核酸的序列特异性靶向转座和选择以及分选的制作方法

本公开涉及核酸的序列特异性靶向转座。靶向转座体复合物可用于介导序列特异性靶向转座。本公开涉及包括用于评估期望样品的初始测序、选择和重新测序的方法。如本文所述，初始测序可鉴定混合样品池中的感兴趣的样品，并且然后可耗尽不需要的样品，或可基于独特样品条形码富集期望样品。然后可对期望样品进行重新测序。

背景技术：

1、对于许多不同的应用，可能需要靶核酸的选定区域的文库产生。例如，在平台输出受到限制(例如pacbio、ont或iseq)的情况下，需要从基因组dna的选定区域制备文库的能力。此外，当需要非常高的覆盖率时，诸如在液体活检样品中筛选罕见的体细胞突变，用于基因组dna的选定区域的文库是有利的。

2、从基因组dna的选定区域获得文库的当前方法包括基于寡核苷酸杂交的富集试剂盒(例如，truseq exome、用于富集的nextera flex)。此外，最近已经公布了用于生成这种文库的基于crispr的系统。特别地，基于crispr的系统已经用于拉出10-100千碱基的区域，这适合于诸如pacbio和ont的长读技术。

3、本公开描述了基因组dna的期望区域的靶向文库制备的新方式。这些方法以多种独特的方式将不同的靶向技术与转座体结合。此外，本公开描述了从无细胞dna(cfdna)制备靶向文库而不需要在标签化之前移除组蛋白的方法。

4、本公开还描述了可用于解决在研究大量细胞群时难以确定的细胞差异的单细胞分析方法。稀有细胞的表征对于许多用途可能是重要的，诸如在肿瘤学(液体或肿瘤活检、最小残留疾病或早期疾病检测、肿瘤进化或肿瘤抗性)、免疫学(免疫或t细胞受体库)和宏基因组学(不可培养的生物体基因组组装)中。图1提供了可能感兴趣的宏基因组学和肿瘤学样品的一些代表性示例，其中稀有细胞是高度感兴趣的。目前的单细胞测序方法能够并行地对数百万个单细胞进行细胞分辨的‘组学’表征，诸如研究单个细胞的基因组学、转录组学或表观基因组学特征部。

5、然而，在没有选择期望样品的情况下，群体中稀有细胞的基于测序的表征是昂贵且具有挑战性的。此外，基于细胞分选的富集方法基于可划分细胞特征部的可用性而受到限制。例如，facs可富集某些细胞大小、形态和表面蛋白表达，但其他特征可能不能被facs划分。基于特定的‘组学’特征部富集细胞(例如基于物种、细胞类型或变体的存在的富集)将是非常有用的。这些特征部可以是先验地(基于现有技术)或从头(通过初始测序分析确定)已知的。通过对初始测序后鉴定为感兴趣的单细胞的样品进行重新测序来进行后续的、全面的/正交的‘组学’表征也是非常有价值的。

6、本文公开了用于从“单细胞测序文库”或“sc文库”选择、富集和基于测序表征单个细胞的dna文库的方法，该“单细胞测序文库”或“sc文库”由包含由不同单细胞生成的文库的多个细胞dna文库组成。可进行sc-文库的初始测序(即，对来自单个细胞的所有dna文库进行测序)，并且可使用生物信息学分析来就感兴趣的特定‘组学’特征部对单个细胞进行分选。使用该方法，通过独特细胞dna条形码(ubc)鉴定由不同的单个细胞生成的文库。用于分选的‘组学’特征部可用相对小的靶向测序组来定义细胞类型(例如表达、表观遗传模式或免疫基因重组)、物种类型(例如使用来自细菌的16s、18s或its rrna/rdna测序)或疾病状态/风险(例如癌症显著的种系或体细胞变体)。换句话讲，初始测序的足迹可能很小，并且重新测序可能更全面，但侧重于感兴趣的细胞。因此，本领域技术人员可使用单个初始测序运行来查询数百万或数十亿个细胞的示例性特征部，以将样品分选成期望样品和不需要的样品，随后对期望样品进行靶向重新测序。

7、另选地，可使用初始测序运行来鉴定用于后续分析的从头示例性‘组学’细胞特征部。例如，初始测序运行可鉴定新的细胞特征部，然后可将该新的细胞特征部用于分选。

8、本方法中的富集或耗尽可通过已知的核酸靶标富集方法(例如杂交捕获、独特样品条形码特异性扩增或crispr消化)进行。然后可对来自感兴趣的细胞的单个细胞dna进行重新测序并从完整的sc-文库中分离表征。因此，本方法可允许在用于分选细胞的初始测序运行之后进行更全面和/或正交的重新测序和分析。

技术实现思路

1、本公开描述了许多不同的靶向转座体复合物，其包含指导转座体复合物结合靶核酸中的一个或多个感兴趣的核酸序列的一个或多个元件。本文还描述了许多使用这些靶向转座体复合物的方法。

2、根据本说明书，还描述了一种表征包含期望样品和不需要的样品两者的样品混合池中的期望样品的方法。

3、实施方案1：一种靶向转座体复合物，包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列；5'衔接子序列；以及用重组酶包被的靶向寡核苷酸，其中所述靶向寡核苷酸能够结合到一个或多个感兴趣的核酸序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补。

4、实施方案2：根据实施方案1所述的转座体复合物，其中所述靶向寡核苷酸的序列与所述一个或多个感兴趣的核酸序列完全或部分互补。

5、实施方案3：根据实施方案1或2中任一项所述的转座体复合物，其中一个或多个靶向寡核苷酸连接至所述衔接子序列的5'端。

6、实施方案4：根据实施方案1至3中任一项所述的转座体复合物，其中一个或多个靶向寡核苷酸直接连接至所述衔接子序列的5'端。

7、实施方案5：根据实施方案1至4中任一项所述的转座体复合物，其中一个或多个靶向寡核苷酸经由接头连接至所述衔接子序列的5'端。

8、实施方案6：根据实施方案1至5所述的转座体复合物，其中所述接头是寡核苷酸接头。

9、实施方案7：根据实施方案1至6所述的转座体复合物，其中所述接头是非寡核苷酸接头。

10、实施方案8：根据实施方案1至7所述的转座体复合物，其中所述衔接子序列的5'端和所述靶向寡核苷酸都是生物素化的并且经由链霉抗生物素蛋白连接。

11、实施方案9：根据实施方案1至8中任一项所述的转座体复合物，其中所述衔接子序列包含引物序列、索引标签序列、捕获序列、条形码序列、切割序列或测序相关序列或它们的组合。

