)；dnax辅助分子1(dnam1)；活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kar)；c型凝集素样活化性受体nkp80；信号传导淋巴细胞活化分子(slam)受体家族，包括slamf3、slamf4、slamf5、slamf6和slamf7；以及天然细胞毒性受体(ncr)，包括nkp30、nkp44和nkp46。ncr选择性地表达于nk细胞上，并参与nk细胞在自身免疫性疾患中对病原体、肿瘤细胞、病毒感染细胞和自身细胞的识别和活化。62.在特定实施方案中，car可以包括结合nk细胞上的nkp46活化性受体(也称为天然细胞毒性触发受体1(ncr1)或分化簇(cd)335)的细胞外结合结构域。nkp46是一种46kda的i型跨膜糖蛋白，具有细胞外免疫球蛋白(ig)结构域、一个含有带正电荷的氨基酸残基的跨膜结构域和一个短的细胞质尾。示例性nkp46氨基酸序列包括seqidno:1(uniprotido76036)。编码nkp46的示例性nkp46核苷酸序列包括seqidno:2(ncbiref:nm_004829)。特异性单克隆抗体与nkp46交联导致强烈的nk细胞活化，从而引起细胞内ca++水平的升高，细胞毒性的触发以及淋巴因子的释放(sivori等人(1997)j.exp.med.186:1129-1136)。wo2005/105848描述了一种单克隆抗nkp46抗体(bab281)，它能够活化nk细胞并且还被存在于靶细胞表面上的人fc受体，例如fcgamma(fcγ)受体特异性地结合。在特定实施方案中，单克隆抗nkp46抗体包括通过用sivori等人(1997)j.exp.med.186:1129-1136描述的nk细胞克隆s192使小鼠免疫而产生的igg1抗体。在特定实施方案中，靶向nkp46的car结合结构域包括源自抗nkp46抗体的scfv(gauthier等人(2019)cell,177(7),1701-1713；wo2016/207278；wo2017/016805)。在特定实施方案中，靶向nkp46的car结合结构域包括表1和表2中抗nkp46抗体的互补决定区(cdr)、重链可变(vh)结构域和轻链可变(vl)结构域。63.表1.靶向nkp46的抗nkp46抗体的cdr的示例性序列64.65.66.[0067][0068]ab＝抗体[0069]表2.靶向nkp46的抗nkp46抗体的重链可变(vh)和轻链可变(vl)结构域的示例性氨基酸序列[0070][0071][0072][0073][0074]在特定实施方案中，靶向nkp46的car的结合结构域包括表3中的抗nkp46抗体的单链可变片段(scfv)。在特定实施方案中，源自靶向nkp46的抗nkp46抗体的scfv由包括seqidno:120-126和248在内的核苷酸序列编码。[0075]表3.源自靶向nkp46的抗nkp46抗体的scfv的示例性氨基酸序列[0076][0077][0078][0079]在特定实施方案中，靶向nkp46的car的结合结构域包括vh结构域，所述vh结构域包括：具有tygigvg(seqidno:260)的序列的cdrh1、具有hiwwndneyynidlks(seqidno:261)的序列的cdrh2和具有gnyryargyvmdy(seqidno:262)的序列的cdrh3；以及vl结构域，所述vl结构域包括：具有rasesveyygtslmq(seqidno:263)的序列的cdrl1、具有aasnves(seqidno:264)的序列的cdrl2和具有qqnrkvpwt(seqidno:265)的序列的cdrl3。在特定实施方案中，靶向nkp46的car的结合结构域包括如seqidno:266所示的重链抗原结合片段和如seqidno:267所示的轻链的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向nkp46的car的结合结构域包括可商购抗体的抗原结合片段，这些抗体包括：小鼠单克隆igg2b抗人nkp46克隆#195314(r&dsystems，猫#mab1850，minneapolis，mn)；和小鼠单克隆igg1抗人nkp46克隆9e2(biolegend，猫#331902，sandiego，ca)。[0080]在特定实施方案中，car可以包括结合nkp30活化性受体的细胞外结合结构域。在特定实施方案中，nkp30包括seqidno:268的氨基酸序列(ncr3，uniprotido14931)。在特定实施方案中，靶向nkp30的car的结合结构域包括jp2008502322中描述的抗体az20、抗体a76和抗体z25的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向nkp30的car的结合结构域包括仓鼠抗nkp30抗体(包括wo2020172605中描述的15e1、9g1、15h6、9d9、3a12和12d10)的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向nkp30的car的结合结构域包括可商购抗体的抗原结合片段，这些抗体包括：小鼠单克隆igg2a抗人nkp30克隆#210845(r&dsystems，猫#mab1849，minneapolis，mn)；小鼠单克隆igg1抗人nkp30克隆p30-15(bdbiosciences，猫#563384，franklinlakes，nj)；和小鼠单克隆igg1抗nkp30克隆af29-4d12(thermofisherscientific，猫#501122309，waltham，ma)。[0081]在特定实施方案中，car可以包括结合nkp44活化性受体的细胞外结合结构域。在特定实施方案中，nkp44包括seqidno:269的氨基酸序列(ncr2/cd336，uniprotido95944)。在特定实施方案中，靶向nkp44的car的结合结构域包括jp2008502322中描述的小鼠单克隆抗体z231的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向nkp44的car的结合结构域包e结合肽可以包括：多药耐药相关蛋白7的肽，其包括alalvrmli(seqidno:286)的氨基酸序列(wooden等人jimmunol2005；175:1383-1387)；和hsp60的前导肽，其包括氨基酸序列qmrpvsrvl(seqidno:287)(michaelsson等人jexpmed2002；196:1403-1414)。[0084]在特定实施方案中，car可以包括结合nk细胞表面抑制性受体cd94/nkg2a的细胞外结合结构域。在特定实施方案中，人nkg2a包括seqidno:186。在特定实施方案中，人nkg2a由seqidno:187编码。在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域包括人工hla-e模拟物(gornalusse等人(2017)naturebiotechnology,35(8),765)。在特定实施方案中，hla-e模拟物包括以下的异源三聚体：1)hla-g的信号肽(另一种hlai类分子)；2)成熟β-2微球蛋白(b2m)；和3)hla-e01:03重链(图2a、图10a)。[0085]在特定实施方案中，hla-g的信号肽(即，图2a、图10a中的“g肽”)包括通常由hla-e呈递的非多态性肽，其通过与cd94/nkg2a结合抑制nk细胞依赖性溶解。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括hla-g的信号肽，其包括vmaprtlfl(seqidno:127)。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物的hla-g信号肽(即，图2a、图10a中的“g肽”)由seqidno:128、129和207编码。[0086]b2m是一种非多形性基因，它编码所有多形性hlai类重链的表面表达所需的共同蛋白质亚基。如同其他hlai类分子，hla-e可以与b2m亚基形成异源二聚体。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括如seqidno:130所示的b2m信号肽。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物的b2m信号肽由seqidno:131、132和208编码。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括如seqidno:133所示的b2m多肽。在特定实施方案中，b2m多肽是不包括b2m信号肽的成熟多肽。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物的成熟b2m多肽由seqidno:134、135和209编码。[0087]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括hla-e重(α)链。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括如seqidno:136所示的hla-e01:03重(α)链。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物的hla-e01:03重(α)链由seqidno:137和210编码。[0088]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:130所示和/或由seqidno:131、132或208编码的b2m信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:128、129或207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:134、135或209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:137或210编码的hla-e01:03重链。[0089]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:130所示和/或由seqidno:208编码的b2m信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括seqidno:242所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物由seqidno:243所示的核苷酸序列编码。[0090]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:238所示和/或由seqidno:239编码的cd8信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括seqidno:244所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物由seqidno:245所示的核苷酸序列编码。[0091]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:238所示和/或由seqidno:239编码的cd8信号肽；2)seqidno:130所示和/或由seqidno:208编码的b2m信号肽；3)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；4)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；5)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；6)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和7)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物包括seqidno:246所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物由seqidno:247所示的核苷酸序列编码。[0092]在特定实施方案中，人工hla-e模拟物可不包括以下一者或多者：cd8信号肽、b2m信号肽、hla-g信号肽、(ggggs)3柔性接头、(ggggs)4柔性接头、b2m成熟蛋白和/或hla-eα链的跨膜结构域。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物可以不包括hla-g信号肽。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物可以不包括b2m成熟蛋白。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物可以不包括hla-eα链的跨膜结构域。在特定实施方案中，hla-eα链的跨膜结构域包括在seqidno:136所示的成熟b2m中发现的序列vgiiaglvllgsvvsgavvaaviw(seqidno:259)。[0093]在特定实施方案中，使用人工hla-e模拟物结合nk细胞上的cd94-nkg2a抑制性受体的意想不到的益处包括允许使用hla破坏的同种异体抗nkcar修饰细胞而不导致nk介导的抗nkcar修饰细胞的细胞溶解。在特定实施方案中，表达car与人工hla-e模拟物的抗nkcar修饰细胞可以避免nk介导的细胞溶解，因为nk细胞被人工hla-e模拟物抑制。在特定实施方案中，人工hla-e模拟物缺乏细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，表达抗nkp46car的抗nkcar修饰细胞可通过共表达car与人工hla-e模拟物来避免靶nk细胞引起的细胞溶解。在特定实施方案中，表达抗nkp46car的抗nkcar修饰细胞可以在存在经基因修饰以表达car与人工hla-e模拟物的细胞的情况下避免靶nk细胞引起的细胞溶解。共表达包括在细胞中表达car，其中car同时具有活化性nk受体结合结构域和抑制性nk受体结合结构域；或在细胞中表达两个单独的car，一个car包括活化性nk受体结合结构域，另一个car包括抑制性nk受体结合结构域。[0094]在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域包括源自结合nkg2a的抗体的scfv。在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域包括莫纳利珠单抗或者可以源自莫纳利珠单抗。莫纳利珠单抗是一种人源化igg4单克隆抗体，其靶向表达于肿瘤浸润性细胞毒性nk和cd8t淋巴细胞上的nkg2a受体(wo2016/041947；innatepharma,marseilles,france)。[0095]在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域包括表4至表6中公开的莫纳利珠单抗的cdr(根据kabat编号)、vh结构域、重链和轻链。[0096]表4.莫纳利珠单抗的cdr的示例性序列[0097][0098]表5.莫纳利珠单抗的可变重结构域(vh)的示例性氨基酸序列[0099][0100][0101]表6.莫纳利珠单抗的重链和轻链的示例性氨基酸序列[0102][0103][0104][0105]在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域可源自：抗nkg2a抗体z270(wo2006070286；wo2008/009545；us8,206,709)；人源化抗nkg2a抗体z199(wo2009/092805；carretero等人eurjimmunol1997；27:563-567；可经由beckmancoulter,inc.，产品号im2750，brea，ca商购获得))；大鼠抗鼠nkg2抗体20d5(vance等人(1999)jexpmed190:1801-1812；可经由bdbiosciencespharmingen，目录号550518，usa商购获得)；和鼠抗体3s9(us2003/0095965)。在特定实施方案中，靶向nkg2a的结合结构域包括vh结构域，所述vh结构域包括：具有syams(seqidno:290)的序列的cdrh1、具有eissggsytyyadsvkg(seqidno:291)的序列的cdrh2和具有hgdyprffdv(seqidno:292)的序列的cdrh3；以及vl结构域，所述vl结构域包括：具有sasssvssyiy(seqidno:293)的序列的cdrl1、具有ltsnlas(seqidno:294)的序列的cdrl2和具有qqwsgnpyt(seqidno:295)的序列的cdrl3，如us9422368中所述。[0106]在特定实施方案中，car可以包括结合kir的细胞外结合结构域。在特定实施方案中，靶向kir的car的结合结构域包括如seqidno:288所示的重链抗原结合片段和如seqidno:289所示的轻链可变结构域的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向kir的car的结合结构域包括us8119775和shin等人hybridoma1999；18:521-527中描述的抗体a210或抗体a803g的抗原结合片段。在特定实施方案中，靶向kir的car的结合结构域包括可商购抗体的抗原结合片段，这些抗体包括：小鼠单克隆igg2b抗人kir克隆#180704(r&dsystems，猫#mab1848，minneapolis，mn)；和小鼠单克隆igg1抗人kir克隆nkvfs1(bio-rad，猫#mca2243，hercules，ca；spaggiari等人blood2002；99:1706-1714和blood2002；100:4098-4107)。[0107]经修饰以表达靶向活化性nk受体(如nkp46)的car的免疫细胞可以杀伤nk细胞，但也可以诱导nk细胞的活化，从而导致nk介导的cart细胞杀伤。在特定实施方案中，结合抑制性nk受体的结合结构域可以在抗nkp46car修饰细胞中表达或过表达，以帮助防止抗nkp46car修饰细胞被由于抗nkp46car修饰细胞与nkp46结合而被活化的nk细胞溶解。在特定实施方案中，结合抑制性nk受体的结合结构域包括hla-e或hla-e模拟物。这与gornalusse等人2017(naturebiotechnology,35(8),765)的hla-e模拟物用途形成对比，其中hla-e模拟物用于防止经工程化不表达hla的细胞的溶解。相比之下，在本公开中，hla-e有助于防止其中hla和β-2-微球蛋白仍然完整的car细胞的溶解。在特定实施方案中，结合抑制性nk受体的结合结构域包括莫纳利珠单抗。在特定实施方案中，结合抑制性nk受体的结合结构域包括源自本文所述的抗nkg2a抗体的结合结构域。[0108]结合抑制性nk受体以赋予表达car的细胞(即表达抗nk活化性受体car的细胞)对nk细胞杀伤的抗性的结合结构域的表达或过表达可以以多种方式发生。在特定实施方案中，细胞可以共表达：(a)car，其中细胞外组分包括结合活化性nk受体(例如，nkp46)的结合结构域；和(b)car，其中细胞外组分包括抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)。在特定实施方案中，细胞可以共表达：(a)car，其中细胞外组分包括结合活化性nk受体(例如，nkp46)的结合结构域；和(b)car，其中细胞外组分包括抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)，并且细胞内组分缺乏一个或多个细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，细胞可以共表达：(a)car，其中细胞外组分包括结合活化性nk受体(例如，nkp46)的结合结构域；和(b)细胞表面上包括抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)的不包括细胞内信号传导组分的分子。在特定实施方案中，细胞可以表达包括细胞外组分的单个car，所述细胞外组分包括活化性nk受体(例如，nkp46)和抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)。在特定实施方案中，第一细胞群体可以表达car，其中细胞外组分包括结合活化性nk受体(例如，nkp46)的结合结构域；并且第二细胞群体可以表达car，其中细胞外组分包括抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)(具有或不具有一个或多个细胞内信号传导结构域)。在特定实施方案中，第一细胞群体可以表达car，其中细胞外组分包括结合活化性nk受体(例如，nkp46)的结合结构域；并且第二细胞群体可以表达各细胞表面上包括抑制性nk受体结合结构域(例如，hla-e模拟物)的不包括细胞内信号传导结构域的分子。分子(例如，多肽，car)在细胞中或细胞上的过表达包括将分子的表达增加到高于细胞正常产生的水平的水平。分子(例如，多肽，car)在细胞中或细胞上的过表达包括由引入细胞中的载体中的基因编码的分子的表达。[0109]在特定实施方案中，结合结构域可以包括抗体或其结合片段。如技术人员将理解的并且如本文别处所述，完整抗体包括两条重链和两条轻链。每条重链包括一个可变区和第一、第二和第三恒定区，而每条轻链包括一个可变区和一个恒定区。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，而哺乳动物轻链分为λ或κ。包括α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分为免疫球蛋白(ig)a、igd、ige、igg和igm。完整的抗体形成“y”形。y的茎由结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区(而对于ige和igm，是第四恒定区)组成，并且在铰链中形成二硫键(链间)。重链γ、α和δ具有由三个串联(在一条线上)ig结构域构成的恒定区和用以增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“ch2结构域”和“ch3结构域”。y的每个臂包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。[0110]轻链和重链可变区含有由三个高变区中断的“框架”区，高变区也称为“互补决定区”或“cdr”。cdr可以通过常规方法，例如按照根据kabat等人(wu和kabat(1970)jexpmed.132(2):211-50；borden和kabat(1987)pnas,84:2440-2443；kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)，或按照根据chothia等人(chothia和lesk(1987)jmol.biol.,196(4):901-917；chothia等人,nature,342:877-883(1989))的结构来定义或鉴定。[0111]不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种如人内是相对保守的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐cdr。cdr主要负责与抗原的表位结合。每条链的cdr通常称为cdr1、cdr2和cdr3(从n末端开始按顺序编号)，并且通常也由特定cdr所在的链标识。因此，位于抗体重链可变结构域的cdr称为cdrh1、cdrh2和cdrh3，而位于抗体轻链可变结构域的cdr称为cdrl1、cdrl2和cdrl3。具有不同特异性(即，对不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同的cdr。尽管cdr因抗体而异，但cdr内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。cdr内的这些位置称为特异性决定残基(sdr)。[0112]提及“vh”或“vh”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、fv、scfv、dsfv、fab或如本文公开的其他抗体片段的可变区。提及“vl”或“vl”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、fv、scfv、dsfv、fab或如本文公开的其他抗体片段的可变区。在特定实施方案中，“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的可变区并且包括重链的cdr。在特定实施方案中，“vl结构域”包括免疫球蛋白轻链的可变区并且包括轻链的cdr。[0113]术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2、fv片段、单链可变(scfv)抗体片段、二硫键连接的fv(sdfv)、包括vh和恒定ch1结构域的fd片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdab(vl或vh))、骆驼科仅可变重(vhh)结构域、由抗体片段(如二价片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段)形成的多特异性抗体，以及抗体的分离的cdr或其他表位结合片段(harlow等人,1999,于：usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等人,1989,于：antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,n.y.；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等人,1988,science242:423-426)。抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-nar和bis-scfv中(参见，例如，hollinger和hudson(2005)naturebiotechnology23:1126-1136)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如iii型纤连蛋白(fn3)的支架中(参见us6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。[0114]术语“scfv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区是经由合成接头例如短的柔性多肽接头连续连接的并且能够表达为单链多肽，并且其中scfv保留了其所源自的完整抗体的特异性。在特定实施方案中，连接可变区的接头可以包括甘氨酸-丝氨酸接头，包括seqidno:142-145。在特定实施方案中，scfv可以具有任意顺序的vl和vh可变区，例如，相对于多肽的n末端和c末端，scfv可以包括vl-接头-vh或者可以包括vh-接头-vl。[0115]重组抗体包括使用重组dna技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。重组抗体还包括通过合成编码抗体的dna分子并且该dna分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中已使用重组dna或氨基酸序列技术获得该dna或氨基酸序列，该技术在本领域中是可获得的并且是众所周知的。[0116]“单克隆抗体”是由单个b淋巴细胞克隆或由转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合物制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。[0117]在特定实施方案中，结合结构域可以包括人源化形式的非人(例如，鼠)抗体或其抗原结合片段。人源化抗体包括一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物(非人)免疫球蛋白的结合区例如cdr融合的抗体。此类人源化抗体被设计为保持结合区所源自的非人抗体的结合特异性，但避免针对非人抗体的免疫反应。在特定实施方案中，结合结构域可以包括完全人抗体或其抗体片段，其中整个分子来源于人或者包括与人形式的抗体或免疫球蛋白同一的氨基酸序列。[0118]在特定实施方案中，结合结构域可以包括嵌合抗体或其抗原结合片段。嵌合抗体可以包括抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替代或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接至具有不同或改变的类别、效应功能和/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部分被改变、替代或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。[0119](ii)car细胞内组分.car的细胞内组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域产生促进car修饰细胞例如抗nkcar修饰免疫细胞的免疫效应功能的信号。例如在抗nkcar修饰免疫细胞中的免疫效应功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。[0120]信号传导结构域是指蛋白质的功能部分，它们通过在细胞内传递信息以经由限定的信号传导通路通过产生第二信使或通过响应此类信使而作为效应子发挥作用来调节细胞活性。刺激是指由刺激分子(例如，car)与其同源配体(例如，nk细胞表面标志物)结合所诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，例如经由car的适当信号传导结构域的信号传导。