诱导产生RAAV病毒粒子的稳定细胞系的制作方法

诱导产生raav病毒粒子的稳定细胞系
1.相关申请的交叉引用
1.本专利申请要求2020年7月30日提交的第63/058887号、第63/058894号和第63/058900号，2021年3月3日提交的第63/156230号、第63/156207号和第63/156239号，以及2021年6月30日提交的第63/216615号美国临时专利申请的利益和优先权。上述引用各申请各自内容在此通过专门引用以其整体并入。2.发明背景
2.重组腺相关病毒(raav)是基因导入体内基因导入的首选载体。aav不存在已知的疾病关联，可感染分裂和未分裂细胞(罕见于将其整合入哺乳动物细胞基因组中时)，并且基本上可以作为一种转录活性核游离基因在被感染细胞的一生中持续存在。美国食品和药物管理局(fda)最近批准了几种raav基因治疗产品，许多其他基于raav的基因治疗和基因编辑产品正在研发中。
3.最常用的raav病毒粒子生产方法是在无辅助病毒的条件下将多个质粒瞬时转染至贴壁细胞系(通常是三重转染)。尽管在通过持续投资来提高生产能力，但目前的aav制造工艺效率低下且成本高昂。此外，这些工艺所获得的产品质量千差万别，且有效载荷(如治疗有效载荷)的包壳水平较低。
4.因此，有必要改进raav产品的生产方法。无论何种解决方案，首先需要解决的问题是，aav rep蛋白生产用宿主细胞和腺病毒辅助蛋白的组成型表达对生产用宿主细胞的毒性。3.概述
5.本发明公开了稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒粒子可表达有效载荷。
6.本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒可表达有效载荷；其稳定细胞产生的病毒粒子群相比于其他类似细胞(在瞬时转染时产生raav病毒粒子)产生的病毒粒子群具有更高的同质性。
7.本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒可表达有效载荷；并且在加入触发剂后，可诱导产生病毒粒子。
8.本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒粒子可表达有效载荷；并且病毒粒子的产生不取决于细胞内是否存在质粒。
9.在某些方面，含有一种或多种核酸的药用组合物共同包含：(i)编码aav rep蛋白和aav cap蛋白的第一重组核酸序列；和(ii)编码一个或多个腺病毒辅助蛋白的第二重组核酸序列。当一个或多个核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组中时，其可有条件地表达aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或一个或多个腺病毒辅助蛋白，从而有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。在一些实施例中，通过存在于一种或多种核酸中的一种或更多种可切除
元件，可以控制aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或一个或多个腺病毒辅助蛋白的条件性表达。在一些实施例中，一个或多个可切除元件包含一个或多个内含子和/或一个或多个外显子。在一些实施例中，第一重组核酸序列负责编码：a)aav rep蛋白编码序列的第一部分；b)aav rep蛋白编码序列的第二部分；c)aav rep蛋白编码序列的第一部分和aav rep蛋白编码序列的第二部分之间的可切除元件；以及d)aav cap蛋白编码序列。在一些实施例中，可切除元件包含：a)由第一内含子组成的第一间隔区；b)由可检测标记物编码序列组成的第二间隔区；和c)包含第二内含子的第三间隔区，其中，第一间隔区和第三间隔区能够被哺乳动物细胞的内源性细胞机制所切除。在一些实施例中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)包含第一内含子的第一间隔区；c)包含：i)第一lox序列；ii)3’端剪接位点；iii)外显子；iv)停止信号序列；和v)第二lox序列；以及d)包含第二内含子的第三间隔区。在一些实施例中，可检测标记物为发光标记物、放射性标记物或荧光标记物，可选的荧光标记物为gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp、或mcherry。在一些实施例中，a)第一间隔区包含与seq id no:1具有至少80％同源性的核酸序列；1；和/或b)第二间隔区包含与seq id no:2具有至少80％同源性的核酸序列；2；和/或c)第三间隔区包含与seq id no:3具有至少80％同源性的核酸序列。3.在一些实施例中，第二间隔区能够被cre多肽所切除。在一些实施例中，由天然启动子驱动aav rep蛋白和/或aav cap蛋白的表达。在一些实施例中，a)由天然启动子p5和/或p19驱动aav rep蛋白的表达；和/或b)由天然启动子p40驱动aav cap蛋白的表达。在一些实施例中，第二重组核酸序列负责编码：a)一个或多个腺病毒辅助蛋白；b)一个条件性自切元件；和c)一个诱导型启动子；其中，这些编码一旦整合至哺乳动物细胞的核基因组中，将在条件性自切元件和诱导型启动子的控制之下表达一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列。在一些实施例中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。在一些实施例中，自切元件包含一个序列，其可编码多肽，具体为重组酶多肽，更具体为cre多肽。在一些实施例中，由自切元件编码的多肽是条件性表达的，并且只有当存在触发剂的情况下表达。在一些实施例中，触发剂为一种激素，优选他莫昔芬。在一些实施例中，诱导型启动子为tet诱导型启动子。在一些实施例中，第二重组核酸序列进一步包含可编码tet反应性激活蛋白，具体为tet-on-3g的序列。在一些实施例中，由e1α启动子驱动tet-on 3g激活蛋白的表达。在一些实施例中，第二重组核酸序列包含与seq id no:11或seq id no:12具有至少80％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少99％同源性或完全相同的序列。在一些实施例中，一种或多种核酸进一步包含va rna核酸编码序列。在一些实施例中，va rna的表达是组成型的。在一些实施例中，va rna的表达是诱导型的。在一些实施例中，va rna序列包含va rna内部启动子，具体为g16a和g60a的一个或多个突变。在一些实施例中，va rna的表达是由e1α启动子或u6启动子驱动的。在一些实施例中，va rna的表达由u6启动子驱动，其中，u6启动子包含：a)u6启动子序列的第一部分，b)填充片段序列，和c)u6启动子序列的第二部分，其中，填充片段序列能够被cre多肽切除。在一些实施例中，aav cap蛋白的血清型选自由aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、
aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68所组成的群组。在一些实施例中，血清型是aav5以及包含一个或多个突变或插入物的cap蛋白。在一些实施例中，一个或多个重组核酸进一步编码第三重组核酸序列(该序列负责编码有效载荷)，其中，有效载荷可以是：(a)一个多核苷酸有效载荷，如用于rna编辑的向导rna、用于cas蛋白定向dna编辑的向导rna、trna抑制剂或用于替代基因疗法的基因；或(b)一个蛋白质，如治疗性抗体或疫苗免疫原。在一些实施例中，一个或多个重组核酸包含一个或多个哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，一个或多个哺乳动物细胞选择元件负责编码抗生素抗性基因，这可以是杀稻瘟菌素抗性基因。在一些实施例中，一个或多个哺乳动物细胞选择元件是负责编码活化蛋白的营养缺陷筛选元件，其中，蛋白质优选dhfr。在一些实施例中，一个或多个哺乳动物细胞选择元件是第一营养缺陷筛选元件，它负责编码一种非活化型蛋白，该蛋白需要表达来自第二营养缺陷筛选编码序列的第二个非活化型蛋白才能活化。在一些实施例中，第一营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter(seq id no:5)活性，和/或其中第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-nter(seq id no:4)。在一些实施例中，a)第一重组核酸包含哺乳动物细胞选择元件，其负责编码抗生素抗性基因，优选杀稻瘟菌素抗性基因；和b)i.第二重组核酸包含第一营养缺陷筛选元件，其负责编码非活化型蛋白，该蛋白质需要表达来自第二营养缺陷筛选编码序列的第二个非活化型蛋白才能活化；和ii.第三重组核酸包含第二营养缺陷筛选元件，其负责编码非活化型蛋白，该蛋白质需要表达来自第一营养缺陷筛选编码序列的第一个非活化型蛋白才能活化；以及，其中在(i)或(ii)中，第一营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter(seq id no:5)，而第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-nter(seq id no：4)，或者其中第一营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-nter(seq id no：4)，而第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter(seq id no：5)。
10.本发明在某些方面公开了一种哺乳动物细胞，其中，该细胞的核基因组包含多个整合的重组核酸构建体，这些构建体共同编码重组腺相关病毒(raav)病毒粒子，其中哺乳动物细胞可以有条件地表达raav病毒粒子。在一些实施例中，多个整合的重组核酸构建体包含先前任一实施例中的一种或多种重组核酸，其中哺乳动物细胞可以有条件地表达aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或腺病毒辅助蛋白。在一些实施例中，该细胞系表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b。在一些实施例中，多个整合的重组核酸构建体包含：(i)第一个整合的多核苷酸构建体，其中包括：a)aav rep蛋白编码序列的第一部分；b)aav rep蛋白编码序列的第二部分；c)aav rep蛋白编码序列的第一部分与aav rep蛋白编码序列的第二部分之间的可切除元件，其中该可切除元件包含：i)包含第一内含子的第一间隔区；ii)包含可检测标记物编码序列的第二间隔区，其中第二间隔区能够被cre多肽切除；和iii)包含第二内含子的第三间隔区；和d)aav cap蛋白编码序列；其中aav rep蛋白和aav cap蛋白由天然启动子p5、p19和p40驱动；(ii)第二个整合的多核苷酸构建，其中包括：a)一个条件性表达的va rna编码序列，该序列包含va rna内部启动子的一个突变，va rna的表达由u6启动子驱动，其中va rna序列包含g16a和g60a突变；b)一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列，其中腺病毒辅助蛋白是e2a和e4；c)一个条件性自切元件，其负责编码cre多肽，该多肽可易位至细胞核中，并且只有存在触发剂(即他莫昔芬)时才能自切；以及d)一个诱导型启动子，它是一个tet诱导型启动子，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列的表达受到条件性自切元件和诱导型启动子的控制；和(iii)第三个整合的多核苷酸构建体，其包含有效载荷编码，其
中有效载荷是多核苷酸有效载荷。
11.在某些方面，一种raav病毒粒子群的生产方法，其特征在于：(a)当允许表达raav病毒粒子时，培养第36-39方面中任一方面所述的细胞；和(b)从细胞培养物中分离raav病毒粒子。
12.在一些实施例中，纯化前的raav病毒基因组(vg)与病毒颗粒(vg：vp)的比例大于0.5。在一些实施例中，细胞产生的raav病毒粒子群具有如下特征：(a)病毒基因组与转导单位的比例约为500：1-1：1；和/或(b)载体基因组与感染单位的比例为100：1。
13.在某些方面，一种制备之前任一实施例所述细胞的方法，其特征在于：i)提供一种哺乳动物细胞以及前面任一实施例所述的一种或多种核酸；和ii)将之前任一实施例所述的一种或多种核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组中。
14.在某些方面，raav病毒粒子群由之前任一实施例所述方法所生产。在一些实施例中，当病毒感染复数(moi)为10000时，病毒粒子的感染性至少为50％。
15.在某些方面，一种药用组合物包含根据之前任一实施例所述方法制备的raav病毒粒子群，可供选择用于治疗单基因疾病。在某些方面，根据之前任一实施例所述方法制备的raav病毒粒子群或根据之前任一实施例所述方法制备的药用组合物，可用作药物，并且可供选择用于治疗单基因疾病。在一些实施例中，根据之前任一实施例所述方法制备的raav病毒粒子群或药用组合物，其特征在于raav病毒粒子的给药剂量为4x10
14
或更低。
16.本发明还提供了满足以下条件的细胞，即包含：a)负责编码aav rep蛋白和aav cap蛋白的第一个多核苷酸构建体；b)负责编码一种或多种腺病毒辅助蛋白的第二个多核苷酸构建体。当一种或多种核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组时，其可有条件地表达aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或一种或多种腺病毒辅助蛋白，从而有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。
17.在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体包含编码以下内容的序列：a)一种或多种辅助蛋白；b)一种或多种辅助蛋白的上游自切元件；和c)自切元件的上游诱导型启动子。在一些实施例中，通过操纵可将自切元件连接至诱导型启动子。在一些实施例中，自切元件的表达是由诱导型启动子驱动的。
18.在一些实施例中，诱导型启动子是四环素反应性启动子元件(tre)。在一些实施例中，tre包含与最小启动子融合的tet操纵子(teto)序列多联体。在一些实施例中，最小启动子是人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，诱导型启动子包含一个与seq id no:22具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，与激活剂结合后，可通过诱导型启动子激活转录过程。在一些实施例中，当存在触发剂时，激活剂可与诱导型启动子结合。在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体进一步包含一个激活剂编码序列。在一些实施例中，通过操纵可将激活剂连接至组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子或人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，激活剂是四环素控制的反式活化因子(rta)，其包含一个与vp16反式激活结构域融合的tet阻遏物结合蛋白(tetr)。在一些实施例中，rta包含tetr dna结合部分中的四个突变。在一些实施例中，rta包含与seq id no:21具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
19.在一些实施例中，诱导型启动子是一个cumate操纵子序列。在一些实施例中，cumate操纵子序列位于组成型启动子的下游。在一些实施例中，组成型启动子是人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，当缺少第一触发剂时，诱导型启动子可与cymr阻遏物结合。在一些实施例中，当存在第一触发剂时，诱导型启动子可被激活。在一些实施例中，第一触发剂可与cymr阻遏物结合。在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体进一步包含cymr阻遏物。在一些实施例中，通过操纵可将cymr阻遏物连接至组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第一触发剂是cumate。
20.在一些实施例中，自切元件编码序列包含一个聚腺苷酸序列。在一些实施例中，自切元件是一种重组酶。在一些实施例中，重组酶与配体结合域融合。在一些实施例中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一个激素受体。在一些实施例中，重组酶是cre-ert2多肽。在一些实施例中，当存在第二触发剂时，自切元件可易位至细胞核。在一些实施例中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。在一些实施例中，第二触发剂是选择性雌激素受体调节剂(serm)。在一些实施例中，第二触发剂是他莫昔芬。在一些实施例中，重组酶两侧分布着重组位点。在一些实施例中，重组位点是lox位点或翻转酶识别靶(frt)位点。在一些实施例中，lox位点是loxp位点。
21.在一些实施例中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。在一些实施例中，e2a是flag标记的e2a。在一些实施例中，e2a编码序列和e4编码序列被内部核糖体进入位点(ires)或p2a分隔开。
22.在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体进一步包含一个可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
23.在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体进一步包含va rna编码序列。在一些实施例中，va rna编码序列是一个转录死亡序列。在一些实施例中，内部启动子中的va rna编码序列至少有两个突变。在一些实施例中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体由va rna基因编码序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；以及e)u6启动子序列的第二部分。在一些实施例中，填充片段序列可被重组酶切除。在一些实施例中，填充片段序列包含基因编码序列。在一些实施例中，填充片段序列包含一个启动子。在一些实施例中，启动子是一个组成型启动子。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。
24.在一些实施例中，第一个多核苷酸构建体包含：a)rep基因序列的第一部分；b)rep基因序列的第二部分；c)cap基因序列；以及d)位于rep基因序列第一部分和第二部分之间的可切除元件。
25.在一些实施例中，可切除元件包含一个停止信号序列。在一些实施例中，可切除元件包含一个兔β球蛋白内含子。在一些实施例中，可切除元件包含一个外显子。在一些实施例中，可切除元件包含一个内含子和一个外显子。在一些实施例中，可切除元件包含一个内
含子。
26.在一些实施例中，两个剪接位点位于rep基因序列的第一部分和第二部分序列之间。在一些实施例中，两个剪接位点是5’端剪接位点和3’端剪接位点。在一些实施例中，5’端剪接位点是兔β球蛋白5’端剪接位点。在一些实施例中，3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。在一些实施例中，三个剪接位点位于rep基因的第一和第二部分序列之间。在一些实施例中，三个剪接位点是5’端剪接位点、第一3’端剪接位点、和第二3’端剪接位点。在一些实施例中，第一3’端剪接位点是第二3’端剪接位点的副本。在一些实施例中，第一3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。在一些实施例中，第二3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。
27.在一些实施例中，可切除元件包含一个重组位点。在一些实施例中，重组位点是lox位点或frt位点。在一些实施例中，lox位点是loxp位点。
28.在一些实施例中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)第一重组位点；c)第一3’端剪接位点；d)停止信号序列；e)第二重组位点；和f)第二3’端剪接位点。
29.在一些实施例中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)第一间隔区；c)第二间隔区，其包含i)第一重组位点，ii)第一3’端剪接位点，iv)停止信号序列，和v)第二重组位点；以及d)包含3’端剪接位点的第三间隔区。在一些实施例中，第一间隔区序列包含一个内含子。在一些实施例中，第一间隔区包含与seq id no:1具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第二间隔区包含与seq id no:2具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第三间隔区包含与seq id no:3具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第三间隔区包含一个内含子。在一些实施例中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。在一些实施例中，第二间隔区包含一个外显子。在一些实施例中，第二间隔区进一步包含一个polya序列。在一些实施例中，polya序列是外显子的3’端。在一些实施例中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。
30.在一些实施例中，第二间隔区包含(从5’端到3’端)：a)第一重组位点；b)第一3’端剪接位点；c)一个外显子；d)停止信号序列；和e)第二个重组位点。在一些实施例中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。在一些实施例中，第一lox序列是第一loxp序列，第二lox序列是第二loxp序列。在一些实施例中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。在一些实施例中，停止信号序列是外显子的终止密码子或polya序列。在一些实施例中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。在一些实施例中，外显子负责编码一个可检测标记物或一个可选标记物。在一些实施例中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。在一些实施例中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。
31.在一些实施例中，第二间隔区可被重组酶切除。在一些实施例中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一个激素受体。在一些实施例中，重组酶是cre-ert2多肽。
32.在一些实施例中，rep基因编码rep多肽。在一些实施例中，cap基因编码cap多肽。在一些实施例中，rep基因和cap基因的转录是由天然启动子驱动的。在一些实施例中，天然启动子包括p5、p19和p40。
33.在一些实施例中，rep多肽是野生型rep多肽。在一些实施例中，rep多肽包括rep78、rep68、rep52和rep40。在一些实施例中，一个截短复制相关蛋白包含表达于rep基因第一部分序列的多肽和缺少重组酶时表达的外显子。
34.在一些实施例中，cap多肽是野生型cap多肽。在一些实施例中，cap多肽是aav衣壳蛋白。在一些实施例中，aav衣壳蛋白质包括vp1、vp2和vp3。在一些实施例中，aav衣壳蛋白的血清型选自由aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68所组成的群组。
35.在一些实施例中，第一个多核苷酸构建体进一步包含可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
36.在一些实施例中，第一个多核苷酸构建体包含与seq id no:1-seq id no:3、seq id 6-seq id no:8或seq id no:32中的任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第二多核苷酸构建体包含与seq id no:9-seq id no:19、seq id 23-seq id no:32或seq id no:35中的任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第一个多核苷酸构建体和第二个多核苷酸构建体被稳定整合至细胞的基因组中。