12、实施方案10：根据实施方案1至9所述的转座体复合物，其中所述衔接子序列包含p5或p7序列。

13、实施方案11：根据实施方案1至10中任一项所述的转座体复合物，其中所述重组酶是uvsx、rec233或reca。

14、实施方案12：根据实施方案1至11中任一项所述的转座体复合物，其中所述转座体复合物在溶液中。

15、实施方案13：根据实施方案1至12中任一项所述的转座体复合物，其中所述转座体复合物固定到固体载体。

16、实施方案14：根据实施方案1至13所述的转座体复合物，其中所述固体载体是小珠。

17、实施方案15：一种试剂盒或组合物，包含作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的第一转座体复合物和第二转座体复合物，所述第二转座体复合物包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列和5'衔接子序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补。

18、实施方案16：一种试剂盒或组合物，包含各自作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的两种转座体复合物，其中所述两种靶向转座体复合物包含不同的靶向寡核苷酸。

19、实施方案17：一种靶向生成靶核酸的带5'标签的片段的方法，包括将包含双链核酸的样品和作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的转座体复合物混合；通过所述重组酶启动所述核酸的链侵入；以及通过将所述第一转座子的3'端接合到所述片段的5'端以产生多个带5'标签的片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

20、实施方案18：一种生成带标签的核酸片段的文库的方法，包括将包含双链核酸的样品、作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的第一转座体复合物和第二转座体复合物混合，所述第二转座体复合物包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列和5'衔接子序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补；通过所述重组酶启动所述核酸的链侵入；以及通过将每个第一转座子的3'端接合到所述靶片段的5'端以产生由所述第一转座体复合物生成的多个第一带5'标签的靶片段和由所述第二转座体复合物生成的多个第二带5'标签的靶片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

21、实施方案19：一种生成带标签的核酸片段的文库的方法，包括将包含双链核酸的样品、作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的实施方案1至14中任一项的第二转座体复合物混合；通过所述重组酶启动所述核酸的链侵入；以及通过将每个第一转座子的3'端接合到所述靶片段的5'端以产生由所述第一转座体复合物生成的多个第一带5'标签的靶片段和由所述第二转座体复合物生成的多个第二带5'标签的靶片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

22、实施方案20：根据实施方案17至19中任一项所述的方法或根据实施方案15或实施方案16所述的试剂盒或组合物，其中包含在所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物中的所述5'衔接子序列是不同的。

23、实施方案21：根据实施方案19所述的方法，其中包含在作为靶向转座体复合物的所述第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的所述第二转座体复合物中的所述靶向寡核苷酸是不同的。

24、实施方案22：根据实施方案21所述的方法，其中作为靶向转座体复合物的所述第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的所述第二转座体复合物的所述靶向寡核苷酸结合到靶核酸中给定感兴趣区域中的不同感兴趣序列。

25、实施方案23：根据实施方案22所述的方法，其中作为靶向转座体复合物的所述第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的所述第二转座体复合物的所述靶向寡核苷酸结合到所述双链核酸的相反链。

26、实施方案24：根据实施方案17至23中任一项所述的方法，其中在存在重组酶负载因子的情况下进行通过所述重组酶启动所述核酸的链侵入；任选地其中所述重组酶负载因子在片段化之前被移除或失活。

27、实施方案25：根据实施方案17至24中任一项所述的方法，其中启动链侵入经由置换环形成发生。

28、实施方案26：根据实施方案17至25中任一项所述的方法，其中在所述靶向寡核苷酸与所述一个或多个感兴趣的序列的结合位点的40、30、20、15、10或5个碱基内启动链侵入。

29、实施方案27：根据实施方案17至26中任一项所述的方法，其中用于启动链侵入的温度不同于通过所述转座酶进行片段化的最佳温度。

30、实施方案28：根据实施方案27所述的方法，其中用于启动链侵入的温度低于通过所述转座酶进行片段化的最佳温度。

31、实施方案29：根据实施方案28所述的方法，其中启动链侵入在27℃至47℃处进行。

32、实施方案30：根据实施方案29所述的方法，其中启动链侵入在32℃至42℃处进行。

33、实施方案31：根据实施方案30所述的方法，其中启动链侵入在37℃处进行。

34、实施方案32：根据实施方案28中任一项所述的方法，其中所述片段化在45℃至65℃处进行。

35、实施方案33：根据实施方案32中任一项所述的方法，其中所述片段化在50℃至60℃处进行。

36、实施方案34：根据实施方案33中任一项所述的方法，其中所述片段化在55℃处进行。

37、实施方案35：根据实施方案17至34中任一项所述的方法，其中在启动侵入之后和片段化之前将所述转座酶的辅因子添加到所述转座体复合物中。

38、实施方案36：根据实施方案35所述的方法，其中所述辅因子是mg++。

39、实施方案37：根据实施方案36所述的方法，其中所述mg++浓度为10mm至18mm。

40、实施方案38：根据实施方案17至37中任一项所述的方法，其中所述片段化在由所述靶向寡核苷酸结合的核酸序列中的所述一个或多个感兴趣的序列的40、30、20、15、10或5个碱基内发生。

41、实施方案39：根据实施方案17至38中任一项所述的方法，还包括用聚合酶和连接酶处理所述多个带5'标签的片段以延伸和连接所述链，以产生完全双链带标签的片段。

42、实施方案40：根据实施方案17至39中任一项所述的方法，还包括对所述带5'标签的片段或完全双链带标签的片段中的一者或多者进行测序。

43、实施方案41：一种在对靶核酸进行测序时保留邻接信息的方法，包括根据实施方案17至40中任一项所述的方法产生所述靶核酸的带标签的片段；对所述带5'标签的片段或完全双链带标签的片段进行测序以提供所述片段的序列；将包含相同靶向寡核苷酸的所述序列的片段的序列分组；以及如果一组序列包含相同靶向寡核苷酸的所述序列，则确定它们在所述靶核酸内是接近的。

