控制分生组织大小以改良作物的方法与流程

本发明涉及用于修饰植物中的富含亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶(leucinerich repeat receptor like protein kinase,lrr-rlk)基因、任选地用于增加穗行数(kernel row number)的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数的植物。

背景技术：

1、新的植物器官在植物的称为分生组织的生长尖端处起始。在分生组织中维持着未分化干细胞群。在生长期间，分生组织将干细胞分配给新形成的器官，包括种子，同时保留一些干细胞以连续维持分生组织。已经描述了几种保守的分子机制，其控制干细胞群的大小以确保组织化生长和适当的分生组织大小。

2、由于玉米穗发育的模块化性质，较大的分生组织倾向于启动更多的花，因此，分生组织大小对穗行数和产量具有直接影响。在玉米穗的发育期间启动的花的数量直接限制了谷粒产量。围绕穗周围启动的花的增加数量(穗行数或krn)是在玉米驯化期间选择的一个主要性状。通过育种的显著进步已经导致了穗行数的急剧增加，从作为玉米先辈的teosinte中的2行，到现代优秀玉米品种中的～8-20行。在各种玉米品系中，穗行数可以高达36。

3、在模型植物拟南芥中描述的经典调控途径中，分生组织顶点中的细胞分泌clavata3(clv3)肽，其移动通过质外体进入中心干细胞结构域，在那里它与包括clavata1(clv1)和clavata2(clv2)的若干富含亮氨酸受体(leucine rich receptors，lrr)相互作用。这种受体-配体相互作用刺激信号传导，其最终起到降低wus表达和限制干细胞群扩增的作用。wus的靶标之一是clv3基因本身，通过这种方式，wus起到限制其自身表达并维持干细胞稳态的作用(fletcher,j.c.,plants 7:87(2018))。

4、clv1、clv2或clv3中功能损失突变(loss of function mutations)导致wus结构域的扩增和增加的分生组织大小(schoof等人,cell 100:635–644(2000))。这种分生组织大小的增加常常导致异常的植物生长，因为分生组织不受控制地扩张并且变得紊乱，这种现象被称为扁化(fasciation)(je等人,nat genet 48:ng.3567(2016a))。重要的是，较大的分生组织不仅制造较大的器官，而且围绕较大区域的器官数量增加。由于分生组织大小和器官数目之间的这种关系，玉米clv-wus信号传导基因中的突变能够导致增加的花数目和产量。

5、在拟南芥和番茄中已经描述了几个显性阴性clv1等位基因，其中单个氨基酸的变化使激酶结构域失去功能。这些激酶死亡蛋白继续与受体蛋白复合物中的其他因子相互作用，但不介导下游信号传导，因为它们磷酸化下游靶标的能力受损。该突变蛋白对信号传导具有显性作用，因为它与野生型clv1受体以及可能与clv1功能重叠的其他lrr-rlk竞争。

6、需要用于调节分生组织大小的新的遗传显性的策略以改善杂交作物性能。

技术实现思路

1、本发明的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在编码lrr-rlk蛋白的内源富含亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶(leucine rich repeat receptor likeprotein kinase,lrr-rlk)基因中的至少一个突变。

2、本发明的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)crispr-cas效应子蛋白；和(b)指导核酸(grna、gdna、crrna、crdna、sgrna、sgdna)，其包含与编码lrr-rlk蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。

3、本发明的第三方面提供了在lrr-rlk基因内包含至少一个突变的玉米植物细胞，所述突变导致无效等位基因、显性阴性等位基因、半显性等位基因、亚效突变或弱的功能损失等位基因，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与所述lrr-rlk基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。

4、本发明的第四方面提供了一种产生/培育无转基因的经过编辑的玉米植物的方法，包括：将本发明的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个突变且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经过编辑的玉米植物。

5、本发明的第五方面提供了一种具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域中种植本发明的两株或更多株植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。

6、本发明的第六方面提供了一种在玉米lrr-rlk蛋白的区域中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码玉米lrr-rlk蛋白的部分的玉米lrr-rlk基因区域，其中所述部分包含与seq id no：117-174的氨基酸序列中的任一个；以及使玉米lrr-rlk基因的区域与编辑系统接触，从而在玉米植物细胞的玉米lrr-rlk蛋白的区域中引入突变；以及在所述lrr-rlk蛋白的所述区域中产生变异。

7、本发明的第七方面提供了一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源lrr-rlk基因内的靶位点，所述内源lrr-rlk基因：包含与seq id no：72-85的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码(a)与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含一个或多个下述基序的序列，所述基序具有：(i)iwhxdzk序列(seq idno:118)，其中w＝v、i或l，x＝r或c，z＝l或v；(ii)nxll序列(seq id no:119)，其中x＝i或v，(iii)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f,(iv)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列,其中x＝f或y,z＝g或s,w＝f、y或i,x1＝i或v,z1＝l或v,并且w1＝l、v或m，和/或(v)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(c)具有seq id no:123-179中任一氨基酸序列的序列的区域，从而在玉米植物细胞的内源lrr-rlk基因中产生编辑并产生在所述内源lrr-rlk基因中包含所述编辑的玉米植物细胞。