37.在一些实施例中，细胞进一步包含一个有效载荷构建体，其中有效载荷构建体是一个编码有效载荷的多核苷酸。在一些实施例中，有效载荷构建体包含与seq id no:33序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，有效载荷构建体包含一个有效载荷序列，其两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷序列的表达是由组成型启动子驱动的。在一些实施例中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧分别是itr序列。
38.在一些实施例中，有效载荷的序列包含多核苷酸基因编码序列。在一些实施例中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。在一些实施例中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。
39.在一些实施例中，有效载荷序列包含治疗性多核苷酸的多核苷酸编码序列。在一些实施例中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。在一些实施例中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。在一些实施例中，蛋白质是核酸酶。在一些实施例中，蛋白质是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是具有催化作用的非活化型cas蛋白质。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。
40.在一些实施例中，多个有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些
实施例中，多个有效载荷构建体被分别稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物的编码序列。在一些实施例中，有效载荷构建体被整合至细胞的基因组中。
41.本发明还提供了稳定细胞系的生产方法，包括上述细胞的扩增。
42.本发明还提供了多种raav病毒粒子的生产方法，包括在有第一触发剂和第二触发剂的情况下培养上述细胞。在一些实施例中，第一触发剂是多西环素，第二触发剂是他莫昔芬。在一些实施例中，多个raav病毒粒子在纯化前的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。在一些实施例中，多个raav病毒粒子在纯化前的f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，多个raav病毒粒子在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
1013或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，当moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，多个raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，细胞培养是在一个生物反应器中进行的。
43.本发明还提供了一些药用组合物，其包括由上述细胞或方法生产的raav病毒粒子以及医药上可接受的载体。本发明还提供了治疗病症或疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药用组合物。4.图纸的简要说明
44.图1描述了一种示例性细胞的预触发状态，其中多个合成核酸构建体已分别整合至该细胞的核基因组中。这种示例性细胞产生了一个稳定细胞系，能够有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子，该病毒包装了有效载荷(例如，治疗性多核苷酸)。构建体3中的括号表示itr的两侧位置。
45.图2a-2c更详细地描述了图1中构建体2的一个示例性实施例。这种构建体允许条件性表达cre。在预触发状态下(图2a的顶部)，整合的核酸构建体具有cre编码序列和腺病毒e2a和e4辅助蛋白编码序列，这两个序列共同受诱导型启动子的控制，在加入触发剂后可活化。其他编码元件(激活剂和哺乳动物筛选基因(哺乳动物筛选))受组成型启动子(“cmv启动子”)的控制。cre编码元件位于loxp位点之间，并且还与雌激素反应元件(“er2”)融合，这允许在对雌激素激动剂(如他莫昔芬)的反应中控制cre的定位。加入触发剂后，cre可被表达(图2a的底部)，加入他莫西芬后，cre将易位至细胞核。如图2b所示，经过cre蛋白翻译和转运到细胞核后，cre蛋白切除了其自身的编码序列，得到了图2b底部所示的整合构建体。图2c中显示了构建体2中的一个可选插入物。可选插入物包含一个cre诱导型u6启动子，其驱动va rna1(va rna)转录死亡突变体的表达。具体而言，u6启动子被分成两部分，通过lox两侧的填充片段序列分隔开。由于填充片段序列的存在，u6启动子是非活化型的。填充片段序列的cre介导切除激活了u6启动子，从而驱动va rna的表达。
46.图3a-3b是描述构建体1的一个示例性实施例的细节示意图。该构建体被设计为允许在触发事件后通过其内源性启动子表达aav rep和cap蛋白。图3a显示了整合核酸构建体的预触发状态。一个中间间隔区(可切除间隔区)阻断了rep编码序列。可切除间隔区包含第一间隔区、可切除的第二间隔区(第二“可切除”间隔区)、以及第三间隔区。第二“可切除”间隔区包含egfp，其两侧分别是loxp位点和一个上游3’端剪接位点(3’ss)。图中底部显示了一个预触发转录本。该预触发转录本负责编码aav rep的5’端，使该部分融合至荧光标记蛋
白egfp中。预触发转录本包含一个内含子，其两侧分别是5’端剪接位点(5’ss)和3’端剪接位点(3’ss)。图3b显示了在细胞核中暴露于cre后，预触发构建体(顶部示意图)转换为触发后状态(底部示意图)。cre切除了第二“可切除”间隔区，其中包括egfp标记的编码序列和上游3’端剪接位点(3’ss)。当第二“可切除”间隔区被cre切除时，构建体允许通过其各自的内源性启动子表达功能性rep和cap转录本。
47.图4描述了构建体3的一个示例性实施例。构建体3包含一个有效载荷编码序列(有效载荷多核苷酸)。有效载荷多核苷酸受到组成型启动子的控制。括号内表示两侧itr的位置。如图所示，在各种非限制性实施例中，有效载荷是编码兴趣蛋白质的转基因、同源定向修复的同源元件(如hdr同源区)、或向导rna。图中还显示了一个蛋白质编码序列，该蛋白质允许对哺乳动物细胞进行选择(哺乳动物选择)。
48.图5a描述了一个分裂营养缺陷筛选系统的示例性实施例，该系统允许在单一选择压力下稳定维持两个整合的核酸构建体。其中一个构建体负责编码哺乳动物二氢叶酸还原酶(dhfr)的n端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“nter-dhfr”)。这个n端片段无酶促功能。另一个构建体负责编码dhfr的c端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“cter-dhfr”)。这个c端片段无酶促功能。当细胞中同时表达这两个片段时，通过亮氨酸拉链肽的结合形成功能性dhfr酶复合物。通过在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长(-ht选择)，这两个构建体可以稳定地维持在dhfr裸细胞的基因组中。
49.图5b显示了在图1的多构建体系统中这种分裂营养缺陷筛选设计在其预触发状态下的示例性部署。在本示例中，分裂营养缺陷筛选元件被部署在构建体1和3中。一个单独的示例性抗生素选择方法(杀稻瘟菌素抗性)部署于构建体2中。这可允许通过在含有单一抗生素杀稻瘟菌素且缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基中培养实现在哺乳动物细胞系中稳定地维持所有三个构建体。
50.图6显示了所有3个构建体在加入他莫昔芬和触发剂之后的触发后状态。当存在触发剂时，腺病毒e2a和e4辅助蛋白将被表达。aav rep和cap编码序列的表达受内源性启动子的控制。有效载荷的表达受到组成型启动子的控制，从而产生包装了有效载荷的raav病毒粒子。三个整合的构建体在单一抗生素(杀稻瘟菌素)和营养缺陷筛选(同时缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基)的作用下被稳定地维持在核基因组中。
51.图7a-7b是光学显微镜图像和荧光显微镜图像。光学显微镜图像显示在左侧条形图。绿色荧光图像显示在中间栏。红色荧光图像显示在右侧条形图。加入不同数量的含有cre蛋白和红色荧光标记蛋白的cre囊泡后，采用以下其中一种方式对细胞进行模拟转染(“模拟”)，即采用具有构建体1的质粒(“aav2 code”)或能够表达rep和cap蛋白的对照aav2质粒(“aav2”)进行转染。在不添加cre(图7a)的情况下，只有采用含有构建体1质粒转染的细胞才会显示出密集绿色荧光，提示rep-egfp融合蛋白被表达(见图3a底部)。图7b显示了在cre数量越来越多的情况下，egfp荧光减弱，表明发生了重组以及构建体1egfp基因盒的后续敲除。
52.图8a-8b是蛋白质免疫印迹图和图表，其中显示了触发后质粒构建体1生产的rep。图8a显示了蛋白质免疫印迹(western blot)，表明可切除间隔区的cre介导切除诱导了触发后质粒构建体1的rep蛋白生产。此外，兔β球蛋白内含子的存在并不影响rep蛋白的表达水平。图8b是rep/cap多核苷酸构建体的示意图，该构建体被克隆到具有杀稻瘟菌素抗性基
因(seq id no:8)的piggybac载体中。负责阻断rep基因的可切除元件被插入p19启动子的下游。与亲本细胞系的细胞相比(顶部的facs图)，gfp水平证实了在stxc0068细胞系的细胞中成功整合了rep/cap构建体(底部的facs图)。stxc0068细胞系的细胞密度(上图)和活力(下图)数据图表说明，整合的aav序列无副作用。左侧蛋白质免疫印迹图显示产生了rep蛋白，右侧蛋白质免疫印迹图显示了亲本细胞系、添加cre后的亲本细胞系、stxc0068细胞系和添加cre后的stxc0068细胞系的总蛋白。
53.图9a是pkr通路的相互作用示意图。
54.图9b显示了va rna构建体的示意图，以及展示了双链rna(dsrna)结构的va rna1序列图。
55.图10a-10b显示了由va rna构建体组成的质粒的描述(图10a)和测试(图10b)，这些构建体包括野生型va rna(phelper)构建体、va rna敲除(stxc002)构建体和带补偿性病毒蛋白的va rna敲除(感染细胞蛋白34.5(icp34.5)；stxc0016)构建体，用于评估va rna对aav滴度的影响。
56.图11a-11b显示了由va rna启动子突变体组成的质粒的描述(图11a)和测试(图11b)，以了解贴壁hek293细胞中的va rna相对表达。
57.图12a-12d显示了含有突变型va rna的诱导型u6启动子片段的设计(图12a)，对照质粒和测试质粒的质粒描述(图12b)，以及lv max细胞中va rna的相对表达(图12c和12d)，并且演示了用诱导型启动子拯救选择突变体。
58.图13a-13b是一些图表，其显示了使用图12b中的突变型和诱导型va rna构建体在hek293t细胞(图13a)和lv max细胞(图13b)中获得的滴度结果。
59.图14显示了stx_c002的质粒图，stx_c002是一个无va rna表达的辅助质粒(缺少va rna)。
60.图15显示了stx_c0032的质粒图，stx_c0032是一个包含wt va rna的stx_c002辅助质粒骨架。
61.图16显示了stx_c0033的质粒图，stx_c0033是一个stx_c002的辅助质粒骨架，其包含va rna1 b1突变体(这是一个从b框中敲除的含有6个核苷酸的片段)，并且含有逆向va rna。
62.图17显示了stx_c0036的质粒图，stx_c0036是一个含有va rna突变g16a和t45c的stx_c002辅助质粒，并且含有逆向va rna)。
63.图18显示了stx_c0041的质粒图，stx_c0041是通过修饰含有va rna1b1突变体的stx_00033辅助构建体(这是一个从b框中敲除的含有6个核苷酸的片段)使其含有u6诱导型启动子构建体(如图12a所示)来制备的。图中显示了新的u6启动子和lox位点的位置。
64.图19显示了stx_c0042的质粒图，stx_c0035是通过修饰含有va rna突变g16a和t45c的stx_c0035辅助质粒使其含有u6诱导型启动子构建体(如图12a所示)来制备的。图中显示了新的u6启动子和lox位点的位置。
65.图20显示了stx_c0043的质粒图，stx_c0043是通过修饰含有va rna突变g16a和g60a的stx_c0037辅助质粒来制备的。图中显示了新的u6启动子和lox位点的位置。
66.图21显示了含有va rna突变g16a和g60a的stx_c0037质粒图。
67.图22是一个示意图，其显示了示例性稳定细胞系(p2生产用细胞系)的生产过程，
该细胞系包含一个rep/cap构建体、一个诱导型辅助构建体、以及一个含有有效载荷构建体并将有效载荷(兴趣基因)包装入病毒粒子中的构建体。p1辅助细胞系是由1号诱导型辅助构建体或2号诱导型构建体整合至无血清悬液适应型293细胞中产生的。
68.图23显示了质粒图，以及在瞬时转染系统中使用可诱导双顺反子构建体生产rep的图片。
69.图24显示了stxc0090和stxc0110构建体的示意图，说明了辅助构建体以及使用teton系统进行的cre诱导。
70.图25显示了va rna突变型构建体以及各种启动子和选项的示意图。
71.图26显示了，在模拟诱导、无诱导或cre诱导之后，通过稳定整合stxc-0123(t33，左图)、stxc-0124(t34，左图)或stxc-0125(t35，右图)辅助构建体的细胞表达flag标记e2a的染色情况。
72.图27显示了含有稳定整合辅助质粒的hek293细胞的概况，这种辅助质粒无细胞毒性，可诱导cre和生产va rna，以及具有e2a表达的良好分布。
73.图28显示了生产稳定细胞系池的工作流程。左侧的示意图和工作流程说明了生产t33细胞系池的stxc0123整合过程，在此过程中，进一步整合stxc0137和stxc0136，以产生三个稳定细胞系池(t40、t41和t42)。右侧的示意图和工作流程说明了生产t44细胞系池的stxc0133整合过程，在此过程中，进一步整合stxc0137和stxc0136，以产生三个稳定细胞系池(t56、t57和t58)。然后，用多西环素和他莫西芬处理稳定细胞系池，以产生stxc650衣壳化病毒粒子。
74.图29显示了t33细胞系池和t44细胞系池(图28)的活细胞密度(左图)和活力(右图)图，并说明了整合质粒构建体无副作用。
75.图30显示了未被诱导或诱导后在t33稳定细胞系、t44稳定细胞系和亲本细胞系(vpc)中e2a表达、va rna表达、培养细胞密度和活力的图表。左图是诱导后24小时的情况，右图是诱导后48小时的情况。
76.图31显示了图28中所示的t40、t41和t42细胞系池的活细胞密度(左图)和活力(右图)图表。
77.图32显示了t59、t60和t61细胞系池的活细胞密度(右图)和活力(左图)的图表，这些细胞系池的生产方式与图28中所示的t56、t57和t58细胞系池相同。
78.图33显示了t42稳定细胞系池诱导后的衣壳产量曲线图，并且与各种细胞培养基中通过瞬时三重转染(3xtfxn)生产的细胞进行了比较(aav、bal、cyt 2、cyt9、fuji 7、fuji 7-2、he300、ts1、ts3、或ts5)。每种培养基类型的左侧条形图表示衣壳总滴度，其右侧条形图表示病毒基因组(例如，有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。
79.图34显示了，在he300培养基中进行(+)或不进行(-)诱导时，t42稳定细胞系池、t59稳定细胞系池、t60稳定细胞系池和t61稳定细胞系池的病毒基因组(例如，有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。
80.图35显示了感染性，即用t42稳定细胞系池的衣壳感染靶细胞(cho pro-5细胞)后，与t61稳定细胞系池相比，在各种培养基中的gfp+细胞百分比。每种细胞系类型/培养基的左侧条形图是稀释系数为1的数据，其右侧条形图是稀释系数为4的数据。
81.图36显示了在各种细胞培养基中诱导后采用t42稳定细胞系池和三重转染亲代细
胞系(vpc)各细胞所得到的病毒基因组(例如，有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度图，并两者进行了对比。每种培养基类型的左侧条形图表示采用t42稳定细胞系池各细胞所生产的病毒基因组衣壳化的衣壳滴度，其右侧条形图表示采用三重转染亲代细胞系(vpc)各细胞所生产的病毒基因组衣壳化的衣壳滴度。
82.图37显示了在不同细胞培养基中以不同种子密度诱导后采用t42稳定细胞系池所得到的病毒基因组(例如有效载荷构建体)衣壳化的稀释调节滴度图。3x tfxn虚线表示采用瞬时三重转染(3xtfxn)后细胞所生产的病毒基因组(例如有效载荷构建体)衣壳化的稀释调节滴度图。
83.图38显示了在含有选自t42稳定细胞系池的迷你池克隆细胞vs.诱导后t42稳定细胞系池的不同细胞培养基中的衣壳总滴度图。
84.图39显示了感染性，表示为使用衣壳感染靶细胞(cho pro-5细胞)后的gfp+细胞(有效载荷衣壳化)百分比与图38所述各种细胞培养基中选自t42稳定细胞系池的迷你池克隆细胞的感染倍数(vg/细胞)的对比。(对照品是由细胞瞬时转染后产生的纯化衣壳)。
85.图40显示了感染性，表示为使用衣壳感染靶细胞(cho pro-5细胞)后的gfp+细胞(有效载荷衣壳化)百分比与图38所述各种细胞培养基中选自t42稳定细胞系池的迷你池克隆细胞的感染倍数(vg/细胞)的对比。插入对照显示了感染性，表示为使用衣壳感染靶细胞(cho pro-5细胞)后的gfp+细胞(有效载荷衣壳化)百分比与瞬时转染后细胞产生的纯化衣壳的感染倍数(vg/细胞)的对比。5.详细说明
86.为了解决瞬时转染法生产raav病毒粒子所带来的问题，同时解决组成型aav rep蛋白表达所带来的毒性问题，本发明披露了多核苷酸构建体以及与所述多核苷酸构建体稳定整合的细胞系(均指“稳定细胞系”)，它们能够有条件地(均指“诱导性”)生产重组aav(raav)病毒粒子。在一些实施例中，本发明披露的药用组合物及其使用方法介绍了能够衣壳化所需可表达有效载荷(例如可表达治疗有效载荷)的raav病毒粒子。本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒；其稳定细胞产生的病毒粒子群相比于其他类似细胞(在瞬时转染时产生raav病毒粒子)产生的病毒粒子群具有更高的同质性。
87.本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒；并且在加入触发剂后，可诱导产生病毒粒子。
88.本发明进一步提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地生产包装有可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒粒子；并且病毒粒子的产生不取决于细胞内是否存在质粒。5.1.定义
89.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的含义。
[0090]“重组”，当应用于aav病毒粒子时，则表示raav病毒粒子(同义，raav病毒粒子)是一个或多个程序的产物，这些程序产生的aav病毒粒子构建体不同于自然界的aav病毒粒子。
[0091]
在某些方面，本发明公开提供了转染宿主细胞。术语“转染”是指细胞吸收外来dna
的过程，当外源dna被导入细胞膜内时，细胞就被“转染”了。许多转染技术在本领域中是众所周知的。请参见，例如，graham等人(1973)，“病毒学”，52:456；sambrook等人(1989)，“分子克隆”，“实验室手册”，科尔德斯普林实验室(cold spring harbor laboratories)，美国纽约；davis等人(1986)，“分子生物学基本方法”；elsevier和chu等人(1981)，“基因”，13:197.这种技术可用于将一种或多种外源核酸(例如核苷酸整合载体和其他核酸分子)导入合适的宿主细胞中。
[0092]“宿主细胞”是指任何含有或能够含有某种相关物质的任何细胞。通常情况下，宿主细胞是一种哺乳动物细胞。宿主细胞可作为aav辅助构建体、aav小基因质粒、辅助功能载体或与重组aav生产相关的其他转移dna的受体。该术语包含已转染的原始细胞的后代。因此，“宿主细胞”可以指被外源性dna序列转染的细胞。可以理解的是，由于自然的、偶然的或刻意的突变，单个亲代细胞的后代在形态学或基因组或总dna补体方面不一定与原始亲代完全相同。本文所用的“宿主细胞”可指任何能够作为腺病毒包装细胞的哺乳动物细胞，即表达生产aav所必需的任何腺病毒蛋白，如hek 293细胞及其衍生物(hek293t细胞、hek293f细胞)、hela、a549、vero、cho细胞或cho衍生细胞、以及其他包装细胞。
[0093]
本文所用的术语“细胞系”是指能够在体外持续或长时间生长和分裂的细胞群。通常情况下，细胞系是由单一祖细胞衍生出来的克隆种群。在本领域中，更为众所周知的是，在储存或转移这些克隆种群的过程中，核型会发生自发或诱发的变化。因此，从所述细胞系衍生的细胞可能与祖细胞或培养物不完全相同，并且所述细胞系包括此类变异体。
[0094]
本文所用的术语“重组细胞”是指导入了外源dna片段的细胞，如导致生物活性多肽的转录或生物活性核酸(如rna)的产生的dna片段。
[0095]
术语“细胞培养”涉及贴壁或悬浮生长的细胞、生物反应器、滚瓶、hyperstack、微球、大球、烧瓶等，以及上清液或悬浮液本身的成分，包括但不限于raav颗粒、细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、宿主细胞蛋白、核酸和脂类以及絮凝剂。大规模生产方法(如生物反应器)包括悬浮培养物和附着在搅拌式生物反应器中的微载体或大载体上的贴壁细胞，也包含在术语“细胞培养”中。本发明公开包括用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养程序。
[0096]
本文所用的术语“中间细胞系”是指含有整合至宿主细胞基因组中的aav rep和cap组分的细胞系或含有整合至宿主细胞基因组中的腺病毒辅助功能的细胞系。
[0097]
本文所用的术语“包装细胞系”是指含有整合至宿主细胞基因组中的aav rep和cap组分以及腺病毒辅助功能的细胞系。有效载荷构建体必须加入到包装细胞系中以产生raav病毒粒子。
[0098]
本文所用的术语“生产用细胞系”是指含有aav rep和cap组分、腺病毒辅助功能和有效载荷构建体的细胞系。rep和cap组分以及腺病毒的辅助功能被整合至宿主细胞基因组中。有效载荷构建体可被稳定整合入宿主细胞基因组中或被瞬时转染。在没有任何质粒或转染剂的情况下，引入一种或多种触发剂后，生产用细胞系可产生raav病毒粒子。
[0099]
本文所用的术语“下游纯化”是指将raav病毒粒子从细胞和其他杂质中分离出来的过程。下游纯化过程包括基于色谱法的纯化过程，如离子交换(iex)色谱法和亲和色谱法。
[0100]
术语“纯化前产量”是指在下游纯化过程之前的raav产量。术语“纯化后产量”是指
经过下游纯化过程后的raav产量。raav产量可以用病毒基因组(vg)/l衡量。
[0101]
raav病毒粒子群的衣壳化比率可以用raav病毒颗粒(vp)与病毒基因组(vg)的比率来衡量。raav病毒颗粒包含空衣壳、部分全衣壳(例如，包含部分病毒基因组)和全衣壳(例如，包含全病毒基因组)。
[0102]
raav病毒粒子群的f:e比率可以用raav全衣壳与空衣壳的比率来衡量。raav全衣壳颗粒包含部分全衣壳(例如，包含部分病毒基因组)和全衣壳(例如，包含全病毒基因组)病毒颗粒。空衣壳不含病毒基因组。
[0103]
raav病毒粒子群的效力或感染性可以用指定病毒感染复数(moi；病毒基因组/靶细胞)条件下被raav病毒感染的靶细胞百分比来衡量。示例性moi值为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。moi可以是从1
×
10
1-1
×
105vg/靶细胞范围内所选择的任一数值。
[0104]
本文所用的术语“载体”包含任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转位子、黏质体、染色体、人造染色体、病毒、病毒粒子等，当与适当的控制元件相关联时，它能够进行复制，并能在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包含克隆载体和表达载体以及病毒载体。本说明书中使用的术语“载体”是指质粒或病毒载体，其允许通过转染或感染将所需组分转移到宿主细胞中。例如，腺相关病毒(aav)载体是一个包含重组aav基因组的质粒。在一些实施例中，有用的载体被认为是待转录的核酸片段受到启动子转录控制的载体。
[0105]
短语“操纵性定位”、“操纵性连接”、“受控”或“转录受控”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的启动和基因的表达。
[0106]