44、实施方案42：一种在对靶核酸进行测序时保留邻接信息的方法，包括根据实施方案17至40中任一项所述的方法产生所述靶核酸的带标签的片段，其中一个或多个衔接子序列包含与单个靶向寡核苷酸序列缔合的独特分子标识符(umi)；对所述带5'标签的片段或完全双链带标签的片段进行测序以提供所述片段的序列；将包含相同umi的所述序列的片段的序列分组；以及如果一组序列包含相同umi的所述序列，则确定它们在所述靶核酸内是接近的。

45、实施方案43：一种靶向生成核酸的带5'标签的片段的方法，包括使一个或多个靶向寡核苷酸与包含单链核酸的样品杂交，其中所述一个或多个靶向寡核苷酸能够各自结合到所述核酸中的感兴趣的序列；施加转座体复合物，所述转座体复合物包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列和5'衔接子序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补；以及通过将所述第一转座子的3'端接合到所述片段的5'端以产生多个带5'标签的片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

46、实施方案44：根据实施方案43所述的方法，其中使双链dna变性以生成所述单链dna。

47、实施方案45：根据实施方案43至44中任一项所述的方法，其中使靶向寡核苷酸与包含单链核酸的样品杂交生成能够被片段化的双链核酸区域。

48、实施方案46：根据实施方案43至45中任一项所述的方法，其中使两种或更多种具有不同序列的靶向寡核苷酸杂交。

49、实施方案47：根据实施方案43至45中任一项所述的方法，其中使单个靶向寡核苷酸的多个拷贝杂交。

50、实施方案48：根据实施方案47所述的方法，其中所述单个靶向寡核苷酸足够长以允许两个转座体复合物结合到通过使所述单个靶向寡核苷酸与包含单链核酸的所述样品杂交而产生的所述双链核酸。

51、实施方案49：根据实施方案47或实施方案48所述的方法，其中所述单个靶向寡核苷酸包含80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个碱基对。

52、实施方案50：根据实施方案43至49中任一项所述的方法，其中所述片段化在由所述一个或多个靶向寡核苷酸结合的核酸序列中的所述一个或多个感兴趣的序列内发生。

53、实施方案51：根据实施方案43至50中任一项所述的方法，还包括用聚合酶和连接酶处理所述多个带5'标签的片段以延伸和连接所述链，以产生完全双链带标签的片段。

54、实施方案52：根据实施方案43至51中任一项所述的方法，还包括对所述带5'标签的片段或完全双链带标签的片段中的一者或多者进行测序。

55、实施方案53：一种靶向转座体复合物，包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列、5'衔接子序列，以及与指导rna缔合的无催化活性的内切核酸酶，其中所述指导rna能够指导内切核酸酶结合到一个或多个感兴趣的核酸序列；以及第二转座子，包含所述转座子末端序列的互补序列。

56、实施方案54：根据实施方案53所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶结合核酸但不启动切割。

57、实施方案55：根据实施方案53或实施方案54所述的转座体复合物，其中所述指导rna是单指导rna。

58、实施方案56：根据实施方案53至55中任一项所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶与所述转座酶缔合。

59、实施方案57：根据实施方案56所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶连接至所述转座酶。

60、实施方案58：根据实施方案53至57中任一项所述的转座体复合物，其中所述转座酶和所述无催化活性的内切核酸酶包含在crispr相关转座酶中。

61、实施方案59：根据实施方案58所述的转座体复合物，其中所述crispr相关转座酶来自蓝细菌贺氏伪枝藻属(scytonema hofmanni)(shcast)，任选地其中：

62、a.shcast与指导rna偶联，任选地其中所述grna和所述转座酶中的至少一者是生物素化的，并且其中生物素化的所述grna和所述转座酶中的至少一者能够与链霉抗生物素蛋白包被的小珠偶联；

63、b.shcast包含cas12k；

64、c.所述转座酶包含tn5或tn7样转座酶，任选地其中所述第一转座子包含p5衔接子和p7衔接子中的至少一者。

65、实施方案60：根据实施方案57所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶连接至所述转座酶的5'端。

66、实施方案61：根据实施方案57所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶连接至所述转座酶的3'端。

67、实施方案62：根据实施方案57所述的转座体复合物，其中所述转座酶连接至所述无催化活性的内切核酸酶的5'端。

68、实施方案63：根据实施方案57所述的转座体复合物，其中所述转座酶连接至所述无催化活性的内切核酸酶的3'端。

69、实施方案64：根据实施方案53至63中任一项所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶和转座酶包含在融合蛋白中。

70、实施方案65：根据实施方案64所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的和转座酶经由接头连接。

71、实施方案66：根据实施方案53至56中任一项所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶和转座酶包含在单独的蛋白质中。

72、实施方案67：根据实施方案66所述的转座体复合物，其中所述单独的无催化活性的内切核酸酶和转座酶能够经由结合配偶体的配对缔合在一起，其中第一结合配偶体结合到所述无催化活性的内切核酸酶并且第二结合配偶体结合到所述转座酶。

73、实施方案68：根据实施方案67所述的转座体复合物，其中所述结合配偶体是生物素和链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白。

74、实施方案69：根据实施方案55至68中任一项所述的转座体复合物，其中所述单指导rna包含在包含所述第一转座子和/或第二转座子的寡核苷酸中。

75、实施方案70：根据实施方案69所述的转座体复合物，其中所述寡核苷酸包含5'单指导rna和3'第一转座子和/或第二转座子。

76、实施方案71：根据实施方案53至70中任一项所述的转座体复合物，其中所述单指导rna包含少于20个核苷酸。

77、实施方案72：根据实施方案71所述的转座体复合物，其中所述单指导rna序列包含15、16、17、18或19个核苷酸。

78、实施方案73：根据实施方案53至72中任一项所述的转座体复合物，其中所述单指导rna包含发夹二级结构。

79、实施方案74：根据实施方案53至73中任一项所述的转座体复合物，其中所述无催化活性的内切核酸酶是cas9蛋白。

80、实施方案75：根据实施方案74所述的转座体复合物，其中所述cas9蛋白是犬链球菌(streptococcus canis)cas9。

81、实施方案76：根据实施方案53至75中任一项所述的转座体复合物，其中所述犬链球菌cas9具有最小序列约束。

82、实施方案77：一种靶向转座体复合物，包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列；5'衔接子序列；以及锌指dna结合结构域，其中所述锌指dna结合结构域能够结合到一个或多个感兴趣的核酸序列；以及第二转座子，包含所述转座子末端序列的互补序列。