8、第八方面提供了一种用于制备玉米植物的方法，其包括：(a)使包含野生型内源lrr-rlk基因的玉米植物细胞群与连接了核酸结合结构域(例如dna结合结构域；例如编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合如下序列，所述序列：(1)与seq id no：72-85的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性，或(2)编码(i)与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含一个或多个下述基序的序列，所述基序具有：a)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，b)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，c)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，d)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或e)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(iii)具有seq idno:123-179的任一氨基酸序列所示的序列的区域；(b)从所述群中选择在野生型内源lrr-rlk基因中包含至少一个突变的玉米植物细胞，其中所述至少一个突变导致无效等位基因、显性阴性等位基因、半显性等位基因、亚效等位基因或弱的功能损失等位基因；和(c)将所选择的植物细胞生长成玉米植物。

9、第九方面提供了用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其包括(a)使包含内源lrr-rlk基因的玉米植物细胞与靶向所述内源lrr-rlk基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合所述内源lrr-rlk基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如dna结合结构域；例如编辑系统)连接，其中所述内源lrr-rlk基因：(i)包含与seq id no：72-85的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)编码与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(iii)编码与包含一个或多个下述基序的序列具有至少90％序列同一性的序列，所述基序具有：a)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，b)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，c)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，d)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或e)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(iv)编码包含具有seq id no:123-179中任一氨基酸序列所示的序列的区域的序列；以产生在所述内源lrr-rlk基因中包含突变的玉米植物细胞，从而产生包含在所述内源lrr-rlk基因中具有突变的至少一个细胞(例如一个或多个)的玉米植物；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述内源lrr-rlk基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源lrr-rlk基因和增加的穗行数的玉米植物。

10、第十方面提供了生产包含具有突变的内源lrr-rlk基因的至少一个细胞(例如一个或多个)的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源lrr-rlk基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源lrr-rlk基因中的靶位点，其中所述内源lrr-rlk基因：(a)包含与seq id no：72-85的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)编码与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)编码与包含一个或多个下述基序的序列具有至少90％序列同一性的序列，所述基序具有：(i)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，(ii)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，(iii)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，(iv)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或(v)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(d)编码包含具有seq id no:123-179的任一氨基酸序列所示的序列的区域的序列，以产生在内源lrr-rlk基因中包含突变的植物细胞，从而生产包含在所述内源lrr-rlk基因中具有突变的至少一个(例如一个或多个)细胞的玉米植物或其部分。

11、本发明的第十一方面提供了生产包含突变的内源lrr-rlk基因并显示增加的穗行数(例如产生具有增加的穗行数的穗，任选地没有实质性减小穗长度，例如与不包含相同lrr-rlk突变的植物的穗相比没有实质性减小穗长度超过30％)的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源lrr-rlk基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源lrr-rlk基因中的靶位点，其中所述内源lrr-rlk基因：(a)包含与seq id no：72-85的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)编码与seq id no：86-100的任何一个氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)编码与包含下述一个或多个基序的序列具有至少90％序列同一性的序列，所述基序具有：(i)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，(ii)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，(iii)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，(iv)dvxzwgx1z1lw1el(seqid no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或(v)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(d)编码包含具有seq id no:123-179中任一氨基酸序列的序列的区域的序列，从而生产包含具有突变的内源lrr-rlk基因并显示增加的穗行数、任选地没有实质性减小穗长度(例如与不包含相同lrr-rlk突变的植物的穗相比没有实质性减小穗长度超过30％)的玉米植物或其部分。

12、第十二方面提供了一种与lrr-rlk基因中的靶位点结合的指导核酸，所述靶位点：(a)包含与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)具有包含一个或多个下述基序的序列，所述基序具有：(i)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，(ii)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，(iii)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，(iv)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或(v)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(c)包含具有seq id no:123-179中任一氨基酸序列的序列的区域。

13、在第十三方面，提供了一种系统，其包含本发明的指导核酸和与所述指导核酸缔合的crispr-cas效应蛋白。

14、第十四方面提供了一种基因编辑系统，其包含与指导核酸缔合的crispr-cas效应蛋白，其中所述指导核酸包含与内源lrr-rlk基因结合的间隔子序列。

15、在第十五方面，提供了包含含有切割结构域和指导核酸的crispr-cas效应子蛋白的复合物，其中所述指导核酸结合内源lrr-rlk基因中的靶位点，其中所述内源lrr-rlk基因：(a)包含与seq id no：72-85的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)编码与seq id no：86-100的任何一个氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)编码与包含下述一个或多个基序的序列具有至少90％序列同一性的序列，所述基序具有：(i)iwhxdzk(seq id no:118)的序列，其中w＝v、i或l，x＝r或c，并且z＝l或v，(ii)nxll(seq id no:119)的序列，其中x＝i或v，(iii)dfglawxl(seq id no:120)的序列，其中w＝k或r，并且x＝l或f，(iv)dvxzwgx1z1lw1el(seq id no:121)的序列，其中x＝f或y，z＝g或s，w＝f、y或i，x1＝i或v，z1＝l或v，并且w1＝l、v或m，和/或(v)xzwx1gz1(seq id no:122)的序列，其中x＝s或t，z＝a、g或s，w＝v或i，x1＝a或r，z1＝t或s；和/或(d)编码包含具有seq idno:123-179中任一氨基酸序列的序列的区域的序列，其中所述切割结构域切割所述lrr-rlk基因中的靶标链。