术语“表达载体或构建体”或“合成构建体”是指含有核酸的任何类型的遗传构建体，在其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施例中，表达过程包括核酸的转录，例如，通过转录的基因产生具有生物活性的多肽产品或功能性rna(例如，向导rna)。
[0107]
本文所用的术语“营养缺陷”或“营养缺陷筛选标记物”是指使用缺乏补充物的培养基，如缺乏嘌呤前体次黄嘌呤和胸苷(ht)等必需营养物的培养基，旨在选择能够在缺乏必需营养物的培养基中生长的功能酶，例如功能性二氢叶酸还原酶或类似物。
[0108]
本文所用的术语“细胞阻滞剂”是指抑制细胞生长的细胞成分或药剂/元件或条件。细胞阻滞是对细胞生长和繁殖的抑制。
[0109]
本文所用的术语“细胞毒性”是指对细胞具有毒性的性质。例如，暴露在细胞毒性试剂或毒性条件下的细胞可能会发生坏死，在这种情况下，它们会由于细胞裂解而失去膜完整性并迅速死亡。暴露在细胞毒性试剂中的细胞也可以停止主动生长和分裂(细胞活力降低)，或者细胞可以激活一个受控细胞死亡(细胞凋亡)的基因程序。
[0110]
本文所用的“单克隆细胞系”或“单克隆性”用来描述通过重复细胞复制过程基于单个祖细胞产生的细胞。因此，“单克隆细胞”可以被称为形成单个克隆。
[0111]
术语“四环素”在本文中一般用于指在结构和功能上与四环素有关的所有抗生素，包含四环素、多西环素、地美环素、米诺环素、沙瑞环素、土霉素、奥马环素或依拉环素。
[0112]
术语“组成型”或“组成型表达”在此可互换使用。它们指的是以持续方式转录的基因。在一些实施例中，这些术语指的是治疗性载荷或核酸序列的表达，其不取决于是否向细胞培养基中添加表达触发剂。
[0113]
术语“可表达的治疗性多核苷酸”或“编码有效载荷的可表达多核苷酸”或“有效载
荷多核苷酸”或“有效载荷”是指在aav基因组载体(“aav基因组载体”)中编码的多核苷酸，两侧为aav末端反向重复序列(itr)。本文公开的有效载荷可以是治疗性有效载荷。有效载荷可包含以下任何一种或组合：转基因、trna抑制剂、向导rna或任何其他靶结合/修饰寡核苷酸或其衍生物，或者有效载荷可以包括疫苗的免疫原和任何基因编辑机制(dna或rna编辑)的元件。有效载荷也可以包括传递转基因编码的抗体链或片段，这些抗体链或片段可以通过病毒载体介导表达(也称为用于基因导入的“载体抗体或载体化抗体”)。请参见，例如，curr opin hiv aids，2015年5月；10(3)：190-197页，介绍了用于预防或治疗艾滋病毒感染的载体抗体基因导入。另见第10780182号美国专利，其中描述了用于治疗her2+脑转移瘤的曲妥珠单抗(herceptin)的aav导入。本发明公开的有效载荷可能不是治疗性有效载荷(例如，可检测标记物如gfp的编码)。
[0114]
特别是在某些情况下，有效载荷多核苷酸是指一种多核苷酸，它可以是用于同源定向修复的同源性元件，也可以是用于各种目的的待导入向导rna。在一些实施例中，转基因是指为表达向导rna而编码的核酸序列，用于adar编辑或adat编辑。在一些实施例中，转基因指的是包装用于基因治疗的转基因。在一些实施例中，转基因指的是包装用于疫苗的合成构建体。5.2.系统概述
[0115]
稳定哺乳动物细胞系依靠的是在细胞的核基因组中稳定地整合和维持多个合成核酸构建体。其中一个构建体允许诱导性表达一个由激素激活的切除元件。切除元件可以是一种重组酶。重组酶可以是一个位点特异性的重组酶。位点特异性重组酶可以是cre多肽或翻转酶。触发cre表达会导致基因组重排，进而导致腺病毒辅助蛋白的表达、aav rep和cap蛋白的表达，以及raav的生产，也可以选择衣壳化治疗性有效载荷(如转基因、trna抑制剂、向导rna或其他寡核苷酸)。
[0116]
图1描述了一个示例性实施例的预触发状态。在所示的实施例中，三种合成核酸构建体分别整合至表达腺病毒e1a和e1b的细胞系(例如hek 293细胞)的核基因组中。在预触发状态下，构建体1上的转录通读被中间间隔区所阻断。构建体3上的有效载荷多核苷酸的两侧是aav itr，用括号表示。
[0117]
图2a-2c更详细地显示了一个示例性构建体2。这种构建体允许条件性表达cre。在一些实施例中，构建体2包含位于e2a序列和e4序列之间的p2a序列。在一些实施例中，构建体2包含位于e2a序列和e4序列之间的核糖体内部进入位点(ires)序列。在一些实施例中，构建体2的诱导型启动子系统是tet on诱导型启动子系统。在一些实施例中，构建体2的诱导型启动子系统是tet off诱导型启动子系统。在一些实施例中，构建体2的诱导型启动子系统是cumate诱导型启动子系统。
[0118]
在预触发状态(图2a的顶部)，cre编码序列受诱导型启动子的控制。例如，诱导型启动子是tet诱导型启动子。在没有触发剂的情况下，诱导型启动子是非活化的。例如，tet诱导型启动子的触发剂是四环素。在没有四环素的情况下，如多西环素(“dox”)，tet激活蛋白(teton3g)无法结合和激活基础的tet on启动子。此外，cre的定位受雌激素反应元件(“er2”)的控制，需要与雌激素激动剂或选择性调节剂(如他莫昔芬)结合，才能从细胞质易位至细胞核。这种方法限制了预触发cre表达，进而导致混杂重组事件和毒性。er2的cre元件还包含一个强3’端聚腺苷酸化信号，它可以阻止下游腺病毒辅助基因e2a和e4的基础表
达。在一些实施例中，cre被分割成两个片段，当存在化学制剂(如雷帕霉素)时，这两个片段可以融合。在一些实施例中，cre是一种光诱导型cre。
[0119]
当培养基中加入触发剂(如dox)和他莫昔芬时，teton3g与tet反应性基础启动子结合，此时，雌激素反应元件被激活，触发cre表达(图2a底部)。在cre蛋白质翻译并随后易位到细胞核中之后，cre从构建体2中切除其自身的编码序列，得到图2b底部所示的整合构建体。通过敲除上游多腺苷酸化位点，可允许表达e2a和e4辅助蛋白，当存在多西环素的情况下可以维持这种表达。类似地，对于图2c所示的可选附加插入物，可在cre介导下切除填充片段序列来表达va-rna，从而激活u6启动子，然后驱动va rna表达。
[0120]
图3a-3b是构建体1的一个示例性实施例详情示意图。该构建体设计用于防止在触发事件前表达aav rep，但在触发事件后允许利用其内源性启动子表达aav rep和cap蛋白。
[0121]
图3a显示了整合核酸构建体1的预触发状态。一个可切除间隔物中断了rep编码序列，阻断了全长rep编码序列的转录通读。图中底部显示了一个预触发转录本。该预触发转录本负责编码aav rep的5’端，使该部分融合至荧光标记蛋白egfp中。该转录本含有一个内含子，内含子的两侧分别是5’端和3’端剪接位点。通过常规剪接可产生一个编码融合蛋白的转录本，其中包括与增强型绿色荧光蛋白(egfp)融合的rep的n端部分。融合蛋白没有全长rep蛋白的毒性，并且可以通过egfp荧光检测细胞基因组中是否存在预触发构建体1，以进行质量控制。在一些实施例中，egfp的荧光被用来选择含有整合核酸构建体1的细胞，然后利用这些细胞形成稳定的细胞池。因此，通过筛选出egfp表达细胞，可以产生含有整合核酸构建体1的稳定细胞池。
[0122]
如图3a顶部所示，可切除间隔区包含第一间隔区、第二间隔区和第三间隔区。图3b显示了，当暴露于细胞核内的cre时，预触发构建体(上图)转变为触发后状态(下图)。cre负责切除第二间隔区，其中包含egfp标记编码序列和上游3’端剪接位点。经过重排，该构建体现在允许通过其各自的内源性启动子表达功能性rep和cap转录本，如图3b底部所示。不再表达egfp，则表明cre介导的基因组重组取得成功。
[0123]
图4是构建体3的一个示例性实施例，它是一个示例性有效载荷构建体。构建体3包含一个有效载荷编码序列。这个序列元件受一个组成型启动子的控制。有效载荷可以是任何有效载荷，其中由raav充当合适的载体，其中包括编码兴趣蛋白的转基因、用于同源重组修复的同源元件、或向导rna。有效载荷的两侧是aav itr，用括号表示。
[0124]
图6显示了在细胞培养基中加入他莫昔芬和多西环素后所有3个构建体的触发后状态。在诱导型启动子的控制下(如当存在dox时激活的tet-on启动子)，通过整合构建体2表达腺病毒e2a和e4辅助蛋白。在内源性启动子的控制下，通过构建体1表达aav rep和cap编码序列。在组成型启动子的控制下表达有效载荷，从而产生有效载荷衣壳化的raav病毒粒子。
[0125]
与当前的aav生产系统相比，在有效载荷的导入过程中，这种方法提供了许多好处。
[0126]
将构建体稳定地维持在细胞基因组中需要选择压力。为了减少在细胞系基因组内稳定维持三个整合构建体所需的筛选剂(特别是抗生素)数量，我们设计了一种方法，通过单一抗生素筛选和加上单一营养缺陷筛选，在核基因组中稳定地维持所有三个构建体。
[0127]
图5a显示了一个分裂的营养缺陷筛选系统，该系统允许在单一选择压力下稳定地
维持两个整合的核酸构建体。其中一个构建体负责编码哺乳动物二氢叶酸还原酶(dhfr)的n端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“nter-dhfr”)。这个n端片段无酶促功能。另一个构建体负责编码dhfr的c端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“cter-dhfr”)。这个c端片段无酶促功能。当细胞中同时表达这两个片段时，通过亮氨酸拉链肽的结合形成功能性dhfr酶复合物。通过在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长，这两个构建体可以稳定地保留在dhfr裸细胞的基因组中。
[0128]
图5b显示了在图1的多构建体系统中这种分裂营养缺陷筛选设计在其预触发状态下的示例性部署。在这个示例中，分裂营养缺陷筛选元件被部署在构建体1和3上。在构建体2上部署了一个单独的示例性抗生素选择方法，即杀稻瘟菌素抗性。这使得我们能够使用单一抗生素，在含有杀稻瘟菌素、缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基中进行培养，从而在哺乳动物细胞系中稳定地维持所有三个构建体。
[0129]
在触发和cre介导基因组重排之后，选择元件保持不变，允许在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中使用单一抗生素继续维持三个触发后的整合构建体。
[0130]
形成aav病毒粒子所需的病毒蛋白被宿主细胞机制所抑制。这些宿主细胞机制抑制(以使本文所述的稳定细胞系中的aav病毒滴度最大化)包括但不限于：敲除起始细胞系(p0)中的pkr(pkr ko)(该通路负责抑制病毒蛋白)，在起始细胞系(p0)中引入突变型eif2α(在pkr通路中)，和/或操纵或调节病毒相关(va)rna(va rna，pkr抑制剂)。腺病毒的病毒相关(va)rna发挥小干扰rna的作用，并且转录于载体基因组。这些va rna可以触发先天性免疫反应。此外，va rnas被加工成功能性病毒mirna，可干扰许多细胞基因的表达。因此，va缺失的腺病毒载体生产构建体(adv)将是有利的，这种构建体不含va rna基因或含有修饰va rna。然而，va缺失的腺病毒载体生产构建体(adv)不能满足大规模商业生产所需的aav滴度(例如，生产出数量较少且质量较差的病毒粒子)。相反，过量表达va rna也会导致生产出低滴度的aav，从而不可能扩大商业生产规模。因此，通过研发条件性va rna构建体，并将任何这些优化的构建体与本文所述的条件性辅助构建体相结合，将使本文所述的aav生产系统能够提供满足商业生产需求的高质量病毒粒子。这三种策略都可以任意组合。
[0131]
va rna也是一种pkr抑制剂，参与了aav病毒蛋白合成抑制通路。特别是，pkr磷酸化eif2α，从而抑制病毒蛋白合成。图4a是va rna抑制pkr的示意图，pkr通路如左下图所示。图4b显示了va rna的结构，va rna是一种双链rna(dsrna)。
[0132]
虽然我们已经了解了va rna、pkr和eif2α之间有限的相互作用，但pkr是一种可能自我磷酸化的主要激酶，eif2α可能被其他激酶磷酸化。就这一点来说，有三种策略(pkr ko、eif2α突变、va rna操纵)正在研发中，以便在本文所述的aav生产系统中任意组合使用。
[0133]
因此，修饰va rna的表达是克服aav病毒粒子的哺乳动物细胞生产方法的一般抗病毒作用的一种选择。为此，一种va缺失的腺病毒载体生产构建体(adv)被设计了出来，这种构建体不含va rna基因或含有修饰va rna，如图2c和图4-15中所述。需要指出的是，va缺失的adv不能满足大规模商业生产所需的aav滴度(例如，生产出数量较少且质量较差的病毒粒子)。相反，过量表达va rna也会导致生产出低滴度的aav，从而不可能扩大商业生产规模。因此，通过研发条件性va rna构建体，并将任何这些优化的构建体与本文所述的条件性辅助构建体相结合，将使本文所述的aav生产系统能够提供满足商业生产需求的高质量病毒粒子。图2c和图4-15介绍了各种经过修饰和诱导的突变型va rna构建体及其对病毒粒子
生产的影响。与目前的aav生产系统相比，这些不同的方法提供了许多益处。5.3.条件性表达
[0134]
第一方面，提供了稳定细胞系。在一些实施例中，稳定细胞系是哺乳动物稳定细胞系。细胞能够有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。在一些实施例中，细胞能够有条件地产生raav病毒粒子。在一些实施例中，上述raav病毒粒子被包装了一个可表达有效载荷。在一些实施例中，上述raav病毒粒子被包装了一个有效载荷编码序列。在优选实施例中，病毒粒子的产生不以细胞内存在游离基因或独立质粒为条件。
[0135]
在一些实施例中，aav rep是条件性表达的。在一些实施例中，aav rep和cap蛋白是条件性表达的。在某些实施例中，表达aav rep和cap蛋白的前提条件是向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂。在某些实施例中，表达aav rep和cap蛋白的前提条件是向细胞培养基中加入第一表达触发剂和第二表达触发剂。
[0136]
在含有触发剂的系统中，多西环素是一种合适的触发剂。在某些实施例中，可以使用多西环素控制tet诱导型启动子。另外，可以利用cumate诱导型启动子系统，其中cumate诱导型启动子受cumate的控制。
[0137]
在含有触发剂的系统中，多西环素是一种合适的触发剂。在某些实施例中，多西环素被用于控制tet诱导型启动子。另外，可以利用cumate诱导型启动子系统代替tet诱导型启动子，后者受cumate的控制。
[0138]
可以使用任何合适的诱导型剪切剂(如重组酶)。剪切剂可以是一种重组酶。剪切剂可以是一种位点特异性重组酶。剪切剂可以指向一个重组位点。合适的诱导型剪切剂示例包括cre和翻转酶。cre元件可以是荷尔蒙激活的cre或光诱导型cre。重组位点可以是一个lox位点。lox位点可以是一个loxp位点。重组位点可以是一个frt位点。
[0139]
翻转酶重组酶系统基于flp-frt重组，这是一种位点定向重组技术，用于在体内受控条件下操纵dna。这种重组酶系统类似于cre-lox重组，但是其通过来自2μ面包酵母质粒的重组酶翻转酶(flp)，在短翻转酶识别靶(frt)位点之间进行序列重组。flp蛋白(非常类似于cre)是一种酪氨酸家族的位点特异性重组酶。
[0140]
在典型的实施例中，在向细胞培养基中同时加入第一和第二表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞毒性水平的rep蛋白。在某些实施例中，在向细胞培养基中同时加入第一和第二表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞阻滞水平的rep蛋白。在某些实施例中，细胞内rep蛋白的平均浓度低于向细胞培养基中添加第一和第二表达触发剂之前的浓度。在一些实施例中，在向细胞培养基中至少加入所有这些第一表达触发剂后，rep和cap蛋白表达成为组成型蛋白。
[0141]
在一些实施例中，至少一个腺病毒辅助蛋白是条件性表达的。
[0142]
在某些实施例中，在向细胞培养基中至少加入第三表达触发剂之后，才能触发至少一种腺病毒辅助蛋白的表达。在特定的实施例中，第三表达触发剂与第一表达触发剂相同。在某些实施例中，在向细胞培养基中加入第三表达触发剂和第四表达触发剂之后，才能触发腺病毒辅助蛋白的表达。在特定的实施例中，第四表达触发剂与第二表达触发剂相同。在特定的实施例中，第三表达触发剂与第一表达触发剂相同，第四表达触发剂与第二表达触发剂相同。
[0143]
在一些实施例中，在通过细胞与至少第三表达触发剂接触而触发腺病毒辅助蛋白
的表达之后，只有细胞培养基中仅存在第三表达触发剂时才能继续表达腺病毒辅助蛋白。在某些实施例中，第三触发剂与第一触发剂相同。
[0144]
在一些实施例中，至少一种腺病毒辅助rna是条件性表达的。在某些实施例中，腺病毒辅助蛋白包含ad e2a。在某些实施例中，腺病毒辅助蛋白包含ad e4。在一些实施例中，腺病毒辅助蛋白被标记。标签可以是蛋白质标签。蛋白质标签可以是flag标签。在某些实施例中，e2a是flag标记的。在一些实施例中，e4是flag标记的。
[0145]
在特定的实施例中，腺病毒辅助rna是一种va rna。在特定的实施例中，腺病毒辅助rna是一种诱导型va rna构建体。在一些实施例中，va rna是一种突变型va rna。在一些实施例中，va rna是一种转录死亡va rna。在一些实施例中，va rna受u6启动子的控制。
[0146]
在一些实施例中，第三表达触发剂是四环素。在某些实施例中，四环素是多西环素(“dox”)。在一些实施例中，第四表达触发剂是一种雌激素受体配体。在某些实施例中，雌激素受体配体是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。在特定的实施例中，雌激素受体配体是他莫西芬。
[0147]
在稳定细胞系的一些实施例中，表达有效载荷的前提条件是在细胞培养基中至少加入第五表达触发剂。在一些实施例中，有效载荷的表达不以在细胞培养基中加入表达触发剂为条件。
[0148]
在一些实施例中，在只向细胞培养基中加入一种表达触发剂后，rep和cap蛋白、腺病毒辅助蛋白和有效载荷的表达成为组成型。在某些实施例中，在只向细胞培养基中加入一种表达触发剂后，rep和cap蛋白以及腺病毒辅助蛋白的表达成为组成型。
[0149]
在某些实施例中，表达触发剂是第一表达触发剂。在某些实施例中，第一表达触发剂是四环素。在特定的实施例中，第一表达触发剂是多西环素。5.4.合成核酸构建体
[0150]
在典型的实施例中，稳定细胞系的细胞核基因组包含多个整合的合成核酸构建体。通常情况下，多个合成核酸构建体中的每一个都被单独整合至细胞的核基因组中。在一些实施例中，只需要单个非营养缺陷筛选，就可以将所有这些合成核酸构建体稳定地维持在细胞的核基因组中。在一些实施例中，需要抗生素抗性，以便将多个合成构建体稳定地维持在细胞的核基因组中。在一些实施例中，既需要非营养缺陷筛选，也需要抗生素抗性，才能将多个合成构建体稳定地维持在细胞核基因组中。
[0151]
在一些实施例中，细胞的核基因组包含两个整合的合成构建体。
[0152]
在一些实施例中，细胞的核基因组包含三个整合的合成构建体。在特定的实施例中，第一个整合的合成构建体包含条件性表达的aav rep和cap编码序列；第二个整合的合成构建体包含条件性表达的cre编码序列和腺病毒辅助蛋白编码序列；以及第三个整合的合成构建体包含可表达有效载荷编码序列。5.4.1.构建体1(aav rep/cap构建体)
[0153]
本发明公开了编码rep和cap多肽的多核苷酸构建体。在此处提供了第一个多核苷酸构建体，该构建体负责编码rep和cap，并包含间隔区或可切除元件。第一个多核苷酸构建体也被称为rep/cap构建体，和/或“aav rep/cap构建体”。
[0154]
这些多核苷酸构建体被设计成可以稳定地整合至细胞系中，并且只有在有切除元件的情况下才会被触发产生aav rep和cap多肽。在一些实施例中，第一个整合的合成构建
体包含条件性表达的aav rep和cap编码序列。
[0155]
rep序列可以利用任何需要的aav血清型编码rep蛋白。在一些实施例中，编码rep蛋白与cap蛋白来自同一血清型。在一些实施例中，编码rep蛋白与cap蛋白来自不同的血清型。在特定的实施例中，编码rep蛋白包括但不限于来自于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10和aav-11的rep蛋白，或其嵌合类组合体。
[0156]
aav血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，aav-1的完整基因组在genbank登录号nc_002077中提供；aav-2的完整基因组在genbank登录号nc_001401以及srivastava等人在“病毒学杂志(j.virol)”发表的文章(45:555-564(1983))中提供；aav-3的完整基因组在genbank登录号nc_1829中；aav-4的完整基因组在genbank登录号nc_001829中提供；aav-5的基因组在genbank登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在genbank登录号nc_00 1862中提供；aav-7和aav-8基因组的至少一部分分别在genbank登录号ax753246和ax753249中提供(另见与aav-8相关的第7282199和7790449号美国专利)；aav-9基因组在gao等人在“病毒学杂志(virol)”发表的文章(78:6381-6388(2004))中提供；aav-10基因组在mol ther，13(1):67-76(2006)中提供；aav-11基因组在“病毒学”(330(2):375-383(2004))中提供。
[0157]
在图3a所示的示例性实施例中，在细胞与第一表达触发剂接触之前，rep编码序列被中间间隔区所阻断。
[0158]
在特定实施例中，中间间隔区包含(从5’端到3’端)第一间隔区、第二间隔区和第三间隔区。
[0159]
在特定的实施例中，第一间隔区包含连接至第一间隔元件的5’端剪接位点(5’ss)5’。在一些实施例中，第一间隔区包含与seq id no:1有至少80％同源性的核酸序列。
[0160]
在一些实施例中，第二间隔区包含编码可检测蛋白标记物的多核苷酸，其两侧是lox位点。在某些实施例中，可检测蛋白质标记物是一种荧光蛋白。在特定的实施例中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)。在具体实施例中，gfp是egfp。在特定的实施例中，荧光蛋白是一种蓝色荧光蛋白(bfp)。通过筛查荧光标记物可确认构建体是否整合至细胞基因组中，随后可用于确认是否切除中间间隔区。在一些实施例中，第二间隔区进一步包含一个polya序列。在某些实施例中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya。在一些实施例中，第二间隔区进一步包含位于第一lox位点和编码蛋白标记物的多核苷酸之间的第一个3’端剪接位点(3’ss)。
[0161]
在一些实施例中，第二间隔区包含一个与seq id no:2至少有80％同源性的核酸序列。
[0162]
在一些实施例中，第三间隔区进一步包含第二个3’端剪接位点(3’ss)。在特定的实施例中，第二个3’端剪接位点被定位在第二个lox位点的3’端。
[0163]
在一些实施例中，第三间隔区包含与seq id no:3有至少80％同源性的核酸序列。
[0164]
在不同的实施例中，通过操纵将rep编码序列连接至内源性p5启动子。在不同的实施例中，通过操纵将rep编码序列连接至内源性p19启动子。在一些实施例中，在p19启动子的下游位置将rep编码序列插入中间间隔区。
[0165]
在一些实施例中，rep编码序列是cap编码序列的5’端。在某些实施例中，通过操纵将cap编码序列连接至内源性p40启动子。
[0166]
在不同的实施例中，cap蛋白选自禽类aav、牛类aav、犬类aav、马类aav、灵长类aav、非灵长类aav和羊类aav的衣壳蛋白，及其修饰物、衍生物或伪型。
[0167]
在一些实施例中，衣壳蛋白是选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群(如wo2020/033842中所述，在此全文并入作为参考)。wo 2018/160582文件中描述了hu68衣壳蛋白，在此全文并入作为参考。
[0168]
在一些实施例中，衣壳蛋白是包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群的修饰物、衍生物或伪型。
[0169]
在一些实施例中，衣壳蛋白是选自以下两种或多种血清型的衣壳蛋白的嵌合体：aav1、aav2、raav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15和aav.hsc16(如wo2020/033842中所述，在此全文并入以供参考)。在某些实施例中，衣壳蛋白是rh32.33衣壳蛋白，请参见第8999678号美国专利，在此全文并入作为参考。
[0170]
在特定的实施例中，衣壳蛋白是aav1衣壳蛋白。在特定的实施例中，衣壳蛋白是aav5衣壳蛋白。在特定的实施例中，衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。
[0171]
在各种实施例中，第一个整合构建体进一步包含第一哺乳动物细胞选择元件。
[0172]