83、实施方案78：根据实施方案77所述的靶向转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域包含在锌指核酸酶中。

84、实施方案79：根据实施方案78所述的靶向转座体复合物，其中所述锌指核酸酶是无催化活性的。

85、实施方案80：根据实施方案77至79中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述一个或多个感兴趣的核酸序列包含在与组蛋白缔合的dna中。

86、实施方案81：根据实施方案80所述的靶向转座体复合物，其中所述与组蛋白缔合的dna是无细胞dna。

87、实施方案82：根据实施方案77至81中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述第一转座子包含亲和力元件。

88、实施方案83：根据实施方案82所述的靶向转座体复合物，其中所述亲和力元件附接到所述第一转座子的5'端。

89、实施方案84：根据实施方案82至83中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述第一转座子包含接头。

90、实施方案85：根据实施方案84所述的靶向转座体复合物，其中所述接头具有附接到所述第一转座子的5'端的第一端和附接到亲和力元件的第二端。

91、实施方案86：根据实施方案77至85中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述第二转座子包含亲和力元件。

92、实施方案87：根据实施方案86所述的靶向转座体复合物，其中所述亲和力元件附接到所述第二转座子的3'端。

93、实施方案88：根据实施方案82至85中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述第二转座子包含接头。

94、实施方案89：根据实施方案88所述的靶向转座体复合物，其中所述接头具有附接到所述第二转座子的3'端的第一端和附接到亲和力元件的第二端。

95、实施方案90：根据实施方案82至89中任一项所述的靶向转座体复合物，其中所述亲和力元件是生物素。

96、实施方案91：根据实施方案77至90所述的靶向转座体复合物，其中所述复合物包含锌指dna结合结构域阵列。

97、实施方案92：根据实施方案77至91所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域与所述转座酶缔合。

98、实施方案93：根据实施方案92所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域连接至所述转座酶。

99、实施方案94：根据实施方案93所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域连接至所述转座酶的5'端。

100、实施方案95：根据实施方案93所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域连接至所述转座酶的3'端。

101、实施方案96：根据实施方案94或95所述的转座体复合物，其中所述转座酶连接至所述锌指dna结合结构域的5'端。

102、实施方案97：根据实施方案94或95所述的转座体复合物，其中所述转座酶连接至所述锌指dna结合结构域的3'端。

103、实施方案98：根据实施方案77至97中任一项所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域和转座酶包含在融合蛋白中。

104、实施方案99：根据实施方案77至98中任一项所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域和转座酶经由接头连接。

105、实施方案100：根据实施方案77至92中任一项所述的转座体复合物，其中所述锌指dna结合结构域和转座酶包含在单独的蛋白质中。

106、实施方案101：根据实施方案100所述的转座体复合物，其中所述单独的锌指dna结合结构域和转座酶能够经由结合配偶体的配对缔合在一起，其中第一结合配偶体结合到所述无催化活性的内切核酸酶并且第二结合配偶体结合到所述转座酶。

107、实施方案102：根据实施方案101所述的转座体复合物，其中所述结合配偶体是(i)生物素和(ii)链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。

108、实施方案103：根据实施方案53至102中任一项所述的转座体复合物，其中所述衔接子序列包含引物序列、索引标签序列、捕获序列、条形码序列、切割序列或测序相关序列或它们的组合。

109、实施方案104：根据实施方案53至103所述的转座体复合物，其中所述衔接子序列包含p5或p7序列。

110、实施方案105：根据实施方案53至104中任一项所述的转座体复合物，其中所述转座体复合物在溶液中。

111、实施方案106：根据实施方案53至105中任一项所述的转座体复合物，其中所述转座体复合物固定到固体载体。

112、实施方案107：根据实施方案106所述的转座体复合物，其中所述固体载体是小珠。

113、实施方案108：一种试剂盒或组合物，包含作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的第一转座体复合物和第二转座体复合物，所述第二转座体复合物包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列和5'衔接子序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补。

114、实施方案109：根据实施方案108所述的试剂盒或组合物，包含各自作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的两种转座体复合物，其中所述两种靶向转座体复合物包含不同的指导rna。

115、实施方案110：一种试剂盒或组合物，包含各自作为靶向转座体复合物的实施方案108或109中任一项的两种转座体复合物，其中所述两种靶向转座体复合物包含不同的锌指dna结合结构域。

116、实施方案111：一种靶向生成靶核酸的带5'标签的片段的方法，包括将包含双链核酸的样品和作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的转座体复合物混合；以及通过将所述第一转座子的3'端接合到所述片段的5'端以产生多个带5'标签的片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

117、实施方案112：一种生成带标签的核酸片段的文库的方法，包括将包含双链核酸的样品、作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的第一转座体复合物和第二转座体复合物混合，所述第二转座体复合物包含转座酶；第一转座子，包含3'转座子末端序列和5'衔接子序列；以及第二转座子，包含5'转座子末端序列，其中所述5'转座子末端序列与所述3'转座子末端序列互补；以及通过将每个第一转座子的3'端接合到所述靶片段的5'端以产生由所述第一转座体复合物生成的多个第一带5'标签的靶片段和由所述第二转座体复合物生成的多个第二带5'标签的靶片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

118、实施方案113：一种生成带标签的核酸片段的文库的方法，包括将包含双链核酸的样品、作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的实施方案53至107中任一项的第二转座体复合物混合；以及通过将每个第一转座子的3'端接合到所述靶片段的5'端以产生由所述第一转座体复合物生成的多个第一带5'标签的靶片段和由所述第二转座体复合物生成的多个第二带5'标签的靶片段，通过所述转座酶将所述核酸片段化成多个片段。