刺激可以介导某些分子的表达改变。刺激分子是指由提供细胞质信号传导序列的免疫细胞(例如，t细胞、nk细胞、b细胞)表达的分子，所述细胞质信号传导序列相对于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激性方式调节免疫细胞的活化。在特定实施方案中，信号是初级信号，所述初级信号例如通过car与nk细胞表面标志物的结合引发，这导致免疫细胞反应的介导，包括增殖、活化、分化等。[0121]细胞内信号传导结构域可以包括其所源自的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括初级细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。[0122]初级细胞内信号传导结构域可以包括称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号基序。含有itam的初级细胞质信号传导序列的实例包括源自cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12或它们的组合的那些。[0123]在特定实施方案中，cd3ζ(cd247)刺激性结构域可以包括来自t细胞受体ζ链的细胞质结构域或其功能衍生物的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播细胞活化所必需的初始信号。在特定实施方案中，cd3ζ刺激性结构域可以包括人cd3ζ刺激性结构域或其功能直向同源物。在特定实施方案中，人cd3ζ刺激性结构域包括seqidno:146。在特定实施方案中，人cd3ζ刺激性结构域由seqidno:147编码。在特定实施方案中，在源自cd3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的cd3ζ结构，使得它可以在适当条件下产生信号。[0124]在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。在特定实施方案中，共刺激细胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些结构域。在特定实施方案中，共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子是指免疫细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激反应，如增殖。共刺激分子包括有助于有效免疫反应的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子可以表示为以下蛋白质家族：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)和活化性nk细胞受体。此类分子的实例包括：mhci类分子、b和t细胞淋巴细胞衰减子(btla，cd272)、toll配体受体、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd30、cd40、icos(cd278)、baffr、hvem(lightr)、icam-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1；cd11a/cd18)、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、nkg2d、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp30、nkp44、nkp46、cd160(by55)、b7-h3(cd276)、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、与cd83特异性结合的配体等，或它们的组合。[0125]在特定实施方案中，共刺激细胞内信号传导结构域包括4-1bb(cd137，tnfrsf9)。4-1bb是指肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员。在特定实施方案中，4-1bb共刺激结构域包括人4-1bb共刺激结构域或其功能直向同源物。在特定实施方案中，人4-1bb共刺激结构域包括seqidno:148。在特定实施方案中，人4-1bb共刺激结构域由seqidno:149编码。[0126]在特定实施方案中，共刺激细胞内信号传导结构域包括cd28。cd28是一种t细胞特异性糖蛋白，参与t细胞活化，诱导细胞增殖和细胞因子产生，以及促进t细胞存活。在特定实施方案中，cd28共刺激结构域包括人cd28共刺激结构域或其功能直向同源物。在特定实施方案中，人cd28共刺激结构域包括seqidno:188。在特定实施方案中，人cd28共刺激结构域由seqidno:189编码。[0127]在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括本文所述的一种或多种刺激性结构域和一种或多种共刺激结构域的组合。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括4-1bb共刺激结构域和seqidno:230所示的cd3ζ刺激性结构域。在特定实施方案中，细胞内信号传导结构域包括4-1bb共刺激结构域和由seqidno:231所示的序列编码的cd3ζ刺激性结构域。[0128](iii)car跨膜结构域.car可以被设计为包括将car的细胞外组分与细胞内组分连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以将car分子锚定到细胞膜上。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜所源自的蛋白质的细胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸或更多的氨基酸)和/或与跨膜蛋白所源自的蛋白的细胞内区相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸或更多的氨基酸)。在特定实施方案中，跨膜结构域可以来自与信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的蛋白质相同的蛋白质。在特定实施方案中，跨膜结构域并非源自car的任何其他结构域所源自的相同蛋白质。在特定实施方案中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域以避免与car中的其他结构域的结合或最小化与其他结构域的相互作用。[0129]在特定实施方案中，跨膜结构域具有在细胞膜中热力学稳定的三维结构，并且通常长度范围为15至30个氨基酸。跨膜结构域的结构可以包括α螺旋、β折叠桶(βbarrel)、β折叠片(βsheet)、β螺旋或它们的任何组合。[0130]跨膜结构域可以源自天然来源和/或来自重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在特定实施方案中，每当car与靶标结合时，跨膜结构域能够向细胞内结构域进行信号传导。在特定实施方案中，跨膜结构域可以至少包括以下各项的跨膜区：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd27；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd86；cd134；cd137；和/或cd154。在特定实施方案中，跨膜结构域可以至少包括以下各项的跨膜区：kirds2；ox40；cd2；lfa-1；icos；4-1bb；gitr；cd40；baffr；hvem；slamf7；nkp80；nkp44；nkp30；nkp46；cd160；cd19；il2rβ；il2rγ；il7ra；itga1；vla1；cd49a；itga4；ia4；cd49d；itga6；vla-6；cd49f；itgad；cdlld；itgae；cd103；itgal；cdlla；itgam；cdllb；itgax；cdllc；itgb1；cd29；itgb2；cd18；itgb7；tnfr2；dnam1；slamf4；cd84；cd96；ceacam1；crtam；ly9；cd160；psgl1；cd100；slamf6(ntb-a，lyl08)；slam；blame；selplg；ltbr；pag/cbp；nkg2d；nkg2c；或它们的组合。在特定实施方案中，跨膜结构域可以包括来自cd8α链的跨膜结构域。在特定实施方案中，cd8跨膜结构域包括seqidno:138。在特定实施方案中，cd8跨膜结构域由seqidno:139或233编码。在特定实施方案中，跨膜结构域可以包括来自hla-eα链的跨膜结构域。在特定实施方案中，hla-eα链包括在seqidno:136所示的成熟b2m中发现的序列vgiiaglvllgsvvsgavvaaviw(seqidno:259)。[0131]在特定实施方案中，跨膜结构域可以主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在特定实施方案中，跨膜结构域可以包括在跨膜结构域的每一端发现的苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在特定实施方案中，cd8铰链并列在跨膜结构域的细胞外侧。在特定实施方案中，本文公开的car包括seqidno:234所示的和/或由seqidno:235所示的序列编码的cd8铰链和cd8跨膜结构域的氨基酸序列。[0132](iv)car接头.如本文所用，接头可以是car分子的用于连接分子的两个亚组分或结构域的任何部分。在特定实施方案中，接头可为car或car的一部分提供柔性。在连接scfv的抗体来源结合结构域的vh和vl的上下文中的接头如上所述。接头可以包括间隔区和接点氨基酸。在特定实施方案中，接头包括具有seqidno:142所示的氨基酸序列和/或由seqidno:211所示的序列编码的甘氨酸-丝氨酸接头。在特定实施方案中，接头包括具有seqidno:143所示的氨基酸序列和/或由seqidno:212所示的序列编码的甘氨酸-丝氨酸接头。[0133]间隔区是用于产生与其他连接的组分的适当距离和/或柔性的一种类型的接头区。在特定实施方案中，间隔区的长度可以为在nk细胞上的单个细胞标志物定制，以优化nk细胞识别和破坏。与不存在间隔区的情况相比，间隔区的长度可以在抗原结合后提供增加的表达car的细胞的响应性。在特定实施方案中，间隔区长度可以基于细胞标志物表位的位置、结合结构域对表位的亲和力和/或car修饰细胞响应于nk细胞标志物识别而离体和/或在体内破坏靶nk细胞的能力来选择。间隔区也可以允许car修饰细胞中的高表达水平。在特定实施方案中，car的细胞外间隔区位于跨膜结构域和细胞外结合结构域之间。[0134]示例性的间隔区包括具有10至250个氨基酸、10至200个氨基酸、10至150个氨基酸、10至100个氨基酸、10至50个氨基酸或10至25个氨基酸的那些间隔区。在特定实施方案中，间隔区为12个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在特定实施方案中，较长间隔区为大于119个氨基酸，中等间隔区为13-119个氨基酸，并且短间隔区为10-12个氨基酸。[0135]在特定实施方案中，间隔区包括免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。在特定实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区可以是igg、iga、igd、ige或igm铰链区。igg铰链区可以是igg1、igg2、igg3或igg4铰链区。在特定实施方案中，间隔区可以包括来自单独的或与ch2区的全部或一部分；ch3区的全部或一部分；或ch2区的全部或一部分和ch3区的全部或一部分组合的igg1、igg2、lgg3、lgg4或igd的铰链区序列的全部或一部分。如本文所用，“野生型免疫球蛋白铰链区”是指插入并连接在抗体重链中发现的ch1和ch2结构域(对于igg、iga和igd)或插入并连接ch1和ch3结构域(对于ige和igm)的天然存在的上部和中部铰链氨基酸序列。[0136]示例性的间隔区包括单独的igg4铰链、连接至ch2和ch3结构域的igg4铰链，或连接至ch3结构域的igg4铰链。在特定实施方案中，间隔区包括以下氨基酸序列的igg4接头：eskygppcppc(seqidno:150)。可以修饰铰链区以避免不希望的结构相互作用，例如与不希望的配偶体二聚化。可用于本文所述的car的铰链区的其他实例包括存在于1型膜蛋白(如cd8α、cd4、cd28和cd7)的细胞外区中的铰链区，其可以是野生型或其变体。在特定实施方案中，铰链包括seqidno:140所示的cd8α铰链，并且/或者由seqidno:141或232所示的序列编码。在特定实施方案中，间隔区可以是氨基酸序列psplfpgpskp(seqidno:151)的cd28接头。[0137]在特定实施方案中，间隔区包括为ii型c凝集素结构域间(茎)区或分化簇(cd)分子茎区的铰链区。ii型c凝集素或cd分子的“茎区”是指位于c型凝集素样结构域(ctld；例如，类似于天然杀伤细胞受体的ctld)和疏水部分(跨膜结构域)之间的ii型c凝集素或cd分子细胞外结构域的部分。例如，人cd94的细胞外结构域(genbank登录号aac50291.1)对应于氨基酸残基34-179，但ctld对应于氨基酸残基61-176，因此人cd94分子的茎区包括氨基酸残基34-60，其位于疏水部分(跨膜结构域)和ctld之间(参见boyington等人,immunity10:15,1999；关于其他茎区的描述，还参见beavil等人,proc.nat'l.acad.sci.usa89:153,1992；以及figdor等人,nat.rev.immunol.2:11,2002)。这些ii型c凝集素或cd分子还可以具有在茎区和跨膜区或ctld之间的接点氨基酸。在另一个实例中，233个氨基酸的人nkg2a蛋白(uniprotidp26715.1)具有氨基酸71-93范围内的疏水部分(跨膜结构域)和氨基酸94-233范围内的细胞外结构域。ctld包含氨基酸119-231，并且茎区包含氨基酸99-116，其侧翼可以为另外的接点氨基酸。其他ii型c凝集素或cd分子以及它们的细胞外配体结合结构域、茎区和ctld是本领域已知的(关于人cd23、cd69、cd72、nkg2a和nkg2d的序列及它们的描述，分别参见例如genbank登录号np001993.2；aah07037.1；np001773.1；aal65234.1；caa04925.1)。[0138]当不需要和/或想要由间隔区提供的距离时，接点氨基酸可以是可以用于连接car结构域序列的接头。在特定实施方案中，接点氨基酸是可以用于连接细胞内信号传导结构域的短氨基酸序列。在特定实施方案中，接点氨基酸为9个氨基酸或更少。[0139]接点氨基酸可以是短的寡或蛋白质接头，优选地长度为2个和9个氨基酸之间(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、或9个氨基酸)以形成接头。在特定实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接点氨基酸接头。在特定实施方案中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作合适的接点氨基酸。[0140]在特定实施方案中，长度在2和9个氨基酸之间的短寡核苷酸或多肽接头可以连接car的跨膜结构域和细胞内组分。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。在特定实施方案中，接头可以包括seqidno:142-145。[0141](v)car检测和控制元件.在特定实施方案中，car可以包括一个或多个标签以体外、体内和/或离体活化基因修饰细胞，促进基因修饰细胞的增殖，检测、富集、分离、追踪、消耗和/或消除基因修饰细胞。“标签盒”是指融合于car或作为car的一部分的独特的合成肽序列，同源结合分子(例如配体、抗体或其他结合配偶体)能够与其特异性地结合，其中结合特性可以用于活化表达标记的car的细胞，促进所述细胞的增殖，检测、富集、分离、追踪、消耗和/或消除所述细胞。[0142]标签可以包括于car中，包括例如his标签(seqidno:152)、flag标签(seqidno:153-155)、xpress标签(seqidno:156)、avi标签(seqidno:157)、钙调蛋白结合肽(cbp)标签(seqidno:158)、聚谷氨酸标签(seqidno:159)、ha标签(seqidno:160-162)、myc标签(seqidno:163)、strep标签(其指原始的标签(seqidno:164)、标签ii(seqidno:165)(ibainstitutfurbioanalytik,germany)；参见，例如us7,981,632)、softag1(seqidno:166)、softag3(seqidno:167)和v5标签(seqidno:168)。[0143]特异性地结合本文所公开的标签序列的缀合物结合分子可商购获得。例如，his标签抗体可商购自供应商，包括lifetechnologies、pierceantibodies和genscript。flag标签抗体可商购自供应商，包括pierceantibodies、genscript和sigma-aldrich。xpress标签抗体可商购自供应商，包括pierceantibodies、lifetechnologies和genscript。avi标签抗体可商购自供应商，包括pierceantibodies、isbio和genecopoeia。钙调蛋白标签抗体可商购自供应商，包括santacruzbiotechnology、abcam和pierceantibodies。ha标签抗体可商购自供应商，包括pierceantibodies、cellsignal和abcam。myc标签抗体可商购自供应商，包括santacruzbiotechnology、abcam和cellsignal。strep标签抗体可商购自供应商，包括abcam、iba和qiagen。[0144]在特定实施方案中，一种或多种转导标志物可以使用允许转导标志物和car作为不同分子表达的跳跃元件与car共表达，以追踪已经整合了携带car和转导标志物的载体的细胞。在特定实施方案中，转导标志物可以用于体外、体内和/或离体活化基因修饰细胞，促进基因修饰细胞的增殖，检测、富集、分离、追踪、消耗和/或消除基因修饰细胞。转导标志物可以包括任何合适的荧光蛋白，包括：蓝色荧光蛋白(例如，bfp、ebfp、ebfp2、azurite、mkalamal、gfpuv、sapphire、t-sapphire)；青色荧光蛋白(例如，ecfp、cerulean、cypet、amcyanl、midoriishi-cyan)；绿色荧光蛋白(例如，gfp-2、taggfp、turbogfp、egfp、emerald、azamigreen、单体azamigreen、copgfp、acegfp、zsgreenl)；橙色荧光蛋白(例如，morange、mko、kusabira-orange、单体kusabira-orange、mtangerine、tdtomato)；红色荧光蛋白(例如，mkate、mkate2、mplum、dsred单体、mcherry、mrfp1、dsred-express、dsred2、dsred单体、hcred串联体、hcredl、asred2、eqfp611、mraspberry、mstrawberry、jred)；黄色荧光蛋白(例如，yfp、eyfp、citrine、venus、ypet、phiyfp、zsyellowl)；和任何其他合适的荧光蛋白，包括例如萤火虫荧光素酶。在特定实施方案中，转导标志物可以包括任何细胞表面展示的标志物，该标志物可以用与该标志物结合的抗体检测并允许分选具有该标志物的细胞。在特定实施方案中，转导标志物可以包括通过截短的低亲和力神经生长受体(lngfrf)和用链霉抗生物素蛋白缀合的磁珠实现的一步选择(matheson等人(2014)plosone9(10):e111437)或截短的人表皮生长因子受体(egfr)(tegfr；seewang等人,blood118:1255,2011)展示在细胞表面的磁性可分选标志物链霉抗生物素结合肽(sbp)。[0145]在特定实施方案中，转导标志物包括bfp，包括seqidno:169-174(heim和tsien(1996)currentbiology,6(2):178-182；yang等人(1998)journalofbiologicalchemistry,273(14):8212-8216；ai等人(2007)biochemistry,46(20):5904-5910；和constantini等人(2015)naturecommunications,6(1):7670)。在特定实施方案中，本公开的car中的bfp包括seqidno:236所示的氨基酸序列和/或由seqidno:237所示的序列编码。[0146]在特定实施方案中，可以通过使用同源结合分子(例如，抗体)在体内检测或追踪抗nkcar修饰细胞，所述同源结合分子特异性地结合标签或转导标志物并且缀合至荧光染料、放射性示踪剂、氧化铁纳米颗粒或本领域已知的用于通过x射线、ct扫描、mri扫描、pet扫描、超声、流式细胞术、近红外成像系统或其他成像形式检测的其他成像剂(参见，例如，yu等人(2012)theranostics2:3)。[0147]在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞或car分子可以包括调节car活性以控制毒性或调整car活性大小的元件。例如，可以使用双特异性(或串联)car，其在一个受体内并入两个不同的抗原识别结构域(例如，抗nkp46结合结构域和抗nkg2a结合结构域)。在特定实施方案中，表达这些串联car的细胞识别表达任一抗原的靶细胞。在特定实施方案中，可以使用自杀基因形式的分子安全开关，如诱导型半胱天冬酶9(icasp9)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)或截短的表面受体(例如，tegfr)。自杀基因编码一种分子，该分子允许在施用无毒前药或抗体时选择性地破坏表达该分子的细胞(jones等人(2014)front.pharmacol.,5:254；sun等人(2018)j.immunol.res.)。例如，icasp9系统是基于半胱天冬酶9和药物敏感性fk修饰结合蛋白的融合。在暴露于合成分子ap1903后，融合蛋白二聚化并导致表达融合蛋白的细胞快速凋亡。在特定实施方案中，抑制性car(icar)的使用可以选择性地限制细胞因子分泌、细胞毒性和/或通过活化性car诱导的增殖，并且可用于保护健康组织免受抗nkcar介导的破坏(fedorov等人(2013)sci.transl.med.,5:215ra172)。[0148]在特定实施方案中，可以通过在施用后的期望时间消耗表达car的细胞来控制施用于受试者的表达car的细胞。包含至少一个标签和/或转导标志物的car可以使用结合所述标签或转导标志物的相应同源结合分子来消耗。在特定实施方案中，本公开提供了一种用于消耗抗nkcar修饰细胞的方法，所述方法通过使用对标签或转导标志物具有特异性的同源结合分子(例如，抗体)或通过使用表达对所述标签或转导标志物具有特异性的car的第二修饰细胞来实现。在特定实施方案中，同源结合分子包括对标签或转导标志物具有特异性的消耗剂。例如，如果将tefgr用作转导标志物，则可以使用融合或缀合至细胞毒性试剂(如毒素或放射性金属)的抗tefgr结合结构域(例如，抗体、scfv)，或者可以使用抗tefgr/抗cd3双特异性scfv或抗tefgrcart细胞。[0149]特定实施方案提供了可用于开启、诱导或增加car活性的元件。已经开发出允许药理学诱导car表达的系统。在特定实施方案中，系统可以包括二分受体系统，该二分受体系统含有单独的抗原靶向和信号传导多肽，每个多肽含有细胞外二聚化结构域。t细胞活化是抗原依赖性的，但只能在二聚化药物雷帕霉素存在下实现(leung等人(2019)jciinsight4(11):e124430)。[0150]cart细胞活性的调节综述于brandt等人(2020)frontiersinimmunology,11:326中。[0151](vi)经基因修饰以表达car的细胞.本公开包括经基因修饰以表达car的细胞。如本文所用，术语“基因修饰的”或“基因工程化的”是指将dna或rna形式的另外的遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。术语“基因修饰的细胞”和“修饰的细胞”可互换使用。在特定实施方案中，经基因修饰以表达car的细胞包括免疫效应细胞。“免疫效应细胞”包括具有一种或多种效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、抗体依赖性细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)的诱导)的免疫系统的任何细胞。免疫效应细胞是免疫细胞的一种亚型。[0152]本公开的免疫细胞可以是自体的/自身的(“自身”)或非自体的(“非自身”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。“自体的”是指来自同一受试者的细胞。“同种异体的”是指与相比较的细胞在遗传学上不同的相同物种的细胞。“同基因的”是指与相比较的细胞在遗传学上相同的不同受试者的细胞。“异基因的”是指与相比较的细胞不同物种的细胞。在特定实施方案中，本公开的修饰细胞是自体的或同种异体的。[0153]在特定实施方案中，基因修饰的细胞包括淋巴细胞。在特定实施方案中，基因修饰的细胞包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、单核细胞/巨噬细胞和hspc。[0154]大多数t细胞具有由两条独立的肽链(α-tcr链和β-tcr链)构成的t细胞受体(tcr)。γδt细胞代表一小部分t细胞，它们具有由一条γ链和一条δ链组成的独特t细胞受体(tcr)。[0155]cd3在所有成熟t细胞上表达。t细胞可进一步分为细胞毒性t细胞(cd8+t细胞，也称为ctl)和辅助t细胞(cd4+t细胞)。[0156]细胞毒性t细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有关。这些细胞通过结合在身体几乎每个细胞的表面上存在的与mhci类相关的抗原而识别它们的靶标。[0157]中央记忆t细胞(tcm)是指表达cd62l或ccr7和cd45ro并且与原初细胞(naivecell)相比不表达cd45ra或具有降低的cd45ra表达的抗原经历的ctl。[0158]效应记忆t细胞(tem)是指与中央记忆细胞相比不表达cd62l或具有降低的cd62l表达并且与原初细胞相比不表达cd45ra或具有降低的cd45ra表达的抗原经历的t细胞。在特定实施方案中，与原初细胞或中央记忆细胞相比，效应记忆t细胞对于cd62l和ccr7的表达呈阴性，并且具有可变的cd28和cd45ra表达。与记忆或原初t细胞相比，效应t细胞对颗粒酶b和穿孔素呈阳性。[0159]辅助t细胞协助其他免疫细胞，例如活化细胞毒性t细胞和巨噬细胞以及促进b细胞成熟，以及其他功能。辅助t细胞当呈递肽抗原时被表达于抗原呈递细胞(apc)表面上的mhcii类分子活化。一旦被活化，它们迅速分裂并分泌调控或辅助主动免疫反应的细胞因子。[0160]自然杀伤t(nkt)细胞是t细胞的一个子集，它们共表达αβt细胞受体，但也表达通常与自然杀伤细胞相关的各种分子标志物，如nk1.1(cd161)、cd16和/或cd56。[0161]自然杀伤细胞(也称为k细胞和杀伤细胞)表达cd8、cd16和cd56，但不表达cd3。nk细胞还表达调控nk细胞对肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性功能的活化性受体(如nkp46)和抑制性受体(如nkg2a)。[0162]巨噬细胞(及其前体，单核细胞)驻留于身体的每个组织中，在那里，它们吞噬凋亡的细胞、病原体和其他非自身组分。单核细胞/巨噬细胞表达cd11b、f4/80、cd68、cd11c、il-4rα和/或cd163。[0163]未成熟的树突细胞(即，活化前)在外周吞噬抗原和其他非自身组分，并且随后以活化的形式迁移到淋巴组织的t细胞区域，在那里它们将抗原呈递给t细胞。树突细胞表达cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd21、cd35、cd39、cd40、cd86、cd101、cd148、cd209和dec-205。[0164]造血干细胞(hsc)是指未分化的造血细胞，它们能够自我更新，并且分化成所有其他造血细胞类型。hsc是cd34+。[0165]造血祖细胞(hpc)源自hsc并且能够进一步分化为成熟细胞类型。hpc可以自我更新或者可以分化成(i)骨髓祖细胞，该细胞最终产生单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板，或树突细胞；或(ii)淋巴祖细胞，该细胞最终产生t细胞、b细胞和nk细胞。hpc是cd24lolin-cd117+。[0166]hspc是指具有hsc和hpc的细胞群体。hspc细胞群体可以是对cd34、cd43、cd45ro、cd45ra、cd59、cd90、cd109、cd117、cd133、cd166、hladr或它们的组合呈阳性的。[0167]本公开的特定实施方案实现了通过car修饰细胞同时靶向靶nk细胞上的nkp46和nkg2a。由于nk细胞上任一靶抗原的下调，同时靶向可以最大限度地减少肿瘤逃逸。在特定实施方案中，细胞可以经基因修饰以共表达抗nkp46car和抗nkg2acar。在特定实施方案中，第一细胞群体可以经基因修饰以表达抗nkp46car并且第二细胞群体可以经基因修饰以表达抗nkg2acar。[0168]在特定实施方案中，通过经基因修饰以表达抗活化性nk受体car和抗抑制性nk受体car的细胞同时靶向靶nk细胞上的活化性nk受体和抑制性nk受体可以减轻活化的靶nk细胞对car修饰细胞的杀伤。