本公开涉及癌症抗原特异性nk细胞、双特异性抗原结合分子、它们的药物组合，以及产生其和用其治疗癌症患者的方法。
背景技术：
1、自然杀伤(nk)细胞是先天免疫系统的组成部分，在肿瘤和病毒感染细胞的宿主排斥反应中发挥主要作用。它们是过继性癌症免疫疗法的重要效应细胞类型。与t细胞类似，nk细胞也可以修饰为表达嵌合抗原受体(car)以增强抗肿瘤活性。
2、近年来，关于car的研究主要集中在t细胞上。可以将t细胞激活，然后与编码car分子的载体一起温育。温育几天后，在细胞进入时，载体将car的遗传信息表达为rna，然后逆转录为dna并永久整合至t细胞的基因组中。最常报道的用于car t细胞临床试验的载体是慢病毒载体。
3、尽管越来越多的car-t细胞疗法正在开发并在临床试验中进行测试，但其广泛的临床应用受到固有风险的限制，如移植物抗宿主病(gvhd)、肿瘤溶解综合征、脱靶副作用和细胞因子释放综合征(crs)。为了防止这些缺点，car技术最近已应用于其他免疫细胞如自然杀伤(nk)细胞。nk细胞可以更容易地修饰，以避免治疗相关的毒性和免疫介导的不良反应。一般认为car-nk细胞疗法比car-t细胞疗法更安全，更不容易引起crs。据报道单倍体相合的异基因nk细胞移植几乎不会诱导移植物抗宿主病(gvhd)。此外，nk细胞可以从许多来源分离，包括外周血和脐带血。据报道nk细胞还促进树突细胞迁移至肿瘤中，增强抗pd-1免疫疗法。
4、自从利妥昔单抗首次被批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤以来，基于抗体的疗法作为癌症治疗方法得到了重振。高特异性、低脱靶效应、理想的药代动力学和高成功率使抗体适合作为药物进行开发。临床前研究和早期临床试验都证明，双特异性抗体疗法可能是用于对抗实体瘤的有效治疗方法。
技术实现思路
1、在一些实施方案中，本公开涉及一种癌症抗原特异性自然杀伤(nk)细胞，其包含编码嵌合抗原受体的非病毒表达质粒(例如，pcar、pt2、pt2b)，所述嵌合抗原受体具有：癌症抗原特异性单链可变片段(scfv)；铰链区；跨膜结构域；和胞内结构域。在一些实施方案中，癌症抗原特异性nk细胞，与表达抗原的细胞相比，对抗原阴性细胞的非特异性细胞毒性作用可以降低，与未修饰的nk细胞的细胞毒性作用相比，对表达抗原的肿瘤细胞的特异性细胞毒性作用可以增加，或者两者都有。
2、根据一些实施方案，本公开进一步涉及双特异性抗原结合分子，其包含对第一癌症抗原具有特异性scfv的第一抗原结合分子，以及具有scfv和基于适体的分子中的至少一种的第二抗原结合分子，其中所述第二抗原结合分子对第二癌症抗原和nk细胞受体具有特异性。
3、本公开进一步涉及药物组合物，其包含癌症抗原特异性自然杀伤(nk)细胞和双特异性抗原结合分子。
4、根据一些实施方案，本公开涉及治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的至少一种癌症抗原特异性nk细胞和基于双特异性的抗体，或者包含其的药物组合物。治疗癌症的方法的患者可以包括患有三阴性乳腺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑素瘤、食管胃癌中至少一种的癌症患者。
5、本公开进一步涉及制备癌症抗原特异性nk细胞的方法，所述方法包括：使用非病毒表达质粒转染nk细胞，并且诱导icaspase-9基因系统。在一些实施方案中，非病毒表达质粒编码融合基因，所述融合基因具有癌症抗原特异性单链可变片段(scfv)；铰链区；跨膜结构域；和胞内结构域。
6、定义
7、“抗原”是指在患者体内上调的一种或多种蛋白，它们存在于个体的体液中。
8、“双特异性抗体”是指描述一个大的分子家族，设计为识别两种不同的表位或抗原。
9、“cd27”是tnf受体超家族的成员。目前它作为共刺激免疫检查点分子受到免疫学家的关注。
10、“cd28”(分化簇28)是t细胞上表达的蛋白之一，其提供t细胞激活和存活所需的共刺激信号。它是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)蛋白的受体。此外，它是唯一在幼稚t细胞(naivet cells)上组成性表达的b7蛋白受体。
11、“cd40”是在apc上发现的共刺激蛋白，是apc激活所必需的。t辅助(th)细胞上的cd154(cd40l)与cd40的结合激活apc并诱导各种下游效应。缺陷可以引起3型高igm综合征。
12、“cd133抗原”，也称作prominin-1，是人中由prom1基因编码的糖蛋白。它是五跨膜糖蛋白的成员，特异性地定位在细胞突起上。
13、“癌胚抗原”(cea)描述了一组参与细胞粘附的高度相关的糖蛋白。cea通常在胎儿发育过程中在胃肠道组织中产生，但是在出生前停止产生。
14、“嵌合抗原受体”是指经过工程化的受体蛋白，其赋予nk细胞靶向特定蛋白的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和nk-细胞激活功能组合在单一受体中。
15、“细胞毒性t-淋巴细胞相关蛋白4”(ctla-4)，也称作“分化簇152”(cd152)，是作为免疫检查点发挥作用的蛋白受体。ctla-4还下调免疫系统。它在调节性t细胞中组成性表达，激活后在常规t细胞中上调，这在癌症中是值得注意的现象。
16、“表皮生长因子受体”(egfr)是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(egf家族)成员的跨膜蛋白受体。
17、“表皮生长因子受体变体iii”(egfrviii)是egfr最常见的胞外域突变，这个突变导致egfr基因的外显子2-7缺失，使突变受体不能结合任何已知配体。