119、实施方案114：根据实施方案111至113中任一项所述的方法，其中所述第一靶向转座体复合物和/或第二靶向转座体复合物包含锌指dna结合结构域。

120、实施方案115：根据实施方案114所述的方法，其中所述锌指dna结合结构域包含在锌指核酸酶中。

121、实施方案116：根据实施方案115所述的方法，其中所述锌指核酸酶是无催化活性的。

122、实施方案117：根据实施方案111至116中任一项所述的方法，其中包含在所述靶向转座体复合物中的所述第一转座子包含亲和力元件。

123、实施方案118：根据实施方案117所述的方法，其中所述亲和力元件附接到所述第一转座子的5'端。

124、实施方案119：根据实施方案118中任一项所述的方法，其中包含在所述靶向转座体复合物中的所述第一转座子包含接头。

125、实施方案120：根据实施方案119所述的方法，其中所述接头具有附接到所述第一转座子的5'端的第一端和附接到亲和力元件的第二端。

126、实施方案121：根据实施方案111至120中任一项所述的方法，其中所述第二转座子包含亲和力元件。

127、实施方案122：根据实施方案121所述的方法，其中所述亲和力元件附接到所述第二转座子的3'端。

128、实施方案123：根据实施方案121所述的方法，其中所述第二转座子包含接头。

129、实施方案124：根据实施方案123所述的方法，其中所述接头具有附接到所述第二转座子的3'端的第一端和附接到亲和力元件的第二端。

130、实施方案125：根据实施方案117至124中任一项所述的方法，其中所述亲和力元件是生物素。

131、实施方案126：根据实施方案111至125中任一项所述的方法，其中所述双链核酸包含dna。

132、实施方案127：根据实施方案126所述的方法，其中所述dna包括与组蛋白缔合的dna。

133、实施方案128：根据实施方案127所述的方法，其中所述与组蛋白缔合的dna是无细胞dna。

134、实施方案129：根据实施方案127或实施方案128所述的方法，其中所述无细胞dna在与所述锌指dna结合结构域混合之前不用蛋白酶处理。

135、实施方案130：根据实施方案111至129中任一项所述的方法，还包括在片段化之后将亲和力结合配偶体添加在固体载体上，其中所述带标签的靶片段结合到所述固体载体。

136、实施方案131：根据实施方案130所述的方法，其中在将所述亲和力元件添加在所述固体载体上之前停止所述片段化。

137、实施方案132：根据实施方案131所述的方法，其中通过添加包含蛋白酶k和/或sds的溶液来停止所述片段化。

138、实施方案133：根据实施方案111至132中任一项所述的方法，其中将包含双链核酸的样品与一种或多种靶向的转座体复合物混合包括将所述样品与锌指dna结合结构域或无催化活性的内切核酸酶混合，其中所述锌指dna结合结构域或无催化活性的内切核酸酶结合到第一结合配偶体，以及添加所述转座酶以及第一转座子和第二转座子，其中所述转座酶结合到第二结合配偶体，其中所述转座酶能够通过所述第一结合配偶体和第二结合配偶体的配对结合到所述锌指dna结合结构域或无催化活性的内切核酸酶。

139、实施方案134：根据实施方案133所述的方法，其中所述样品与锌指dna结合结构域混合。

140、实施方案135：根据实施方案134所述的方法，其中所述锌指dna结合结构域包含在锌指核酸酶中。

141、实施方案136：根据实施方案135所述的方法，其中所述锌指核酸酶是无催化活性的。

142、实施方案137：根据实施方案133至136中任一项所述的方法，其中所述双链核酸包含dna。

143、实施方案138：根据实施方案137所述的方法，其中双链核酸包括与组蛋白缔合的dna。

144、实施方案139：根据实施方案138所述的方法，其中所述与组蛋白缔合的dna是无细胞dna。

145、实施方案140：根据实施方案139所述的方法，其中所述无细胞dna在与所述锌指dna结合结构域混合之前不用蛋白酶处理。

146、实施方案141：根据实施方案133至140中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述混合之后和在所述添加之前洗涤。

147、实施方案142：根据实施方案133至141中任一项所述的方法，其中靶向的所述第一转座体复合物和靶向的所述第二转座子复合物结合到所述双链核酸的相反链，其中所述第一转座体复合物结合到第一转座体复合物结合位点，并且其中所述第二转座体复合物结合到第二转座体复合物结合位点。

148、实施方案143：根据实施方案142所述的方法，其中所述第一带5'标签的靶片段和所述第二带5'标签的靶片段包含在所述第一转座体复合物结合位点和所述第二转座体复合物结合位点之间的所述双链核酸的区域中包含的核酸序列。

149、实施方案144：根据实施方案143所述的方法，其中所述第一带5'标签的靶片段和所述第二带5'标签的片段至少部分互补。

150、实施方案145：根据实施方案133至144中任一项所述的方法，其中所述转座体复合物与所述靶dna的化学计量近似相等。

151、实施方案146：根据实施方案133至145中任一项所述的方法，其中在所述混合期间不存在二价阳离子。

152、实施方案147：根据实施方案133至145中任一项所述的方法，其中在所述混合期间存在ca2+和/或mn2+。

153、实施方案148：根据实施方案133至145中任一项所述的方法，还包括在所述混合之后和在所述片段化之前将一种或多种二价阳离子添加到所述样品中。

154、实施方案149：根据实施方案148所述的方法，其中所述二价阳离子是mg2+。

155、实施方案150：根据实施方案133至149中任一项所述的方法，还包括在所述混合之后和在所述片段化之前用外切核酸酶处理所述样品。

156、实施方案151：根据实施方案150所述的方法，包括在用外切核酸酶处理样品之后和在所述片段化之前添加mg2+。

157、实施方案152：根据实施方案133至151中任一项所述的方法，还包括用蛋白酶k和/或sds释放所述带标签的片段。

158、实施方案153：根据实施方案111至152中任一项所述的方法或根据实施方案108至110所述的试剂盒或组合物，其中包含在所述第一转座体复合物和所述第二转座体复合物中的所述5'衔接子序列是不同的。

159、实施方案154：根据实施方案111至153中任一项所述的方法，其中包含在作为靶向转座体复合物的所述第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的所述第二转座体复合物中的所述无催化活性的内切核酸酶或锌指dna结合结构域是不同的。