在一些实施例中，诱导型rep和cap构建体如图8b所示。在一些实施例中，编码rep和cap的可诱导多核苷酸构建体负责编码rep多肽的第一部分、rep多肽的第二部分、cap多肽和可切除元件。可切除元件可以定位在rep多肽的第一部分和rep多肽的第二部分之间。因此，可切除元件可以在rep多肽编码序列上的任何一点中断rep编码序列。如果没有切除元件的剪切作用，则rep多肽会极少表达或根本不表达。在一些实施例中，rep多肽是野生型rep多肽。在其他实施例中，rep多肽是突变型rep多肽。在一些实施例中，cap多肽是野生型cap多肽。在其他实施例中，cap多肽是突变型cap多肽。在一些实施例中，可切除元件包含一个内含子、一个外显子，或一个内含子和一个外显子。在特定的实施例中，可切除元件(从5’端到3’端)包含：5’端剪接位点；包含第一内含子的第一间隔区；包含以下内容的第二间隔区：第一lox序列、3’端剪接位点、外显子、停止信号序列、第二lox序列；以及包含第二内含子的第三间隔区。第一间隔区和第三间隔区可由内源性细胞机制切除。
[0173]
在一些实施例中，可切除元件中的第二间隔区是由cre切除的。cre可以作为任何形式的外源性cre提供，如cre纳米囊泡。cre也可以由第二个多核苷酸构建体负责编码。在一些实施例中，编码腺病毒辅助蛋白的构建体也负责编码cre。在一些实施例中，第二个多核苷酸构建体也是诱导型构建体，如下文4.3.2节中所述。
[0174]
在一些实施例中，rep和cap的表达由天然启动子驱动，包括p5、p19、p40或其任何组合。在一些实施例中，可切除元件的外显子可以是任何可检测标记物。例如，这里考虑的可检测标记物包括发光标记物、荧光标记物或放射性标记物。荧光标记物包括但不限于egfp、gfp、bfp、rfp或其任何组合。
[0175]
在一些实施例中，rep/cap构建体是一种多核苷酸构建体，其中包含：a)rep基因序列的第一部分；b)rep基因序列的第二部分；c)cap基因序列；以及d)位于rep基因序列的第一部分和第二部分之间的可切除元件。在一些实施例中，可切除元件包含一个停止信号序列。在一些实施例中，可切除元件包含一个兔β球蛋白内含子。在一些实施例中，可切除元件包含一个外显子。在一些实施例中，可切除元件包含一个内含子和一个外显子。在一些实施例中，可切除元件包含一个内含子。在一些实施例中，两个剪接位点位于rep基因序列的第一部分和第二部分序列之间。在一些实施例中，两个剪接位点是5’端剪接位点和3’端剪接位点。在一些实施例中，5’端剪接位点是兔β球蛋白5’端剪接位点。在一些实施例中，3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。在一些实施例中，三个剪接位点位于rep基因序列的第一部分和第二部分序列之间。在一些实施例中，三个剪接位点是5’端剪接位点、第一3’端剪接位点、和第二3’端剪接位点。在一些实施例中，第一3’端剪接位点是第二3’端剪接位点的重复。在一些实施例中，第一3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。在一些实施例中，第二3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。在一些实施例中，可切除元件包含一个重组位点。在一些实施例中，重组位点是一个lox位点或frt位点。在一些实施例中，lox位点是一个loxp位点。在一些实施例中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)第一重组位点；c)第一3’端剪接位点；d)停止信号序列；e)第二重组位点；和f)第二3’端剪接位点。在一些实施例中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)第一间隔区；c)第二间隔区，其中包括：i)第一重组位点；ii)第一3’端剪接位点；iii)停止信号序列；和iv)第二重组位点；和d)第三间隔区，包含第二3’端剪接位点。在一些实施例中，第一间隔区序列包含一个内含子。在一些实施例中，第一间隔区包含与seq id no:1具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第二间隔区包含与seq id no:2具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第三间隔区包含与seq id no:3具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第三间隔区包含一个内含子。在一些实施例中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。在一些实施例中，第二间隔区包含一个外显子。在一些实施例中，第二间隔区进一步包含一个polya序列。在一些实施例中，polya序列是外显子的3’端。在一些实施例中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。任何一项权利要求中所述的多核苷酸构建体，其中第二间隔区包含(从5’端到3’端)：a)第一重组位点；b)第一3’端剪接位点；c)外显子；d)停止信号序列；和e)第二重组位点。在一些实施例中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。在一些实施例中，第一lox序列是第一loxp序列，第二lox序列是第二loxp序列。在一些实施例中，第一重组位点是第一frt位点，
第二重组位点是第二frt位点。在一些实施例中，停止信号序列是外显子的终止密码子或polya序列。在一些实施例中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。在一些实施例中，外显子负责编码一个可检测标记物或一个可选标记物。在一些实施例中，可检测标记物包括发光标记物或荧光标记物。在一些实施例中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。在一些实施例中，第二间隔区可被重组酶切除。在一些实施例中，重组酶是一种位点特异性重组酶。权利要求中任一项所述的的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一种激素受体。在一些实施例中，激素受体是一种雌激素受体。在一些实施例中，雌激素受体包含一个点突变。在一些实施例中，雌激素受体是ert2。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre-ert2多肽。权利要求9中所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶由第二个多核苷酸构建体编码或由外源提供。在一些实施例中，rep基因负责编码rep多肽。在一些实施例中，cap基因负责编码cap多肽。在一些实施例中，rep基因和cap基因的转录是由天然启动子驱动的。在一些实施例中，天然启动子包含p5、p19和p40。在一些实施例中，rep多肽是野生型rep多肽。在一些实施例中，rep多肽包含rep78、rep68、rep52和rep40。在在一些实施例中，一个截短复制相关蛋白包含表达于rep基因第一部分序列的多肽和缺少重组酶时表达的外显子。在一些实施例中，cap多肽是野生型cap多肽。在一些实施例中，cap多肽是aav衣壳蛋白。在一些实施例中，aav衣壳蛋白包含vp1、vp2和vp3。在一些实施例中，aav衣壳蛋白的血清型选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。
[0176]
在一些实施例中，rep/cap构建体进一步包含一个可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。该抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
[0177]
在一些实施例中，rep/cap构建体位于载体中。在一些实施例中，rep/cap构建体位
于质粒中。在一些实施例中，rep/cap构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。在一些实施例中，rep/cap构建体是一种合成核酸构建体。在一些实施例中，rep/cap构建体包含与seq id no:1-seq id no:3、seq id 6-seq id no:8、或seq id no:32中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，rep/cap构建体包含与seq id no:1-seq id no:3、seq id 6-seq id no:8、或seq id no:32中的任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
[0178]
在一些实施例中，rep/cap构建体进一步包含va rna编码序列。在一些实施例中，va rna编码序列是一个转录死亡序列。在一些实施例中，va rna编码序列的内部启动子至少包含两个突变。在一些实施例中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，由va rna基因编码序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。在一些实施例中，填充片段序列是可以被重组酶切除的。在一些实施例中，填充片段序列包含基因编码序列。在一些实施例中，填充片段序列包含一个启动子。在一些实施例中，启动子是一个组成型启动子。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。
[0179]
本发明公开的编码rep和cap的诱导型多核苷酸构建体的主要优点包括：在稳定整合至哺乳动物细胞系后，即使在没有转染剂或质粒的情况下，也可诱导rep和cap表达。在一些实施例中，本发明公开的稳定细胞系种群具有同源性。例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的稳定细胞群包含编码rep和cap蛋白的稳定整合的多核苷酸构建体。5.4.2.构建体2(腺病毒辅助构建体(提供e2a/e4))
[0180]
本发明提供了第二个多核苷酸构建体，它负责编码一个或多个腺病毒辅助蛋白。第二个多核苷酸构建体也被称为诱导型辅助构建体(例如，腺病毒辅助构建体(提供e2a/e4))。在某些实施例中，腺病毒辅助构建体负责诱导生产e2a/e4。在一些实施例中，腺病毒辅助蛋白进一步包含一个蛋白质标签。蛋白质标签可以是flag标签。在一些实施例中，e2a是flag标记的e2a。在一些实施例中，e4是flag标记的e4。蛋白质标签(如flag标签)可用于筛选第二个多核苷酸构建体，或确认是否整合第二个多核苷酸构建体，以及确认在诱导后细胞中是否表达第二个多核苷酸构建体的腺病毒辅助蛋白。
[0181]
在一些实施例中，第二个整合的合成构建体包含条件性表达的cre重组酶和腺病毒辅助蛋白。在图2a所示的示例性实施例中，在细胞与至少第三表达触发剂接触之前，第二个整合构建体包含(从5’端到3’端)：诱导型启动子、cre编码序列、第一polya序列、腺病毒辅助蛋白编码序列、第二polya序列、组成型启动子、对第一表达触发剂有反应的蛋白质编码序列和第二哺乳动物细胞选择元件。
[0182]
在典型的实施例中，通过操纵将cre编码序列连接至诱导型启动子。在不同的实施例中，诱导型启动子包含对第三表达触发剂有反应的元件。在某些实施例中，诱导型启动子包含多个四环素(tet)操纵子元件，当存在四环素时，能够与tet反应性激活蛋白结合。在一些实施例中，多个四环素(tet)操纵子元件构成了四环素反应元件(tre)。在一些实施例中，tre含有19个碱基对操纵子序列的7次重复。在更多实施例中，tre包含最小cmv启动子序列上游的19个碱基对操纵子序列的7次重复。
[0183]
在一些实施例中，第二个构建体进一步包含第四表达触发剂反应元件。在某些实
施例中，第四表达触发剂反应元件包含多个激素反应元件。在特定的实施例中，激素反应元件是雌激素反应元件(eres)。在不同的实施例中，第三表达触发元件与第一表达触发元件相同，而第四表达触发元件与第二表达触发元件相同。
[0184]
在一些实施例中，cre编码序列的两侧分别是第一lox位点和第二lox位点。
[0185]
在一些实施例中，诱导型启动子包含多个tet操纵子元件，当存在第三表达触发剂时，这些元件能够与tet反应性激活蛋白结合。在特定的实施例中，第三表达触发剂与第一表达触发剂相同。
[0186]
在一些实施例中，第一polya序列位于cre编码序列和编码腺病毒e2a和e4之一或两者的腺病毒辅助蛋白编码序列之间。强3’端聚腺苷酸化信号位于腺病毒辅助蛋白编码序列的上游(5’到)，可防止下游腺病毒辅助基因e2a和e4的基础表达。
[0187]
在一些实施例中，图2c所示的其他片段能够通过构建体2诱导生产va-rna。
[0188]
在本实施例中其他片段包含cre诱导型u6启动子。u6启动子被lox侧翼填充片段序列分成2个部分。由于填充片段序列的存在，u6启动子是非活化型的。填充片段的cre介导切除激活了u6启动子。u6启动子负责驱动va rna1转录死亡突变体的表达(一个优选的实施例是双点突变型g16a-g60a)。其他实施例提供了va-rna的备选来源。
[0189]
在不同的实施例中，通过操纵将第一表达触发剂反应蛋白的编码序列连接至cmv启动子。在一些实施例中，第一表达触发剂反应蛋白的编码序列包含tet反应性激活蛋白的编码序列。在特定的实施例中，tet反应性激活蛋白是tet-on-3g激活蛋白。
[0190]
在不同的实施例中，第二哺乳动物细胞选择元件用于赋予抗生素抗性。在特定的实施例中，抗生素抗性赋予元件是杀稻瘟菌素抗性基因。
[0191]
在一些实施例中，诱导型辅助多核苷酸构建体如图25中左侧或右侧所示。此处考虑了多种诱导型辅助多核苷酸构建体。在一些实施例中，所述诱导型辅助多核苷酸构建体负责编码一种或多种腺病毒辅助蛋白，如va rna、e2a、e4，或其任何组合。在一些实施例中，本发明公开提供了突变型va rna基因编码序列的诱导型多核苷酸构建体。在一些实施例中，va rna的突变使其内部启动子失去活性。例如，如图25(左图)所示，诱导型辅助多核苷酸构建体可以包含(从5’端到3’端)：u6启动子序列的第一部分、第一lox序列、填充片段序列、第二lox序列和u6启动子序列的第二部分。填充片段序列可以是任何多核苷酸序列，并且可被cre切除。cre可以是外源性提供的，例如以cre纳米囊泡的形式。cre也可以在同一诱导型辅助多核苷酸构建体中被编码，表达cre的前提条件是存在至少两种触发剂，如多西环素和他莫昔芬。cre可能是一种激素活化cre。
[0192]
在其他实施例中，例如，如图25(右图)所示，诱导型辅助构建体可以包含未突变的组成型表达va rna，而不包含突变型va rna基因序列。
[0193]
在一些实施例中，诱导型辅助多核苷酸构建体还负责编码一个或多个辅助蛋白、一个或多个辅助蛋白上游的自切元件以及自切元件上游的诱导型启动子。自切元件的表达可能由tet-on-3g系统驱动。例如，构建体可包含tet-on 3g基因序列，其中e1α启动子负责驱动该基因序列的表达。e1α启动子可以是一个突变型e1α启动子。突变型e1α启动子可以包含以下序列：
[0194]
当存在第一触发剂(如多西环素)时，tet-on-3g能够与tet诱导型启动子结合。在这一结合事件中，tet诱导型启动子负责驱动自切元件的表达。在一些实施例中，自切元件是一种激素活化cre。当存在第二触发剂(如他莫昔芬)时，表达后，cre会发生自切，从而引发下游腺病毒辅助蛋白的表达。因此，只有在至少两种触发剂(如多西环素和他莫昔芬)存在的情况下，稳定整合至本发明公开发明公开的诱导型辅助构建体的哺乳动物细胞系才会表达腺病毒辅助蛋白。
[0195]
在一些实施例中，诱导型辅助构建体是编码以下内容的多核苷酸构建体：a)一种或多种辅助蛋白；b)一种或多种辅助蛋白的上游自切元件；和c)自切元件的上游诱导型启动子。在一些实施例中，通过操纵将自切元件连接至诱导型启动子。在一些实施例中，自切元件的表达是由诱导型启动子驱动的。
[0196]
在一些实施例中，诱导型启动子是四环素反应性启动子元件(tre)。在一些实施例中，tre包含与最小启动子融合的tet操纵子(teto)序列多联体。在一些实施例中，最小启动子是人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，诱导型启动子包含一个与seq id no:22具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，与激活剂结合可通过诱导型启动子激活转录过程。在一些实施例中，当存在触发剂时，激活剂与诱导型启动子结合。在一些实施例中，还需要其他激活剂。在一些实施例中，通过操纵将激活剂连接至组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子或人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，激活剂是四环素控制的反式活化因子(rta)，其中包含一个与vp16反式激活结构域融合的tet阻遏物结合蛋白(tetr)。在一些实施例中，rta包含tetr dna结合部分中的四个突变。在一些实施例中，rta包含与seq id no:21具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
[0197]
在一些实施例中，当不存在第一触发剂时，诱导型启动子将会被阻遏物结合。在一些实施例中，当存在第一触发剂时，诱导型启动子将会被激活。在一些实施例中，第一触发剂与阻遏物结合。在一些实施例中，阻遏物是一种四环素控制性反式激活子。在一些实施例中，还需要其他阻遏物。在一些实施例中，通过操纵将阻遏物连接至组成型启动子。在一些实施例中，还需要其他四环素控制性反式激活子。在一些实施例中，通过操纵将四环素控制性反式激活子连接至组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，当存在第一触发剂时，四环素控制性反式激活子不会连接至组成型启动子。在一些实施例中，当
存在第一触发剂时，四环素控制的反式激活剂不会与诱导型启动子结合。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，当第一触发剂与阻遏物结合时，可通过诱导型启动子激活转录过程。在一些实施例中，阻遏物与第一触发剂结合。在一些实施例中，第一触发剂是四环素。在一些实施例中，四环素是多西环素。
[0198]
在一些实施例中，诱导型启动子是一个cumate操纵子序列。在一些实施例中，cumate操纵子序列位于组成型启动子的下游。在一些实施例中，组成型启动子是人巨细胞病毒启动子。在一些实施例中，当不存在第一触发剂时，诱导型启动子将会被cymr阻遏物结合。在一些实施例中，当存在第一触发剂时，诱导型启动子会被激活。在一些实施例中，第一触发剂与cymr阻遏物结合。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含cymr阻遏物。在一些实施例中，通过操纵将cymr阻遏物连接至组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是e1α启动子。在一些实施例中，e1α启动子包含至少一个突变。在一些实施例中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，第一触发剂是cumate。
[0199]
在一些实施例中，自切元件编码序列包含一个polya序列。在一些实施例中，自切元件是一种重组酶。在一些实施例中，重组酶是一种位点特异性重组酶。在一些实施例中，重组酶与配体结合域融合。在一些实施例中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一个激素受体。在一些实施例中，激素受体是一种雌激素受体。在一些实施例中，雌激素受体包含一个点突变。在一些实施例中，雌激素受体是ert2。在一些实施例中，重组酶是cre-ert2多肽。在一些实施例中，当存在第二触发剂时，自切元件可易位至细胞核。在一些实施例中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。在一些实施例中，第二触发剂是选择性雌激素受体调节剂(serm)。在一些实施例中，第二触发剂是他莫昔芬。在一些实施例中，重组酶的两侧是重组位点。在一些实施例中，重组位点是lox位点或翻转酶识别靶(frt)位点。在一些实施例中，lox位点是loxp位点。
[0200]
在一些实施例中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。在一些实施例中，一个或多个腺病毒辅助蛋白进一步包含一个蛋白质标签。在一些实施例中，蛋白质标签是flag标签。在一些实施例中，e2a是flag标记的e2a。在一些实施例中，e2编码序列和e4编码序列被内部核糖体进入位点(ires)或p2a分隔开。
[0201]
在一些实施例中，诱导型辅助构建体进一步包含可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
[0202]
在一些实施例中，诱导型辅助构建体进一步包含va rna编码序列。在一些实施例中，va rna编码序列是一个转录死亡序列。在一些实施例中，va rna编码序列的内部启动子至少包含两个突变。在一些实施例中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，由va rna基因编码序列的上游所组成，包含(从5’端到3’端)：
a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。在一些实施例中，填充片段序列是可以被重组酶切除的。在一些实施例中，填充片段序列包含基因编码序列。在一些实施例中，填充片段序列包含一个启动子。在一些实施例中，启动子是一个组成型启动子。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。
[0203]
在一些实施例中，基因负责编码可检测标记物或可选标记物。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，dhfr z-nter包含一个与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，其中，dhfr z-cter包含一个与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。在一些实施例中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。在一些实施例中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。在一些实施例中，第一lox序列是第一loxp位点，第二lox序列是第二loxp位点。在一些实施例中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。
[0204]
在一些实施例中，诱导型辅助构建体位于载体中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体位于质粒中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体是一种合成核酸构建体。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含与seq id no:9-seq id no:19、seq id 23-seq id no:32、或seq id no:35中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含与seq id no:9-seq id no:19、seq id 23-seq id no:32、或seq id no:35中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
[0205]
在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，其中va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。在一些实施例中，一种单独多核苷酸构建体负责编码va rna，其中，va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。在一些实施例中，va rna编码序列包含va rna转录死亡编码序列。在一些实施例中，va rna编码序列包含在启动子区域缺失约5-10个核苷酸的片段。在一些实施例中，va rna编码序列包含至少一个突变。在一些实施例中，至少一个突变是在a框启动子区域。在一些实施例中，至少一个突变是在b框启动子区域。在一些实施例中，至少一个突变是g16a和g60a。在一些实施例中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，由va rna基因序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；