在特定实施方案中，细胞可以经基因修饰以共表达抗活化性nk受体car和抗抑制性nk受体car。在特定实施方案中，细胞可以经基因修饰以共表达抗活化性nk受体car和抑制性nk受体结合结构域。在特定实施方案中，第一细胞群体可以经基因修饰以表达抗活化性nk受体car并且第二细胞群体可以经基因修饰以表达抗抑制性nk受体car。在特定实施方案中，第一细胞群体可以经基因修饰以表达抗活化性nk受体car并且第二细胞群体可以经基因修饰以表达抑制性nk受体结合结构域。在特定实施方案中，也可以将工程化为缺乏hlai类分子(例如，hla-a、hla-b、hla-c)表达的非自体同源cart细胞工程化以共表达：i)抗活化性nk受体car和抗抑制性nk受体car，或ii)抗活化性nk受体car和抑制性nk受体结合结构域，以减少nk介导的对非自体同源cart细胞的杀伤，允许使用现成的cart细胞。在特定实施方案中，经工程化为缺乏hlai类分子表达的非自体同源cart细胞在b2m基因的两个拷贝中都具有破坏(gornalusse等人(2017)naturebiotechnology35(8):765)。在特定实施方案中，抗活化性nk受体car是抗nkp46car。在特定实施方案中，抗抑制性nk受体car是抗nkg2acar。在特定实施方案中，抑制性nk受体结合结构域是nkg2a结合结构域。在特定实施方案中，nkg2a结合结构域是hla-e。在特定实施方案中，nkg2a结合结构域是人工hla-e模拟物。[0169]现成的cart细胞将有助于减少接受者对cart细胞的排斥。当移植的细胞、组织或器官不被接受者(宿主)的身体接受时，就会发生免疫排斥。免疫排斥是由适应性免疫系统的t细胞和b细胞以及先天免疫系统的nk细胞介导的。例如，部分car可被宿主的t细胞和nk细胞识别为外来物，并被靶向以破坏。移植物的免疫排斥可包括超急性排斥、急性排斥和慢性排斥。在特定实施方案中，超急性排斥在移植后不久发生。在特定实施方案中，超急性排斥包括对供体组织反应的预先存在的抗体。在特定实施方案中，超急性排斥包括血液凝固后的严重全身炎症反应。在特定实施方案中，由于hla抗原错配，在移植后一周内发生急性排斥。在特定实施方案中，慢性排斥包括错配的次要组织相容性复合物，导致移植物的长期排斥。在特定实施方案中，对急性排斥的治疗包括再移植或施用化学治疗性免疫阻抑剂(例如，皮质类固醇和钙调磷酸酶抑制剂)。然而，免疫阻抑剂会导致免疫损害并发症。在特定实施方案中，接受者对car修饰细胞的排斥包括对car疗法没有治疗反应。在特定实施方案中，接受者对car修饰细胞的排斥包括car修饰细胞被接受者的细胞毒性t细胞和/或nk细胞破坏。在特定实施方案中，与施用表达抗抑制性nk受体car(例如，抗nkg2acar)的细胞之前接受者对car修饰细胞的排斥相比，施用表达抗抑制性nk受体car的细胞可以减少接受者对car修饰细胞的排斥。[0170]在特定实施方案中，抗nkp46car包括：包括seqidno:3-98、260-265的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:99-112的vh和vl的nkp46scfv；包括seqidno:113-119的nkp46scfv；包括seqidno:266的重链的抗原结合片段；和/或包括seqidno:267的轻链的抗原结合片段。在特定实施方案中，抗nkp46car包括：包括seqidno:190-203的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:204和205的vh和vl的nkp46scfv；和/或包括seqidno:206的nkp46scfv。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:127、130、133、136、142和143的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:242、244和246的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括：seqidno:213、214、215、216、217、218、290、291、292、293、294和295的cdr；seqidno:219、220、221、222和223的vh；seqidno:224、225、226、227和228的重链的抗原结合片段；和/或seqidno:229的轻链的抗原结合片段。[0171](vii)离体和体内收集和修饰细胞的方法.本公开提供了用于收集、富集、培养和修饰细胞以表达car的方法。[0172]在特定实施方案中，t细胞是从样品如血液或血液源性样品、单采或白细胞单采产物中分离的。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、癌组织、淋巴组织、脾脏或其他适当来源。[0173]hspc的来源包括脐带血、胎盘血和外周血(参见美国专利第5,004,681；7,399,633；和7,147,626号；craddock等人,1997,blood90(12):4779-4788；jin等人,2008,journaloftranslationalmedicine6:39；pelus,2008,curr.opin.hematol.15(4):285-292；papayannopoulou等人,1998,blood91(7):2231-2239；tricot等人,2008,haematologica93(11):1739-1742；和weaver等人,2001,bonemarrowtransplantation27(2):s23-s29)。[0174]关于血液样品的采集、抗凝和处理等的方法可见于例如alsever等人,1941,n.y.st.j.med.41:126；degowin等人,1940,j.am.med.ass.114:850；smith等人,1959,j.thorac.cardiovasc.surg.38:573；rous和turner,1916,j.exp.med.23:219；以及hum,1968,storageofblood,academicpress,newyork,第26-160页。[0175]在特定实施方案中，将收集的细胞洗涤、离心并且/或者在一种或多种试剂存在下孵育，例如，以去除不需要的组分，富集所需组分，溶解或去除对特定试剂敏感的细胞。分离可以包括各种细胞制备和分离步骤中的一者或多者，包括基于一种或多种特性，如大小、密度、对特定试剂的敏感性或抗性和/或对抗体或其他结合配偶体的亲和力(例如，免疫亲和力)进行的分离。[0176]在特定实施方案中，通过所提供的方法从样品富集、分离和/或选择的细胞群体中的一者或多者是对一种或多种特定标志物(如表面标志物)呈阳性(标志物+)或表达高水平的所述标志物的细胞(标志物hi)，或对一种或多种标志物呈阴性(标志物-)或表达相对低水平的一种或多种标志物的细胞(标志物lo)。在特定实施方案中，细胞群体(如t细胞)富集了对本文别处描述的细胞标志物呈阳性或表达高表面水平的本文别处描述的细胞标志物的细胞。[0177]在特定实施方案中，可以通过溶解红细胞并消耗单核细胞，例如通过经由percolltm梯度离心，从外周血单核细胞(pbmc)分离t细胞。在特定实施方案中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达cd3、cd28、cd4、cd8、cd45ra和cd45ro的特定t细胞亚群。例如，通过阴性选择富集t细胞群体可以用针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。在特定实施方案中，细胞分选和/或选择通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物进行。例如，为了通过阴性选择富集cd4+细胞，可以使用通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体的单克隆抗体混合物。流式细胞术和细胞分选也可用于分离目标细胞群体以用于本公开。[0178]隔离和/或富集后，可以扩增细胞以增加细胞数量。在特定实施方案中，可以使用例如us6,352,694；us6,534,055；us6,905,680；us6,692,964；us5,858,358；us6,887,466；us6,905,681；us7,144,575；us7,067,318；us7,172,869；us7,232,566；us7,175,843；us5,883,223；us6,905,874；us6,797,514；us6,867,041；和us2006/0121005中描述的方法，在基因修饰之前或之后活化和扩增t细胞以表达car。[0179]通常，通过与附着有刺激cd3tcr复合物相关信号的剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增t细胞。在特定实施方案中，pbmc或分离的t细胞在具有适当细胞因子的培养基中与通常附着于珠粒或其他表面的刺激剂和共刺激剂(如抗cd3和抗cd28抗体)接触(参见berg等人,transplantproc.30(8):3975-3977,1998；haanen等人,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人,j.immunolmeth.227(1-2):53-63,1999)。在特定实施方案中，附着于相同珠粒的抗cd3和抗cd28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(apc)。在特定实施方案中，可以使用如us6,040,177；us5,827,642；和wo2012/129514中描述的方法，用饲养细胞和适当的抗体和细胞因子活化和刺激t细胞增殖。[0180]在特定实施方案中，人工apc(aapc)可以通过工程化k562、u937、721.221、t2和c1r细胞以指导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌来制备。在特定实施方案中，k32或u32aapc用于指导一种或多种基于抗体的刺激分子在aapc细胞表面上的展示。aapc上各种基因组合的表达能够精确确定人t细胞活化要求，从而可以定制aapc，以优化具有特定生长要求和不同功能的t细胞亚群的繁殖。与使用天然apc相比，aapc支持功能性人t细胞的离体生长和长期扩增，而无需添加外源性细胞因子。t细胞群体可以通过表达多种共刺激分子，包括cd137l(4-1bbl)、cd134l(ox40l)和/或cd80或cd86的aapc来扩增。最后，aapc提供了有效的平台来扩增基因修饰t细胞并维持t细胞上的cd28表达。aapc描述于wo03/057171和us2003/0147869中。[0181]在特定实施方案中，hspc可以根据描述于例如以下中的方法来分离和/或扩增：us7,399,633；us5,004,681；us2010/0183564；wo2006/047569；wo2007/095594；wo2011/127470；和wo2011/127472；vamum-finney等人,1993,blood101:1784-1789；delaney等人,2005,blood106:2693-2699；ohishi等人,2002,j.clin.invest.110:1165-1174；delaney等人,2010,naturemed.16(2):232-236；和regenerativemedicine,departmentofhealthandhumanservices,2006年8月,第2章，以及本文引用的参考文献。本文所述的其他细胞类型的收集和处理是本领域普通技术人员已知的。[0182]在特定实施方案中，分离、孵育、扩增和/或工程化步骤在无菌或封闭环境中和/或以自动化方式进行，例如由连接到执行这些步骤的装置的计算机控制。[0183](viii)car的产生.根据本公开的car可以通过本领域已知的任何方式产生。在特定实施方案中，使用重组dna技术产生car。可以通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛查、聚合酶链反应(pcr)、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scfv文库、定向诱变等)制备编码car的若干区域的核酸序列并将其组装成完整的编码序列。所得编码区可被插入到表达载体中并被用于转化合适的表达细胞系。[0184]术语“基因”是指编码如本文所公开的抗nkcar、抗nkcar的组分或与抗nkcar共表达的分子的核酸序列(可与多核苷酸或核苷酸序列互换使用)。这一定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变基本上不会影响所编码的蛋白质的功能。术语“基因”不仅可以包括编码序列，而且还可以包括调控区，如启动子、增强子和终止区。所述术语可进一步包括从mrna转录物剪接的所有内含子和其他dna序列，连同由可变剪接位点产生的变体。编码分子的基因序列可以是指导分子表达的dna或rna。这些核酸序列可以是转录成rna的dna链序列或翻译成蛋白质的rna序列。核酸序列包括全长核酸序列以及源自全长蛋白的非全长序列两者。所述序列还可包括天然序列的简并密码子或可被引入以在特定细胞类型中提供密码子偏好的序列。[0185]“编码”是指基因中特定核苷酸序列(如互补dna(cdna)或信使rna(mrna))用作合成其他大分子(如已确定的氨基酸序列)的模板的特性。因此，如果对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。“编码蛋白质的基因序列”包括彼此互为简并形式并且编码相同的氨基酸序列或具有基本上类似的形式和功能的氨基酸序列的所有核苷酸序列。[0186]编码例如car的一部分的开放阅读框的序列可以从基因组dna来源、cdna来源获得，或者可以合成(例如，经由pcr)，或它们的组合。根据基因组dna的大小和内含子的数量，可能需要使用cdna或它们的组合，因为内含子可以稳定mrna或提供细胞特异性表达。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mrna可能更有利。[0187]编码所表达car是超过一个部分的多核苷酸基因序列可以与彼此和相关调控序列可操作地连接。例如，调控序列和外源性核酸序列之间可能存在功能连键(functionallinkage)，该功能连键导致外源性核酸序列的表达。对于另一个实例，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列可以与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在必要或有帮助的情况下，将编码区接合到同一阅读框中。[0188]在本公开中采用的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，启动子与编码car的核酸序列可操作地连接，即它们被定位成促进mrna从编码car的dna转录。该启动子可以是基因组来源的或合成产生的。该启动子可以与或不与增强子缔合，其中该增强子可以与特定启动子天然地缔合或者与不同的启动子缔合。用于细胞的多种启动子在本领域中是众所周知的(例如，cd4启动子)。例如，启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定细胞类型或特定发育阶段相关。或者，许多众所周知的病毒启动子也是合适的。目标启动子包括：病毒猿病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)启动子；莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)长末端重复(ltr)启动子；劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子；单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子；甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子；热休克蛋白70kda(hsp70)启动子；泛素c(ubc)启动子；或磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子。特定实施方案可以利用骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(mnd)启动子(challita等人(1995)j.virol.69:748–755)。在特定实施方案中，mnd启动子是合成启动子，其包含修饰的莫洛尼鼠白血病病毒(momulv)长末端重复(ltr)与骨髓增殖性肉瘤病毒增强子的u3区。在特定实施方案中，mnd启动子包括seqidno:175。[0189]对于car表达，可以使用允许组成型或诱导型表达的外源性转录起始区，其中可以根据靶宿主、所需的表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。[0190]同样，将car引导至表面膜的信号序列可以是car的n末端组分的内源性信号序列。任选地，在一些情况下，可能希望将该序列交换为不同的信号序列。但是，所选择的信号序列应与car表达细胞的分泌途径相适应，使car呈现在表达car的细胞的表面上。[0191]类似地，终止区可以由编码car的c末端组分的核酸序列的天然存在的或内源性的转录终止区提供。或者，终止区可以源自不同的来源。在大多数情况下，通常不认为终止区的来源对重组蛋白的表达至关重要，并且可以使用多种终止区而不会对表达产生不利影响。[0192]如本领域技术人员将理解的，在一些情况下，car中的结合结构域末端的几个氨基酸可以缺失，例如通常不超过10个，更通常不超过5个残基。此外，可能需要在边界处引入少量氨基酸，通常不超过10个，更通常不超过5个残基。氨基酸的缺失或插入可能是由于构建的需要，提供方便的限制性位点、易于操作、提高表达水平等。此外，出于类似的原因，可能会发生用不同氨基酸取代一个或多个氨基酸。[0193]在本文所述的任何实施方案中，多核苷酸可以包括编码自裂解多肽的多核苷酸，其中编码自裂解多肽的多核苷酸位于编码car的多核苷酸和编码转导标志物(例如，bfp)的多核苷酸之间。示例性的自裂解多肽包括来自以下病毒的2a肽：猪捷申病毒1(porcineteschovirus-1)(p2a)、明脉扁刺蛾病毒(thoseaasignavirus)(t2a)、马甲型鼻炎病毒(equinerhinitisavirus)(e2a)、口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)(f2a)、马铃薯y病毒(potyvirus)2a、心病毒2a或它们的变体。2a肽的其他示例性核酸和氨基酸序列陈述于例如kim等人(plosone6:e18556(2011))和donnelly等人(j.gen.virol.82:1027-1041(2001))。在特定实施方案中，示例性的2a肽序列包括seqidno:176-185和240。在特定实施方案中，示例性的2a肽序列由seqidno:241编码。[0194]可通过本领域已知的任何方法将编码car的所需基因引入细胞中，这些方法包括转染、电穿孔、显微注射、脂转染、磷酸钙介导的转染、用包括该基因序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合、体内纳米颗粒介导的递送、哺乳动物人工染色体(vos,1998,curr.op.genet.dev.8:351-359)、脂质体(tarahovsky和ivanitsky,1998,biochemistry(mosc)63:607-618)、脂质体(branch和klotman,1998,exp.nephrol.6:78-83)、三联体dna(chan和glazer,1997,j.mol.med.75:267-282)等。本领域已知许多用于将外来基因引入细胞中的技术(参见，例如，loeffler和behr,1993,meth.enzymol.217:599-618；cohen等人,1993,meth.enzymol.217:618-644；cline,1985,pharmac.ther.29:69-92)并且这些技术都可以使用，条件是接受者细胞的必要发育和生理功能没有被过度破坏。所述技术可以将基因稳定地转移至细胞中，由此使基因可以被细胞表达，并且在某些情况下，优选地可以被其细胞后代遗传和表达。[0195]在特定实施方案中，可以将编码car的基因引入载体中的细胞中。“载体”是能够转运另一个核酸的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体。“表达载体”是这样的载体，当其存在于适当的环境中时能够指导由该载体携带的一种或多种基因编码的蛋白质的表达。[0196]源自病毒的载体可用于基因递送。可以使用的病毒包括腺病毒、腺相关病毒(aav)和甲病毒。参见kozarsky和wilson,1993,currentopinioningeneticsanddevelopment3:499-503；rosenfeld等人,1991,science252:431-434；rosenfeld等人,1992,cell68:143-155；mastrangeli等人,1993,j.clin.invest.91:225-234；walsh等人,1993,proc.soc.exp.bioi.med.204:289-300；以及lundstrom,1999,j.recept.signaltransduct.res.19:673-686。[0197]在特定实施方案中，可以使用的载体包括逆转录病毒载体(参见miller等人,1993,meth.enzymol.217:581-599)。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。在特定实施方案中，转移导致核酸整合到细胞基因组中。[0198]“逆转录病毒”是具有rna基因组的病毒。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。示例性的γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮增生病病毒。[0199]在特定实施方案中，逆转录病毒载体包括病毒基因组的包装和整合所必需的所有顺式作用序列，即，(a)载体每一端的长末端重复(ltr)或其部分；(b)负链和正链dna合成的引物结合位点；和(c)包装信号，这是将基因组rna掺入病毒体所必需的。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于boesen等人,1994,biotherapy6:291-302；clowes等人,1994,j.clin.invest.93:644-651；kiem等人,1994,blood83:1467-1473；salmons和gunzberg,1993,humangenetherapy4:129-141；以及grossman和wilson,1993,curr.opin.ingeneticsanddevel.3:110-114中。在本文中提及元件如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等时，应理解这些元件的序列以rna形式存在于逆转录病毒颗粒中并且以dna形式存在于dna质粒中。[0200]在特定实施方案中，逆转录病毒载体可以包括慢病毒载体。术语“慢病毒载体”是指含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括hiv(人免疫缺陷病毒：包括hiv1型和hiv2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猴免疫缺陷病毒(siv)。本领域已知多种慢病毒载体(naldini等人(1996)science272(5259):263-267；naldini等人(1996)proceedingsofthenationalacademyofsciences93(21):11382-11388；zufferey等人(1997)naturebiotechnology15(9):871-875；dull等人(1998)journalofvirology72(11):8463-8471；us6,013,516；和us5,994,136)，其中许多可能适于产生病毒载体或转移质粒。[0201]在特定实施方案中，病毒载体包括可操作地连接至编码car的基因的mnd启动子，所述car包括结合nkp46或nkg2a的结合结构域、cd8α铰链、cd8α跨膜结构域、细胞内cd3ζ信号传导结构域和细胞内4-1bb共刺激信号传导结构域。在特定实施方案中，病毒载体包括编码bfp转导标志物的基因，所述基因通过2a可裂解肽与编码car的基因连接。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括：包括seqidno:3-98、260-265的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:99-112的vh和vl的nkp46scfv；包括seqidno:113-119的nkp46scfv；包括seqidno:266的重链的抗原结合片段；和/或包括seqidno:267的轻链的抗原结合片段。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括：包括seqidno:190、193、196、198、201和202的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:204和205的vh和vl的nkp46scfv；和/或包括seqidno:206的nkp46scfv。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括包含seqidno:190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202和203的cdr的nkp46scfv。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:127、130、133、136、142和143的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:242、244和246的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括：seqidno:213、214、215、216、217、218、290、291、292、293、294和295的cdr；seqidno:219、220、221、222和223的vh；seqidno:224、225、226、227和228的重链的抗原结合片段；和/或seqidno:229的轻链的抗原结合片段。[0202]在特定实施方案中，本公开的car从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:238所示和/或由seqidno:239所示核苷酸序列编码的cd8信号肽；2)seqidno:206所示和/或由seqidno:248所示核苷酸序列编码的抗nkp46scfv；3)seqidno:234所示和/或由seqidno:235所示核苷酸序列编码的cd8铰链和cd8跨膜结构域；4)包括seqidno:230所示和/或由seqidno:231所示核苷酸序列编码的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域的细胞内信号传导结构域；5)seqidno:240所示和/或由seqidno:241所示核苷酸序列编码的2a肽；以及6)seqidno:236所示和/或由seqidno:237所示核苷酸序列编码的bfp。在特定实施方案中，本公开的car包括seqidno:249所示的抗nkp46car的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的car包括由seqidno:250所示的核苷酸序列编码的抗nkp46car。[0203]在特定实施方案中，本公开的car从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:130所示和/或由seqidno:208编码的b2m信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链；7)包括seqidno:230所示和/或由seqidno:231所示核苷酸序列编码的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域的细胞内信号传导结构域；8)seqidno:240所示和/或由seqidno:241所示核苷酸序列编码的2a肽；以及9)seqidno:236所示和/或由seqidno:237所示核苷酸序列编码的bfp。在特定实施方案中，本公开的car包括seqidno:251所示的抗nkg2a(hla-e)car的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的car包括由seqidno:252所示的核苷酸序列编码的抗nkg2a(hla-e)car。[0204]在特定实施方案中，本公开的car从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:130所示和/或由seqidno:208编码的b2m信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链；7)seqidno:234所示和/或由seqidno:235所示核苷酸序列编码的cd8铰链和cd8跨膜结构域；8)包括seqidno:230所示和/或由seqidno:231所示核苷酸序列编码的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域的细胞内信号传导结构域；9)seqidno:240所示和/或由seqidno:241所示核苷酸序列编码的2a肽；以及10)seqidno:236所示和/或由seqidno:237所示核苷酸序列编码的bfp。