160、实施方案155：根据实施方案111至154所述的方法，其中作为靶向转座体复合物的所述第一转座体复合物和作为靶向转座体复合物的所述第二转座体复合物的所述无催化活性的内切核酸酶或锌指dna结合结构域结合到靶核酸中给定感兴趣区域中的不同感兴趣序列。

161、实施方案156：根据实施方案111至155中任一项所述的方法，其中所述片段化在45℃至65℃处进行。

162、实施方案157：根据实施方案156所述的方法，其中所述片段化在50℃至60℃处进行。

163、实施方案158：根据实施方案157中任一项所述的方法，其中所述片段化在55℃处进行。

164、实施方案159：根据实施方案111至158中任一项所述的方法，还包括用聚合酶和连接酶处理所述多个带5'标签的片段以延伸和连接所述链，以产生完全双链带标签的片段。

165、实施方案160：根据实施方案111至159中任一项所述的方法，还包括对所述带5'标签的片段或完全双链带标签的片段中的一者或多者进行测序。

166、实施方案161：一种表征包含期望样品和不需要的样品两者的样品混合池中的期望样品的方法，包括：从双链核酸产生测序数据，首先对包含来自所述混合池的多个核酸样品的文库进行测序，其中每个核酸文库包含来自单个样品的核酸和独特样品条形码以将来自所述单个样品的核酸与来自所述文库中其他样品的核酸区分开；分析所述测序数据并鉴定与来自期望样品的测序数据相关联的独特样品条形码；对所述文库进行选择步骤，包括从期望样品富集核酸样品以及/或者从不需要的样品耗尽核酸样品；以及对所述核酸文库进行重新测序。

167、实施方案162：根据实施方案161所述的方法，其中所述样品混合池包括细胞混合池、细胞核混合池或高分子量dna混合池。

168、实施方案163：根据实施方案161或实施方案162所述的方法，其中所述样品是细胞、细胞核或高分子量dna。

169、实施方案164：根据实施方案161至163中任一项所述的方法，其中所述独特样品条形码是独特细胞条形码。

170、实施方案165：根据实施方案161至164中任一项所述的方法，其中所述富集步骤包括杂交捕获、经由无催化活性的内切核酸酶捕获或独特样品条形码特异性扩增。

171、实施方案166：根据实施方案165所述的方法，其中所述独特样品条形码特异性扩增是独特样品条形码靶向pcr扩增。

172、实施方案167：根据实施方案161至164中任一项所述的方法，其中所述耗尽步骤包括杂交捕获、经由无催化活性的内切核酸酶捕获、crispr消化或通过包含与指导rna(grna)偶联的shcast(贺氏伪枝藻属crispr相关转座酶)的复合物切割。

173、实施方案168：根据实施方案167所述的方法，其中所述杂交捕获包括使杂交捕获寡核苷酸与所述独特样品条形码杂交。

174、实施方案169：根据实施方案168所述的方法，其中所述杂交捕获寡核苷酸直接或间接结合到固体载体。

175、实施方案170：根据实施方案169所述的方法，其中所述杂交捕获寡核苷酸通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用结合到固体载体。

176、实施方案171：根据实施方案167所述的方法，其中所述crispr消化是经由催化活性的内切核酸酶切割的。

177、实施方案172：根据实施方案171所述的方法，其中所述内切核酸酶是cas9。

178、实施方案173：根据实施方案172所述的方法，其中所述cas9是犬链球菌cas9。

179、实施方案174：根据实施方案173所述的方法，其中所述犬链球菌cas9具有最小序列约束。

180、实施方案175：根据实施方案171至174中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶是高保真突变体。

181、实施方案176：根据实施方案171所述的方法，包括通过包含与grna偶联的shcast的复合物切割。

182、实施方案177：根据实施方案171至176中任一项所述的转座体复合物，其中所述内切核酸酶与foki核酸酶一起包含在融合蛋白中。

183、实施方案178：根据实施方案171至177中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶与结合到一个或多个独特样品条形码的指导rna缔合。

184、实施方案179：根据实施方案178所述的方法，其中指导rna针对与不需要的样品的核酸缔合的独特样品条形码进行指导。

185、实施方案180：根据实施方案178所述的方法，其中指导rna针对与期望样品的核酸缔合的独特样品条形码进行指导。

186、实施方案181：根据实施方案178至180中任一项所述的转座体复合物，其中所述指导rna是单一指导。

187、实施方案182：根据实施方案181所述的转座体复合物，其中所述单指导rna包含少于20个核苷酸。

188、实施方案183：根据实施方案182所述的转座体复合物，其中所述单指导rna序列包含15、16、17、18或19个核苷酸。

189、实施方案184：根据实施方案178至183中任一项所述的转座体复合物，其中所述单指导rna包含发夹二级结构。

190、实施方案185：根据实施方案171至184中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶直接或间接结合到固体载体。

191、实施方案186：根据实施方案185所述的方法，其中所述内切核酸酶通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用结合到固体载体。

192、实施方案187：根据实施方案161至186中任一项所述的方法，其中所述期望样品是以小于或等于1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、0.0000001％、0.00000001％或0.000000001％的样品混合池存在的稀有样品。

193、实施方案188：根据实施方案161至186所述的方法，其中所述期望样品是以小于或等于1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、0.0000001％、0.00000001％或0.000000001％的细胞混合池存在的期望细胞。