c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。在一些实施例中，填充片段序列可被重组酶切除。在一些实施例中，填充片段序列包含基因编码序列。在一些实施例中，填充片段序列包含一个启动子。在一些实施例中，启动子是一个组成型启动子。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。在一些实施例中，基因负责编码可检测标记物或可选标记物。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，dhfr z-nter包含一个与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，dhfr z-cter包含一个与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。在一些实施例中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，或va rna构建体进一步包含重组酶编码序列。在一些实施例中，重组酶是外源性提供的。在一些实施例中，重组酶是一种位点特异性重组酶。在一些实施例中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一个激素受体。在一些实施例中，激素受体是一种雌激素受体。在一些实施例中，雌激素受体包含一个点突变。在一些实施例中，雌激素受体是ert2。在一些实施例中，重组酶是cre-ert2多肽。在一些实施例中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。在一些实施例中，第一lox序列是第一loxp位点，第二lox序列是第二loxp位点。在一些实施例中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。在一些实施例中，所述含va rna的构建体进一步包含可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，或va rna构建体位于载体中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，或va rna构建体位于质粒中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，或va rna构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含编码va rna的多核苷酸构建体，或va rna构建体是合成核酸构建体。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:2中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:2中的任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、
99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，va rna构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:2中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，va rna构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:2中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。5.4.3.构建体3(编码有效载荷的多核苷酸)
[0206]
在一些实施例中，第三个整合的合成构建体包含可表达有效载荷编码序列和第三哺乳动物细胞选择元件。在图4所示的示例性实施例中，可表达有效载荷受到组成型启动子的控制。这种构建体可以被称为构建体3或有效载荷构建体，两种称谓可以互换。
[0207]
在某些实施例中，可表达有效载荷负责编码一种向导rna。在某些实施例中，向导rna负责指导rna编辑。在一些实施例中，向导rna负责指导cas介导的dna编辑。在一些实施例中，第三个整合的合成构建体包含本发明公开的任何可表达有效载荷编码序列。例如，所述序列可以编码用于任何治疗用品。例如，治疗用品可以是转基因、向导rna、反义rna、寡核苷酸、mrna、mirna、shrna、trna抑制剂、crispr-cas蛋白、任何基因编辑酶或其任何组合。在一些实施例中，第三个整合的合成构建体包含本发明公开的一种以上的可表达有效载荷编码序列。
[0208]
在一些实施例中，可表达有效载荷负责编码一种蛋白质。在某些实施例中，可表达有效载荷是一种用于替代基因治疗的酶。在某些实施例中，蛋白质是一种治疗性抗体。在一些实施例中，蛋白质是一种疫苗免疫原。在特定的实施例中，疫苗免疫原是一种病毒蛋白。
[0209]
在一些实施例中，可表达有效载荷是用于同源重组的同源构建体。
[0210]
在各种实施例中，第三哺乳动物细胞选择元件是一种辅助选择元件。
[0211]
在一些实施例中，有效载荷构建体包含与seq id no:33序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，有效载荷构建体包含与seq id no:33序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，有效载荷构建体包含一个有效载荷序列，其两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷序列的表达是由组成型启动子驱动的。在一些实施例中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷的序列包含多核苷酸基因编码序列。在一些实施例中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。在一些实施例中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。在一些实施例中，有效载荷序列包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。在一些实施例中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。在一些实施例中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。在一些实施例中，蛋白质是核酸酶。在一些实施例中，蛋白质是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是具有催化作用的非活化型cas蛋白质。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，多个有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，多个有效载荷构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物的编码序列。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需
要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。5.4.4.生产用宿主细胞
[0212]
多个合成核酸构建体被整合至生产宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，生产用宿主细胞是一种昆虫细胞。在一些实施例中，生产用宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0213]
在典型的实施例中，生产用宿主细胞是表达腺病毒e1a和e1b的哺乳动物细胞系。在特定的实施例中，细胞是人胚胎肾(hek)293细胞系或其衍生细胞(hek293t细胞、hek293f细胞)，表达e1a和e1b的人hela细胞系，表达e1a和e1b的中国仓鼠卵巢(cho)细胞系，或表达腺病毒e1a和e1b的vero细胞。在特定的实施例中，宿主细胞是hek293细胞系。
[0214]
在某些实施例中，宿主细胞是dhfr裸细胞。在具体实施例中，宿主细胞是dhfr hek293裸细胞。
[0215]
在一些实施例中，hek293细胞表达aav e1a和e1b。当存在多西环素和他莫西芬时，从第一个整合的合成构建体中切除er2 cre，从而允许aav e2a和e4的表达。自切er2 cre借助于第二个整合的合成构建体中egfp基因盒两侧的lox位点进行重组，从而删除第二个整合的合成构建体中第二间隔元件的egfp片段。就这一点来说，在加入触发剂后，任何仅包含第二个整合的合成构建体的细胞具有阳性egfp信号，而包含第一个和第二个整合的合成构建体的细胞具有阴性egfp信号。egfp信号的缺失则表明第一个和第二个整合的合成构建体在细胞中的转染都是成功的。抗生素抗性选择压力(例如杀稻瘟菌素抗性)进一步确保了成功转染。
[0216]
此外，删除egfp基因盒可实现rep和cap蛋白的功能性表达，这两个蛋白可以连接至第一dhfr选择元件，例如z-cter dhfr。z-cter dhfr能够与第三个整合的合成构建体中第二dhfr选择元件(例如z-nter dhfr)结合，形成活性分子，使细胞能够在选择培养基(例如，ht缺乏培养基选择)中存活。
[0217]
在一些实施例中，第三个整合的合成构建体包含一个有效载荷。有效载荷可以是一个向导rna(图4和5b)，一个hdr同源区，或一个兴趣基因。
[0218]
总之，该系统的一个优选实施例只需要一个抗生素抗性标记物，以及用于选择所有三个质粒的两个分裂营养缺陷型构建体，每个构建体只需转化一次到dhfr基因敲除菌株中，就能产生一个用于病毒生产的主细胞系，该主细胞系可以储存起来，随后用于大规模生产，而无需进一步转化。这种方法能够诱导控制rep/cap产品表达，避免了通常与rep/cap生产相关的毒性，也避免了用多种抗生素进行选择，这些对于治疗性产品都是不可取的。rep/cap的过度表达以及使用多种抗生素进行选择都会产生毒性，导致病毒粒子产量降低。转化
后的细胞可以冷冻保存，并在解冻后用于后续应用。5.4.5.有效载荷
[0219]
本发明公开的是可由多核苷酸构建体3编码的有效载荷，该构建体负责编码有效载荷。第三个多核苷酸在此被称为“有效载荷构建体”或“治疗性有效载荷”。因此，本发明公开的是有效载荷衣壳化的稳定哺乳动物细胞系。有效载荷可以是一个可表达有效载荷。多核苷酸可以编码用于任何治疗用品。例如，治疗用品可以是转基因、向导rna、反义rna、寡核苷酸、mrna、mirna、shrna、trna抑制剂、crispr-cas蛋白、任何基因编辑酶或其任何组合。在一些实施例中，本发明公开的稳定哺乳动物细胞系可以有条件地生产一个以上有效载荷衣壳化的raav病毒粒子。本发明公开的有效载荷的任何组合均可以考虑。5.4.6.分裂营养缺陷筛选
[0220]
将构建体稳定地维持在细胞基因组中需要选择压力。
[0221]
通常，每个整合的核酸构建体都包含一个哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，稳定细胞系包含三个整合的核酸构建体，其中第一个核酸构建体包含第一哺乳动物细胞选择元件，第二个核酸构建体包含第二哺乳动物细胞选择元件，以及第三个核酸构建体包含第三哺乳动物细胞选择元件。
[0222]
图5a描述了一个示例性分裂营养缺陷筛选系统，该系统允许在单一选择压力下稳定地维持两个整合的核酸构建体。其中一个构建体负责编码哺乳动物二氢叶酸还原酶(dhfr)的n端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“nter-dhfr”)。这个n端片段无酶促功能。另一个构建体负责编码dhfr的c端片段，并与亮氨酸拉链肽融合(“cter-dhfr”)。这个c端片段无酶促功能。当细胞中同时表达这两个片段时，通过亮氨酸拉链肽的结合形成功能性dhfr酶复合物。通过在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长，这两个构建体可以稳定地保留在dhfr裸细胞的基因组中。
[0223]
图5b显示了在图1的多构建体系统中这种分裂营养缺陷筛选设计在其预触发状态下的示例性部署。在本实施例中，分裂营养缺陷筛选元件被部署在构建体1和3上。在构建体2上部署了一个单独的示例性抗生素选择元件，即杀稻瘟菌素抗性。这使得我们能够使用单一抗生素，在含有杀稻瘟菌素、缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基中进行培养，从而在哺乳动物细胞系中稳定地维持所有三个构建体。在一些实施例中，构建体2进一步包含本文所述的va rna编码序列。在一些实施例中，va rna是一种突变型va rna。在一些实施例中，va rna是转录死亡va rna。在一些实施例中，va rna受u6启动子的控制。在一些实施例中，u6启动子可有条件地被激活。在一些实施例中，u6启动子包含一个中断序列，在加入触发剂后，该序列可被敲入(例如，触发剂诱导了本文所述重组酶的表达)。
[0224]
在一些实施例中，第一个核酸构建体包含第一哺乳动物细胞选择元件，而第一哺乳动物细胞选择元件是第一营养缺陷筛选元件。在某些实施例中，第一营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。在特定的实施例中，第一营养缺陷筛选元件是dhfr。在一些实施例中，第一营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在某些实施例中，第一营养缺陷筛选元件负责编码z-cter-dhfr(seq id no：5)。
[0225]
在不同的实施例中，第二个核酸构建体包含第二哺乳动物细胞选择元件，而第二哺乳动物细胞选择元件负责编码抗生素抗性。在特定的实施例中，抗生素抗性基因是杀稻
瘟菌素抗性基因。
[0226]
在各种实施例中，第三个核酸构建体包含第三哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，第三哺乳动物细胞选择元件是第二营养缺陷筛选元件。在某些实施例中，第二营养缺陷筛选元件负责编码一种活化蛋白。在特定的实施例中，第二营养缺陷筛选元件是dhfr。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第一营养缺陷筛选编码序列才具有活性。在某些实施例中，第二营养缺陷筛选元件负责编码z-nter-dhfr(seq id no:4)。
[0227]
在不同的实施例中，稳定哺乳动物细胞系可以在缺乏次黄嘌呤和胸苷的生长培养基中繁殖。5.4.7.完整系统详情
[0228]
第一个整合的合成构建体包含插入到aav2 rep蛋白编码序列中的间隔区序列。中间间隔区序列包含一个增强型绿色荧光蛋白(egfp)和一个兔β球蛋白(rbg)聚腺苷酸化(polya)信号，其两侧有两个lox位点，该序列被插入至rbg内含子中。rbg内含子包含5’端剪接位点(5’ss)和3’端剪接位点(3’ss)(如图3a-3b所示)。rbg内含子被插入rep内源性p5和p19启动子的下游，并阻断rep编码序列。这种设计阻断了由p5和p19启动子产生的rep蛋白的表达。egfp是成功整合的可视指标，用于监测cre介导切除，并且可以用任何合适的标记物替代。例如，缺少egfp表达表明cre介导的基因组重组成功(请参见图3b)。目前的方法是将egfp和polya插入内含子中，而不含3’端剪接位点(3’ss)的副本。如果polya之后存在通读，5’ss部分可以与天然3’ss部分结合，从而去除整个rbg内含子，并因此开始表达rep。相比之下，本文所述的设计包含位于egfp上游的一个额外3’ss部分，从而不会表达rep(不希望有这种情况)。本设计规定，如果存在通读，构建体允许5’ss部分剪接至上游3’ss部分。在不受任何理论约束的情况下，最好将最接近的额外3’ss部分剪接至5’ss部分，因为它与下游的3’ss部分相同，而且这两个3’ss部分的强度相等。就这一点来说，所有rep蛋白与egfp蛋白融合，然后终止生产。一旦rep蛋白在egfp之后没有终止生产，它们将继续产生由rbg引子的其余部分编码的密码子，从而形成一个无功能性rep蛋白。该方法防止了rep蛋白的过度表达，rep蛋白可能对腺病毒和细胞生长具有抑制作用，从而降低重组aav(raav)构建体的毒性。
[0229]
如本文所述，只有当存在第一表达触发剂时才能诱导功能性rep蛋白的表达，例如，加入多西环素，从而产生cre。当存在cre时，中间间隔区被切除，从而恢复了rep蛋白的完整编码序列。这种方法提供了受控和诱导性rep表达。
[0230]
这是由第二个整合的合成构建体驱动的，该构建体包含一个雌激素诱导的cre(er2 cre)基因和腺病毒辅助基因e2a和e4orf6(e4)(请参见图1、2a-2b、3a-3b和6)。
[0231]
在某些实施例中，第三个整合的合成构建体(“构建体三”)包含两侧有aav反向末端重复序列(itr，在图1、图4、图5b和图6中用括号表示)的多核苷酸。在某些实施例中，第三个整合构建体进一步包含如上文第4.4.5节所述的分裂营养缺陷筛选的组分。在特定的实施例中，分裂营养缺陷筛选的组分包含与亮氨酸拉链融合的第一个无功能的二氢叶酸还原酶(dhfr)片段。其通过与第二个dhfr片段结合，同时与一个亮氨酸拉链融合，产生一个活性复合物，并允许选择同时表达第一个和第三个整合的合成构建体的细胞。构建体3的多核苷酸可以包含任何有效载荷，至少包含向导rna、兴趣基因、转基因、hdr同源区、小基因或治疗
性多核苷酸。这种方法只需要细胞培养基中存在单一的营养缺陷筛选剂和单一的抗生素选择剂，就能够将所有的多个合成核酸构建体稳定地维持在细胞的核基因组中。这种方法还避免了多重抗生素抗性选择，这可能是下游应用(例如基因治疗)所不期望的。
[0232]
在一个方面，本发明提供了一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够有条件地产生包装了可表达有效载荷的重组aav(raav)病毒粒子；并且病毒粒子的产生不以细胞内存在游离基因为条件。
[0233]
在不同的实施例中，aav rep和cap蛋白的表达是有条件的。在一些实施例中，表达aav rep和cap蛋白的前提条件是在细胞培养基中至少加入第一表达触发剂。在一些实施例中，表达aav rep和cap蛋白的前提条件是向细胞培养基中加入第一表达触发剂和第二表达触发剂。
[0234]
在一些实施例中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞毒性水平的rep蛋白。在一些实施例中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞阻滞水平的rep蛋白。
[0235]
在一些实施例中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂之前，细胞内rep蛋白的平均浓度低于1-99％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％。在一些实施例中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂之前，细胞内rep蛋白的平均浓度低于约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
[0236]
在不同的实施例中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂后，rep和cap蛋白的表达为组成型。稳定细胞系包括条件性表达腺病毒辅助蛋白的细胞系。在一些实施例中，表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂。在一些实施例中，表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是向细胞培养基中加入第一表达触发剂和第二表达触发剂。在一些实施例中，触发表达后，持续表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是细胞培养基中只存在第一表达触发剂。
[0237]
在一些实施例中，腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。
[0238]
在一些实施例中，第一表达触发剂是四环素。在一些实施例中，四环素是多西环素。
[0239]
在一些实施例中，第二表达触发剂是一种雌激素受体配体。在一些实施例中，雌激素受体配体是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。在一些实施例中，雌激素受体配体是他莫昔芬。
[0240]
在某些实施例中，有效载荷的表达不以向细胞培养基中添加表达触发剂为条件。
[0241]
在不同的实施例中，细胞的核基因组包含多个整合的合成核酸构建体。在一些实施例中，细胞的核基因组包含两个整合的合成构建体。在一些实施例中，细胞的核基因组包含三个整合的合成构建体。在一些实施例中，多个合成核酸构建体中的每一个都被单独整合至细胞的核基因组中。
[0242]
在一些实施例中，只需要细胞培养基中存在单一的非营养缺陷选择剂，就可以将多个合成核酸构建体全部稳定地维持在细胞的核基因组中。
[0243]
在一些实施例中，第一个整合的合成构建体包含条件性表达的aav rep和cap编码序列；第二个整合的合成构建体包含条件性表达的cre编码序列和腺病毒辅助蛋白编码序
列；以及第三个整合的合成构建体包含可表达有效载荷编码序列。
[0244]
在一些实施例中，第一个整合构建体包含被中间间隔区阻断的重复编码序列。在一些实施例中，中间间隔区保包含(从5’端到3’端)：第一间隔区、第二间隔区和第三间隔区。在一些实施例中，中间间隔区包含兔β球蛋白(rbg)内含子和兔β球蛋白(rbg)poly a的核酸序列。在一些实施例中，第一间隔区包含与seq id no:1具有至少80％同源性的核酸序列。在一些实施例中，第一间隔区包含连接至第一间隔区元件5’端的5’端剪接位点(5’ss)。在一些实施例中，第二间隔区包含与seq id no:2具有至少80％同源性的核酸序列。在一些实施例中，第二间隔区包含(从5’端到3’端)：第一lox位点、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、rbg polya序列和第二lox位点。在一些实施例中，第二间隔区进一步包含第一个3’端剪接位点(3’ss)，其两侧是第一lox位点和egfp。在一些实施例中，第三间隔区包含与seq id no:3具有至少80％同源性的核酸序列。在一些实施例中，第三间隔区进一步包含连接至第三间隔区3’端的第二个3’端剪接位点(3’ss)。
[0245]
在一些实施例中，rep编码序列包含一个多核苷酸序列，可通过操纵将该序列连接至内源性p5启动子。在一些实施例中，rep编码序列包含一个多核苷酸序列，可通过操纵将该序列连接至内源性p19启动子。在一些实施例中，中间间隔区被插入到p19启动子下游位置的rep编码序列中。在一些实施例中，中间间隔区被插入rep编码序列中，其位置与活化p5启动子和p19启动子产生的蛋白质同框。在一些实施例中，rep编码序列的5’端连接至cap编码序列。在一些实施例中，可通过操纵将cap编码序列连接至内源性p40启动子。
[0246]
在一些实施例中，第二个整合构建体包含(从5’端到3’端)：cre编码序列和第一polya序列、腺病毒辅助蛋白编码序列和第二polya序列、第一表达触发剂反应元件和抗生素选择元件。在一些实施例中，cre编码序列的两侧有一个第一lox位点和一个第二lox位点。在一些实施例中，可通过操纵将cre编码序列连接至诱导型启动子。在一些实施例中，诱导型启动子包含多个四环素(tet)操纵子元件，当存在第一表达触发剂时，能够与tet反应性激活蛋白结合。在一些实施例中，诱导型启动子包含多个tet操纵子元件，当存在第一表达触发剂和第二表达触发剂反应元件时，能够与tet反应性激活蛋白结合。在一些实施例中，腺病毒辅助蛋白的编码序列包含e2a和e4序列。在一些实施例中，可通过操纵将第一表达触发剂反应元件连接至cmv启动子。在一些实施例中，第一表达触发剂反应元件包含tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)。在一些实施例中，抗生素选择元件是杀稻瘟菌素抗性。
[0247]
在一些实施例中，第三个整合的合成构建体包含可表达有效载荷的编码序列和营养缺陷型选择剂第一元件，第一个整合的合成构建体包含营养缺陷筛选剂第二元件的编码序列。在一些实施例中，营养缺陷筛选剂第一元件包含第一个二氢叶酸还原酶(dhfr)可选标记物(seq id no:4)。在一些实施例中，第一个dhfr包含一个亮氨酸拉链(nter)。在一些实施例中，营养缺陷筛选剂第二元件包含第二个dhfr(seq id no:5)。在一些实施例中，第二个dhfr包含一个亮氨酸拉链(cter)。在一些实施例中，dhfr选择压力包括在缺乏次黄嘌呤胸苷的培养基中生长的能力。
[0248]
在一些实施例中，哺乳动物细胞系选自由人胚肾(hek)293细胞系、人hela细胞系和中国仓鼠卵巢(cho)细胞系组成的细胞群。在一些实施例中，哺乳动物细胞系是hek293细胞系。在一些实施例中，哺乳动物细胞系表达腺病毒辅助功能e1a和e1b。a.稳定哺乳动物细胞或细胞系
[0249]
如本文所述，稳定哺乳动物细胞或细胞系可以是人源性细胞或细胞系，如人胚肾(hek)293细胞系或人hela细胞系，或者哺乳动物细胞或细胞系，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞系。在一些实施例中，哺乳动物细胞系是hek293细胞系。在一些实施例中，哺乳动物细胞系表达腺病毒辅助功能e1a和e1b。b.第一个整合的合成构建体
[0250]
图中显示的是第一个整合的合成构建体的示范性设计(图1、3b和6)。
[0251]