在特定实施方案中，本公开的car包括seqidno:253所示的抗nkg2a(hla-e)car的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的car包括由seqidno:254所示的核苷酸序列编码的抗nkg2a(hla-e)car。[0205]在特定实施方案中，本公开的car从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:238所示和/或由seqidno:239编码的cd8信号肽；2)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；3)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；4)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；5)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和6)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链；7)包括seqidno:230所示和/或由seqidno:231所示核苷酸序列编码的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域的细胞内信号传导结构域；8)seqidno:240所示和/或由seqidno:241所示核苷酸序列编码的2a肽；以及9)seqidno:236所示和/或由seqidno:237所示核苷酸序列编码的bfp。在特定实施方案中，本公开的car包括seqidno:255所示的抗nkg2a(hla-e)car的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的car包括由seqidno:256所示的核苷酸序列编码的抗nkg2a(hla-e)car。[0206]在特定实施方案中，本公开的car从氨基末端到羧基末端包括：1)seqidno:238所示和/或由seqidno:239编码的cd8信号肽；2)seqidno:130所示和/或由seqidno:208编码的b2m信号肽；3)vmaprtlfl(seqidno:127)和/或由seqidno:207编码的hla-g信号肽；4)seqidno:142所示和/或由seqidno:211编码的(ggggs)3柔性接头；5)seqidno:133所示和/或由seqidno:209编码的b2m成熟蛋白；6)seqidno:143所示和/或由seqidno:212编码的(ggggs)4柔性接头；和7)seqidno:136所示和/或由seqidno:210编码的hla-e01:03重链；8)seqidno:234所示和/或由seqidno:235所示核苷酸序列编码的cd8铰链和cd8跨膜结构域；9)包括seqidno:230所示和/或由seqidno:231所示核苷酸序列编码的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域的细胞内信号传导结构域；10)seqidno:240所示和/或由seqidno:241所示核苷酸序列编码的2a肽；以及11)seqidno:236所示和/或由seqidno:237所示核苷酸序列编码的bfp。在特定实施方案中，本公开的car包括seqidno:257所示的抗nkg2a(hla-e)car的氨基酸序列。在特定实施方案中，本公开的car包括由seqidno:258所示的核苷酸序列编码的抗nkg2a(hla-e)car。[0207]在特定实施方案中，转导细胞以表达car包括将编码car的病毒载体转染到包装细胞中以获得产生病毒颗粒的生产者细胞，所述病毒颗粒接着用于转导经设计用于注定表达car的细胞。包装细胞系不包含包装信号，但稳定或瞬时地表达病毒结构蛋白和复制酶(例如，gag、pol和env)，病毒结构蛋白和复制酶与病毒载体上编码car的元件一起，是正确包装病毒颗粒所必需的。可以采用任何合适的细胞系来制备包装细胞。通常，细胞是哺乳动物细胞。感染性病毒颗粒和病毒原液的产生可以使用常规技术进行(例如，soneoka等人(1995)nucl.acidsres.23:628-633以及landau等人(1992)j.virol.66:5110-5113)。可以使用常规技术从包装细胞中收集感染性病毒颗粒。[0208]靶向基因工程化方法也可用于将编码car的核酸引入细胞中。crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)/cas(crispr相关蛋白)核酸酶系统是一种用于基因工程化的工程化核酸酶系统，所述系统是基于细菌系统。关于crispr-cas系统及其组分的信息描述于例如us8697359、us8771945、us8795965、us8865406、us8871445、us8889356、us8889418、us8895308、us8906616、us8932814、us8945839、us8993233和us8999641和与之相关的申请；以及wo2014/018423、wo2014/093595、wo2014/093622、wo2014/093635、wo2014/093655、wo2014/093661、wo2014/093694、wo2014/093701、wo2014/093709、wo2014/093712、wo2014/093718、wo2014/145599、wo2014/204723、wo2014/204724、wo2014/204725、wo2014/204726、wo2014/204727、wo2014/204728、wo2014/204729、wo2015/065964、wo2015/089351、wo2015/089354、wo2015/089364、wo2015/089419、wo2015/089427、wo2015/089462、wo2015/089465、wo2015/089473和wo2015/089486、wo2016205711、wo2017/106657、wo2017/127807和与之相关的申请中。[0209]特定实施方案利用锌指核酸酶(zfn)作为基因编辑剂。zfn是一类经工程化以在特定位置结合并裂解dna的位点特异性核酸酶。zfn被用于在dna序列的特定位点处引入双链断裂(dsb)，由此使得zfn能够靶向多种不同细胞中的基因组内的独特序列。关于zfn和可用于本公开的教导内容中的zfn的另外的信息，参见例如us6,534,261；us6,607,882；us6,746,838；us6,794,136；us6,824,978；6,866,997；us6,933,113；6,979,539；us7,013,219；us7,030,215；us7,220,719；us7,241,573；us7,241,574；us7,585,849；us7,595,376；us6,903,185；us6,479,626；us2003/0232410和us2009/0203140，以及gaj等人,natmethods,2012,9(8):805-7；ramirez等人,nuclacidsres,2012,40(12):5560-8；kim等人,genomeres,2012,22(7):1327-33；urnov等人,naturereviewsgenetics,2010,11:636-646；miller等人naturebiotechnology25,778-785(2007)；bibikova等人,science300,764(2003)；bibikova等人,genetics161,1169-1175(2002)；wolfe等人,annualreviewofbiophysicsandbiomolecularstructure29,183-212(2000)；kim等人,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica93,1156-1160(1996)；和miller等人,theembojournal4,1609-1614(1985)。[0210]特定实施方案可使用转录活化因子样效应物核酸酶(talen)作为基因编辑剂。talen是指包括转录活化因子样效应物(tale)dna结合蛋白和dna裂解结构域的融合蛋白。talen通过在dna中诱导双dsb来编辑基因和基因组，从而诱导细胞中的修复机制。一般来说，两个talen必须结合并侧接在靶dna位点的每一侧，以使dna裂解结构域二聚化并诱导dsb。关于talen的另外的信息，参见us8,440,431；us8,440,432；us8,450,471；us8,586,363；和us8,697,853；以及joung和sander,natrevmolcellbiol,2013,14(l):49-55；beurdeley等人,natcommun,2013,4:1762；scharenberg等人,currgenether,2013,13(4):291-303；gaj等人,natmethods,2012,9(8):805-7；miller等人,naturebiotechnology29,143-148(2011)；christian等人,genetics186,757-761(2010)；boch等人,science326,1509-1512(2009)；以及moscou和bogdanove,science326,1501(2009)。[0211]特定实施方案可以利用megatal作为基因编辑剂。megatal具有单链稀有裂解核酸酶结构，其中tale与大范围核酸酶的dna裂解结构域融合。大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是在同一结构域中具有dna识别和核酸酶功能两者的单肽链。与talen相比，megatal仅需要递送单一肽链来获得功能活性。[0212]可以根据例如转导标志物的表达对已成功进行基因修饰而表达car的细胞进行分类，并进行进一步处理。[0213](ix)表征表达car的细胞的测定.本领域技术人员熟知的任何相关测定或测试可用于确定抗nkcar修饰细胞是否可以结合并且/或者杀伤表达nk表面标志物(例如，nkp46和/或nkg2a)的靶细胞。在特定实施方案中，当抗nkcar修饰细胞被活化时，所述抗nkcar修饰细胞可以结合并且/或者杀伤靶细胞。抗nkcar修饰细胞活化的评定包括：(i)在结合靶细胞上的nk细胞表面标志物后，抗nkcar修饰细胞上的cd137(4-1bb)表达的诱导；(ii)细胞因子(包括il-2、ifnγ、肿瘤坏死因子(例如，tnfα)、白介素(il)-5和il-13)的分泌(xhangolli等人(2019)genomics,proteomics&bioinformatics,17(2):129-139)；和/或(iii)对表达nk细胞表面标志物(例如，nkp46和/或nkg2a)的靶细胞的细胞毒性。例如，评估抗nkcar修饰细胞的功能可以包括以下内容。经基因修饰以表达nk细胞表面标志物如nkp46的靶细胞可以与具有抗nkp46scfv结合结构域的抗nkcar修饰细胞(效应细胞)以2:1的效应细胞:靶细胞比率接触。在特定实施方案中，效应细胞:靶细胞的比率可以包括1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1。在特定实施方案中，靶细胞包括k562细胞，其源自人永生化骨髓性白血病细胞系。k562细胞缺乏mhc复合物，缺乏任何ebv痕迹，并自发地发展出类似于早期红细胞、粒细胞和单核细胞的特征。在特定实施方案中，靶细胞包括nk细胞淋巴瘤细胞系，如nk92。在特定实施方案中，靶细胞包括从来自供体的pbmc获得的自体同源原代nk细胞。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞是抗nkcar修饰t细胞，并且可以在流式细胞术中通过例如针对cd3+(t细胞标志物)和bfp+(指示与car共表达的转导标志物的荧光发射波长)细胞的门控选择性地观察。[0214]在特定实施方案中，可以使用识别cd137的抗体通过流式细胞术测量结合靶细胞后抗nkcar修饰细胞上cd137表达的诱导。可以在抗nkcar修饰t细胞与结合cd137的标记抗体接触后通过流式细胞术测量cd137+抗nkcar修饰t细胞的％。结合cd137的抗体是可商购的，包括兔单克隆抗体[blr051f]抗人cd137抗体(abcam,cambridge,uk)、小鼠单克隆4b4-1抗人cd137抗体(thermofisher,waltham,ma)和小鼠单克隆bbk-2抗人cd137抗体(santacruzbiotechnology,dallas,tx)。[0215]在特定实施方案中，可通过本领域已知的测定测量结合靶细胞后抗nkcar修饰细胞的细胞因子分泌。例如，细胞因子的分泌可以通过elisa、蛋白质印迹、流式细胞术、单细胞多重细胞因子分析和高通量单细胞3’mrna转录组测序来测量。在特定实施方案中，测定使用特异性地结合至特定细胞因子的抗体。在特定实施方案中，测定使用流式细胞术来测量细胞因子的细胞内染色。在特定实施方案中，测定使用3’mrna的细胞条形码化和高通量测序。在特定实施方案中，测量的细胞因子包括il-2、ifnγ和肿瘤坏死因子(例如，tnfα)。细胞因子测定进一步描述于wilkie等人(2008)jimmunol.180:4901-4909；jena等人(2014)currhematolmaligrep.9:50-56；kaiser等人(2015)cancergenether.22:72-78；xue等人(2017)jimmunothercancer5:85；以及xhangolli等人(2019)genomicsproteomicsbioinformatics.17(2):129-139。[0216]在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞在结合靶细胞后的细胞毒活性可以通过流式细胞术来测量。在特定实施方案中，针对由靶细胞表达的nk细胞表面标志物的标记抗体可用于通过流式细胞术定量在抗nkcar修饰细胞存在或不存在下靶细胞的量。在特定实施方案中，细胞毒性测定包括铬51释放测定或使用非放射性报告物的类似测定，如增强型绿色荧光蛋白(gfp)-萤火虫荧光素酶融合(xiong等人(2018)jimmunol200(1):增刊1,179.2)，乳酸脱氢酶(ldh)释放测定，使用金微电极生物传感器通过电阻抗定量细胞活力的实时细胞分析系统(例如，sener等人(2017)expthermed.14(3):1866-1870)，以及基于受损细胞膜完整性的基于探针如碘化丙啶和sytoxgreen的实时系统。在释放测定中，靶细胞死亡可以通过从溶解细胞中释放的铬51(在与cart细胞接触之前预加载到靶细胞中)或ldh的量来定量。靶细胞细胞毒性可以使用以下公式计算：细胞毒性％＝100×[(car-t:靶细胞-单独的car-t细胞-单独的靶细胞)/(最大靶细胞溶解-无溶解缓冲液的单独靶细胞)]。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞在结合靶细胞后的细胞毒活性可以通过测量用标记或染料如细胞示踪剂橙或绿(celltrackerorangeorgreen)(thermofisherscientific,waltham,ma)预染色的靶细胞的百分比的降低来评定。[0217]在特定实施方案中，活化的抗nkcar修饰细胞可以诱导抗nkcar修饰细胞与靶细胞接触后抗nkcar修饰细胞的活化的统计学上显著的(例如，p《0.05)增加。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞与靶细胞接触后抗nkcar修饰细胞的活化可以通过如本文所述的cd137+的抗nkcar修饰细胞的量或倍数增加来评定。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞与靶细胞接触后抗nkcar修饰细胞的活化可以通过产生细胞因子的抗nkcar修饰细胞的量或倍数增加或通过或如本文所述产生的细胞因子(例如，ifnγ、tnfα、il-2)的量或倍数增加来评定。在特定实施方案中，与对照条件相比，活化的抗nkcar修饰细胞具有5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％、100％或更高的活化增加。在特定实施方案中，与对照条件相比，活化的抗nkcar修饰细胞具有10％至50％的活化增加。在特定实施方案中，与对照条件相比，抗nkcar修饰细胞活化的增加为2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍或更大。在特定实施方案中，与对照条件相比，抗nkcar修饰细胞活化的增加为1.5倍至6倍。在特定实施方案中，活化的抗nkcar修饰细胞可以诱导抗nkcar修饰细胞与靶细胞接触后存活的靶细胞数量的统计学上显著的(例如，p《0.05)减少。在特定实施方案中，存活靶细胞的量的减少度量了靶细胞在暴露于本公开的car时的消耗。在特定实施方案中，存活靶细胞的量的减少可通过测量用如本文所述的标记或染料标记的靶细胞的减少来评定。在特定实施方案中，与对照条件相比，存活靶细胞的量减少5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％、100％、125％、150％、175％、200％或更多。在特定实施方案中，与对照条件相比，存活靶细胞的量减少10％至100％。在特定实施方案中，与对照条件相比，存活靶细胞的量减少2倍、4倍、6倍、8倍、10倍或更多。在特定实施方案中，与对照条件相比，存活靶细胞的量减少2倍至5倍。在特定实施方案中，对照条件可以包括：仅用抗nkcar修饰细胞进行的测定(不存在靶细胞)；仅用靶细胞进行的测定(不存在抗nkcar修饰细胞)；用抗nkcar修饰细胞和表达不被该抗nkcar修饰细胞表达的car结合结构域识别的抗原的靶细胞(例如，抗nkp46修饰cart细胞和表达cd19的k562细胞)进行的测定。[0218](x)表征靶nk细胞的测定.可以使用本领域已知的任何数量的测定来表征由本公开的表达抗nkcar的细胞靶向的nk细胞的特性和/或行为。可以例如在使靶nk细胞与表达抗nkcar的细胞接触后表征nk细胞。在特定实施方案中，nk靶细胞:表达抗nkcar的细胞的比率可以包括1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10。可以测量或检测与nk细胞活性相关的任何参数，如细胞毒性标志物(cd107、cd69)、细胞因子产生(例如，ifn-γ或tnf-α)、细胞内游离钙水平的增加和/或溶解细胞的能力。在特定实施方案中，nk细胞的细胞内细胞因子表达可以通过流式细胞术来评定。在特定实施方案中，nk细胞可以用细胞示踪染料加以标记以区分nk细胞和表达抗nkcar的细胞。在特定实施方案中，表达抗nkcar的细胞可以通过流式细胞术根据是细胞示踪染料阴性的，cd3+的和/或选择性标志物阳性的进行鉴定。nk细胞活性可以通过基于基因表达的活性、基于细胞毒性的测定和增殖测定来评定。有关nk细胞测定的有用方案可见于naturalkillercellsprotocols(campbellksandcolonnam.humanapress编辑,第219-238页(2000))。[0219]在特定实施方案中，nk细胞在与表达抗nkcar的细胞接触后可以显示出统计学上显著的(例如，p《0.05)活化增加。在特定实施方案中，nk细胞活化反映为与对照条件相比细胞因子产生增加1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍，7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍或更多倍。在特定实施方案中，nk细胞在与表达抗nkcar的细胞接触后可以显示出统计学上显著的(例如，p《0.05)抑制增加。在特定实施方案中，nk细胞抑制反映为与对照条件相比细胞因子产生减少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍，7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍或更多倍。在特定实施方案中，nk细胞在与表达抗nkcar的细胞接触后不显示出任何统计学上显著的(例如，p》0.05)活化增加或抑制增加。在特定实施方案中，在nk细胞与表达抗nkcar的细胞接触后，nk细胞可以诱导统计学上显著的(例如，p《0.05)表达抗nkcar的细胞的量的减少(例如，如通过表达car的细胞呈细胞示踪染料阴性，cd3+和/或选择性标志物阳性所评定)。在特定实施方案中，与对照条件相比，表达抗nkcar的细胞的量减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在特定实施方案中，在nk细胞与表达抗nkcar的细胞接触后，nk细胞不诱导统计学上显著的(例如，p《0.05)表达抗nkcar的细胞的量的减少。在特定实施方案中，对照条件可以包括：用nk细胞和未经修饰以表达抗nkcar的细胞(例如，模拟t细胞)进行的测定；用nk细胞和经修饰以表达抗活化性nk受个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。[0230]在本文所公开的组合物和制剂中，细胞的体积一般是一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或者100ml或更少。因此，施用的细胞的密度通常大于104个细胞/ml、107个细胞/ml’或108个细胞/ml。[0231]治疗有效量的纳米颗粒的范围可以是0.1至5μg/kg或0.5至1μg/kg。在其他实例中，剂量可包括1μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、150μg/kg、350μg/kg、500μg/kg、750μg/kg、1000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。在其他实例中，剂量可包括1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg、700mg/kg、1000mg/kg或更高。[0232]在特定实施方案中，组合物和制剂可以包括一种或多种基因修饰的细胞类型(例如，修饰的t细胞、nk细胞或干细胞)或具有一种或多种car类型的基因修饰的细胞(例如，包括抗nkp46car的修饰的t细胞和包括抗nkg2acar的修饰的t细胞)。可以按不同的比率提供不同的基因修饰的细胞群体。[0233]可以制备基于细胞的组合物和制剂以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用。组合物和制剂还可被配制成用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、表面、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内和/或皮下注射。[0234]对于注射，可将组合物配制成水溶液形式，如在包括汉克斯氏溶液(hanks'solution)、林格氏溶液(ringer'ssolution)或生理盐水在内缓冲液中的水溶液。水溶液可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，制剂可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒介物(例如无菌的无热原水)复原。[0235]在一些情况下，冷冻保存本公开的细胞或细胞制剂可能是有用的。如本文所用，“冷冻保存”是指通过冷却至零下温度如(通常)77k或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞。冷冻保护剂通常在零下温度下使用，以改善或防止由于低温冷冻或升温至室温引起的细胞受损。冷冻保护剂和最佳冷却速率可以防止细胞损伤。可以使用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜(dmso)(lovelock和bishop,nature,1959；183:1394-1395；ashwood-smith,nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(rinfret,ann.n.y.acad.sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(sloviter和ravdin,nature,1962；196:48)。在特定实施方案中，冷却速率为1℃至3℃/分钟。至少两小时后，细胞达到-80℃的温度，可以直接放入液氮(-196℃)中进行永久储存，例如放入长期低温储存容器中。[0236](xii)使用方法.本文所述的基因修饰细胞提供了治疗nk细胞相关疾病以及治疗与表达nk受体的细胞相关的其他疾病的方法。在特定实施方案中，nk细胞相关疾病包括nk细胞发挥作用的任何疾病，包括作为疾病的起因或进展(例如，在nk细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病、同种免疫性疾病或感染中)，或起到改善或预防疾病的作用(例如，在癌症中)。在特定实施方案中，nk细胞相关疾病包括nk细胞恶性肿瘤、癌症、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病。在特定实施方案中，nk细胞相关疾病包括恶性肿瘤或感染，其中通过消耗表达更多抑制性受体或具有抑制性表型的nk细胞来改善或增强nk细胞功能将具有治疗益处。在特定实施方案中，nk细胞抑制性表型包括：nk细胞上抑制性受体表达增多；nk细胞活性受抑制；nk细胞溶解靶细胞的能力下降；和/或与正常功能的nk细胞或无抑制性表型的nk细胞相比，nk细胞对炎症细胞、感染细胞、肿瘤细胞和/或其他需要被破坏的细胞的免疫反应降低。在特定实施方案中，nk细胞抑制性表型可以通过如本文所述的测定来测量。[0237]在特定实施方案中，与表达nk细胞受体的细胞相关的疾病包括具有异常nk受体表达的恶性肿瘤。在特定实施方案中，当细胞群体中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞表达给定nk受体时，该细胞群体中的细胞上的nk受体表达是异常的。可以将细胞群体中表达nk受体的细胞的百分比与对照条件或参考值进行比较。在特定实施方案中，对照条件可以包括来自健康受试者或健康受试者库的细胞群体中的细胞，或来自未患有具有异常nk受体表达的恶性肿瘤的受试者或受试者库的细胞群体中的细胞。在特定实施方案中，参考值可以源自来自健康受试者或健康受试者库的细胞群体中的细胞，或者源自来自未患有具有异常nk受体表达的恶性肿瘤的受试者或受试者库的细胞群体中的细胞。具有异常nk受体表达的恶性肿瘤包括塞扎里综合征、成熟t细胞肿瘤、t细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病和alk+间变性大细胞淋巴瘤。在特定实施方案中，与表达nk细胞受体的细胞相关的疾病包括nk受体在t细胞或其他细胞上表达的自身免疫性或同种免疫性疾患。[0238]在特定实施方案中，表达结合nkp46和/或nkg2a的car的抗nk修饰细胞允许消耗nk细胞以治疗nk细胞恶性肿瘤。在特定实施方案中，表达结合nkg2a抑制性受体的car的抗nk修饰细胞允许消耗抑制性nk细胞以增强nk对癌症的反应。在特定实施方案中，癌症包括非nk细胞恶性肿瘤。在特定实施方案中，表达结合nkg2a抑制性受体的car的抗nk修饰细胞允许消耗抑制性nk细胞以增强nk对感染的反应。在特定实施方案中，表达结合nkp46活化性受体的car的抗nk修饰细胞允许消耗活化性nk细胞以减少自身免疫性或同种免疫性疾病中的免疫反应。[0239]在特定实施方案中，将抗nkcar修饰细胞施用于有需要的受试者。施用的细胞可以靶向并破坏受试者体内的nk细胞。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞是抗nkcar修饰t细胞，其能够在体内复制，产生长期的持久性，可以导致持续的治疗。在特定实施方案中，抗nkcar修饰t细胞可以经历强大的体内t细胞扩增并且可以持续较长时间。在特定实施方案中，抗nkcar修饰t细胞进化成特定的记忆t细胞，其可以被重新活化以靶向和破坏nk细胞。在特定实施方案中，抗nkcar修饰细胞是抗nkcar修饰hspc，其在施用于受试者后在体内分化为成熟的免疫效应细胞。[0240]在特定实施方案中，向有需要的受试者施用有效量的组合物以增加受试者对nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的细胞免疫反应。免疫反应可以包括由调节性t细胞、辅助性t细胞反应和/或能够杀伤nk细胞的细胞毒性t细胞介导的细胞免疫反应。也可能诱导体液免疫反应，该反应主要由能够活化b细胞的辅助性t细胞介导，由此导致抗体产生。可以使用多种技术来分析由组合物诱导的免疫反应的类型，这些技术在本领域中有很好的描述；例如，currentprotocolsinimmunology,编辑者：johne.coligan,adam.kruisbeek,davidh.margulies,ethanm.shevach,warrenstrober(2001)johnwiley&sons,ny,n.y.。[0241]就t细胞介导的杀伤而言，car抗原结合启动t细胞中的car信号传导，导致多种t细胞信号传导通路活化，这些信号传导通路诱导t细胞产生或释放能够通过各种机制诱导靶细胞凋亡的蛋白质。这些t细胞介导的机制包括细胞内细胞毒性颗粒从t细胞转移到靶细胞中；t细胞分泌促炎细胞因子，所述促炎细胞因子可以直接(或通过募集其他杀伤效应细胞间接)诱导靶细胞杀伤；以及上调t细胞表面上的死亡受体配体(例如fasl)，所述配体在与靶细胞上的同源死亡受体(例如fas)结合后诱导靶细胞凋亡。[0242]方法包括用本文所公开的组合物和制剂治疗受试者(人、兽医动物(狗、猫、爬行动物、鸟类等)、牲畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究动物(猴、大鼠、小鼠、鱼类等))。