18、“上皮细胞粘附分子”(epcam)一种跨膜糖蛋白，介导上皮中ca2+非依赖性同型细胞-细胞粘附。epcam还参与细胞信号传导、迁移、增殖和分化。
19、“gd2”是一种在神经外胚层来源的肿瘤(包括人神经母细胞瘤和黑素瘤)上表达的二唾液酸神经节苷脂，在正常组织上(主要是在人的小脑和周围神经)的表达非常有限。
20、“g-蛋白偶联受体(gpcr)-激酶相互作用蛋白”(git)是迄今为止研究的所有哺乳动物和鸟类都表达的，并且在所有哺乳动物和鸟类物种中高度保守。哺乳动物和鸟类表达两种git蛋白：git1和git2。
21、“磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3”(gpc3)是一种细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖，通过糖基-磷脂酰肌醇锚与细胞表面膜结合。它主要在发育期间表达，针对特定组织和阶段在胎儿的肝脏、肾脏、脊椎和生殖系统中表达，但是在大多数成熟的正常器官中不表达。
22、“疱疹病毒进入介质”(hvem)(herpesvirus entry mediator)也称作tnf受体超家族成员14(tnfrsf14)，是tnf受体超家族的人细胞表面受体。
23、“人表皮生长因子受体2”(her2)是一种膜酪氨酸激酶和癌基因，在大约20％的乳腺癌中过量表达和基因扩增。
24、“可诱导t细胞共刺激分子”(icos)是一种蛋白编码基因。与icos相关的疾病包括免疫缺陷普通变异型1和普通变异型免疫缺陷。其相关途径包括b细胞受体和gab1信号体的下游信号传导事件。
25、“白介素12受体”(il-12受体)是结合il-12的1型细胞因子受体。它由il-12受体β-1亚基和il-12受体β-2亚基组成。
26、“白介素-18受体”(il-18受体)是免疫球蛋白超家族的白介素-受体。
27、“淋巴细胞激活基因3”(lag-3)(lymphocyte-activation gene 3)是人中由lag3基因编码的蛋白。lag-3是一种细胞表面分子，对t细胞功能具有多种生物效应。lag-3是一种免疫检查点受体，是各种药物开发计划的目标，旨在开发治疗癌症和自身免疫性病症的新方法。
28、“间皮素”是一种肿瘤分化抗原，通常存在于衬垫胸膜、腹膜和心包的间皮细胞上。它在几种人癌症中高度表达，包括恶性间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌。
29、“粘蛋白1”(muc1)是一种糖蛋白，其胞外域具有广泛的o-联糖基化。粘蛋白在肺、胃、小肠、眼睛和其他几个器官的上皮细胞顶端表面排列。
30、“粘蛋白16”(muc16)，以前称作ca125，是人中由muc16基因编码的蛋白。它是糖蛋白的粘蛋白家族成员。
31、“自然杀伤组2d”(nkg2d)是一种c型、凝集素样、ii型跨膜糖蛋白，其转录本最初在人nk和t细胞中发现。
32、“ox40”是一种次级共刺激免疫检查点分子，在激活后24-72小时后表达；其配体ox40l也不在静息抗原呈递细胞上表达，而是在其激活后表达。
33、“程序性细胞死亡-1”(pd-1)是cd28超家族的成员，在与它的两个配体pd-l1或pd-l2相互作用时传递负信号。
34、“程序性死亡-配体1”(pd-l1)，也称作分化簇274(cd274)或b7同系物1(b7-h1)，是由cd274基因编码的人蛋白。pd-l1在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的非转化细胞上过量表达。此外，在肿瘤细胞上表达的pd-l1与位于活化t细胞上的pd-1受体结合。这种结合事件导致细胞毒性t细胞的抑制。
35、“前列腺干细胞抗原”(psca)是人中由psca基因编码的蛋白。该基因编码糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞膜糖蛋白。除了在前列腺中高表达外，它还在膀胱、胎盘、结肠、肾脏和胃中表达。
36、“前列腺特异性膜抗原”(psma)据认为是核医学中最成功的成像和治疗靶标之一。它是一种糖蛋白，膜结合金属肽酶，由11号染色体上的folh1基因编码。
37、“具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体”(tigit)是存在于一些t细胞和自然杀伤细胞(nk)上的免疫受体。它还被识别为wucam和vstm3。tigit可以与树突细胞(dc)和巨噬细胞上的cd155(pvr)高亲和力结合。此外，tigit还可以与cd112(pvrl2)结合，但是亲和力低于它与pvr和dc的结合。
38、“t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1”(tim-1)，也称作kim-1或havcr1，是扎伊尔埃博拉病毒(zaire ebolavirus)和维多利亚湖马尔堡病毒(lake victoriamarburgvirus)的受体，是包含胞外ig可变(igv)结构域、粘蛋白样结构域、跨膜结构域和胞质尾的1型跨膜蛋白。该蛋白在肾上皮的分裂细胞和活化的2型辅助t细胞(th2细胞)上表达，与磷脂酰丝氨酸(ps)以及家族成员tim-4结合，分别导致凋亡细胞的清除和t细胞增殖的激活。
39、“t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3”(tim-3)，也称作甲肝病毒细胞受体2(havcr2)，是人中由havcr2基因编码的蛋白。
40、“4-1bb”(也称作cd137)是一种属于肿瘤坏死因子超家族的2型跨膜糖蛋白受体，在活化的t-淋巴细胞上表达。4-1bbl(4-1bb配体，cd137l)存在于抗原呈递细胞(apc)上，与cd137结合。