如图3a-3b所述，第一个整合的合成构建体包含cap编码序列的5’端rep编码序列。rep编码序列被中间间隔区阻断。在一些实施例中，第一个整合的合成构建体进一步包含选择元件，如营养缺陷筛选标记物(图5b)。在一些实施例中，选择元件是非营养缺陷筛选标记物的部分元件或第二元件。中间间隔区包含一个兔β球蛋白(rbg)内含子，其通过在内含子中的增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因盒上游复制rbg 3’端剪接位点(3’ss)来修饰。egfp基因盒被立即克隆至这个重复的剪接位点下游，一个兔β球蛋白聚腺苷酸化信号紧跟其后。整个修饰部分(3’ss、egfp和polya)的两侧有两个lox位点，因此在cre表达时可以敲除该模块。修饰后的兔β球蛋白内含子(中间间隔区序列)被插入aav2 rep蛋白编码序列中。插入点位于p19启动子的下游，远离任何已知的调节元件。它还与p5和p19蛋白产生的蛋白质同框，从而便于观察到egfp的表达。任何aav血清型的cap基因都可以克隆到aav2 rep基因盒的下游。cap基因由其内源性p40启动子驱动。当不存在cre的情况下，5’端剪接位点(5’ss)被剪接到3’ss的上游，使得egfp成为末端外显子，在β球蛋白聚腺苷酸化信号处停止转录。因此，所有来自p5或p19启动子的rep蛋白的表达都被提前终止。由于只有存在rep蛋白的情况下才能表达p40启动子，因此p40启动子是沉默型，并且没有cap蛋白的表达。当通过第二个整合的合成构建体表达cre时，从β球蛋白内含子中切除了整个第二间隔区元件(除了左边的lox位点外)。5’ss现在与天然3’ss位点进行剪接，开始所有rep蛋白的表达。rep表达激活了p40蛋白，从而也启动了cap蛋白表达。c.第二个整合的合成构建体
[0252]
图中显示的是第二个整合的合成构建体的示范性设计(图2a-2c)。
[0253]
如图2a所示，第二个整合的合成构建体包含(从5’端到3’端)：cre编码序列和第一polya序列、腺病毒辅助蛋白编码序列和第二polya序列、第一表达触发剂反应元件和抗生素选择元件。cre编码序列的两侧是第一lox位点和第二lox位点，并且可通过操纵连接至一个诱导型启动子。诱导型启动子包含多个四环素(tet)操纵子元件，能够在第一表达触发剂(如多西环素或四环素)存在的情况下与tet反应性激活蛋白结合。在一些实施例中，诱导型启动子包含多个四环素(tet)操纵子元件，其能够在第一表达触发剂和第二表达触发剂反应元件(例如他莫昔芬)存在时与tet反应性激活蛋白结合。第一表达触发元件可包含tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)，并且可通过操纵连接至cmv启动子。抗生素选择元件可以是杀稻瘟菌素抗性(图5b)。图2c所示的可选插入物可诱导生产va-rna，va-rna是腺病毒复制所必需的非编码短转录本。在这个构建体中，构建体2的替代插入物包含cre诱导的u6启动子，其驱动va rna1转录死亡突变体的表达(一个优选的实施例是双点突变型g16a-g60a)。u6启动子被lox侧翼填充片段序列分成2个部分。由于填充片段序列的存在，u6启动子是非活化型的。在cre介导下切除填充片段激活了u6启动子，然后驱动va rna的表达。其他实施例可提供va-rna的替代来源。
[0254]
在一些实施例中，cre编码序列是一种雌激素诱导的cre，其3’端有一个聚腺苷酸化强信号(停止信号)。其后跟着一个双顺反子e2a、e4orf6基因盒。质粒还含有一个组成型启动子(cmv)，负责驱动tet反应性激活蛋白(tet-on 3g)的表达。
[0255]
在缺少多西环素(dox)的关闭状态下，tet-on 3g无法与tet可调节启动子中的tet操纵子元件结合，因此该启动子是非活化的。使用雌激素反应cre代替简单cre，以抵消tet可调节启动子的基础表达或泄露表达。在关闭状态下，如果cre基因有泄露表达，则表达的cre蛋白将在细胞质中保持非活化状态。cre基因3’端多聚腺苷酸化强信号将阻止腺病毒辅助基因e2a和e4的基础表达。为了诱导表达，在细胞培养中加入了多西环素和他莫西芬(图6)。多西环素与tet-on 3g蛋白结合，这将促进tet-on 3g与tet可调节启动子中的tet操纵子元件结合。然后，进一步触发启动子的激活。er2 cre将高水平表达，他莫西芬可把cre导入细胞核中。d.第三个整合的合成构建体
[0256]
图中是第三个整合的合成构建体的示范性设计(图1、4、5b和6)。如图4和6所述，第三个整合的合成构建体包含可表达有效载荷编码序列，和/或向导rna，以及非营养缺陷型选择剂第一元件，其能够结合到第一个整合的合成构建体中非营养缺陷性选择剂的部分元件或第二元件。在一些实施例中，非营养缺陷筛选剂第一元件包括第一个二氢叶酸还原酶(dhfr)可选标记物(seq id no:4)。第一个dhfr可以包含一个亮氨酸拉链(nter)。在一些实施例中，非营养缺陷筛选剂第二元件包含第二个dhfr(seq id no:5)。第二个dhfr可以包含一个亮氨酸拉链(cter)。在一些实施例中，dhfr选择压力包括次黄嘌呤胸苷选择。在一些实施例中，第一个和第二个dhfr选择标记物的重联允许选择可同时表达第一个整合的合成构建体和第三个整合的合成构建体的哺乳动物细胞。
[0257]
在一些实施例中，细胞包含两个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体的任何组合)。在一些实施例中，细胞包含rep/cap构建体和诱导型辅助构建体。在一些实施例中，细胞(即诱导型辅助构建体)包含如本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含va rna构建体。
[0258]
在一些实施例中，细胞包含所有三个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体)。在一些实施例中，细胞(即诱导型辅助构建体)包含如本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含va rna构建体。在一些实施例中，细胞在至少加入一种触发剂后能够产生raav病毒粒子。在一些实施例中，当moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性有所提高。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的raav病毒粒子相比(在相同moi条件下瞬时转染时能产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子的感染性提高了至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，与含有野生型aav的细胞在相同moi条件下产生的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，与相同moi条件下的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。在一些实施例中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。在一些实施例中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。在一些实施例中，细胞能够有条件地产生有效载荷衣壳比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99的raav病毒粒子。在一些实施例中，raav病毒在纯化前的有效载荷衣壳比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。在一些实施例中，raav病毒在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，细胞能够产生包含有效载荷核酸序列且滴度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。在一些实施例中，细胞能够产生包含有效载荷核酸序列且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。在一些实施例中，通过对细胞进行扩增，可以产生一个细胞群。在一些实施例中，通过对细胞进行扩增，可以产生一个细胞群。在一些实施例中，细胞至少被传代三次。在一些实施例中，细胞可以传代多达60次。在一些实施例中，细胞可以传代60次以上。在一些实施例中，细胞在每次传代后仍然能够有条件地被诱导。5.5.包含构建体的细胞
[0259]
在一些实施例中，细胞包含一个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体)。在一些实施例中，一个构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，包含一个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，细胞包含两个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体的任何组合)。在一些实施例中，两个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，两个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含两个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含两个构建体的多个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，细胞包含rep/cap构建体和诱导型辅助构建体。在一些实施例中，细胞(即诱导型辅助构建体)包含本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，va rna构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。
[0260]
在一些实施例中，细胞包含所有三个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体)。在一些实施例中，三个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，三个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含三个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含三个构建体的多个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，细胞(即诱导型辅助构建体)包含如本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含va rna构建体。
[0261]
在一些实施例中，va rna构建体是负责编码va rna的多核苷酸构建体，其中va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。在一些实施例中，va rna编码序列包含va rna转录死亡编码序列。在一些实施例中，va rna编码序列包含在启动子区域缺失约5-10个核苷酸的片段。在一些实施例中，va rna编码序列包含至少一个突变。在一些实施例中，至少一个突变是在a框启动子区域。在一些实施例中，至少一个突变是在b框启动子区域。在一些实施例中，至少一个突变是g16a和g60a。在一些实施例中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，由va rna基因序列的上游组成，包含(从
5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。在一些实施例中，填充片段序列可被重组酶切除。在一些实施例中，填充片段序列包含基因编码序列。在一些实施例中，填充片段序列包含一个启动子。在一些实施例中，启动子是一个组成型启动子。在一些实施例中，启动子是cmv启动子。在一些实施例中，基因负责编码可检测标记物或可选标记物。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，dhfr z-nter包含与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，dhfr z-cter包含与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。在一些实施例中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。在一些实施例中，va rna构建体进一步包含重组酶编码序列。在一些实施例中，重组酶是外源性提供的。在一些实施例中，重组酶是一种位点特异性重组酶。权利要求中任一项所述的的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，cre多肽与配体结合域融合。在一些实施例中，配体结合域是一个激素受体。在一些实施例中，激素受体是一种雌激素受体。在一些实施例中，雌激素受体包含一个点突变。在一些实施例中，雌激素受体是ert2。权利要求x中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre-ert2多肽。在一些实施例中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。在一些实施例中，第一lox序列是第一loxp位点，第二lox序列是第二loxp位点。在一些实施例中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。权利要求x中任一项所述的的多核苷酸构建体，进一步包含可选标记物编码序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端连接的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，va rna构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:2中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，va rna构建体包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:26中任何一个序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
[0262]
在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一些实施例中，细胞是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞。在一些实施例中，细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。在一些实施例中，细胞进一步包含一个有效载荷构建体。在一些实施例中，有效载荷构建体包含与seq id no:33序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在
一些实施例中，有效载荷构建体包含一个有效载荷序列，其两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷序列的表达是由组成型启动子驱动的。在一些实施例中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷序列包含一个多核苷酸基因编码序列。在一些实施例中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。在一些实施例中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。在一些实施例中，有效载荷序列包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。在一些实施例中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。在一些实施例中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。在一些实施例中，蛋白质是核酸酶。在一些实施例中，蛋白质是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是具有催化作用的非活化型cas蛋白质。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，多个有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，多个有效载荷构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物的编码序列。在一些实施例中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。在一些实施例中，可选标记物是一种营养缺陷筛选元件。在一些实施例中，营养缺陷筛选元件编码活化蛋白。在一些实施例中，活化蛋白是dhfr。在一些实施例中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一个非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才能活化。在一些实施例中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。在一些实施例中，非活化型蛋白质包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。在一些实施例中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。权利要求2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，有效载荷构建体位于质粒中。在一些实施例中，有效载荷构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，有效载荷构建体是一种合成核酸构建体。在一些实施例中，细胞能够产生有效载荷序列衣壳化的raav病毒粒子。在一些实施例中，细胞在至少加入一种触发剂后能够产生raav病毒粒子。
[0263]
在一些实施例中，细胞在至少加入一种触发剂后能够产生raav病毒粒子。在一些实施例中，当moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性有所提高。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的raav病毒粒子相比(在相同moi条件下瞬时转染时能产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子的感染性提高了至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，与含有野生型aav的细胞在相同moi条件下产生的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，与相同moi条件下的aav
病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。在一些实施例中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。在一些实施例中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。在一些实施例中，细胞能够有条件地产生raav病毒粒子，其f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，raav病毒粒子在纯化前的f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，细胞能够有条件地产生raav病毒粒子，其衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，raav病毒粒子在纯化前的有效载荷衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。在一些实施例中，raav病毒在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，细胞能够产生包含有效载荷核酸序列且滴度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。在一些实施例中，细胞能够产生包含有效载荷核酸序列且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。在一些实施例中，通过对细胞进行扩增，可以产生一个细胞群。在一些实施例中，细胞群产生了本文所述的稳定细胞系。在一些实施例中，细胞至少被传代三次。在一些实施例中，细胞可以传代多达60次。在一些实施例中，细胞可以传代60次以上。在一些实施例中，细胞在每次传代后仍然能够有条件地被诱导。5.6.包含构建体的细胞群
[0264]
在一些实施例中，细胞群包含一个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体)。在一些实施例中，一个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含一个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，细胞群包含两个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体的任何组合)。在一些实施例中，两个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，两个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含两个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含两个构建体的多个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，细胞包含rep/cap构建体和诱导型辅助构建体。在一些实施例中，细胞(即诱导型辅助构建体)包含本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，va rna构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。
[0265]
在一些实施例中，细胞群包含所有三个构建体(rep/cap构建体、诱导型辅助构建体和有效载荷构建体)。在一些实施例中，三个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，三个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含三个构建体的多个构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，包含三个构建体的多个构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。在一些实施例中，诱导型辅助构建体包含本文所述的va rna构建体。在一些实施例中，细胞群进一步包含分别整合至细胞基因组中的va rna构建体。
[0266]
一个能够产生raav病毒粒子的细胞群，raav病毒粒子的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。在一些实施例中，细胞群是哺乳动物细胞群或昆虫