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗的那些。[0243]“有效量”是引起受试者的所需生理变化所必需的组合物的量。例如，有效量可以提供抗癌、抗感染、抗自身免疫或抗同种免疫作用。出于研究目的，通常施用有效量。有效量可以在与评估nk细胞恶性肿瘤、癌症、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的发展或进展有关的动物模型或体外测定中引起统计上显著的作用。可以有效量提供免疫原性组合物，其中有效量刺激免疫反应或减弱免疫反应。[0244]“防治性治疗”包括施用于没有表现出nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的体征或症状，或仅表现出nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的早期体征或症状的受试者的治疗，使得施用治疗以便进一步减轻或降低发生nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的风险。因此，防治性治疗用作针对nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的预防性治疗。在特定实施方案中，防治性治疗减少、延迟或预防nk细胞恶性肿瘤的进一步进展。在特定实施方案中，防治性治疗减少、延迟或预防癌症的转移。在特定实施方案中，防治性治疗减少、延迟或预防感染。在特定实施方案中，防治性治疗减少、延迟或预防过度反应的免疫反应。[0245]“治疗性治疗”包括施用于表现出nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的症状或体征的受试者的治疗，并且施用于受试者是为了减轻或消除所述nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的那些体征或症状。治疗性治疗可以减少、控制或消除nk细胞恶性肿瘤、癌症、感染、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的存在或活性并且/或者减少、控制或消除nk细胞恶性肿瘤、癌症、自身免疫性疾病或同种免疫性疾病的副作用。[0246]nk细胞恶性肿瘤包括由未成熟nk细胞和成熟nk细胞引起的赘生物。在特定实施方案中，未成熟(或前体)nk细胞赘生物包括无颗粒cd4+/cd56+血液皮肤赘生物、cd941a+/tcr-淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(lbl)和髓系/nk细胞急性白血病。在特定实施方案中，成熟nk细胞赘生物包括：鼻型结外nk细胞淋巴瘤；侵袭性nk细胞白血病；和慢性nk细胞淋巴细胞增多症。成熟nk细胞赘生物通常是cd2+/cd3-/ccd3ε+/cd56+/mpo-和细胞毒性分子阳性的。与未成熟nk细胞赘生物不同，成熟nk细胞赘生物还与ebv密切相关。[0247]在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防患有鼻nk细胞淋巴瘤的受试者的鼻分泌物、鼻塞、脓性鼻漏、鼻出血和局部肿胀。在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防患有鼻外nk细胞淋巴瘤的受试者的粘膜部位溃疡、血管的血管中心性和血管破坏性生长，以及皮肤病变。在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防患有侵袭性nk细胞白血病的受试者的发热、全身症状、肝功能障碍、肝脾肿大、严重贫血和血小板减少症。在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防患有慢性nk细胞淋巴细胞增多症的受试者的严重中性粒细胞减少、纯红细胞再生障碍、血管炎综合征、发热和外周血nk细胞增加。[0248]可以通过组合物和制剂治疗的癌症包括：癌症，包括膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯克特淋巴瘤(burkett'slymphoma)；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。可以根据本公开治疗的其他示例性癌症包括淋巴谱系的造血系统肿瘤，例如t细胞和b细胞肿瘤，包括：t细胞病症，如t幼淋巴细胞白血病(t-pll)，包括小细胞和脑形细胞类型；t细胞型大颗粒淋巴细胞白血病(lgl)；塞扎里综合征(ss)；成人t细胞白血病淋巴瘤(atll)；肝脾t细胞淋巴瘤；外周/胸腺后t细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤；血管中心性(鼻)t细胞淋巴瘤；间变性(ki1+)大细胞淋巴瘤；肠t细胞淋巴瘤；和t淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(t-lbly/t-all)。[0249]在特定实施方案中，治疗有效量提供抗癌作用。抗癌作用是指减少恶性nk细胞数量，减少癌转移数量，减小肿瘤体积，增加预期寿命，诱导癌细胞的化学敏感性或放射敏感性，抑制癌细胞附近的血管生成，抑制癌细胞增殖，抑制肿瘤生长，预防或减少转移，延长受试者寿命，减轻癌症相关的疼痛和/或减少治疗后癌症的复发或重现。[0250]可以通过所公开的组合物和制剂治疗的感染包括细菌、病毒、真菌、寄生虫和节肢动物感染。在特定实施方案中，感染是慢性的。在特定实施方案中，细菌感染可以包括由葡萄球菌属(staphylococcus)种、链球菌属(streptococcus)种、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(salmonella)、弧菌(vibrio)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)和梅毒螺旋体(treponemapallidum)引起的感染。在特定实施方案中，病毒感染可以包括由鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠状病毒、单纯疱疹病毒1(hsv-1)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)、甲型肝炎、诺如病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎、人免疫缺陷病毒(hiv)、单纯疱疹病毒2(hsv-2)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、西尼罗河病毒(wnv)、肠病毒、丙型肝炎、人t淋巴细胞病毒1(htlv-1)、默克尔细胞多瘤病毒(mcv)和hhv8(卡波西肉瘤)引起的感染。在特定实施方案中，真菌感染可以包括由毛癣菌属(trychophyton)种和念珠菌属(candida)种引起的感染。在特定实施方案中，寄生虫感染可以包括由贾第鞭毛虫(giardia)、弓形虫病(toxoplasmosis)、蛲虫病(e.vermicularis)、克氏锥虫(trypanosomacruzi)、棘球蚴病(echinococcosis)、囊尾蚴病(cysticercosis)、弓蛔虫病(toxocariasis)、滴虫病(trichomoniasis)和阿米巴病(amebiasis)引起的感染。在特定实施方案中，节肢动物感染可以包括由感染病毒或细菌的节肢动物传播的感染，包括加利福尼亚脑炎(californiaencephalitis)、基孔肯雅热(chikungunya)、登革热(dengue)、东方马脑炎(easternequineencephalitis)、波瓦桑病毒(powassan)、圣路易斯脑炎(st.louisencephalitis)、西尼罗河病毒(westnile)、黄热病(yellowfever)、寨卡病毒(zika)、莱姆病(lymedisease)和巴贝虫病(babesiosis)。[0251]在特定实施方案中，治疗有效量提供抗感染作用。抗感染作用包括减少：感染病原体的数量或水平、疲劳、食欲不振、体重减轻、发烧、盗汗、寒战、不适和疼痛、腹泻、腹胀、腹痛、皮疹、咳嗽和/或流鼻涕。[0252]可以通过所公开的组合物和制剂治疗的自身免疫性疾病包括：干燥症；抗磷脂综合征；寻常型天疱疮；脊柱关节病；皮肤病，包括牛皮癣；多发性硬化症；系统性硬化症；i型糖尿病；类风湿性关节炎；幼年特发性关节炎；炎症性肠病；自身免疫性肝病；和系统性红斑狼疮(sle)。[0253]可以通过所公开的组合物和制剂治疗的同种免疫性疾病包括：fnait；造血干细胞排斥、实体组织移植排斥；以及器官移植后的慢性同种异体移植物损伤。[0254]在特定实施方案中，治疗有效量提供抗自身免疫或抗同种免疫作用。抗自身免疫或抗同种免疫作用包括免疫反应减少、炎症减少、组织损伤减少和/或nk细胞对自身或非自身组织的耐受性增加。[0255]在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防：免疫系统对细胞、组织和关节的攻击；类风湿性关节炎、银屑病关节炎或幼年特发性关节炎中的关节肿胀、僵硬和疼痛；多发性硬化症中的麻木、虚弱和平衡问题；肠易激疾病中的胃肠道炎症；干燥症中的眼干和口干；抗磷脂综合征中的动脉和静脉经常性凝结和/或流产；寻常型天疱疮中的皮肤和粘膜上的水泡；脊柱关节病中的炎症性脊柱疼痛、骶髂关节炎、胸壁疼痛、外周关节炎、外周附着点炎、指炎、肺尖病变、结膜炎、葡萄膜炎和主动脉瓣闭锁不全以及传导紊乱；i型糖尿病中的高血糖水平；系统性硬化症中的皮肤、关节和内脏器官的纤维化和血管异常；自身免疫性肝病中的肝硬化和肝功能衰竭；sle中的疲劳、关节痛、皮疹和发热；fnait中的流产和宫内生长受限；造血干细胞移植排斥；实体组织移植排斥；免疫系统对同种异体细胞、组织和/或器官的攻击；以及供体特异性抗体的从头发展，对血管床内皮的损伤，和肾移植后慢性同种异体移植物损伤中的细胞肥大。[0256]防治性治疗和治疗性治疗不必相互排斥，并且在特定实施方案中，所施用的剂量可达成多于一种治疗类型。[0257]对于施用，可基于体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计治疗有效量(本文中也称为剂量)。此类信息可用于更准确地确定目标受试者的可用剂量。施用至特定受试者的实际剂量的量可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如包括受试者的目标、体重、疾患的严重程度、疾病类型、疾病阶段、先前或同时的治疗干预、特发性疾病在内的身体和生理因素以及施用途径的参数的情况下确定。[0258]施用的治疗有效量可包括大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。[0259]有效剂量范围为106-1012个细胞/kg。可用的剂量可以包括106个细胞/kg、107个细胞/kg、108个细胞/kg、109个细胞/kg、1010个细胞/kg、1011个细胞/kg、1012个细胞/kg或更多。对于接受治疗的患者，这些细胞可以是同种异体的、同基因的、异基因的或自体同源的。如果需要，治疗还可以包括施用有丝分裂原(例如，pha)或淋巴因子、细胞因子、和/或趋化因子(例如，ifn-γ、il-2、il-12、tnfα、il-18和tnfβ、gm-csf、il-4、il-13、flt3-l、rantes、mip1α等)以增强免疫反应的诱导。[0260]可用于施用的剂量可以例如在0.1至5μg/kg或0.5至1μg/kg的范围内。在其他实例中，剂量可包括1μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、150μg/kg、350μg/kg、500μg/kg、750μg/kg、1000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。在其他实例中，剂量可包括1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg、700mg/kg、1000mg/kg或更高。[0261]治疗有效量可通过在治疗方案的过程期间(例如，每天、每隔一天、每3天、每周、每2周、每月、每2个月、每4个月、每6个月、每年等)施用单次或多次剂量来实现。[0262]如所指出的，可以通过注射、输注、植入或移植来施用组合物和制剂。在特定实施方案中，组合物和制剂是非肠道施用的。短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，包括血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、瘤内、腹膜内和皮下注射和输注。在特定实施方案中，本文所述的组合物和制剂通过直接注射到肿瘤、淋巴结或疾病部位而施用于受试者。[0263]在特定实施方案中，组合物和制剂与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用于患者，所述治疗方式如化疗剂、放射、免疫阻抑剂或免疫消融剂、抗炎剂(例如，类固醇、糖皮质激素、非甾体抗炎药(nsaid))和/或细胞因子。[0264]在特定实施方案中，组合物和制剂可以与抗病毒治疗或防治组合施用，例如，当治疗nk细胞恶性肿瘤或癌症时。在特定实施方案中，抗病毒治疗或防治包括用于治疗ebv感染的化合物。在特定实施方案中，抗病毒治疗或防治包括核苷类似物，包括阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦或缬更昔洛韦。[0265](viii)药盒.本文所述组合物的任一者可以包含在药盒中。在特定实施方案中，可以在药盒中提供以下一项或多项：待经基因修饰以表达抗nkcar的细胞，包括免疫细胞；适于扩增待修饰细胞的试剂，包括培养基、aapc、生长因子和抗体；适于将编码抗nkcar的核酸引入细胞中的试剂，包括用于转染和/或转导细胞的试剂；抗nkcar修饰细胞；用于冷冻保存细胞的试剂；car表达构建体；用于产生car表达构建体的试剂，包括酶、聚合酶和引物；适于表征car修饰细胞的试剂，包括用于分选或检测car修饰细胞的抗体；和/或可用于操作核酸和细胞的实验室用品，包括组织培养板、缓冲液、注射器、移液器等。[0266]在特定实施方案中，用于car表达构建体转染的细胞包括293细胞、293t细胞或a549细胞。在特定实施方案中，用于car表达构建体转导的试剂包括纤连蛋白包被的板、海地美溴铵(hexadimethrinebromide)(聚凝胺(polybrene))和/或阳离子脂质体(lipofectamine)。在特定实施方案中，car表达构建体包括包含编码car的基因的逆转录病毒载体。在特定实施方案中，car表达构建体包括可操作地连接至car的mnd启动子，所述car包括结合活化性nk受体和/或抑制性nk受体的结合结构域。在特定实施方案中，car表达构建体包括可操作地连接至car的mnd启动子，所述car包括结合nkp46和/或nkg2a的结合结构域。在特定实施方案中，car表达构建体包括可操作地连接至car的mnd启动子，所述car包括结合nkp46或nkg2a的结合结构域、cd8α铰链、cd8α跨膜结构域、细胞内cd3ζ信号传导结构域和细胞内4-1bb共刺激信号传导结构域。在特定实施方案中，car表达构建体包括编码bfp转导标志物的基因，所述基因通过2a可裂解肽与编码car的基因连接。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括：包括seqidno:3-98、260-265的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:99-112的vh和vl的nkp46scfv；包括seqidno:113-119的nkp46scfv；包括seqidno:266的重链的抗原结合片段；和/或包括seqidno:267的轻链的抗原结合片段。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括：包括seqidno:190、193、196、198、201和202的cdr的nkp46scfv；包括seqidno:204和205的vh和vl的nkp46scfv；和/或包括seqidno:206的nkp46scfv。在特定实施方案中，结合nkp46的结合结构域包括包含seqidno:190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202和203的cdr的nkp46scfv。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:127、130、133、136、142和143的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括包含seqidno:242、244和246的人工hla-e模拟物。在特定实施方案中，结合nkg2a的结合结构域包括：seqidno:213、214、215、216、217、218、290、291、292、293、294和295的cdr；seqidno:219、220、221、222和223的vh；seqidno:224、225、226、227和228的重链的抗原结合片段；和/或seqidno:229的轻链的抗原结合片段。[0267]药盒可包括一种或多种适当等分的试剂以产生本公开的组合物。药盒的组分可以包装在水性介质中或者以冻干形式包装。药盒的容器装置可以包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可以放置其中，并且优选地适当地等分。在药盒中存在超过一种组分的情况下，药盒通常还可以包含第二、第三或其他另外的容器，另外的组分可以单独放置其中。然而，组分的各种组合可以包含在容器中。药盒通常还包括用于容纳car表达构建体的装置和任何其他封闭的试剂容器，用于商业销售。例如，这样的容器可以包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶被保持在其中。[0268](xiv)变体.还包括本文公开和引用的序列的变体。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如dnastartm(madison,wisconsin)软件来发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不会消除生物活性的指导。优选地，蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电氨基酸的取代。保守氨基酸变化涉及取代用侧链相关的氨基酸家族中的一者进行的取代。[0269]功能变体包括不实质性影响蛋白质的生理效应的一个或多个残基添加或取代。功能片段包括不实质性影响蛋白质的生理效应的一个或多个缺失或截短。可以通过在活化研究或结合研究中观察到实验上相当的结果来确认没有实质性影响。当处于本公开的活化状态时，细胞内结构域(例如，细胞内信号传导结构域)的功能变体和功能片段传递与野生型参考相当的活化或抑制信号。结合结构域的功能变体和功能片段以与野生型参考相当的水平结合它们的同源抗原或配体。[0270]在特定实施方案中，当与已知抗体的vh相比时，结合结构域vh区可以源自或基于已知抗体的vh，并且可以任选地含有一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)插入、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)缺失、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以是在vh区中的任何地方，包括在该区域的氨基末端或羧基末端或两个末端，条件是每个cdr包含零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的vh区的结合结构域仍然可以以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。[0271]在特定实施方案中，当与已知抗体的vl相比时，结合结构域中的vl区源自或基于已知抗体的vl，并且任选地含有一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)插入、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)缺失、一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)，或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以是在vl区中的任何地方，包括在该区域的氨基末端或羧基末端或两个末端，条件是每个cdr包含零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的vl区的结合结构域仍然可以以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。[0272]在肽或蛋白质中，合适的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如watson等人,molecularbiologyofthegene,第4版,1987,thebenjamin/cummingspub.co.,第224页)。天然存在的氨基酸一般分为以下保守性取代家族：第1组：丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)；第2组：(酸性)：天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)；第3组：(酸性；也分类为极性带负电残基及其酰胺)：天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、asp和glu；第4组：gln和asn；第5组：(碱性；也分类为极性带正电残基)：精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)和组氨酸(his)；第6组(大的脂肪族非极性残基)：异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、缬氨酸(val)和半胱氨酸(cys)；第7组(不带电的极性残基)：酪氨酸(tyr)、gly、asn、gln、cys、ser和thr、第8组(大的芳香族残基)：苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)和tyr；第9组(非极性)：脯氨酸(pro)、ala、val、leu、ile、phe、met和trp；第11组(脂肪族)：gly、ala、val、leu和ile；第10组(小的脂肪族非极性或弱极性残基)：ala、ser、thr、pro和gly；以及第12组(含硫残基)：met和cys。额外信息可见于creighton(1984)proteins,w.h.freemanandcompany。[0273]在进行此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物功能方面的重要性是本领域中大体了解的(kyte和doolittle,1982,j.mol.biol.157(1),105-32)。各氨基酸已基于其疏水性和电荷特征而指定亲水指数(kyte和doolittle,1982)。这些值是：ile(+4.5)；val(+4.2)；leu(+3.8)；phe(+2.8)；cys(+2.5)；met(+1.9)；ala(+1.8)；gly(-0.4)；thr(-0.7)；ser(-0.8)；trp(-0.9)；tyr(-1.3)；pro(-1.6)；his(-3.2)；谷氨酰胺(-3.5)；gln(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；asn(-3.5)；lys(-3.9)；和arg(-4.5)。[0274]本领域中已知，某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或分数的其他氨基酸取代并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物功能等效的蛋白质。在进行此类变化时，优选取代亲水指数在±2内的氨基酸，特别优选亲水指数在±1内的氨基酸，并且甚至更优选亲水指数在±0.5内的氨基酸。本领域中还应了解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。[0275]如美国专利号4,554,101中所详述，以下亲水性值已被指定给氨基酸残基：arg(+3.0)；lys(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；ser(+0.3)；asn(+0.2)；gln(+0.2)；gly(0)；thr(-0.4)；pro(-0.5±1)；ala(-0.5)；his(-0.5)；cys(-1.0)；met(-1.3)；val(-1.5)；leu(-1.8)；ile(-1.8)；tyr(-2.3)；phe(-2.5)；trp(-3.4)。应理解，氨基酸可被取代为具有类似亲水性值的另一个氨基酸，并且仍然获得生物学上等效的且特别是免疫学上等效的蛋白质。在这些变化中，优选亲水性值在±2内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1内的氨基酸的取代，并且甚至更优选亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。[0276]如上所概述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。[0277]如别处所示，基因序列的变体可以包括密码子优化的变体、序列多态性、剪接变体和/或对编码产物的功能没有统计学意义的影响的突变。[0278]蛋白质、核酸和基因序列的变体还包括与本文所公开的蛋白质、核酸和基因序列具有至少70％序列同一性、80％序列同一性、85％序列、90％序列同一性、95％序列同一性、96％序列同一性、97％序列同一性、98％序列同一性或99％序列同一性的序列。[0279]“序列同一性百分比”是指通过比较序列所确定的两个或更多个序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指通过此类序列串之间的匹配所确定的蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关性程度。“同一性”(经常称为“相似性”)可通过已知方法来容易地计算，所述方法包括(但不限于)在以下中描述的那些：computationalmolecularbiology(lesk,a.m.编辑)oxforduniversitypress,ny(1988)；biocomputing:informaticsandgenomeprojects(smith,d.w.编辑)academicpress,ny(1994)；computeranalysisofsequencedata,parti(griffin,a.m.,andgriffin,h.g.编辑)humanapress,nj(1994)；sequenceanalysisinmolecularbiology(vonheijne,g.编辑)academicpress(1987)；以及sequenceanalysisprimer(gribskov,m.anddevereux,j.编辑)oxforduniversitypress,ny(1992)。确定同一性的优选方法被设计用于得到测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编写于可公开获得的计算机程序中。序列比对和同一性百分比计算可使用lasergene生物信息学计算套件(dnastar,inc.,madison,wisconsin)中的megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用clustal比对方法(higgins和sharpcabios,5,151-153(1989)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括gcg程序套件(wisconsin软件包版本9.0，geneticscomputergroup(gcg),madison,wisconsin)；blastp、blastn、blastx(altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)；dnastar(dnastar,inc.,madison,wisconsin)；以及纳入smith-waterman算法的fasta程序(pearson,comput.methodsgenomeres.,[proc.int.symp.](1994),meetingdate1992,111-20.编辑:suhai,sandor.出版商：plenum,newyork,n.y.。在本公开的上下文内，将了解在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指在首次初始化时用软件最初加载的值或参数的任何集合。[0280]变体还包括在严格杂交条件下与本文所公开的序列杂交并提供与参考序列相同功能的核酸分子。示例性严格杂交条件包括：在42℃下在包括50％甲酰胺、5xssc(750mmnacl、75mm柠檬酸三钠)、50mm磷酸钠(ph7.6)、5xdenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精dna的溶液中孵育过夜，随后在50℃下用0.1xssc洗涤。杂交和信号检测的严格度的变化主要通过控制甲酰胺浓度(较低的甲酰胺百分比引起严格性降低)、盐条件或温度来实现。