16、在第十六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含(a)编码crispr-cas效应子蛋白的多核苷酸，所述crispr-cas效应子蛋白包含切割结构域和(b)结合内源lrr-rlk基因中的靶位点的指导核酸，其中所述指导核酸包含与以下互补并与之结合的间隔子序列：(i)编码与seq id nos:86-100的任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核酸的一部分；(ii)与seq id no:72-85的任一核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列的一部分；和/或(iii)具有seq id no:117-174中任一氨基酸序列的序列的区域。

17、在又一个方面，提供了一种在植物中的内源lrr-rlk基因中产生突变的方法，其包括：将基因编辑系统靶向lrr-rlk基因的包含位于下述位置的至少一个(一个或多个)氨基酸残基的部分：(a)参考seq id no:87的氨基酸位置编号而言第893、918和/或943位；(b)参考seq id no:88的氨基酸位置编号而言第187、203和/或228位；(c)参考seq id no:89的氨基酸位置编号而言第451、467和/或492位；(d)参考seq id no:90的氨基酸位置编号而言第453、469和/或494位；(e)参考seq id no:91的氨基酸位置编号而言第468、484和/或509位；(f)参考seq id no:92的氨基酸位置编号而言第449、465和/或490处；(g)参考seq id no:93的氨基酸位置编号而言第928、944和/或969位；(h)参考seq idno:94或seq id no:96的氨基酸位置编号而言第857、874和/或898位；(i)参考seq id no:95的氨基酸位置编号而言第853、870和/或894位；(j)参考seq id no:97的氨基酸位置编号而言第827、845和/或900位；(k)参考seq id no:98的氨基酸位置编号而言第844、861和/或885位；(l)参考seq idno:99的氨基酸位置编号而言第835、852和/或877位；(m)参考seq id no:100的氨基酸位置编号而言第840、857和/或881位；或(n)参考seq idno:86的氨基酸位置编号而言第839、856和/或881位。并选择在(a)-(n)所示位置处包含备选氨基酸的植物。

18、本发明的另一方面提供了编码玉米lrr-rlk蛋白的无效突变、显性阴性突变(dominant negative mutation)、半显性突变(semi-dominant mutation)、亚效突变(hypomorphic mutation)或弱的功能损失突变(weak loss-of-function mutation)的核酸。

19、在另一方面，提供了包含本发明的核酸的玉米植物或其部分。

20、在另一方面，提供了一种玉米植物或其部分，其产生具有增加的穗行数的穗，任选地没有实质性减小穗的长度。

21、在一些方面，提供了一种玉米植物，其还表现出增加的产量，和改善的疾病抗性，以及表现出更大的分生组织和维持的根分生组织。

22、还提供了在其基因组中包含通过本发明的方法产生的一个或多个突变的富含亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶(lrr-rlk)基因的植物以及用于制备本发明的植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。

23、在下面的本发明描述中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。

24、序列的简要描述

25、seq id no：1-17是可用于本发明的示例性cas12a氨基酸序列。

26、seq id no：18-20是可用于本发明的示例性cas12a核苷酸序列。

27、seq id no：21-22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。

28、seq id no：23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。

29、seq id no：30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。

30、seq id no：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂(ugi)序列。

31、seq id no：42-44提供v型crispr-cas12a核酸酶的原间隔子邻近基序位置的实例。

32、seq id no：45-47提供可用于本发明的示例性肽标签和亲和多肽。

33、seq id no：48-58提供可用于本发明的示例性rna募集基序和相应的亲和多肽。

34、seq id no：59-60是可用于本发明的示例性cas9多肽序列。

35、seq id no：61-71是可用于本发明的示例性cas9多核苷酸序列。

36、seq id nos:72-85是示例性的lrr-rlk多核苷酸序列。

37、seq id nos:86-100是示例性的lrr-rlk多肽序列。

38、seq id no:101-117和seq id no:243-266是可用于本发明的核酸指导的示例性间隔子序列。

39、seq id no:118-122是示例性的lrr-rlk多肽基序。

40、seq id no:123-179是可用于本发明的lrr-rlk多肽的示例性靶区。

41、seq id no:180-193是示例性的经编辑的lrr-rlk多肽。

42、seq id no:194-209是图3中的序列。

43、seq id no:210-224是图4中的序列。

44、seq id no:225-227是图1中的序列。

45、seq id no:228-242是示例性的玉米lrr-rlk基因组序列。