细胞群。在一些实施例中，细胞群是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞组成的细胞群。在一些实施例中，细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。在一些实施例中，细胞群进一步包含一个有效载荷构建体。在一些实施例中，有效载荷构建体包含一个有效载荷序列，其两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷的表达是由组成型启动子驱动的。在一些实施例中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧分别是itr序列。在一些实施例中，有效载荷包含多核苷酸基因编码序列。在一些实施例中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。在一些实施例中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。在一些实施例中，有效载荷包含治疗性多核苷酸的多核苷酸编码序列。在一些实施例中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。在一些实施例中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。在一些实施例中，蛋白质是核酸酶。在一些实施例中，蛋白质是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是具有催化作用的非活化型cas蛋白质。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物的编码序列。在一些实施例中，可选标记物是一种抗生素抗性蛋白。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。在一些实施例中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。在一些实施例中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。在一些实施例中，有效载荷构建体位于质粒中。在一些实施例中，有效载荷构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。在一些实施例中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞群的基因组中。通过扩增权利要求x中任一项所述的细胞可产生细胞群。在一些实施例中，扩增包括将细胞至少传代三次。在一些实施例中，至少加入两种触发剂后，细胞群中的细胞能够有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。在一些实施例中，至少加入两种触发剂后，细胞能够有条件地产生raav病毒粒子。在一些实施例中，上述的两种触发剂包括多西环素和他莫昔芬。在一些实施例中，至少两种触发剂才可诱导切除元件的表和核易位。在一些实施例中，加入切除元件后，细胞群中的细胞能够有条件地产生raav病毒粒子。在一些实施例中，切除元件是一种重组酶。在一些实施例中，切除元件是一种位点特异性重组酶。在一些实施例中，切除元件是cre多肽或翻转酶多肽。在一些实施例中，切除元件是受激素调节的。在一些实施例中，细胞群能够有条件地产生已包装了编码有效载荷的可表达性多核苷酸的raav病毒粒子；并且所述细胞群产生的病毒粒子群比其他类似细胞群(能够在瞬时转染时产生raav病毒粒子)所产生的病毒粒子群具有更高的同质性。在一些实施例中，由细胞群产生的病毒粒子群的病毒基因组与转导单位的比例大约是500:1-1:1。在一些实施例中，由细胞群产生的病毒粒子群的载体基因组与感染单位的比例是100:1。在一些实施例中，加入触发剂后，可诱导病毒粒子的产生。在一些实施例中，至少加入两种触发剂后，可诱导病毒粒子的产生。在一些实施例中，细胞群能够有条件地产生有效载荷衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99的raav病毒粒子。在一些实施例中，raav病毒在纯化前的有效载荷衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。在一些实施例中，细胞群的活细胞密度不低于1
×
106、2
×
106、5
×
106或1
×
107/ml。在一些实施例中，raav病毒在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，细胞群能够产生包含有效载荷核酸序列(滴度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升)的raav病毒粒
子。在一些实施例中，细胞群能够产生包含有效载荷核酸序列并且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。在一些实施例中，当moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性有所提高。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的raav病毒粒子相比(在相同moi条件下瞬时转染时能产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子的感染性提高了至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，在相同moi情况下，与aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。在一些实施例中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。在一些实施例中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。在一些实施例中，细胞能够有条件地产生raav病毒粒子，其f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，raav病毒粒子在纯化前的f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，细胞被冷冻保存。在一些实施例中，细胞被装入一个小瓶、烧瓶、注射器或其他合适的细胞储存容器中。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导生产raav病毒粒子。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导表达aav rep和cap蛋白。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导至少一个或多个辅助蛋白的表达。在一些实施例中，当不存在转染剂时，可诱导生产raav病毒粒子。在一些实施例中，当不存在转染剂时，可诱导表达aav rep和cap蛋白。在一些实施例中，当不存在转染剂时，可诱导至少一种或多种辅助蛋白的表达。可通过扩增前述任一实施例所述的细胞群产生第二个细胞群。第二个细胞群，其扩增细胞群包括将细胞群至少传代三次。在一些实施例中，细胞群的扩增包括将细胞群传代3至60次。在一些实施例中，扩增细胞群包括将细胞群至少传代4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、或60次。
[0267]
在一些实施例中，与通过瞬时转染方法产生的类似raav病毒粒子相比，通过本文所述方法产生的raav病毒粒子具有更强的感染性。5.7.稳定细胞系
[0268]
在一些实施例中，稳定细胞系是由本文所述的细胞产生的。在一些实施例中，通过本文所述的细胞群产生一个稳定细胞系。在一些实施例中，稳定细胞系来自单一细胞，并且是单克隆细胞。稳定细胞系可以是哺乳动物稳定细胞系。稳定细胞系可以通过扩增或传代本文所述细胞来来产生。
[0269]
在一些实施例中，稳定细胞系包含本发明公开的细胞群。在一些实施例中，细胞群衍生自单个细胞。在一些实施例中，稳定细胞系中至少70％、80％、90％、95％、99％或100％的细胞是本发明公开的细胞群。稳定细胞系衍生于本发明公开的细胞。稳定细胞系扩增于本发明公开的细胞。在一些实施例中，稳定细胞系是哺乳动物稳定细胞系。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导一个或多个辅助蛋白的表达。在一些实施例中，当不存在转染剂时，可诱导一种或多种辅助蛋白的表达。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导表达aav rep和cap蛋白。在一些实施例中，当不存在转染剂时，可诱导表达aav rep和cap蛋白。在一些实施例中，当不存在质粒时，可诱导生产raav病毒粒子。在一些实施例中，当不存在
转染剂时，可诱导生产raav病毒粒子。在一些实施例中，稳定细胞系能够以大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的浓度产生包含有效载荷核酸序列的raav病毒粒子。在一些实施例中，稳定细胞系能够产生包含有效载荷核酸序列并且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的的raav病毒粒子。在一些实施例中，稳定细胞系能够有条件地产生衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99的raav病毒粒子。在一些实施例中，raav病毒粒子在纯化前的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低的情况下，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性有所提高。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的raav病毒粒子相比(在相同moi条件下瞬时转染时能产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子的感染性提高了至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，与含有野生型aav的细胞在相同moi条件下产生的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，与相同moi条件下的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。在一些实施例中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。在一些实施例中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。在一些实施例中，稳定细胞系能够有条件地产生f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99的raav病毒粒子。在一些实施例中，raav病毒粒子在纯化前的f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，稳定细胞系的至少一种细胞将会被冷冻保存。在一些实施例中，稳定细胞系的至少一种细胞将会储存在小瓶、烧瓶、注射器或其他合适的细胞储存容器中。
[0270]
在一些实施例中，稳定细胞系的生产方法包括将细胞与本文所述的rep/cap构建体接触，然后扩增细胞来生产稳定细胞系。在一些实施例中，稳定细胞系的生产方法包括将细胞与本文所述的诱导型辅助构建体接触，然后扩增细胞来生产稳定细胞系。在一些实施例中，稳定细胞系的生产方法包括将细胞先与rep/cap构建体接触，再与本文所述的诱导型辅助构建体接触，然后扩增细胞来生产稳定细胞系。在一些实施例中，稳定细胞系的生产方法包含将细胞先与rep/cap构建体接触，再与本文所述的诱导型辅助构建体接触，然后与有效载荷构建体接触，最后扩增细胞来生产稳定细胞系。5.8.细胞培养液和生物反应器
[0271]
在一些实施例中，本发明公开的细胞、细胞群或稳定细胞系放置在细胞培养物中。在一些实施例中，细胞培养组合物包含：a)悬浮适应型细胞，b)无血清细胞培养基，和c)重组aav(raav)病毒粒子；此处，细胞培养组合物不含单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒，而且也不含质粒和转染剂。在一些实施例中，细胞培养组合物不含聚乙烯亚胺(pei)。在一些实施例中，悬浮适应型细胞是悬浮适应型哺乳动物细胞。在一些实施例中，悬浮适应型细胞是悬浮适应型hek293细胞或其衍生物。在一些实施例中，所述悬浮适应型哺乳动物细胞是来自本发明公开的稳定细胞系、细胞群细胞，或包含本发明公开的一种细胞。在一些实施例
中，该细胞培养组合物的纯化前raav浓度不低于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l。在一些实施例中，细胞培养组合物的纯化前raav衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。
[0272]
在一些实施例中，来自本发明公开的稳定细胞的raav病毒粒子是在生物反应器中生产的。在一些实施例中，生物反应器中包含本发明公开的稳定细胞系。在一些实施例中，生物反应器中包含本发明公开的细胞群。在一些实施例中，生物反应器中包含本发明公开细胞。在一些实施例中，生物反应器中包含本发明公开的细胞培养物。在一些实施例中，生物反应器是一个1l生物反应器。在一些实施例中，1l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
14
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器是一个5l生物反应器。在一些实施例中，5l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
14
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器是一个50l生物反应器。在一些实施例中，50l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
15
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器是一个100l生物反应器。在一些实施例中，100l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
16
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器是一个500l生物反应器。在一些实施例中，500l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
16
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器是一个2000l生物反应器。在一些实施例中，2000l生物反应器的raav病毒粒子总产量大于2
×
10
17
个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，生物反应器中包括多个浓度大于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l的raav病毒粒子。在一些实施例中，生物反应器中包括多个纯化前浓度大于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l的raav病毒粒子。在一些实施例中，生物反应器是1l、5l、50l、100l、500l或2000l生物反应器。在一些实施例中，生物反应器是一次性使用的生物反应器。5.9.raav病毒粒子的药用组合物
[0273]
在一些实施例中，本发明公开的细胞、细胞群或稳定细胞系经过诱导(如本发明公开所示，例如在生物反应器中施用第一触发剂和第二触发剂之后)可产生多个raav病毒粒子。在一些实施例中，药用组合物包含多个病毒基因组衣壳化的raav病毒粒子，其中，组合物的纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，药用组合物包含多个病毒基因组衣壳化的raav病毒粒子，其中，组合物的纯化前衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，药用组合物包含多个病毒基因组衣壳化的raav病毒粒子，其中，组合物的纯化前f：e比值不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，药用组合物包含病毒基因组衣壳化的raav病毒粒子，其中，组合物在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与其他类似细胞产生的raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子具有更强的感染性。在一些实施例中，与其他类似细胞产生的raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，raav病毒粒子的感染性至少高1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，与相同moi条件下由含有野生型aav的细胞产生的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为50％、60％、70％、80％、90％、
95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，与相同moi条件下由含有野生型aav的细胞产生的aav病毒粒子相比，raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，药用组合物进一步包含多个raav病毒粒子。在一些实施例中，多个raav病毒粒子的纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。在一些实施例中，多个raav病毒粒子的纯化前衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，多个raav病毒粒子的纯化前f：e比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。在一些实施例中，多个raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的多个raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，多个raav病毒粒子具有更强的感染性。在一些实施例中，与其他类似细胞群产生的多个raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，多个raav病毒粒子的感染性至少提高1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，与相同moi条件下由含有野生型aav的细胞产生的aav病毒粒子相比，多个raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104或1
×
105vg/靶细胞。在一些实施例中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞的范围。在一些实施例中，病毒基因组包含一个有效载荷编码序列。在一些实施例中，有效载荷序列的表达由组成型启动子驱动。在一些实施例中，有效载荷的序列包含多核苷酸基因编码序列。在一些实施例中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。在一些实施例中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。在一些实施例中，有效载荷序列包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。在一些实施例中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。在一些实施例中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。在一些实施例中，蛋白质是核酸酶。在一些实施例中，蛋白质是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是具有催化作用的非活化型cas蛋白质。在一些实施例中，raav病毒粒子包含一个cap多肽。在一些实施例中，cap多肽是一种aav衣壳蛋白。在一些实施例中，aav衣壳蛋白是vp1、vp2或vp3。在一些实施例中，aav衣壳蛋白的血清型选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。
[0274]
在一些实施例中，本发明公开的raav病毒粒子在第一种组合物和第二种组合物中。在一些实施例中，第一种组合物和第二种组合物衣壳化比率的变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物和第二种组合物f:e比率的变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物和第二种组合物的浓度变化(单位：病毒基因组/毫升)不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物和第二种组合物的感染性变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物是第一剂，第二种组合物是第二剂。在一些实施例中，在生产第二种组合物之前至少1、2、3、4、5、6或7天生产第一种组合物。在一些实施例中，
在生产第二种组合物的多个raav病毒粒子之前至少1、2、3、4、5、6或7天生产第一种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，在生产第二种组合物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第一种组合物。在一些实施例中，在生产第二种组合物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第一种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，在生产第二种组合物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第一种组合物。在一些实施例中，在生产第二种组合物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第一种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，第一种组合物是由来自第一生物反应器的多个病毒粒子生产的，第二种组合物是由来自第二生物反应器的多个病毒粒子生产的。在一些实施例中，第三种组合物或更多组合物是由本发明公开的raav病毒粒子生产的。在一些实施例中，第一种组合物、第二种组合物和第三种组合物的衣壳化比率变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物、第二种组合物和第三种组合物的f:e比率的变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物、第二种组合物和第三种组合物的浓度变化(单位：病毒基因组/毫升)不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第一种组合物、第二种组合物和第三种组合物的感染性变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，第三种组合物是第三剂。在一些实施例中，在生产第二种组合物后至少1、2、3、4、5、6或7天生产第三种组合物。在一些实施例中，在生产第二种组合物的多个raav病毒粒子后至少1、2、3、4、5、6或7天生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，在生产第二种组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第三种组合物。在一些实施例中，在生产第二种组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，在生产第二种组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第三种组合物。在一些实施例中，在生产第二种组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。在一些实施例中，第三种组合物是由来自第三生物反应器的多个病毒粒子生产的。5.10.药用组合物
[0275]
在一些实施例中，药用组合物包含本发明公开的多个权利要求所述的raav病毒粒子和一个药学上可接受的载体。在一些实施例中，多种药物剂量各自独立地包含本发明公开的多个权利要求所述的raav病毒粒子和一个药学上可接受的载体。在一些实施例中，多种药物剂量的第一剂和第二剂之间的衣壳化比率差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，多种药物剂量的第一剂和第二剂之间的f:e比率差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，多种药物剂量的第一剂和第二剂之间的病毒基因组浓度差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，多种药物剂量的第一剂和第二剂之间的载体基因组浓度差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，多种药物剂量的第一剂和第二剂之间的raav病毒粒子感染性差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。5.11.raav病毒粒子的生产方法
[0276]
在另一个方面，提供了采用稳定细胞系生产raav病毒粒子的方法。该方法包括向培养上述稳定哺乳动物细胞系的培养基中至少加入第一表达触发剂和第二表达触发剂。
[0277]
在特定的实施例中，第一表达触发剂是四环素。在具体的实施例中，第一表达触发
剂是dox。在特定的实施例中，第二表达触发剂是一种雌激素激动剂或选择性雌激素受体调节剂。在具体的实施例中，第二表达触发剂是他莫昔芬。
[0278]
在一些实施例中，该方法进一步包括仅当存在第一表达触发剂时培养稳定哺乳动物细胞系的后续步骤。
[0279]
在一些实施例中，该方法还包括从培养基中提纯raav病毒粒子的方法。在一些实施例中，提纯过程包括色谱纯化方法。在一些实施例中，色谱纯化方法包括使用带正电的阴离子交换树脂、带负电的阴离子交换树脂、阳离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法或其组合。在一些实施例中，色谱纯化方法包括使用色谱柱分馏法。