例如，中等严格度条件包括：在37℃下在包括6xsspe(20xsspe＝3mnacl；0.2mnah2po4；0.02medta，ph7.4)、0.5％sds、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精封闭dna的溶液中孵育过夜，随后在50℃下用1xsspe、0.1％sds洗涤。另外，为了获得甚至更低的严格度，在严格杂交后，可在较高盐浓度(例如5xssc)下执行洗涤。上述条件的变化可以通过包括和/或取代用于抑制杂交实验中的背景的替代封闭试剂来实现。典型的封闭试剂包括denhardt试剂、blotto、肝素、变性鲑鱼精dna和可商购的专有制剂。由于相容性问题，包括特定封闭试剂可能需要改变上述杂交条件。[0281](xv)示例性实施方案.[0282]1.一种嵌合抗原受体(car)，当表达时，所述嵌合抗原受体(car)包含：[0283]细胞外组分；和[0284]细胞内组分，[0285]其中所述细胞外组分包含活化性nk受体结合结构域和/或抑制性nk受体结合结构域。[0286]2.如实施方案1所述的car，所述car还包含将所述细胞外组分连接至所述细胞内组分的跨膜结构域。[0287]3.如实施方案1或2所述的car，其中所述活化性nk受体结合结构域包含nkp30结合结构域、nkp44结合结构域和/或nkp46结合结构域。[0288]4.如实施方案3所述的car，其中所述nkp30结合结构域包含抗体az20、抗体a76、抗体z25、抗体15e1、抗体9g1、抗体15h6、抗体9d9、抗体3a12、抗体12d10、抗体克隆#210845、抗体克隆p30-15或抗体克隆af29-4d12的抗原结合片段。[0289]5.如实施方案3或4所述的car，其中所述nkp44结合结构域包含抗体z231、抗体克隆#253415、抗体克隆44.189、抗体克隆1g6或抗体克隆p44-8的抗原结合片段。[0290]6.如实施方案3-5中任一项所述的car，其中所述nkp46结合结构域包含：[0291](a)重链可变(vh)结构域，所述重链可变(vh)结构域包含：具有如seqidno:190所示序列的cdrh1、具有如seqidno:193所示序列的cdrh2和具有如seqidno:196所示序列的cdrh3；和轻链可变(vl)结构域，所述轻链可变(vl)结构域包含：具有如seqidno:198所示序列的cdrl1、具有如seqidno:201所示序列的cdrl2和具有如seqidno:202所示序列的cdrl3；[0292](b)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:3所示序列的cdrh1、具有如seqidno:6所示序列的cdrh2和具有如seqidno:9所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:12所示序列的cdrl1、具有如seqidno:15所示序列的cdrl2和具有如seqidno:16所示序列的cdrl3；[0293](c)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:19所示序列的cdrh1、具有如seqidno:22所示序列的cdrh2和具有如seqidno:24所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:27所示序列的cdrl1、具有如seqidno:30所示序列的cdrl2和具有如seqidno:31所示序列的cdrl3；[0294](d)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:33所示序列的cdrh1、具有如seqidno:36所示序列的cdrh2和具有如seqidno:39所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:42所示序列的cdrl1、具有如seqidno:45所示序列的cdrl2和具有如seqidno:46所示序列的cdrl3；[0295](e)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:48所示序列的cdrh1、具有如seqidno:51所示序列的cdrh2和具有如seqidno:54所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:57所示序列的cdrl1、具有如seqidno:60所示序列的cdrl2和具有如seqidno:61所示序列的cdrl3；[0296](f)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:63所示序列的cdrh1、具有如seqidno:66所示序列的cdrh2和具有如seqidno:69所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:42所示序列的cdrl1、具有如seqidno:45所示序列的cdrl2和具有如seqidno:72所示序列的cdrl3；[0297](g)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:74所示序列的cdrh1、具有如seqidno:77所示序列的cdrh2和具有如seqidno:78所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:81所示序列的cdrl1、具有如seqidno:30所示序列的cdrl2和具有如seqidno:82所示序列的cdrl3；[0298](h)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:84所示序列的cdrh1、具有如seqidno:87所示序列的cdrh2和具有如seqidno:90所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:93所示序列的cdrl1、具有如seqidno:96所示序列的cdrl2和具有如seqidno:97所示序列的cdrl3；[0299](i)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:260所示序列的cdrh1、具有如seqidno:261所示序列的cdrh2和具有如seqidno:262所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:263所示序列的cdrl1、具有如seqidno:264所示序列的cdrl2和具有如seqidno:265所示序列的cdrl3，[0300]各自根据kabat编号；[0301](j)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:191所示序列的cdrh1、具有如seqidno:194所示序列的cdrh2和具有ryg的序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:199所示序列的cdrl1、具有rms的序列的cdrl2和具有如seqidno:203所示序列的cdrl3；[0302](k)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:4所示序列的cdrh1、具有如seqidno:7所示序列的cdrh2和具有如seqidno:10所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:13所示序列的cdrl1、具有yts的序列的cdrl2和具有如seqidno:17所示序列的cdrl3；[0303](l)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:20所示序列的cdrh1、具有ygs的序列的cdrh2和具有如seqidno:25所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:28所示序列的cdrl1、具有nak的序列的cdrl2和具有如seqidno:32所示序列的cdrl3；[0304](m)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:34所示序列的cdrh1、具有如seqidno:37所示序列的cdrh2和具有如seqidno:40所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:43所示序列的cdrl1、具有yas的序列的cdrl2和具有如seqidno:47所示序列的cdrl3；[0305](n)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:49所示序列的cdrh1、具有如seqidno:52所示序列的cdrh2和具有如seqidno:55所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:58所示序列的cdrl1、具有aat的序列的cdrl2和具有如seqidno:62所示序列的cdrl3；[0306](o)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:64所示序列的cdrh1、具有如seqidno:67所示序列的cdrh2和具有如seqidno:70所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:43所示序列的cdrl1、具有yas的序列的cdrl2和具有如seqidno:73所示序列的cdrl3；[0307](p)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:75所示序列的cdrh1、具有ysg的序列的cdrh2和具有如seqidno:79所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:28所示序列的cdrl1、具有nak的序列的cdrl2和具有如seqidno:83所示序列的cdrl3；[0308](q)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:85所示序列的cdrh1、具有如seqidno:88所示序列的cdrh2和具有如seqidno:91所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:94所示序列的cdrl1、具有gas的序列的cdrl2和具有如seqidno:98所示序列的cdrl3，[0309]各自根据chothia编号；[0310](r)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:192所示序列的cdrh1、具有如seqidno:195所示序列的cdrh2和具有如seqidno:197所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:200所示序列的cdrl1、具有rms的序列的cdrl2和具有如seqidno:202所示序列的cdrl3；[0311](s)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:5所示序列的cdrh1、具有如seqidno:8所示序列的cdrh2和具有如seqidno:11所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:14所示序列的cdrl1、具有yts的序列的cdrl2和具有如seqidno:18所示序列的cdrl3；[0312](t)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:21所示序列的cdrh1、具有如seqidno:23所示序列的cdrh2和具有如seqidno:26所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:29所示序列的cdrl1、具有nak的序列的cdrl2和具有如seqidno:31所示序列的cdrl3；[0313](u)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:35所示序列的cdrh1、具有如seqidno:38所示序列的cdrh2和具有如seqidno:41所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:44所示序列的cdrl1、具有yas的序列的cdrl2和具有如seqidno:46所示序列的cdrl3；[0314](v)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:50所示序列的cdrh1、具有如seqidno:53所示序列的cdrh2和具有如seqidno:56所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:59所示序列的cdrl1、具有aat的序列的cdrl2和具有如seqidno:61所示序列的cdrl3；[0315](w)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:65所示序列的cdrh1、具有如seqidno:68所示序列的cdrh2和具有如seqidno:71所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:44所示序列的cdrl1、具有yas的序列的cdrl2和具有如seqidno:72所示序列的cdrl3；[0316](x)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:76所示序列的cdrh1、具有如seqidno:23所示序列的cdrh2和具有如seqidno:80所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:29所示序列的cdrl1、具有nak的序列的cdrl2和具有如seqidno:82所示序列的cdrl3；[0317](y)vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:86所示序列的cdrh1、具有如seqidno:89所示序列的cdrh2和具有如seqidno:92所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:95所示序列的cdrl1、具有gas的序列的cdrl2和具有如seqidno:97所示序列的cdrl3，[0318]各自根据imgt编号。[0319]7.如实施方案3-6中任一项所述的car，其中所述nkp46结合结构域包含：[0320](a)与如seqidno:204所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:205所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0321](b)与如seqidno:99所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:100所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0322](c)与如seqidno:101所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:102所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0323](d)与如seqidno:103所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:104所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0324](e)与如seqidno:105所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:106所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0325](f)与如seqidno:107所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:108所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0326](g)与如seqidno:109所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:110所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；[0327](h)与如seqidno:111所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域和与如seqidno:112所示序列具有至少98％序列同一性的vl结构域；或[0328](i)与如seqidno:266所示序列具有至少98％序列同一性的抗原结合片段和与如seqidno:267所示序列具有至少98％序列同一性的抗原结合片段。[0329]8.如实施方案3-7中任一项所述的car，其中所述nkp46结合结构域包含：[0330](a)具有如seqidno:204所示序列的vh结构域和具有如seqidno:205所示序列的vl结构域；[0331](b)具有如seqidno:99所示序列的vh结构域和具有如seqidno:100所示序列的vl结构域；[0332](c)具有如seqidno:101所示序列的vh结构域和具有如seqidno:102所示序列的vl结构域；[0333](d)具有如seqidno:103所示序列的vh结构域和具有如seqidno:104所示序列的vl结构域；[0334](e)具有如seqidno:105所示序列的vh结构域和具有如seqidno:106所示序列的vl结构域；[0335](f)具有如seqidno:107所示序列的vh结构域和具有如seqidno:108所示序列的vl结构域；[0336](g)具有如seqidno:109所示序列的vh结构域和具有如seqidno:110所示序列的vl结构域；[0337](h)具有如seqidno:111所示序列的vh结构域和具有如seqidno:112所示序列的vl结构域；或[0338](i)具有如seqidno:266所示序列的重链的抗原结合片段和具有如seqidno:267所示序列的轻链的抗原结合片段。[0339]9.如实施方案3-8中任一项所述的car，其中所述nkp46结合结构域包含与如seqidno:206、seqidno:113、seqidno:114、seqidno:115、seqidno:116、seqidno:117、seqidno:118或seqidno:119所示序列具有至少98％序列同一性的单链可变片段(scfv)。[0340]10.如实施方案3-9中任一项所述的car，其中所述nkp46结合结构域包含具有如seqidno:206、seqidno:113、seqidno:114、seqidno:115、seqidno:116、seqidno:117、seqidno:118或seqidno:119所示序列的单链可变片段(scfv)。[0341]11.如实施方案1所述的car，其中所述抑制性nk受体结合结构域包含杀伤免疫球蛋白受体(kir)结合结构域和/或nkg2a结合结构域。[0342]12.如实施方案11所述的car，其中所述kir结合结构域包含如seqidno:288所示的重链的抗原结合片段和如seqidno:289所示的轻链的抗原结合片段。[0343]13.如实施方案11或12所述的car，其中所述kir结合结构域包含抗体a210、抗体a803g、抗体克隆#180704和抗体克隆nkvfs1的抗原结合片段。[0344]14.如实施方案11-13中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含人工人白细胞抗原(hla)-e模拟物。[0345]15.如实施方案14所述的car，其中所述hla-e模拟物包含以下各项的异源三聚体：i)hla-e结合信号肽；ii)成熟β-2微球蛋白(b2m)；和iii)hla-e重链。[0346]16.如实施方案15所述的car，其中所述hla-e结合信号肽包含：hla-a、hla-b、hla-c或hla-g的信号肽；来自人免疫缺陷病毒(hiv)、巨细胞病毒(cmv)或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)的肽；多药耐药相关蛋白7的肽；或hsp60的前导肽。[0347]17.如实施方案15或16所述的car，其中所述hla-e结合信号肽包含如seqidno:127和276-287所示的序列。[0348]18.如实施方案15-17中任一项所述的car，其中所述hla-e重链包括hla-e01:03重链。[0349]19.如实施方案14-18中任一项所述的car，其中所述hla-e模拟物包含与如seqidno:242、244或246所示序列具有至少98％序列同一性的序列。[0350]20.如实施方案14-19中任一项所述的car，其中所述hla-e模拟物包含如seqidno:242、244和246所示的序列。[0351]21.如实施方案11-20中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域是源自莫纳利珠单抗、抗体z270、抗体z199、抗体20d5或抗体3s9的scfv。[0352]22.如实施方案11-21中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含：[0353]vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:213所示序列的cdrh1、具有如seqidno:214所示序列的cdrh2和具有如seqidno:215所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:216所示序列的cdrl1、具有如seqidno:217所示序列的cdrl2和具有如seqidno:218所示序列的cdrl3，或[0354]vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:290所示序列的cdrh1、具有如seqidno:291所示序列的cdrh2和具有如seqidno:292所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:293所示序列的cdrl1、具有如seqidno:294所示序列的cdrl2和具有如seqidno:295所示序列的cdrl3，[0355]根据kabat编号。[0356]23.如实施方案11-22中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:219、220、221、222或223所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域。[0357]24.如实施方案11-23中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:219、220、221、222或223所示序列的vh结构域。[0358]25.如实施方案11-24中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:224、225、226、227或228所示序列具有至少98％序列同一性的重链的抗原结合片段和/或与如seqidno:229所示序列具有至少98％序列同一性的轻链的抗原结合片段。[0359]26.如实施方案11-25中任一项所述的car，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:224、225、226、227或228所示序列的重链的抗原结合片段和/或具有如seqidno:229所示序列的轻链的抗原结合片段。[0360]27.如实施方案1-26中任一项所述的car，其中所述细胞外组分还包含标签。[0361]28.如实施方案27所述的car，其中所述标签包括his标签、flag标签、xpress标签、avi标签、钙调蛋白结合肽(cbp)标签、聚谷氨酸标签、ha标签、myc标签、strep标签、softag1、softag3和/或v5标签。[0362]29.如实施方案27或28所述的car，其中所述标签具有如seqidno:152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167和/或168所示的序列。[0363]30.如实施方案1-29中任一项所述的car，其中所述细胞外组分还包含铰链。[0364]31.如实施方案30所述的car，其中所述铰链包括人ig铰链、kir2ds2铰链或cd8α铰链。[0365]32.如实施方案30或31所述的car，其中所述铰链是cd8α铰链。[0366]33.如实施方案30-32中任一项所述的car，其中所述铰链具有如seqidno:140所示的序列。[0367]34.如实施方案1-33中任一项所述的car，其中所述细胞外组分还包含接头。[0368]35.如实施方案34所述的car，其中所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头、igg4接头或cd28接头。[0369]36.如实施方案34或35所述的car，其中所述接头具有如seqidno:142、143、144、145、150或151所示的序列。[0370]37.如实施方案2-36中任一项所述的car，其中所述跨膜结构域包括以下各项的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链；cd28；cd27；cd3ε；cd45；cd4；cd5；cd8；cd9；cd16；cd22；cd33；cd37；cd64；cd80；cd86；cd134；cd137；cd154；kirds2；ox40；cd2；lfa-1；icos；4-1bb；gitr；cd40；baffr；hvem；slamf7；nkp80；nkp44；nkp30；nkp46；cd160；cd19；il2rβ；il2rγ；il7ra；itga1；vla1；cd49a；itga4；ia4；cd49d；itga6；vla-6；cd49f；itgad；cdlld；itgae；cd103；itgal；cdlla；itgam；cdllb；itgax；cdllc；itgb1；cd29；itgb2；cd18；itgb7；tnfr2；dnam1；slamf4；cd84；cd96；ceacam1；crtam；ly9；cd160；psgl1；cd100；slamf6；slam；blame；selplg；ltbr；pag/cbp；nkg2d；nkg2c；或它们的组合。[0371]38.如实施方案2-37中任一项所述的car，其中所述跨膜结构域包括cd8α链的跨膜结构域。[0372]39.如实施方案2-38中任一项所述的car，其中所述跨膜结构域具有如seqidno:138所示的序列。[0373]40.如实施方案1-39中任一项所述的car，其中所述细胞内组分包含细胞内信号传导结构域。[0374]41.如实施方案40所述的car，其中所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、常见fcrγ、fcγriia、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10、dap12或它们的组合。[0375]42.如实施方案40或41所述的car，其中所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ。[0376]43.如实施方案40-42中任一项所述的car，其中所述细胞内信号传导结构域具有如seqidno:146所示的序列。[0377]44.如实施方案40-43中任一项所述的car，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。[0378]45.如实施方案44所述的car，其中所述共刺激信号传导结构域包含mhci类分子、b和t细胞淋巴细胞衰减子(btla)、toll配体受体、ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1、icos、4-1bb、gitr、baffr、hvem、slamf7、nkp80、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、cd160、psgl1、cd100、cd69、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a或它们的组合。[0379]46.如实施方案44或45所述的car，其中所述共刺激信号传导结构域包含4-1bb。[0380]47.如实施方案44-46中任一项所述的car，其中所述共刺激信号传导结构域具有如seqidno:148所示的序列。[0381]48.如实施方案40-47中任一项所述的car，其中所述细胞内信号传导结构域包含具有如seqidno:230所示氨基酸序列的4-1bb共刺激结构域和cd3ζ刺激性结构域。[0382]49.如实施方案1-48中任一项所述的car，其中所述car具有与如seqidno:249、251、253、255或257所示序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。[0383]50.如实施方案1-49中任一项所述的car，其中所述car具有如seqidno:249、251、253、255或257所示的氨基酸序列。[0384]51.如实施方案1-50中任一项所述的car，其中所述car由与如seqidno:250、252、254、256或258所示序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列编码。