194、实施方案189：根据实施方案161至188中任一项所述的方法，其中所述方法包括在重新测序之前的扩增步骤。

195、实施方案190：根据实施方案189所述的方法，其中所述扩增步骤使用通用引物。

196、实施方案191：根据实施方案161至190中任一项所述的方法，其中所述核酸文库通过标签化制备。

197、实施方案192：根据实施方案161至191中任一项所述的方法，其中所述方法包括在掺入独特样品条形码之前对所述核酸样品进行空间分离的步骤。

198、实施方案193：根据实施方案161至192中任一项所述的方法，其中所述方法包括在对来自所述样品混合池的多个核酸样品进行测序之前进行标签化。

199、实施方案194：根据实施方案161至193中任一项所述的方法，其中将独特样品条形码掺入到每个核酸样品中。

200、实施方案195：根据实施方案161至194中任一项所述的方法，其中将i5和i7序列掺入到每个核酸样品中。

201、实施方案196：根据实施方案161至195中任一项所述的方法，其中将通用引物掺入到每个核酸样品中。

202、实施方案197：根据实施方案196中任一项所述的方法，其中所述通用引物是p5和/或p7引物。

203、实施方案198：根据实施方案161至197中任一项所述的方法，其中所述独特样品条形码是单个连续条形码。

204、实施方案199：根据实施方案198中任一项所述的方法，其中所述独特样品条形码是多个不连续条形码。

205、实施方案200：根据实施方案199所述的方法，其中所述多个不连续条形码由固定序列隔开。

206、实施方案201：根据实施方案161至200中任一项所述的方法，其中所述扩增和重新测序步骤重复一次。

207、实施方案202：根据实施方案161至200中任一项所述的方法，其中所述扩增和重新测序步骤重复多于一次。

208、实施方案203：根据实施方案161至202中任一项所述的方法，其中所述核酸是dna。

209、实施方案204：根据实施方案161至202中任一项所述的方法，其中所述核酸是rna。

210、实施方案205：根据实施方案204所述的方法，其中所述核酸是rrna。

211、实施方案206：根据实施方案205所述的方法，其中所述核酸是16srrna。

212、实施方案207：根据实施方案205所述的方法，其中所述核酸是18srrna。

213、实施方案208：根据实施方案203所述的方法，其中所述核酸是rdna。

214、实施方案209：根据实施方案161至208中任一项所述的方法，其中所述核酸是内部转录间隔区核酸。

215、实施方案210：根据实施方案161至209中任一项所述的方法，其中所述初始测序步骤不包括全基因组测序，并且所述重新测序步骤包括全基因组测序。

216、实施方案211：根据实施方案161至209中任一项所述的方法，其中所述初始测序步骤包括靶向测序，并且所述重新测序步骤包括全基因组测序。

217、实施方案212：根据实施方案211所述的方法，其中所述初始测序步骤包括用一种或多种基因特异性引物进行靶向测序。

218、实施方案213：根据实施方案212所述的方法，其中所述基因特异性引物包含通用引物尾。

219、实施方案214：根据实施方案161至210中任一项所述的方法，其中所述初始测序步骤包括核糖体测序，并且所述重新测序步骤包括全基因组测序。

220、实施方案215：根据实施方案214所述的方法，其中所述核糖体测序包括16s、18s或内部转录间隔区测序。

221、实施方案216：根据实施方案161至215中任一项所述的方法，其中所述期望样品是细胞或细胞核。

222、实施方案217：根据实施方案216所述的方法，其中所述期望样品是细胞。

223、实施方案218：根据实施方案161至217中任一项所述的方法，其中所述期望样品是来自细胞的细胞核。

224、实施方案219：根据实施方案161至217中任一项所述的方法，其中所述期望样品是人细胞或来自人细胞的细胞核。

225、实施方案220：根据实施方案161至217中任一项所述的方法，其中所述期望样品是癌细胞或来自癌细胞的细胞核。

226、实施方案221：根据实施方案161至220中任一项所述的方法，其中所述期望细胞或细胞核是特定的期望细胞类型或来自特定的期望细胞类型。

227、实施方案222：根据实施方案161至221中任一项所述的方法，其中所述期望样品相对于所述池中的其他样品具有突变。

228、实施方案223：根据实施方案161至222中任一项所述的方法，其中所述期望样品是癌细胞或免疫细胞或来自癌细胞或免疫细胞。

229、实施方案224：根据实施方案223所述的方法，其中所述期望样品是癌症干细胞或来自癌症干细胞。

230、实施方案225：根据实施方案223所述的方法，其中所述期望样品是液体或肿瘤活检样品中的癌细胞或来自液体或肿瘤活检样品中的癌细胞。

231、实施方案226：根据实施方案220所述的方法，其中所述期望样品是对药物治疗有抗性的癌细胞或来自对药物治疗有抗性的癌细胞。

232、实施方案227：根据实施方案220所述的方法，其中所述期望样品是相对于所述细胞池中的其他癌细胞具有至少一个突变的癌细胞或来自相对于所述细胞池中的其他癌细胞具有至少一个突变的癌细胞。

233、实施方案228：根据实施方案161至227中任一项所述的方法，其中所述方法用于追踪癌症进化。

234、实施方案229：根据实施方案161至228中任一项所述的方法，其中所述期望样品是具有体细胞驱动突变的细胞或来自具有体细胞驱动突变的细胞。

235、实施方案230：根据实施方案161至218中任一项所述的方法，其中所述方法用于宏基因组学。

236、实施方案231：根据实施方案230所述的方法，其中所述方法用于对来自环境样品的微生物进行测序。

237、实施方案232：根据实施方案231所述的方法，其中所述方法不包括培养来自所述环境样品的所述微生物。

238、实施方案233：根据实施方案230至232中任一项所述的方法，其中所述微生物包括细菌、真菌、古细菌、真菌、藻类、原生动物或病毒。

239、实施方案234：根据实施方案161至233中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有单核苷酸变体(snv)。

240、实施方案235：根据实施方案161至234中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有拷贝数变异(cnv)。

241、实施方案236：根据实施方案161至235中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有期望的甲基化模式。

242、实施方案237：根据实施方案161至236中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有期望的表达模式。

243、实施方案238：根据实施方案161至237中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有期望的表观遗传模式。

244、实施方案239：根据实施方案161至229或234至238中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有期望的免疫基因重组。

245、实施方案240：根据实施方案161至229或234至239中任一项所述的方法，其中所述方法包括tcr库表征。

246、实施方案241：根据实施方案161至240中任一项所述的方法，其中所述期望样品具有特定的物种类型。

247、实施方案242：根据实施方案230至238中任一项所述的方法，其中所述期望样品是病原体。

248、实施方案243：根据实施方案242所述的方法，其中所述期望样品是或来自细菌、真菌、古细菌、真菌、藻类、原生动物或病毒。

249、实施方案244：根据实施方案161至243中任一项所述的方法，其中所述方法不采用基于细胞分选的富集方法。

250、实施方案245：根据实施方案244所述的方法，其中所述方法不采用facs。

251、实施方案246：根据实施方案245所述的方法，其中所述方法不采用基于细胞大小、形态或表面蛋白表达的facs。

252、实施方案247：根据实施方案161至246中任一项所述的方法，其中所述方法不采用微流体。

253、实施方案248：根据实施方案161至247中任一项所述的方法，其中所述方法不采用全基因组扩增。

254、实施方案249：根据实施方案176所述的方法，其中：

255、a.所述shcast包含cas12k；

256、b.所述转座酶包含tn5或tn7样转座酶；并且/或者

257、c.所述grna和所述转座酶中的至少一者是生物素化的，其中生物素化的所述grna和所述转座酶中的至少一者能够与链霉抗生物素蛋白包被的小珠偶联。

258、实施方案250：根据实施方案176或249所述的方法，其中从不需要的样品耗尽核酸样品是在具有用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶与双链核酸结合的条件的流体中进行的。

