改性明胶的制作方法

本发明涉及改性明胶、制备改性明胶的方法、水凝胶、制备水凝胶的方法和适用于制备水凝胶的试剂盒(kit)。

背景技术：

1、水凝胶是能够吸收大量水和/或生物体液的三维亲水性聚合物网络。由于它们的高含水量、多孔性和柔软一致性，它们与天然的活组织非常相似。

2、水凝胶可用于许多领域—隐形眼镜、伤口敷料、药物递送系统、组织工程和卫生产品中。一些水凝胶可用作有效的基质平台以将细胞包封在3d细胞培养物中。

3、合成聚合物和天然来源的生物聚合物是被广泛研究的水凝胶前体类型之一。一般来说，合成凝胶基质可以容易地在机械强度和降解速率方面进行优化。然而，合成聚合物支架如聚(乙二醇)衍生的水凝胶(基于peg)缺乏生物功能性并且不与细胞相互作用。相比之下，天然来源的生物材料诸如胶原、明胶、纤维蛋白和透明质酸能够提供细胞相互作用位点，但是，由于水凝胶网络中孔网尺寸(mesh size)分布较宽，可能会产生较弱的机械性能。对于明胶中的α1和α2链，沿生物聚合物骨架的交联节点之间的距离范围宽，导致三维网络中的机械性能变得不均匀。显然，需要兼具生物功能和合成化学控制的材料。重组明胶提供了控制和细胞相互作用的优选组合。

4、一种广泛使用的形成水凝胶的方法基于光引发自由基聚合。主要使用以下物质中的丙烯酸酯部分：聚(乙二醇)二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯化的生物聚合物如明胶、透明质酸和葡聚糖。通过添加光引发剂并曝光，引发聚合并形成水凝胶网络。当暴露于自由基时，(甲基)丙烯酸酯通过链生长机制交联为成百上千个单体长度的链，导致网络不均匀、交联后水凝胶收缩和光学混浊。作为这种聚合方法的缺点之一，我们发现所使用的曝光强度是决定所得水凝胶机械性能的关键。在固定的总曝光条件下，低强度长时间曝光与高强度短时间曝光相比，甲基丙烯酸化的(重组)明胶的最终水凝胶压缩模量的变化超过2倍。低强度导致最柔软的水凝胶并且还导致非常明显的水凝胶混浊。最高曝光强度导致最高刚性连同可接受的光学透明度。显然，当需要在聚合之前包封细胞时，高(uv)曝光并不是优选的。细胞活力可能会受损害。

5、替代地，在光引发自由基聚合方法中，使用硫醇和烯烃(具有一个或多个烯属不饱和基团，又名“烯”)的混合物作为前体是有益的。添加硫醇前体使反应具有与单独的(甲基)丙烯酸酯的情形不同的特性并具有许多重要优点。硫醇-烯自由基反应在水凝胶形成期间不易受氧抑制的影响。光聚合动力学比甲基丙烯酸酯的光聚合动力学更快，并且聚合需要较少的光引发剂来完成。与单独使用丙烯酸酯的链生长机制相反，硫醇-烯网络是通过逐步生长机制形成的，导致网络均匀且凝胶后收缩可忽略不计。这是有益的，因为它应该导致细胞对水凝胶的机械信号的响应变化较小。此外，在某种应用需要水凝胶包封的蛋白和/或生长因子的情况下，这些分子被硫醇-烯光聚合破坏的程度远低于(甲基)丙烯酸酯作为唯一前体类型时的破坏程度。

6、然而，光化学交联可能不是最优选的选项可能有多种原因。对于大体积，光路长度可能会变得太长，从而导致曝光强度不均匀。体内应用靶标位点可能会阻挡光线到达样品。需要被包封的细胞类型可能对所需的瞬态光自由基过于敏感，或者最终用户可能没有所需的曝光设备或不方便使用所需的曝光设备。在这类情况下，有必要同时使用细胞相容的点击型反应。

7、通过使用硫醇化合物和含缺电子“烯”的化合物如丙烯酸酯的组合作为水凝胶前体，得到形成水凝胶的优选的点击型反应。由于低分子量的含硫醇的化合物通常表现出令人不快的气味并且通常对细胞有毒，因此优选将硫醇共价地锚接在大分子量(生物)聚合物上以防止气味和细胞毒性。另一方面，含“烯”的化合物通常没有气味并且可以使用低分子量的前体。然而，已知分子量小于3,000道尔顿的含丙烯酸酯的化合物表现出显著的细胞毒性。这将此类交联剂的使用限制在无包封细胞的应用中。