[0385]52.如实施方案1-51中任一项所述的car，其中所述car由如seqidno:250、252、254、256或258所示的核苷酸序列编码。[0386]53.一种载体，所述载体包含编码实施方案1-52中任一项所述的car的核苷酸序列。[0387]54.如实施方案53所述的载体，其中所述载体还包含可操作地连接至编码如实施方案1-52中任一项所述的car的所述核苷酸序列的启动子。[0388]55.如实施方案54所述的载体，其中所述启动子是mnd启动子。[0389]56.如实施方案55所述的载体，其中所述mnd启动子具有如seqidno:175所示的序列。[0390]57.如实施方案53-56中任一项所述的载体，其中所述载体还包含编码转导标志物的核苷酸序列。[0391]58.如实施方案57所述的载体，其中所述转导标志物与所述car共表达。[0392]59.如实施方案49或50所述的载体，其中所述转导标志物是蓝色荧光蛋白(bfp)。[0393]60.如实施方案59所述的载体，其中所述bfp具有如seqidno:169、170、171、172、173、174或236所示的序列。[0394]61.如实施方案57-60中任一项所述的载体，其中编码所述转导标志物的所述核苷酸序列通过编码可裂解肽的核苷酸序列连接至编码所述car的所述核苷酸序列。[0395]62.如实施方案61所述的载体，其中所述可裂解肽包括猪捷申病毒1(p2a)、明脉扁刺蛾病毒(t2a)、马甲型鼻炎病毒(e2a)、口蹄疫病毒(f2a)、马铃薯y病毒2a或心病毒2a。[0396]63.如实施方案61或62所述的载体，其中所述可裂解肽具有如seqidno:176、177、178、179、180、181、182、183、184、185或240所示的序列。[0397]64.如实施方案53-63中任一项所述的载体，其中所述载体还包含分子安全开关。[0398]65.如实施方案64所述的载体，其中所述分子安全开关包括自杀基因。[0399]66.如实施方案65所述的载体，其中所述自杀基因包括诱导型半胱天冬酶9(icasp9)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)或截短的表皮生长因子受体(tegfr)。[0400]67.一种细胞，所述细胞经基因修饰以表达实施方案1-52中任一项所述的car。[0401]68.一种细胞，所述细胞经基因修饰以共表达：(a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和(b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域。[0402]69.一种细胞，所述细胞经基因修饰以共表达：(a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和(b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域，并且所述细胞内组分缺乏细胞内信号传导结构域。[0403]70.如实施方案68或69所述的细胞，其中所述nkg2a结合结构域包含人白细胞抗原(hla)-e或人工hla-e模拟物。[0404]71.一种细胞，所述细胞包含实施方案53-66中任一项所述的载体。[0405]72.如实施方案67-71中任一项所述的细胞，其中所述细胞是t细胞、nk细胞、巨噬细胞、造血干细胞(hsc)或造血祖细胞(hpc)。[0406]73.一种制剂，所述制剂包含实施方案67-72中任一项所述的细胞和药学上可接受的载剂。[0407]74.一种消耗第一nk细胞群体中表达活化性nk受体和/或抑制性nk受体的自然杀伤(nk)细胞的方法，所述方法包括：[0408]将所述第一细胞群体暴露于经基因修饰以表达实施方案1-52中任一项所述的car的第二细胞群体，[0409]其中所述暴露导致所述第一群体中nk细胞的消耗。[0410]75.如实施方案74所述的方法，其中所述暴露包括将所述表达car的第二细胞群体施用于具有所述第一细胞群体的受试者。[0411]76.一种消耗包括表达nkp46的nk细胞的第一细胞群体中表达活化性受体nkp46的自然杀伤(nk)细胞的方法，所述方法包括：[0412]将所述第一细胞群体暴露于第二细胞群体，所述第二细胞群体经基因修饰以共表达：[0413](a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0414](b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a受体结合结构域，[0415]其中所述暴露导致所述第一群体中表达nkp46的nk细胞的消耗。[0416]77.一种消耗包括表达nkp46的nk细胞的第一细胞群体中表达活化性受体nkp46的自然杀伤(nk)细胞的方法，所述方法包括：[0417]将所述第一细胞群体暴露于第二细胞群体，所述第二细胞群体经基因修饰以共表达：[0418](a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0419](b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a受体结合结构域，并且所述细胞内组分缺乏细胞内信号传导结构域。[0420]78.如实施方案76或77所述的方法，其中所述暴露包括将所述表达car的第二细胞群体施用于具有所述第一细胞群体的受试者。[0421]79.如实施方案76-78中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含人白细胞抗原(hla)-e或人工hla-e模拟物。[0422]80.如实施方案79所述的方法，其中所述hla-e模拟物包含以下各项的异源三聚体：i)hla-e结合信号肽；ii)成熟β-2微球蛋白(b2m)；和iii)hla-e01:03重链。[0423]81.如实施方案80所述的方法，其中所述hla-e结合信号肽包含：hla-a、hla-b、hla-c或hla-g的信号肽；来自人免疫缺陷病毒(hiv)、巨细胞病毒(cmv)或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)的肽；多药耐药相关蛋白7的肽；或hsp60的前导肽。[0424]82.如实施方案80或81所述的方法，其中所述hla-e结合信号肽包含如seqidno:127和276-287所示的序列。[0425]83.如实施方案79-82中任一项所述的方法，其中所述hla-e模拟物与如seqidno:242、244或246所示的序列具有至少98％的序列同一性。[0426]84.如实施方案79-83中任一项所述的方法，其中所述hla-e模拟物具有如seqidno:242、244或246所示的序列。[0427]85.如实施方案76-78中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域是源自莫纳利珠单抗、抗体z270、抗体z199、抗体20d5或抗体3s9的scfv。[0428]86.如实施方案76-78和85中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含：[0429]重链可变(vh)结构域，所述重链可变(vh)结构域包含：具有如seqidno:213所示序列的cdrh1、具有如seqidno:214所示序列的cdrh2和具有如seqidno:215所示序列的cdrh3；和轻链可变(vl)结构域，所述轻链可变(vl)结构域包含：具有如seqidno:216所示序列的cdrl1、具有如seqidno:217所示序列的cdrl2和具有如seqidno:218所示序列的cdrl3，或[0430]vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:290所示序列的cdrh1、具有如seqidno:291所示序列的cdrh2和具有如seqidno:292所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:293所示序列的cdrl1、具有如seqidno:294所示序列的cdrl2和具有如seqidno:295所示序列的cdrl3，[0431]根据kabat编号。[0432]87.如实施方案76-78、85和86中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:219、220、221、222或223所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域。[0433]88.如实施方案76-78和85-87中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:219、220、221、222或223所示序列的vh结构域。[0434]89.如实施方案76-78和85-88中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:224、225、226、227或228所示序列具有至少98％序列同一性的重链的抗原结合片段和/或与如seqidno:229所示序列具有至少98％序列同一性的轻链的抗原结合片段。[0435]90.如实施方案76-78和85-89中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:224、225、226、227或228所示序列的重链的抗原结合片段和/或具有如seqidno:229所示序列的轻链的抗原结合片段。[0436]91.如实施方案76-90中任一项所述的方法，其中包含所述nkg2a结合结构域的所述car在表达car的细胞中的表达赋予所述表达car的细胞抵抗表达nkp46的nk细胞的杀伤的抗性。[0437]92.一种治疗有需要的受试者的自然杀伤(nk)细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：[0438]向所述受试者施用治疗有效量的包含经基因修饰以表达实施方案1-52中任一项所述的car的细胞的制剂，[0439]从而治疗所述受试者的所述nk细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病。[0440]93.如实施方案92所述的方法，其中所述nk细胞相关疾病是nk细胞恶性肿瘤。[0441]94.如实施方案93所述的方法，其中所述nk细胞恶性肿瘤包括未成熟nk细胞赘生物、无颗粒cd4+/cd56+血液皮肤赘生物、cd941a+/tcr-淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(lbl)、髓系/nk细胞急性白血病、成熟nk细胞赘生物、鼻型结外nk细胞淋巴瘤、侵袭性nk细胞白血病和慢性nk细胞淋巴细胞增多症。[0442]95.如实施方案92-94中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗病毒治疗或防治。[0443]96.如实施方案95所述的方法，其中所述抗病毒治疗治疗爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)感染。[0444]97.如实施方案95或96所述的方法，其中所述抗病毒治疗包含选自阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和/或缬更昔洛韦的核苷类似物。[0445]98.如实施方案92所述的方法，其中所述与表达nk受体的细胞相关的疾病包括具有异常nk受体表达的非nk细胞恶性肿瘤。[0446]99.如实施方案98所述的方法，其中所述疾病包括塞扎里综合征、成熟t细胞赘生物、t细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病和alk+间变性大细胞淋巴瘤。[0447]100.如实施方案92所述的方法，其中所述与表达nk受体的细胞相关的疾病包括感染。[0448]101.如实施方案100所述的方法，其中所述感染是慢性的。[0449]102.如实施方案100或101所述的方法，其中所述感染是细菌、病毒、真菌、寄生虫和/或节肢动物。[0450]103.如实施方案100-102中任一项所述的方法，其中所述感染由以下各项引起或包括以下各项：葡萄球菌属种、链球菌属种、空肠弯曲杆菌、肉毒杆菌、艰难梭菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、弧菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠状病毒、单纯疱疹病毒1(hsv-1)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、甲型肝炎、诺如病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎、人免疫缺陷病毒(hiv)、单纯疱疹病毒2(hsv-2)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、西尼罗河病毒(wnv)、肠病毒、丙型肝炎、人t淋巴细胞病毒1(htlv-1)、默克尔细胞多瘤病毒(mcv)、hhv8(卡波西肉瘤)、毛癣菌属种、念珠菌属种、贾第鞭毛虫、弓形虫病、蛲虫病、克氏锥虫、棘球蚴病、囊尾蚴病、弓蛔虫病、滴虫病、阿米巴病、加利福尼亚脑炎、基孔肯雅热、登革热、东方马脑炎、波瓦桑病毒、圣路易斯脑炎、西尼罗河病毒、黄热病、寨卡病毒、莱姆病和/或巴贝虫病。[0451]104.如实施方案92所述的方法，其中所述制剂包含表达car的细胞，所述car包括包含nkg2a结合结构域的细胞外组分。[0452]105.如实施方案104所述的方法，其中所述nk细胞相关疾病是癌症。[0453]106.如实施方案105所述的方法，其中所述癌症包括：膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌或皮肤癌；鳞状细胞癌；白血病；急性淋巴细胞性白血病；急性淋巴母细胞性白血病；b细胞淋巴瘤；t细胞淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；毛细胞淋巴瘤；伯克特淋巴瘤；急性骨髓性白血病；慢性骨髓性白血病；早幼粒细胞性白血病；纤维肉瘤；横纹肌肉瘤；骨肉瘤；成神经细胞瘤；神经胶质瘤；星形细胞瘤；神经鞘瘤；黑素瘤；着色性干皮病；角化棘皮瘤；精原细胞瘤；甲状腺滤泡状癌；畸胎癌；t幼淋巴细胞白血病(t-pll)；t细胞型大颗粒淋巴细胞白血病(lgl)；塞扎里综合征(ss)；成人t细胞白血病淋巴瘤(atll)；肝脾t细胞淋巴瘤；外周/胸腺后t细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤；血管中心性(鼻)t细胞淋巴瘤；间变性(ki1+)大细胞淋巴瘤；肠t细胞淋巴瘤；和/或t淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(t-lbly/t-all)。[0454]107.如实施方案92-106中任一项所述的方法，其中与所述施用之前所述受试者中或未施用所述制剂的有需要的参考群体中表达nkg2a抑制性受体的nk细胞的量相比，所述受试者中表达nkg2a抑制性受体的nk细胞的量减少。[0455]108.一种治疗有需要的受试者的自然杀伤(nk)细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：[0456]向所述受试者施用治疗有效量的制剂，[0457]其中所述制剂包含以下细胞：[0458](a)经基因修饰以表达实施方案1-52中任一项所述的car的第一群体，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0459](b)经基因修饰以表达car的第二群体，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域。[0460]109.一种治疗有需要的受试者的自然杀伤(nk)细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：[0461]向所述受试者施用治疗有效量的制剂，[0462]其中所述制剂包含以下细胞：[0463](a)经基因修饰以表达实施方案1-52中任一项所述的car的第一群体，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0464](b)经基因修饰以表达car的第二群体，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域，并且所述细胞内组分缺乏细胞内信号传导结构域。[0465]110.一种治疗有需要的受试者的自然杀伤(nk)细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：[0466]向所述受试者施用治疗有效量的制剂，[0467]其中所述制剂的细胞共表达：[0468](a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0469](b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域。[0470]111.一种治疗有需要的受试者的自然杀伤(nk)细胞相关疾病或与表达nk受体的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：[0471]向所述受试者施用治疗有效量的制剂，[0472]其中所述制剂的细胞共表达：[0473](a)实施方案1-52中任一项所述的car，其中所述细胞外组分包含nkp46结合结构域；和[0474](b)car，其中所述细胞外组分包含nkg2a结合结构域，并且所述细胞内组分缺乏细胞内信号传导结构域。[0475]112.如实施方案108-111中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗病毒治疗或防治。[0476]113.如实施方案112所述的方法，其中所述抗病毒治疗治疗爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)感染。[0477]114.如实施方案112或113所述的方法，其中所述抗病毒治疗包含选自阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和/或缬更昔洛韦的核苷类似物。[0478]115.如实施方案108-114中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含人白细胞抗原(hla)-e或人工hla-e模拟物。[0479]116.如实施方案115所述的方法，其中所述hla-e模拟物包含以下各项的异源三聚体：i)hla-e结合信号肽；ii)成熟β-2微球蛋白(b2m)；和iii)hla-e01:03重链。[0480]117.如实施方案116所述的方法，其中所述hla-e结合信号肽包含：hla-a、hla-b、hla-c或hla-g的信号肽；来自人免疫缺陷病毒(hiv)、巨细胞病毒(cmv)或爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)的肽；多药耐药相关蛋白7的肽；或hsp60的前导肽。[0481]118.如实施方案116或117所述的方法，其中所述hla-e结合信号肽包含如seqidno:127和276-287所示的序列。[0482]119.如实施方案115-118中任一项所述的方法，其中所述hla-e模拟物与如seqidno:242、244或246所示的序列具有至少98％的序列同一性。[0483]120.如实施方案115-119中任一项所述的方法，其中所述hla-e模拟物具有如seqidno:242、244或246所示的序列。[0484]121.如实施方案108-114中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域是源自莫纳利珠单抗、抗体z270、抗体z199、抗体20d5或抗体3s9的scfv。[0485]122.如实施方案121所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含：[0486]重链可变(vh)结构域，所述重链可变(vh)结构域包含：具有如seqidno:213所示序列的cdrh1、具有如seqidno:214所示序列的cdrh2和具有如seqidno:215所示序列的cdrh3；和轻链可变(vl)结构域，所述轻链可变(vl)结构域包含：具有如seqidno:216所示序列的cdrl1、具有如seqidno:217所示序列的cdrl2和具有如seqidno:218所示序列的cdrl3，或[0487]vh结构域，所述vh结构域包含：具有如seqidno:290所示序列的cdrh1、具有如seqidno:291所示序列的cdrh2和具有如seqidno:292所示序列的cdrh3；和vl结构域，所述vl结构域包含：具有如seqidno:293所示序列的cdrl1、具有如seqidno:294所示序列的cdrl2和具有如seqidno:295所示序列的cdrl3，[0488]根据kabat编号。[0489]123.如实施方案121或122所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:219、220、221、222或223所示序列具有至少98％序列同一性的vh结构域。[0490]124.如实施方案121-123中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:219、220、221、222或223所示序列的vh结构域。[0491]125.如实施方案121-124中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含与如seqidno:224、225、226、227或228所示序列具有至少98％序列同一性的重链的抗原结合片段和/或与如seqidno:229所示序列具有至少98％序列同一性的轻链的抗原结合片段。[0492]126.如实施方案121-125中任一项所述的方法，其中所述nkg2a结合结构域包含具有如seqidno:224、225、226、227或228所示序列的重链的抗原结合片段和/或具有如seqidno:229所示序列的轻链的抗原结合片段。[0493]127.如实施方案108-126中任一项所述的方法，其中包含所述nkg2a结合结构域的所述car在表达car的细胞中的表达赋予所述表达car的细胞在所述nk细胞相关疾病中抵抗nk细胞的杀伤的抗性。[0494]128.如实施方案108-127中任一项所述的方法，其中包含所述nkg2a结合结构域的所述car在表达car的细胞中的表达减少所述受试者对所述表达car的细胞的排斥。[0495]129.如实施方案108-128中任一项所述的方法，其中所述nk细胞相关疾病是自身免疫性疾病或同种免疫性疾病。[0496]130.如实施方案129所述的方法，其中所述自身免疫性疾病包括干燥症；抗磷脂综合征；寻常型天疱疮；脊柱关节病；皮肤病，包括牛皮癣；多发性硬化症；系统性硬化症；i型糖尿病；幼年特发性关节炎；类风湿性关节炎；炎症性肠病；自身免疫性肝病；和/或系统性红斑狼疮(sle)。[0497]131.如实施方案129所述的方法，其中所述同种免疫性疾病包括胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症(fnait)；造血干细胞排斥；实体组织移植排斥；和/或肾移植后的慢性同种异体移植物损伤。[0498]132.如实施方案108-131中任一项所述的方法，其中与所述施用之前所述受试者中或未施用所述制剂的有需要的参考群体中表达nkp46活化性受体的nk细胞的量相比，所述受试者中表达nkp46活化性受体的nk细胞的量减少。[0499]133.一种药盒，所述药盒包括：编码实施方案1-52中任一项所述的car的核苷酸序列；实施方案53-66中任一项所述的载体；和/或实施方案67-72中任一项所述的细胞。[0500]134.如实施方案133所述的药盒，所述药盒还包括用于产生所述载体的细胞。[0501]135.如实施方案133或134所述的药盒，其中所述载体是病毒载体。[0502]136.如实施方案134所述的药盒，其中用于产生所述载体的所述细胞包括293细胞、293t细胞和/或a549细胞。[0503]137.如实施方案133-136中任一项所述的药盒，所述药盒还包括培养基、纤连蛋白包被的板、海地美溴铵(聚凝胺)、阳离子脂质体、人工呈递细胞、生长因子和/或抗体。[0504](xvi)实验性实施例.实施例1.本实施例描述了用经基因修饰以表达具有与nkp46结合的细胞外结合结构域的嵌合抗原受体(car)的t细胞靶向自然杀伤(nk)细胞上的活化性nk受体nkp46。本实施例和图2a中描述的car的序列包括seqidno:127、130、133、136、138、140、142、143、146、148、190、193、196、198、201、202、204、205、206、207，208、209、210、211、212、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257和258所示的序列。[0505]nk细胞赘生物，包括nk/t细胞淋巴瘤和侵袭性nk细胞白血病，是罕见的恶性肿瘤。在美国，发病率为0.8/1,000,000，而在南美和亚洲，发病率高出3至10倍。观察到高死亡率，总中位生存期为17至20个月，但复发/难治性nk/t淋巴瘤和侵袭性nk细胞白血病的情况更糟糕。这些恶性肿瘤通常与爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)相关。为了解决这个问题，开发了cart细胞以靶向nk细胞恶性肿瘤。然而，nk细胞不表达统一表达的细胞表面受体，这是nk细胞特有的。nkp46是由许多nk细胞亚群广泛表达的活化性nk受体。报告表明nkp46在90％的nk细胞恶性肿瘤中表达。本研究显示用cart细胞靶向nkp46。[0506]方法：将抗nkp46抗体合成为scfv序列并克隆到含有作为共刺激结构域的4-1bb和下游蓝色荧光蛋白(bfp)报告物的慢病毒(lv)car骨架中(图2a至图2c)。将原代外周血单核细胞(pbmc)用cd3/cd28刺激，用抗nkp46carlv转导，并进行扩增。将cart细胞与用nkp46转导的k-562细胞混合。除非另有说明，否则使用2:1的效应物:靶标比率。通过流式细胞术评估cart细胞功能。通过bfp表达鉴定cart细胞。通过细胞表面cd137的表达和细胞内细胞因子的表达评估cart细胞活化，并与cd19cart细胞进行比较。还通过流式细胞术评定表达nkp46的k562细胞和原代nk细胞的杀伤。[0507]结果：抗nkp46cart细胞从三个不同的供体制备。三个供体中bfp+cart细胞的百分比中位数为56％(范围为53％-65％；图2c)。当暴露于nkp46+靶细胞时，与混合了相同nkp46+靶细胞的cd19cart细胞相比，表达cd137的cart(bfp+)细胞的百分比中位数增加了5倍(范围为4至6倍)(图3a、图3b)。类似地，相对于混合了nkp46+靶细胞的cd19cart细胞，具有细胞内il-2、tnf-α和ifn-γ表达的抗nkp46cart细胞的百分比中位数增加了10.5倍(范围为10至11倍)、11倍(范围为9至13倍)和9倍(范围为7至11倍)(图4a、图4b)。当与cd19+靶细胞混合时，抗cd19cart细胞中的活化显示出与抗nkp46cart细胞相似的cd137活化和细胞因子表达。当混合24小时时，抗nkp46cart细胞能够将nkp46+k562细胞的百分比降低70％(图5)。抗nkp46cart细胞还有效地消耗原代自体nk细胞。抗cd19cart细胞不消耗nkp46+细胞。[0508]将抗nkp46cart细胞与富集nk细胞(40％-50％nk细胞)的自体靶细胞以2:1混合，并且在6小时后通过流式细胞术进行评估。通过对单个表达bfp的活cd3+淋巴细胞进行门控，测量抗nkp46cart细胞中的cd137表达。观测到当与自体nk细胞混合时，抗nkp46cart细胞被活化，如通过抗nkp46cart细胞上cd137表达的上调所测量(图6)。[0509]富集自体靶nk细胞并用细胞示踪剂进行染色，接着与抗nkp46cart细胞、对照cart细胞(抗cd19cart细胞)或模拟t细胞以2car比1靶细胞的比率混合24小时，并且接着通过流式细胞术进行评估。通过对cd3阴性细胞示踪剂橙细胞进行门控来定量nk细胞。观测到抗nkp46cart细胞杀伤自体靶nk细胞(图7)。在抗nkp46cart细胞存在下，nk细胞的百分比在抗nkp46cart细胞存在下降低了72％，而在对照cart细胞(抗cd19car)存在下仅降低了9％。[0510]将富集nk细胞的自体靶细胞与抗nkp46cart细胞以2car细胞:1靶细胞比率混合24小时，并且通过流式细胞术评定细胞内细胞因子表达。观测到自体靶nk细胞通过与抗nkp46cart细胞接触而被活化(图8)。对nk细胞的门控表明，当nk细胞与抗nkp46cart细胞混合时，细胞因子表达增加，但当nk细胞与模拟t细胞或抗cd19cart细胞混合时，细胞因子表达并未增加。表达ifn-γ或tnf-α的nk细胞的百分比增加了2-3倍，而表达il-2的nk细胞的百分比似乎没有增加。ifn-γ或tnf-α是通常由活化的nk细胞产生的细胞因子。[0511]将抗nkp46或抗cd19cart细胞与自体nk细胞混合，并且在6小时通过流式细胞术进行评定。自体nk细胞载有细胞示踪剂，以帮助区分靶细胞。通过对细胞示踪剂阴性细胞(非靶标)、cd3+(非nk细胞)和bfp(car+细胞)进行门控来评估cart细胞。图显示侧向散射(ssc)与bfp。观测到自体靶nk细胞杀伤抗nkp46cart细胞(图9)。在自体靶nk细胞存在下，bfp+抗nkp46cart细胞的百分比下降了35％(10.2％至6.6％)(上图)；而在自体nk细胞存在下，bfp+抗cd19cart细胞的百分比未下降(下图)。抗nkp46cart细胞的下降似乎在表达最多bfp的细胞中最为明显。[0512]已开发出一种有效的基于scfv的第二代抗nkp46car，并在细胞中表达。