259、实施方案251：根据实施方案250所述的方法，其中用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶与双链核酸结合的所述条件是15mm或更低的镁浓度。

260、实施方案252：根据实施方案250或251所述的方法，其中用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶与双链核酸结合的所述条件是50nm或更低的转座酶的浓度。

261、实施方案253：根据实施方案176或249所述的方法，其中从不需要的样品耗尽核酸样品包括：

262、a.在抑制包含在所述复合物中的所述转座酶与所述核酸的结合的条件下将复合物结合到双链核酸；以及

263、b.在所述结合之后，促进所述复合物对所述核酸的切割。

264、实施方案254：根据实施方案253所述的方法，其中(1)在所述结合期间不存在转座酶以及(2)促进切割包括添加转座酶。

265、实施方案255：根据实施方案253所述的方法，其中(1)转座酶在所述结合期间处于低水平以及(2)促进切割包括添加转座酶。

266、实施方案256：根据实施方案252至255中任一项所述的方法，其中(1)转座酶在所述结合期间可逆地失活以及(2)促进切割包括活化所述转座酶。

267、实施方案257：根据实施方案256所述的方法，其中(1)所述转座酶由于缺乏一个或多个转座子而可逆地失活以及(2)活化所述转座酶包括提供一个或多个转座子。

268、实施方案258：一种组合物，包含(1)包含一个或多个感兴趣的核酸序列的靶核酸和(2)各自包含与grna偶联的shcast的多个根据实施方案59的靶向转座体复合物，其中所述shcast具有与其偶联的扩增衔接子，并且其中所述靶向转座体复合物中的每个靶向转座体复合物与感兴趣的核酸序列杂交。

269、实施方案259：根据实施方案258所述的组合物，其中所述shcast包含cas12k，所述组合物还包含具有促进包含在所述复合物中的所述cas12k与所述一种或多种感兴趣的核酸序列杂交并抑制包含在所述复合物中的所述转座酶的结合的条件的流体。

270、实施方案260：根据实施方案259所述的组合物，其中所述流体的所述条件还包括不存在足够量的用于所述转座酶活性的镁离子，任选地其中所述镁浓度为15mm或更低。

271、实施方案261：根据实施方案258所述的组合物，包含具有促进所述转座酶活性的条件的流体，并且其中所述转座酶能够将所述扩增衔接子添加到所述靶核酸中的位置。

272、实施方案262：根据实施方案261所述的组合物，其中所述流体的所述条件包括存在足够量的用于所述转座酶活性的镁离子，任选地其中所述镁浓度为15mm或更高。

273、实施方案263：根据实施方案258至262中任一项所述的组合物，其中所述shcast包含cas12k。

274、实施方案264：根据实施方案258至263中任一项所述的组合物，其中所述转座酶包含tn5或tn7样转座酶。

275、实施方案265：根据实施方案258至264中任一项所述的组合物，其中所述衔接子包含p5衔接子和p7衔接子中的至少一者。

276、实施方案266：根据实施方案258至265中任一项所述的组合物，其中所述靶核酸包含双链dna。

277、实施方案267：根据实施方案258至266中任一项所述的组合物，其中所述grna和所述转座酶中的至少一者是生物素化的，所述组合物还包含所述生物素化的所述grna和所述转座酶中的至少一者与其偶联的链霉抗生物素蛋白包被的小珠。

278、实施方案268：根据实施方案111至113中任一项所述的方法，其中所述第一靶向转座体复合物和/或第二靶向转座体复合物包含根据实施方案59所述的靶向转座体复合物。

279、实施方案269：根据实施方案268所述的方法，其中所述方法在具有用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶的结合的条件的流体中进行。

280、实施方案270：根据实施方案269所述的方法，其中用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶的结合的所述条件是15mm或更低的镁浓度。

281、实施方案271：根据实施方案269或270所述的方法，其中用于限制包含在所述复合物中的所述转座酶的结合的所述条件是50nm或更低的转座酶的浓度。

282、实施方案272：根据实施方案268所述的方法，其中所述方法包括：

283、a.在抑制包含在所述复合物中的所述转座酶与所述双链核酸的结合的条件下将所述复合物结合到双链核酸；以及

284、b.在所述结合之后，促进所述复合物对所述双链核酸的切割。

285、实施方案273：根据实施方案272所述的方法，其中(1)在所述结合期间不存在转座酶以及(2)促进切割包括添加转座酶。

286、实施方案274：根据实施方案271至273中任一项所述的方法，其中(1)转座酶在所述结合期间处于低水平以及(2)促进切割包括添加转座酶。

287、实施方案275：根据实施方案271至274中任一项所述的方法，其中(1)转座酶在所述结合期间可逆地失活以及(2)促进切割包括活化所述转座酶。

288、实施方案276：根据实施方案275所述的方法，其中(1)所述转座酶由于缺乏一个或多个转座子而可逆地失活以及(2)活化所述转座酶包括提供一个或多个转座子。

289、实施方案277：根据实施方案268至276中任一项所述的方法，其中所述转座酶将所述扩增衔接子添加到所述双链核酸中的位置。

290、另外的目的和优点将在下列描述中部分地示出，并且部分地将在描述中显而易见，或可通过实践获知。这些目的和优点将借助所附权利要求书中特别指出的元件和组合来实现和获得。

291、应当理解，上述一般描述和下述详细描述均仅作为示例和说明，并且不是对权利要求书的限制。

292、并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出了一个(多个)实施方案，并且其与说明书一起用于解释本文所述的原理。