8、在一些实施方案中，优选避免使用包含聚(乙二醇)的合成交联剂，而是用缺电子“烯”如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、马来酰亚胺或乙烯基砜来改性明胶或多糖。如本领域已知，甲基丙烯酰胺或甲基丙烯酸酯基团的添加是使用水溶液中的甲基丙烯酸酐以高产率完成的。这样的生物聚合物型交联剂则通常具有高分子量。此类交联剂的实例是重组明胶(rg)、透明质酸(ha)、硫酸乙酰肝素(hs)、肝素(hp)、硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素(ds)和硫酸角质素(ks)的甲基丙烯酸酯化型式。这种生物聚合物交联剂的官能度通常高于4。在一些实施方案中，官能度可以为至少10。

9、在本发明的一个优选的实施方案中，通过硫醇与缺电子“烯”之间的硫醇-迈克尔加成反应形成水凝胶，而不使用光引发剂。

10、wo2008/103041描述了用于以下的重组明胶：涉及细胞附着的应用，例如细胞培养工作；涉及锚地依赖细胞的细胞培养的应用；以及各种医学应用。细胞附着在医疗应用中起着重要作用，这类应用诸如伤口治疗(包括人造皮肤材料)、骨骼和软骨(再)生长、植入和人造血管材料以及细胞附着受体的阻断。

技术实现思路

1、现已发现可对重组明胶诸如wo2008/103041中描述的重组明胶进行改性，以提供具有有用性能的材料，所述有用性能包括用作制备新型水凝胶的水溶性聚合物。

2、本发明提供以下发明。

3、(1)改性明胶，其包含：

4、(a)赖氨酸残基；和

5、(b)包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基；

6、其中所述改性明胶包含至少50μmol/g组分(b)和总共至少450μmol/g组分(a)和(b)。

7、(2)根据(1)所述的改性明胶，其包含平均距离为17个氨基酸且距离标准偏差为12个氨基酸的组分(a)和(b)。

8、(3)根据(1)或(2)所述的改性明胶，其中(a)型组分之间、(b)型组分之间、以及(a)型与(b)型组分之间的距离标准偏差小于14个氨基酸残基。

9、(4)根据(1)至(3)中任一项所述的改性明胶，其重均分子量为15,000至80,000道尔顿。

10、(5)根据(1)至(4)中任一项所述的改性明胶，其等电点为至少5。

11、(6)根据(1)至(5)中任一项所述的改性明胶，其中相对于重组明胶中存在的氨基酸总数，rgd基序的百分比为至少0.4％。

12、(7)根据(1)至(6)中任一项所述的改性明胶，其每250个氨基酸包含至少两个rgd序列。

13、(8)根据(1)至(7)中任一项所述的改性明胶，其不含半胱氨酸。

14、(9)制备改性明胶的方法，其包括使包含至少450μmol/g赖氨酸的重组明胶与硫醇化剂(thiolating agent)反应，其中所述改性明胶包含至少50μmol/g衍生自硫醇化剂的硫醇基团。

15、(10)根据(9)所述的方法，其中所述硫醇化剂包括2-亚氨基硫杂环戊烷、和/或dl-n-乙酰高半胱氨酸硫内酯、和/或其盐。

16、(11)可通过根据(9)或(10)的方法得到的改性明胶。

17、(12)水凝胶，其可通过使用点击反应使根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶与交联剂反应得到。

18、(13)水凝胶，其可通过根据(12)所述使改性明胶反应得到，其中所述点击反应为硫醇-迈克尔加成反应。

19、(14)根据(12)或(13)所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少两个烯属不饱和基团。

20、(15)根据(12)或(13)或(14)所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少一个马来酰亚胺基团。

21、(16)根据(12)至(15)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少一个马来酰亚胺基团和至少一个丙烯酸酯基团。

22、(17)根据(12)至(16)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂包含一个且仅一个马来酰亚胺基团和一个且仅一个丙烯酸酯基团。

23、(18)根据(12)至(17)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂的mw为2,000至30,000道尔顿。

24、(19)根据(12)至(18)中任一项所述的水凝胶，其中添加到改性明胶中的交联剂的摩尔数不足以与改性明胶中存在的所有硫醇基团反应。

25、(20)根据(12)至(19)中任一项所述的水凝胶，其中添加到改性明胶中的交联剂的摩尔数足以与改性明胶中存在的至多95％的硫醇基团反应。

26、(21)根据(12)至(20)中任一项所述的水凝胶，其包含0.5至15μmol/g硫醇基团。

27、(22)根据(12)至(21)中任一项所述的水凝胶，其包含65重量至97.5重量％的水。

28、(23)根据(12)至(21)中任一项所述的水凝胶，其具有至多10重量％的固体含量。

29、(24)制备水凝胶的方法，其包括使用点击反应使根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶与交联剂反应。

30、(25)试剂盒(kit of parts)，其包括：

31、a.根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶；和

32、b.交联剂。

33、(26)根据(25)所述的试剂盒，其中所述交联剂包含一个且仅一个马来酰亚胺基团和一个且仅一个丙烯酸酯基团。

34、(27)根据(25)或(26)所述的试剂盒，其还包括用交联剂使改性明胶交联的说明书。