抗nkp46cart细胞具有功能性，响应于经修饰以表达nkp46受体的靶细胞和自体原代nk细胞显示出强大且特异性的活化、炎性细胞因子释放和细胞杀伤。这种方法可以在体内大量消耗nk细胞。与干细胞移植过程中所完成的类似，通过抗病毒防治，这种风险可能在短期内可控。调节抗nkp46cart细胞或将抗nkp46cart细胞疗法与干细胞移植相结合的技术是解决长期体内nk细胞消耗的潜在途径。[0513]实施例2.本研究表明，表达靶向nkp46(cd335)和nkg2a(cd159a)的两种不同的抗nk细胞car的t细胞对经工程化以表达nkp46的细胞、对nk细胞淋巴瘤细胞系以及对自体原代nk细胞具有特异性和强大细胞毒性。研究表明，cart细胞疗法可用于治疗nk细胞恶性肿瘤。[0514]嵌合抗原受体(car)t细胞疗法在治疗某些难治性血液系统恶性肿瘤方面取得了突破(brentjens等人sci.transl.med.5,177ra38-177ra38(2013)；maude等人n.engl.j.med.371,1507–1517(2014))。抗原逃离cart细胞的选择性压力已有所描述，并激发了针对多个表位的多种策略(shah等人,front.oncol.9,(2019))。为多表位方法提供了额外支持，靶向nk细胞的一个特定障碍是缺乏独特且统一表达的nk细胞表面受体。nkp46是一种活化性受体，其在绝大多数(80％)nk细胞恶性肿瘤上表达(freud等人am.j.clin.pathol.140,853–866(2013))。nkg2a是一种抑制性受体，其在大多数cd3-cd56亮nk细胞上表达，这些细胞包括nk细胞肿瘤的主要亚群(lima,m.pathology(phila.)47,503–514(2015))。因此，开发了靶向nkp46(cd335)和nkg2a(cd159a)的两种不同的抗nk细胞car，两者均来自相同的4-1bb/cd3ζ第二代car构建体，并在体外测试了它们的比活性。[0515]材料和方法.car构建体和病毒载体.先前已描述了含有γ逆转录病毒来源的mnd启动子和mtagbfp报告基因的对照αcd19carprrl载体(sather等人sci.transl.med.7,307ra156(2015))。位于mnd启动子和mtagbfp报告物之间的car构建体包括与cd8a铰链和跨膜结构域融合的抗cd19scfv，接着是细胞内4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。car和mtagbfp报告物被t2a自裂解肽分隔开。为了产生αnkp46car，从由innatepharmas.a.开发的靶向nkp46的抗体合成scfv(αnkp46scfv包括如seqidno:206所示的序列并且/或者由seqidno:248所示的序列编码，如本文所公开)。将scfv编码序列通过idt(integrateddnatechnologies,coralville,ia)合成，并且随后克隆以替代对照载体中的抗cd19scfv。αnkp46car如seqidno:249所示并且/或者由如seqidno:250所示的序列编码，如本文所公开。为了产生αnkg2acar，以同样方式通过idt合成编码先前描述的hla-e/b2m/g肽三聚体(gornalusse等人nat.biotechnol.35,765–772(2017))的序列并且克隆以替代抗cd19mtagbfpcar构建体的scfv、cd8铰链和跨膜结构域。hla-e/b2m/g肽三聚体包括seqidno:242并且/或者由如seqidno:243所示的序列编码。αnkg2acar包括如seqidno:251所示的序列并且/或者由如seqidno:252所示的序列编码。[0516]通过将从sinobiologics(ncbirefseqbc064806)获得的nkp46重组dna扩增并克隆到sef1a启动子下游和mcherry蛋白直接上游的pcvl骨架中来产生表达nkp46的k562细胞系。转导k562细胞，接着通过磁珠分离来富集。在慢病毒生产之前，通过限制消化和测序对所有新载体进行验证。使用prrl-mnd-cd19-gfplv载体转导用作对照的gfp+cd19表达性k562细胞。[0517]原代细胞、细胞系培养.原代t细胞和nk细胞获自匿名供血者。pbmc是先前从西雅图儿童全球传染病中心(经西雅图儿童研究所的机构审查委员会批准)的供体分离的冷冻保存的pbmc，或从astartebiologics(bothell,wa)购买。使用人泛t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec,bergischgladbach,germany)通过阴性分离来分离t细胞。将t细胞和pbmc在补充有20％胎牛血清(gibco,waltham,ma)、1x20mmglutamax补充剂(gibco)、1x1mn-2-羟乙基哌嗪-n’‑2-乙基磺酸(hepes)(gibco)、55μm2-巯基乙醇(gibco)和青霉素/链霉素(gibco)的由rpmi-1640制成的t细胞培养基中培养。将t细胞在补充有50ng/ml的il-2(peprotech,rockyhill,nj)和5ng/ml的il-7(peprotech)和il-15的t细胞培养基中特异性扩增。将细胞保持在1-1.5x106个细胞/ml，并且每1-2天扩增一次。在使用前将储存的pbmc或t细胞在10％二甲基亚砜t细胞培养基中冷冻保存。[0518]将用于共培养的原代nk细胞直接从补充有5％ab血清、500iu/mlil-2和140iu/mlil-15的nkmacs培养基(miltenyibiotec)中的pbmc以4-5x105个细胞/ml扩增，并在使用之前利用nk细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)通过阴性选择进行富集。nk-92mi细胞购自atcc并按推荐培养。将来自atcc的k562细胞在补充有10％胎牛血清、1x20mmglutamax和青霉素/链霉素的rpmi-1640中保持在5-8x105。将所有细胞类型在37℃5％co2下培养。[0519]用car载体对原代t细胞进行慢病毒(lv)转导.将t细胞用cd3/cd28活化珠(gibcodynabeads)以1:1比率刺激48小时。接着将细胞洗涤并在扩增t细胞培养基中静置24-48小时，之后用2-4x104moi的carlv转导。对于每次转导，将细胞以2x106个细胞/ml的密度接种于补充有4μg聚凝胺(sigma-aldrich)的t细胞培养基中。12小时后，加入培养基，调节浓度至1x106个细胞/ml。将细胞逐渐扩增到更大的培养体积以保持最佳密度。在转导后5-7天通过流式细胞术评定bfp表达来测量转导效率，并且在转导后7-9天将细胞用于共培养实验。使用相同的方法产生靶k562-nkp46细胞系。[0520]表面cd137和细胞内细胞因子表达以及细胞毒性测定.进行了三种测定以确定αnkp46和αnkg2acart细胞活化以及针对表达nkp46的k562和原代自体nk细胞的细胞毒活性。cart细胞活化通过cd137表面表达和细胞内细胞因子表达来确定，而细胞毒性通过测量用细胞示踪剂橙或绿(thermofisherscientific,waltham,ma)预染色的靶细胞的百分比下降来确定。为了确定响应于表达nkp46的k562细胞、原代nk细胞和nk92细胞的cart细胞cd137表达，将αnkp46cart细胞、αnkg2a或对照αcd19cart细胞与靶标以2:1的效应物:靶标(e:t)比率在37℃下孵育24小时(k562靶标)或6小时(nk细胞靶标)。接着将细胞洗涤，针对活力(活/死)、cd3(hit3a或okt3)、nkp46(e3)和cd137抗体(4b4-1)(均来自biolegend(sandiego,ca))进行染色，并通过流式细胞术进行分析。为了确定针对表达nkp46的k562和原代nk细胞的细胞内细胞因子表达，将αnkp46cart细胞或对照αcd19cart细胞与靶细胞以2:1e:t比率在37℃下孵育6小时。孵育一小时后，将1000xgolgiplug蛋白转运抑制剂(bdbiosciences,sanjose,ca)添加到共培养物中以阻断细胞因子转运。孵育后，洗涤细胞，针对活力和cd3进行染色，固定和透化，针对il-2(mq1-17h12)、tnfα(mab11)和ifnγ(b27)进行染色，最后通过流式细胞术进行分析。[0521]在捕获αnkp46和αnkg2acar细胞毒性的测定中，将表达nkp46的k562、原代nk细胞用2.5μm细胞示踪剂橙或绿(invitrogen,carlsbad,ca)标记，并以指定e:t比率添加到效应细胞中。共培养24小时后，洗涤细胞，针对活力、cd3和/或nkp46进行染色。靶标溶解百分比计算为[(单独靶细胞下的靶细胞％-具有效应物下的靶细胞％)/具有效应物下的靶细胞％x100]。[0522]对于涉及原代nk细胞的所有测定，将靶标添加到来自含有t细胞的nkmacs培养物的效应细胞(cart细胞)中，至最终效应细胞与nk细胞的比率为2:1。在活化测定中，每次共培养接种2x105个cart细胞。在细胞毒性测定中，以0.5:1至5:1的递增e:t比率将cart细胞添加到5x104个靶细胞中。将所有共培养物以1x106个细胞/ml的密度在37℃下铺板。[0523]分析和统计.在bdlsrii上进行所有流式细胞术。在bdfacsmelody上进行细胞分选。在flowjo中分析所有数据。使用graphpad软件(8.4.2s)进行所有统计分析。[0524]结果.car设计和cart细胞产生.抗nkp46(αnkp46)和抗nkg2a(αnkg2a)car的示意图显示于图10a和图10b中。本研究中测试的所有car构建体都包含下游t2a裂解的bfp报告物。在αnkp46、αnkg2a和对照αcd19car构建体转导后5-9天观测到bfp表达(图10c)。模拟t细胞不接受lv，也不表达bfp。[0525]αnkp46cart细胞强烈活化并杀伤表达nkp46的k562细胞。唯一广泛表征和可接近的nk淋巴瘤细胞系nk92表达高水平的nkg2a+，但表达相对较低水平的nkp46(图12c)。因此，首先针对经修饰以表达nkp46受体的骨髓细胞系k562测试了αnkp46cart细胞。αcd19cart细胞和cd19+k562细胞分别用作阴性对照效应物和靶标。通过流式细胞术确定每个靶细胞系具有其各自靶抗原的接近均一的表面表达(图11a)。[0526]αnkp46cart细胞活化借助于细胞表面cd137和细胞内il-2、tnfα和ifnγ表达来评估。将αnkp46cart细胞与nkp46+、cd19+或非转导(nt)k562细胞以2:1的效应物:靶标比率(e:t)混合24小时(cd137)或6小时(细胞因子)。与对照αcd19cart细胞相比，αnkp46cart细胞响应于nkp46+k562细胞表现出特异性cd137上调(n＝3)以及增加的il-2、ifnγ和tnfα表达(n＝5)(图11b、图11c)。近一半的表达细胞因子的αnkp46cart细胞显示出多功能性(图11d)。通过这两种测定的测量方式，αnkp46和αcd19cart细胞对它们各自的靶标显示出相当的活化水平。[0527]为了确定αnkp46cart细胞的杀伤效率，将模拟或αnkp46cart细胞与nkp46+和cd19+k562细胞的等量混合物以递增e:t比率培养。在24小时共培养后，与模拟t细胞相比，随着αnkp46cart细胞剂量增加，nkp46+k562细胞的特异性溶解显著增加，在5:1e:t比率下接近90％(图11e)。尽管如此，在2:1e:t比率下特异性溶解也保持明显强劲(图11f)。[0528]αnkp46和αnkg2acart细胞响应于nk细胞显示出活化并且溶解nk细胞。αnkp46cart细胞接下来针对nk92细胞进行测试，尽管该细胞系的nkp46表达适中。正如预期的，共培养6小时后，αnkp46cart细胞活化程度极小，显示出轻微的cd137上调，但细胞因子产生没有增加(n＝3，图12d、图12e)。值得注意的是，αnkp46cart细胞中的cd137上调(平均数＝6.13％)仍然是αcd19cart细胞中的6倍(平均数＝1.04％，n＝4)。相比之下，αnkg2acart细胞针对淋巴瘤细胞系显示出cd137和细胞因子表达升高(n＝4，图12d、图12e)。有利于car的且因此次优的nk92共培养条件可能通过抑制nk92存活而无意中降低αnkg2acart细胞活性。尽管如此，近三分之一的产生细胞因子的αnkg2acart细胞是多功能的(图12f)。[0529]鉴于它们以强特异性方式靶向细胞系的能力，αnkp46和αnkg2acart细胞接着针对自体原代nk细胞进行测试。将来自三个供体的pbmc在nk选择培养基(nkmacs,miltenyibiotec,bergischgladbach,germany)中扩增14天，产生主要是nk和t细胞的混合淋巴细胞培养物(图12a)。此时，nk细胞几乎完全表达nkg2a和nkp46(图12b)。观测到以2:1e:t比率共培养6小时后，t细胞消耗的nk细胞培养物活化αnkp46和αnkg2acart细胞，但不活化αcd19cart细胞。cd137上调在αnkp46cart细胞中最高(n＝5；图12d)，而细胞因子产生在αnkg2acar中最高(n＝4；图12e)。与先前测试的细胞系相比，这些自体原代nk细胞产生了相等的(如果不是更大的话)αnkp46和αnkg2acart细胞多功能性(图12f)。[0530]为了进一步确定cart细胞是否可以杀伤nk细胞，将预先标记的混合的nk/t细胞培养物与cart细胞以2:1e:t比率孵育24小时。与αcd19car不同，两种抗nkcar构建体以几乎相同的剂量依赖性趋势降低剩余nk细胞的百分比(图12g)。对于αnkp46(79％杀伤)和αnkg2a(64％杀伤)car，在2:1e:t比率下观测到强大杀伤，相比5:1e:t比率仅分别降低3％和6％(图12e)。[0531]nk细胞活化并溶解αnkp46cart细胞。从理论上讲，接合活化性受体nkp46可以在nk细胞中引发足以杀伤αnkp46cart细胞的细胞毒性反应。此外，已知αnkg2acar的结合结构域hla-e主要结合nkg2a，但也被鉴定为nkg2c(另一种nk细胞活化性受体)的配体(wada等人eur.j.immunol.34,81–90(2004))。因此，进行了实验以评定靶向的nk细胞是否可以引发任一car产物的nkp46和/或nkg2c驱动杀伤。将预先标记的αnkp46或αnkg2acart细胞与自体nk细胞以2:1nk:car比率混合4小时(图13a)。因为将bfp用作car表达的报告物，所以使用添加nk细胞之前和之后表达bfp的细胞的百分比和中位数bfp平均荧光强度(mfi)评定nk介导的cart细胞死亡。[0532]在与自体nk细胞一起培养的αnkp46cart细胞中观测到bfp表达降低12％以及中位数bfpmfi下降15％(图13b至图13d)。αnkg2a和αcd19cart细胞的bfp百分比表达或中位数mfi均未显示出显著变化。因此，集中于αnkp46car，进行了实验以确认car死亡是nk细胞介导的，而不是cart细胞自相残杀的情况，如其他研究中所述(hamieh等人nature568:112-116(2019))。将αnkp46cart细胞与nkp46+k562细胞以2:1e:t比率混合4小时。尽管成功接合k562细胞上的nkp46受体(图11b)，但αnkp46cart细胞的bfp百分比表达或中位数mfi均未显示出显著下降(图13c)。代表性密度图分析显示在添加nk细胞之前和之后αnkp46cart细胞中的bfp表达(图13d)。[0533]当添加自体nk细胞时，bfp亮细胞亚群减少超过50％，这可能表明具有更高表面car密度的αnkp46cart细胞具有更高的溶解敏感性。[0534]此外，同与αcd19cart细胞培养的nk细胞相比，与αnkp46cart细胞培养的nk细胞显示tnfα表达增加1.8倍，且ifnγ表达增加3.5倍(图13e)。[0535]nk细胞恶性肿瘤包括一小部分具有破坏性的血液系统癌症，对于这些癌症有效的治疗方案有限。近年来，cart和carnk细胞对t细胞和b细胞肿瘤有效力，但这项工作首次证明了t细胞可以经工程化而以相当的效率杀伤nk细胞。结合cart细胞过去的临床成功，这项工作鼓励将这些细胞用于治疗这些灾难性的nk细胞恶性肿瘤。[0536]我们通过设计两种靶向nk细胞受体nkp46和nkg2a的替代car构建体来解决nk细胞异质性和抗原特异性的问题。现有数据表明，大多数nk恶性肿瘤表达这些受体中的一者或两者。值得注意的是，nkp46是活化性受体，而nkg2a促进抑制性信号。此外，αnkp46car采用更传统的基于scfv的设计，而αnkg2acar利用合成配体hla-e，该配体的免疫原性可能较低。尽管如此，也应该可以使用基于scfv的构建体来靶向nkg2a。同时靶向每一受体，无论是使用两个单独的效应物，还是作为单一双重cart细胞产物，都具有减轻抗原流失和肿瘤逃逸的潜在优势(majzner和mackall.cancerdiscov.8,1219–1226(2018))。[0537]靶向活化性nk受体nkp46的一个不可预见的结果是nk细胞活化和对αnkp46cart细胞的中等(12％-15％)细胞毒性。同时用αnkg2acar靶向抑制性nkg2a受体可以减轻这种影响，同时还具有上述双重特异性的优势。在另一方面，单独的hla-e配体可能会在开发现成的疗法中带来好处，因为同种异体cart细胞产物消耗hla-a和hla-b但过表达hla-e可以避免宿主t和nk细胞介导的排斥(gornalusse等人nat.biotechnol.35,765–772(2017)；torikai等人blood122,1341–1349(2013))。总之，双重αnkg2a/αnkp46car具有如下益处：1)拓宽靶标范围，2)最大限度地减少肿瘤逃逸的机会，以及3)支持开发一种易于获得且成本更低的现成抗nkcart细胞疗法。[0538]除了cart细胞疗法出现的炎症并发症外(neelapu等人nat.rev.clin.oncol.15,47–62(2018))，抗nk细胞cart细胞的重大的中靶/肿瘤外毒性是可以预料的。大约5％-15％的pbmc是nk细胞。这些细胞将被有效的抗nk细胞cart细胞疗法半永久性地消耗掉。这类似于αcd19cart细胞疗法，该疗法导致b细胞发育不全。然而，低丙种球蛋白血症可以通过免疫球蛋白替代疗法来控制。患有先天性nk细胞缺陷或功能障碍的个体处于疱疹病毒和人乳头瘤病毒感染的高风险中(mace和orange.immunol.rev.287,202–225(2019))，缓解策略包括防治性抗病毒药物和/或免疫刺激疗法(orange,j.s.j.allergyclin.immunol.132,515–525(2013))。靶标nkg2a也存在于一小部分cd8+t细胞上(braud等人trendsimmunol.24,162–164(2003))，但其临床意义尚不明确。[0539]除nk恶性肿瘤外，抗nkcart细胞在研究和治疗应用上也有潜力。hla-e在多种肿瘤中显著过表达，其同源抑制性受体nkg2a在肿瘤浸润性nk和cd8+t细胞上的表达与不良预后有关(kamiya等人j.clin.invest.129,2094–2106(2019))。因此，已开发了靶向该nkg2a-hla-e轴的识别检查点抑制剂(kamiya等人j.clin.invest.129,2094–2106(2019)；vanhall等人j.immunother.cancer7,263(2019))。与类似的单克隆抗体相比，αnkg2acart细胞会直接消耗受阻抑的细胞，可能更有效地消耗抑制性nk和t细胞，从而改造肿瘤微环境，同时受益于更长的半衰期和更好的肿瘤浸润。与非基于细胞的方法一样，这种策略将具有广泛的临床适用性。[0540]总之，这项研究表明，cart细胞可以经工程化来杀伤nk细胞。靶向两种不同的nk受体是有效的，并且在同时使用时具有实际优势。在临床环境中，中靶毒性是可以预期的并且是可以治疗的，但最终这种风险会被对晚期nk细胞恶性肿瘤新治疗方案的迫切需要所平衡。因此，本研究提供了用于抗nkcart细胞治疗的有效组合物和方法。[0541](xvii)结束段落.本文所提供的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基和氨基酸残基的字母缩写示出的，该字母缩写如在37cfr§1.822中所定义以及在wipo标准st.25(1998)附录2表1和表3中的表格中所列出。仅示出每个核酸序列的一条链，但互补链应被理解为包括在合适的实施方案中。[0542]seqidno:128、129、131、132、134和135所示的核苷酸序列已使用从万维网bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html处获得的序列操作套件：reversetranslate以及从万维网genscript.com/tools/codon-frequency-table处获得的人密码子使用表进行反向翻译。reversetranslate接受一个氨基酸序列作为输入，并生成一个核苷酸序列，该序列表示鉴于所提供的密码子使用表(“最可能的密码子”)的最可能的非简并编码序列。还返回源自每个氨基酸的所有可能密码子的共有序列(“共有密码子”)。如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性地结合”或“特异性结合”或“特异性地靶向”描述了一个分子以比背景结合更大的结合亲和力与另一个分子结合。如果结合结构域(例如，包含结合结构域的car的结合结构域)以例如大于或等于105m-1的亲和力或ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，以1/m为单位)结合或缔合靶分子，则该结合结构域“特异性地结合”靶分子。在特定实施方案中，结合结构域(或car)以大于或等于106m-1、107m-1、108m-1、109m-1、1010m-1、1011m-1、1012m-1或1013m-1的ka结合靶标。“高亲和力”结合结构域是指ka为至少107m-1、至少108m-1、至少109m-1、至少1010m-1、至少1011m-1、至少1012m-1、至少1013m-1或更大的那些结合结构域。[0543]可替代地，亲和力可以被定义为以m为单位的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)(例如，10-5m至10-13m，或更低)。根据本公开的结合结构域和car蛋白的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过竞争性elisa(酶联免疫吸附测定)，或通过结合缔合，或使用标记配体的置换测定，或使用表面等离子体共振装置(如可从biacore,inc.,piscataway,n.j.获得的biacoret100)或光学生物传感器技术(如分别可从corning和perkinelmer获得的epic系统或enspire)(另见，例如，scatchard等人(1949)ann.n.y.acad.sci.51:660；us5,283,173；us5,468,614)。[0544]在特定实施方案中，特异性结合的亲和力是背景结合的2倍、背景结合的5倍、背景结合的10倍、背景结合的20倍、背景结合的50倍、背景结合的100倍，或背景结合的1000倍或更多。[0545]如本文所用，“源自”指示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源限制。例如，在源自cd3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的cd3ζ结构，使得它具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它并不暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，这并不意味着，为了提供细胞内信号传导结构域，必须从cd3ζ序列开始并缺失不需要的序列，或者施加突变，以达成细胞内信号传导结构域。[0546]本文所公开的每个实施方案可包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：该每个实施方案的特别陈述的要素、步骤、成分或组分。因此，术语“包括(include/including)”应解释为叙述：“包含(comprise)、由……组成或基本上由……组成”。过渡性术语“包含/包括(comprise/comprises)”意思指具有、但不限于以及允许包括未说明的要素、步骤、成分或组分，即使是呈较大量也是如此。过渡性短语“由……组成”不包括未说明的任何要素、步骤、成分或组分。过渡性短语“基本上由……组成”将实施方案的范围局限于所说明的要素、步骤、成分或组分以及不会实质上影响该实施方案的那些。实质影响会导致细胞表达car以与nk细胞表面标志物结合并靶向表达nk细胞表面标志物的细胞的能力显著降低。[0547]除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所使用的表示成分的数量、特性如分子量、反应条件等的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求中所陈述的数值参数都是近似值，所述近似值可根据本发明寻求获得的所希望的特性而变化。在最低限度上，并且不试图将等同原则的应用局限于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通四舍五入技术来解释。更确切地说，当与所陈述的数值或范围结合使用时，术语“约”具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即，表示略大于或略小于所陈述的值或范围，在所陈述值的±20％范围内；在所陈述值的±19％范围内；在所陈述值的±18％范围内；在所陈述值的±17％范围内；在所陈述值的±16％范围内；在所陈述值的±15％范围内；在所陈述值的±14％范围内；在所陈述值的±13％范围内；在所陈述值的±12％范围内；在所陈述值的±11％范围内；在所陈述值的±10％范围内；在所陈述值的±9％范围内；在所陈述值的±8％范围内；在所陈述值的±7％范围内；在所陈述值的±6％范围内；在所陈述值的±5％范围内；在所陈述值的±4％范围内；在所陈述值的±3％范围内；在所陈述值的±2％范围内；或在所陈述值的±1％范围内。[0548]尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有由在其各自的测试测量中所发现的标准偏差而必然引起的一定误差。[0549]除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种”、“所述”以及类似指代语应解读为涵盖单数和复数指代语。本文中列举的值的范围仅意图充当个别地提到在该范围内的每个独立值的速记方法。除非本文另外指示，否则每一个别值都被并入本说明书中，就如同在本文中个别地叙述该值一样。除非本文另外指示或另外明显与上下文矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何适合的次序执行。本文所提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。[0550]本文所公开的本发明的替代性要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每个群组成员都可个别地或与该群组其他成员或本文中发现的其他要素以任何组合形式被提到和要求保护。可预见的是，出于简便和/或可专利性的原因，一个群组的一个或多个成员可包括在所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，认为本说明书含有如此修改的组，因此满足关于所附权利要求中使用的所有马库什组(markushgroup)的书面描述。[0551]本文描述了本发明的某些实施方案，包括本发明人所知的用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域普通技术人员在阅读前面的描述后将容易了解这些所描述的实施方案的变化形式。发明人希望熟练的技术人员在适当时可使用这些变化形式，而且发明人意图以除本文具体描述的方式以外的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律所容许的对所附权利要求中所述主题的所有修改和等效内容。此外，除非本文另外指示或另外明显与上下文矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。[0552]此外，在本说明书通篇，参考了众多的专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文中的参考材料)。每一参考材料关于它们的参考教义单个地以引用的方式整体并入本文。[0553]应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代配置。因而，本发明不限于明确显示和描述的实施方案。[0554]本文示出的细节是作为举例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且呈现这些细节旨在提供被认为是本发明各个实施方案的原理和概念方面的最有用和最易理解的描述的内容。就这一点而言，除对于基本理解本发明所必需的内容之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，而是结合附图和/或实施例进行描述，以使本领域技术人员易于了解如何能在实践中体现本发明的若干形式。[0555]除非在以下实施例中清晰地且明确地作出修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意图并且旨在控制任何未来的构建。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(webster'sdictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典如生物化学和分子生物学牛津字典(attwoodt等人编辑,oxforduniversitypress,oxford,2006)中取得。当前第1页12当前第1页12