[0280]
在一些实施例中，raav病毒粒子是在本文所述的生物反应器中生产的。
[0281]
在一些实施例中，一种用于诱导本文所述细胞、细胞群或稳定细胞系的方法，其包括向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第一触发剂来诱导rep多肽、cap多肽和一种或多种腺病毒辅助蛋白在细胞、细胞群或稳定细胞系中的表达。在一些实施例中，第一触发剂与激活剂或阻遏物结合。在一些实施例中，诱导型启动子的激活通过诱导实现。在一些实施例中，激活的诱导型启动子负责转录重组酶。在一些实施例中，第一触发剂是四环素或cumate。在一些实施例中，四环素是多西环素。本文所述的方法进一步包括使用第二触发剂培养细胞、细胞群或稳定细胞系。在一些实施例中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。在一些实施例中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。在一些实施例中，第二触发剂是他莫昔芬。在一些实施例中，第二触发剂与重组酶结合。在一些实施例中，第二触发剂诱导重组酶易位至细胞、细胞群、稳定细胞系的细胞核中。
[0282]
在一些实施例中，生产raav病毒粒子的方法包括向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第一触发剂，向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第二触发剂，以在细胞、细胞群或稳定细胞系中产生raav病毒粒子。在一些实施例中，第一触发剂与激活剂或阻遏物结合。在一些实施例中，诱导型启动子的激活通过诱导实现。在一些实施例中，激活的诱导型启动子负责转录重组酶。在一些实施例中，第一触发剂是四环素或cumate。在一些实施例中，四环素是多西环素。权利要求x中任一项所述的方法，进一步包括使用第二触发剂培养细胞、细胞群或稳定细胞系。在一些实施例中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。在一些实施例中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。在一些实施例中，第二触发剂是他莫昔芬。在一些实施例中，第二触发剂与重组酶结合。在一些实施例中，第二触发剂诱导重组酶易位至细胞、细胞群、稳定细胞系的细胞核中。在一些实施例中，在重组酶位点切除重组酶。在一些实施例中，至少表达一个腺病毒辅助蛋白、rep多肽和cap多肽。在一些实施例中，rep多肽和cap多肽组装成一个raav病毒粒子。在一些实施例中，raav病毒被衣壳化了一个有效载荷序列。在一些实施例中，在施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞毒性水平的rep多肽。在一些实施例中，在施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞毒性水平的cap多肽。在一些实施例中，在施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞阻滞水平的rep多肽。在一些实施例中，细胞、细胞群或稳定细胞系中rep多肽的平均浓度低于施用第一触发剂和第二触发剂之前的平均浓度。在一些实施例中，在施用第一触发剂和第二触发剂之后，rep多肽和cap多肽的表达为组成型。权利要求x中任一项所述的方法，进一步包括至少在生物反应器中执行的方法部分。在一些实施例中，生物反应器的容量不低于
20l、30、l、40l、50l、100l、250l、300l或500l。
[0283]
在一些实施例中，方法进一步包括以多个批次生产raav病毒粒子。在一些实施例中，方法进一步包括生产raav病毒粒子的方法，其中第一批和第二批病毒粒子之间的衣壳化比率差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％、或1％。在一些实施例中，方法进一步包括生产raav病毒粒子的方法，其中第一批和第二批病毒粒子之间的的f:e比率差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施例中，方法进一步包括生产raav病毒粒子的方法，其中第一批和第二批病毒粒子之间的病毒基因组差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施例中，方法进一步包括生产raav病毒粒子的方法，其中第一批和第二批病毒粒子之间的载体基因组浓度差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施例中，方法进一步包括生产raav病毒粒子的方法，其中第一批和第二批病毒粒子之间的感染性差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。在一些实施例中，方法进一步包括根据良好生产规范(gmp)标准执行该方法。在一些实施例中，方法进一步包括在符合gmp要求的工厂中执行该方法。在一些实施例中，方法进一步包括在培养基中培养细胞，并从培养基中收集部分多个raav病毒粒子。在一些实施例中，方法进一步包括对培养基中收集的至少部分多个raav病毒粒子进行纯化处理，以获得纯化的raav细胞群。在一些实施例中，纯化方法包括色谱纯化方法。在一些实施例中，色谱纯化方法包括使用带正电的阴离子交换树脂、带负电的阴离子交换树脂、阳离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法或其组合。在一些实施例中，色谱纯化方法包括使用色谱柱分馏。
[0284]
在一些实施例中，raav病毒粒子是通过本发明公开的方法生产的。在一些实施例中，包含多个raav病毒粒子的组合物是通过本发明公开的方法生产的。在一些实施例中，与通过瞬时转染方法产生的类似raav病毒相比，本发明公开方法生产的raav病毒粒子具有更强的感染性。5.12.治疗方法
[0285]
在另一个方面，提供了治疗方法。在不同的实施例中，方法包括将通过上述过程生产的raav病毒粒子施用给有需要的患者。在一些实施例中，给药方式是通过静脉给药、肌内给药、鞘内给药、脑池内给药或通过脑部手术给药。
[0286]
在一些实施例中，治疗病症或疾病的方法包括向有需要的患者施用本发明公开的治疗有效量的药用组合物。在一些实施例中，疾病是一种单基因疾病。在一些实施例中，治疗将会导致至少一种非预期副作用，并且对于偏离预期剂量超过50％、40％、30％、30％、15％、10％、5％或2％的的日剂量给药而言，非预期副作用会减少。在一些实施例中，给药方式为注射给药。在一些实施例中，注射给药方式是输液。在一些实施例中，日剂量是为患者给药一次。在一些实施例中，日剂量是为患者给药两次或更多次。在一些实施例中，治疗会导致至少一种非预期副作用，并且对于施用由三重转染方法生产的多个raav病毒粒子而言，非预期副作用有所减少。
[0287]
在一些实施例中，与通过瞬时三重转染方法制备的raav vg相同剂量相比，这些方法降低了具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量的免疫原性。在一些实施例中，通过受试者体内中和抗体的滴度或浓度来测量免疫原性。在一些实施例中，对于施用由三重转染方法制备的多个raav病毒粒子后患者血清中的raav病毒粒子中和抗体浓度而言，患者血清中的raav病毒粒子中和抗体浓度有所下降。在一些实施例中，raav病毒粒子中和抗体的浓
度是通过elisa方法测定的。
[0288]
在一些实施例中，与通过瞬时三重转染方法制备的raav vg相同剂量相比，这些方法降低了施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量所引起的不良反应的数量或强度。在一些实施例中，这些方法减少了不良反应的数量。在一些实施例中，剂量中的预定vg数量不超过3x10
14 vg/kg。在一些实施例中，剂量中的预定vg数量不超过1x10
14 vg/kg。在一些实施例中，剂量中的预定vg数量不超过5x10
13 vg/kg。在一些实施例中，这些方法降低了不良反应的强度。在一些实施例中，这些方法同时降低了不良事件的数量和强度。
[0289]
在一些实施例中，一种向受试者施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav病毒粒子剂量的方法，其与施用通过瞬时三重转染方法制备的raav vg相同剂量相比，不良反应的数量或强度有所降低，该方法包括：施用在本发明公开的细胞、细胞群、或稳定细胞所生产的raav剂量。在一些实施例中，不良反应有：肝功能障碍、肝脏炎症、胃肠道感染、呕吐、细菌感染、脓毒症、肌钙蛋白水平升高、红细胞计数减少、血小板计数减少、补体免疫系统反应激活、急性肾损伤、心肺功能不全和死亡。在一些实施例中，不良反应是一种或多种促炎细胞因子的血清水平增加。在一些实施例中，不良反应是干扰素γ(ifnγ)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)中的一种或多种血清水平增加。
[0290]
在另一个方面，本发明提供了一种向有需要的受试者重复施用一剂raav的方法。在一些实施例中，该方法包括施用由细胞系和上述过程生产的第一剂raav以及至少第二剂raav。在一些实施例中，该方法包括施用由细胞系和上述过程生产的第一剂和第二剂raav。在一些实施例中，该方法包括施用由细胞系和上述过程生产的第一剂、第二剂和第三剂raav。在一些实施例中，该方法包括施用由细胞系和上述过程生产的三剂以上raav。在一些实施例中，第一剂raav和至少第二剂raav将通过同一给药方式给药。在一些实施例中，第一剂aav和至少第二剂raav将通过不同的给药方式给药。在一些实施例中，给药方式是静脉给药、肌内给药、鞘内给药、脑池内给药或通过脑部手术给药。
[0291]
在一些实施例中，一种治疗病症或疾病的方法，其包括向有需要的患者施用本发明公开的具有预定数量病毒基因组的第一治疗有效量药用组合物，以及第二治疗有效量药用组合物。在一些实施例中，第一治疗有效量和第二治疗有效量的差异不超过1％、5％、10％或15％。5.13.试剂盒
[0292]
在另一个方面，本文所述系统的药用组合物或实施例是以试剂盒的形式提供的。例如，可以提供与任何质粒以及哺乳动物细胞相关的缓冲液、培养基、触发剂或与细胞培养和病毒粒子生产相关的其他药用组合物，可选药用组合物可以冷冻并包装成试剂盒，可以单独提供试剂盒或与任何其他制剂的单独容器一起提供，并且提供了可选的使用说明。在一些实施例中，试剂盒包括培养容器、小瓶、试管或类似物。
[0293]
使用所需的aav衣壳生产和包装重组载体以生产raav病毒粒子的方法，并不意味着仅限定于该方法，对于熟练的技术人员而言，也可以采用其他合适的方法。5.14.发明的各个方面
[0294]
以下项目披露了本发明的各个方面。下文所述的每个方面都可以与本文其他地方公开的其他方面和实施例相结合，包含权利要求(只要这种组合是明显兼容的)。例如，这里介绍的是三个示例性构建体，被称为“构建体1”、“构建体2”和“构建体3”。本发明公开的内
容具体而概括地描述了这些构建体。
[0295]
在以下方面，编码aav rep蛋白和aav cap蛋白的第一重组核酸序列对应于本文所述的“构建体1”的具体和一般披露内容。其目的是，下文所述的与第一重组核酸有关的任何方面都可以与本文介绍的“构建体1”的任何具体和一般披露内容相结合，只要这些组合是明显兼容的。
[0296]
在以下方面，编码一种或多种腺病毒辅助蛋白的第二重组核酸序列对应于本文所述的“构建体2”的具体和一般披露内容。其目的是，下文所述的与第二重组核酸有关的任何方面都可以与本文介绍的“构建体2”的任何具体和一般披露内容相结合，只要这些组合是明显兼容的。。
[0297]
在以下方面，编码有效载荷的第三重组核酸序列对应于本文提供的“构建体3”的具体和一般披露内容。其目的是，下文所述的与第三重组核酸有关的任何方面都可以与本文介绍的“构建体3”的任何具体和一般披露内容相结合，只要这些组合是明显兼容的。
[0298]
其目的是，本文所述的与第一、第二和第三重组核酸相关的任何方面和披露内容以及与构建体1、2和3的相关的具体和一般披露内容可以在组合明显兼容的情况下组合在一起。一种包含一种或多种核酸的药用组合物，这些核酸共同组成：(i)编码aav rep蛋白和aav cap蛋白的第一重组核酸序列；以及(ii)编码一个或多个腺病毒辅助蛋白的第二重组核酸序列，其中，当一个或多个核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组中时，可有条件地表达aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或一个或多个腺病毒辅助蛋白，从而有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。第1方面所述的组合物，其中，aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或一种或多种腺病毒辅助蛋白的条件性表达受到存在于一种或多种核酸中的一种或更多种可切除元件的控制。3.第2方面所述的组合物，其中，一个或多个可切除元件包含一个或多个内含子和/或一个或多个外显子。前述任何一个方面所述的组合物，其中，第一重组核酸序列负责编码：a)aav rep蛋白编码序列的第一部分；b)aav rep蛋白编码序列的第二部分；c)aav rep蛋白编码序列的第一部分和第二部分之间的一个可切除元件；以及d)aav cap蛋白编码序列。5.第2-4方面中任何一个方面所述的组合物，其中，可切除元件包含：a)包含第一内含子的第一间隔区，b)包含可检测标记物编码序列的第二间隔区；和c)包含第二内含子的第三间隔区，其中，第一间隔区和第三间隔区能够被哺乳动物细胞的内源性细胞机制切除。6.第5方面所述的组合物，其中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)包含第一内含子的第一间隔区；c)第二间隔区，其包含：
i)第一lox序列；ii)3’端剪接位点；iii)一个外显子；iv)停止信号序列；和v)第二lox序列；和d)包含第二内含子的第三间隔区。7.第5方面或第6方面所述的组合物，其中，可检测标记物是发光标记物、放射性标记物或荧光标记物，可选的荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。8.第5-7方面中任一项所述的组合物，其中：a)第一间隔区包含一个与seq id no:1至少有80％同源性的核酸序列；和/或b)第二间隔区包含一个与seq id no:2至少有80％相同的核酸序列；和/或c)第三间隔区包含一个与seq id no:3具有至少80％同源性的核酸序列。9.第5-8方面中任一项所述的组合物，其中，第二间隔区能够被cre多肽切除。10.前述任何一个方面所述的组合物，其中，aav rep蛋白和/或aav cap蛋白的表达是由天然启动子驱动的。11.第10方面所述的组合物，其中：a)天然启动子p5和/或p19负责驱动aav rep蛋白的表达；和/或b)天然启动子p40负责驱动aav cap蛋白的表达。12.前述任何一个方面所述的组合物，其中，第二重组核酸序列负责编码：a)一个或多个腺病毒辅助蛋白；b)一个条件性自切元件；和c)一个诱导型启动子。其中，一旦整合至哺乳动物细胞的核基因组中，一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列的表达将受到条件性自切元件和诱导型启动子的控制。13.第12方面所述的组合物，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。14.第12方面或第13方面所述的组合物，其中，自切元件包含多肽编码序列，具体为重组酶多肽，更具体为cre多肽。15.第14方面所述的组合物，其中，只有当存在触发剂时，才能够条件性表达由自切元件编码的多肽。16.第15方面所述的组合物，其中触发剂是一种荷尔蒙，最好是他莫昔芬。17.第9-16方面中任一项所述的组合物，其中诱导型启动子是tet诱导型启动子。18.第12-17方面中任一项所述的组合物，其中第二重组核酸序列进一步包含tet反应性激活蛋白编码序列，优选tet-on-3g。19.第18方面所述的组合物，其中tet-on 3g激活蛋白的表达由e1α启动子驱动。20.第12-19方面中任一项所述的组合物，其中第二重组核酸序列包含与seq id no:11或seq id no:12具有至少80％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少99％同源性或完全同源的序列。21.前述任何一个方面所述的组合物，其中，一种或多种核酸进一步包含va rna核酸编码序列。
22.第21方面所述的组合物，其中va rna的表达是组成型的。23.第21方面所述的组合物，其中va rna的表达是诱导型的。24.第23方面所述的组合物，其中va rna序列包含va rna内部启动子的一个或多个突变，优选g16a和g60a。25.第21-24方面中任一项所述的组合物，其中va rna的表达由e1α启动子或u6启动子驱动。26.第25方面所述的组合物，其中va rna的表达由u6启动子驱动，并且其中u6启动子包含：a)u6启动子序列的第一部分，b)一个填充片段序列，和c)u6启动子序列的第二部分，以及其中，填充片段序列能够被cre多肽切除。27.前述任何一个方面所述的组合物，其中aav cap蛋白的血清型选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。28.第27方面所述的组合物，其中，血清型是aav5和包含一个或多个突变或插入物的cap蛋白。29.前述任何一个方面所述的组合物，其中一个或多个重组核酸进一步编码有效载荷的第三重组核酸编码序列，其中可以选择的有效载荷是：(a)多核苷酸有效载荷，如用于rna编辑的向导rna、用于cas蛋白定向dna编辑的向导rna、trna阻遏物或用于替代基因治疗的基因；或(b)一种蛋白质，如治疗性抗体或疫苗免疫原。30.前述任何一个方面所述的组合物，其中一个或多个重组核酸包含一个或多个哺乳动物细胞选择元件。31.第30方面所述的组合物，其中一个或多个哺乳动物细胞选择元件负责编码抗生素抗性基因，可选杀稻瘟菌素抗性基因。32.第30方面或第31方面所述的组合物，其中一个或多个哺乳动物细胞选择元件是编码活化蛋白的营养缺陷筛选元件，其中蛋白可以选择dhfr。33.第30方面或第31方面所述的组合物，其中哺乳动物细胞选择元件中的一个或多个元件是第一营养缺陷筛选元件，它负责编码一种非活化型蛋白，需要表达来自第二营养缺陷筛选编码序列的第二个非活化型蛋白才能具有活性。34.第33方面所述的组合物，其中第一营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter(seq id no:5)活性，和/或其中第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-nter(seq id no:4)。35.第1-30方面中任一项所述的药用组合物，其中：
a)第一重组核酸包含一个哺乳动物细胞选择元件，元件负责编码抗生素抗性基因，最好是杀稻瘟菌素抗性基因；以及b)i.第二重组核酸包含编码非活化型蛋白的第一营养缺陷筛选元件，蛋白需要表达来自第二营养缺陷筛选编码序列的第二个非活化型蛋白才能具有活性；以及ii.第三重组核酸包含编码非活化型蛋白的第二营养缺陷筛选元件，蛋白需要表达来自第一营养缺陷筛选编码序列的第一个非活化型蛋白才能具有活性；以及其中在(i)或(ii)中，第一营养缺陷筛选序列负责编码dhfr z-cter(seq id no：5)，第二营养缺陷筛选序列负责编码dhfr z-nter(seq id no：4)，或者其中第一营养缺陷筛选序列负责编码dhfr z-nter(seq id no：4)，而第二营养缺陷筛选序列负责编码dhfr z-cter(seq id no：5)。36.一种哺乳动物细胞，其中细胞的核基因组包含多个整合的重组核酸构建体，这些构建体共同编码重组腺相关病毒(raav)病毒，其中细胞可以有条件地表达raav病毒。37.第36方面介绍的哺乳动物细胞，其中多个整合的重组核酸构建体包含第1-35方面中任何一个方面的一种或多种重组核酸，其中细胞可以有条件地表达aav rep蛋白、aav cap蛋白和/或腺病毒辅助蛋白。38.第36方面或第37方面介绍的哺乳动物细胞，其中细胞系可以表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b。39.第36-38方面中任何一个方面介绍的哺乳动物细胞，其中，多个整合的重组核酸构建体包含：(i)第一个整合的多核苷酸构建体，其中包括：a)aav rep蛋白编码序列的第一部分；b)aav rep蛋白编码序列的第二部分；c)位于aav rep蛋白编码序列的第一部分和aav rep蛋白编码序列的第二部分之间的可切除元件，其中可切除元件包含：i)包含第一内含子的第一间隔区。ii)包含可检测标记物编码序列的第二间隔区，其中第二间隔区能够被cre多肽切除；和iii)由第二内含子组成的第三间隔区；和d)aav cap蛋白编码序列；其中，aav rep蛋白和aav cap蛋白由天然启动子p5、p19和p40驱动；(ii)第二个整合的多核苷酸构建体，其中包括：a)条件性表达的va rna编码序列，序列包含va rna内部启动子的突变，其中u6启动子负责驱动va rna的表达，其中va rna序列可选择包含g16a和g60a突变型。b)一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列，其中腺病毒辅助蛋白是e2a和e4。c)负责编码cre多肽的条件性自切元件，这种多肽易位至细胞核，并且只有存在触发剂(即他莫昔芬)的情况下元件才会自切，以及d)一个诱导型启动子，这是一个tet诱导型启动子，并且其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列的表达受到条件性自切元件和诱导型
启动子的控制；以及(iii)第三个整合的多核苷酸构建体，包含有效载荷编码，其中有效载荷是多核苷酸有效载荷。40.一种raav病毒粒子群的生产方法，其中包括：(a)一旦允许表达raav病毒时，培养第36-39方面中任何一个方面所述的细胞；和(b)从细胞培养物中分离raav病毒粒子。41.第40方面介绍的方法，其中，纯化前raav病毒基因组(vg)与病毒颗粒(vg:vp)的比例大于0.5。42.第40方面或第41方面介绍的方法，其中，由细胞产生的raav病毒粒子群具有：(a)病毒基因组与转导单位的比例约为500：1至1：1；和/或(b)载体基因组与感染单位的比例为100:1。43.一种制备第36-39方面中任何一个方面所述细胞的方法，其中包括：i)提供哺乳动物细胞以及第1-35方面中任何一个方面所述的一个或多个核酸；以及ii)将第1-35方面中任何一个方面所述的一个或多个核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组中。44.由第40-42方面中任何一个方面所述的方法产生的raav病毒粒子群。45.第44方面所述的raav病毒粒子群，其中，当moi为10000时，病毒粒子的感染性至少为50％。46.一种用作药物的药用组合物，其中包括第44方面或第45方面所述的raav病毒粒子群，可供选择用于治疗单基因疾病。47.第44方面或第45方面所述的raav病毒粒子群或第46方面所述的药用组合物，作为药物使用，可供选择用于治疗单基因疾病。48.第47方面所述的raav病毒粒子群或药用组合物，其中raav病毒粒子的给药剂量为4x1014或更低。5.15.第1部分编号实施例[1]多核苷酸构建体，负责编码以下内容：a)rep多肽的第一部分；b)rep多肽的第二部分；c)cap多肽；以及d)位于rep多肽的第一部分和第二部分之间的可切除元件。[2]实施例1所述的多核苷酸构建体，其中，rep多肽是野生型rep多肽。[3]实施例1-2中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，cap多肽是野生型cap多肽。[4]实施例1-3中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含一个内含子。[5]实施例1-4中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含一个外显子。[6]实施例1-5中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含一个内含子和一个外显子。[7]实施例1-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含(从5’端到
3’端)：a)5’端剪接位点；b)包含第一内含子的第一间隔区；c)第二间隔区，其包含：i)第一lox序列；ii)3’端剪接位点；iii)一个外显子；iv)停止信号序列；和v)第二lox序列；和d)包含第二内含子的第三间隔区。其中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。[8]实施例7所述的多核苷酸构建体，其中第一和第二lox序列是loxp序列。[9]实施例7所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区可被cre多肽切除。[10]实施例9所述的多核苷酸构建体，其中，第二个多核苷酸构建体负责编码cre多肽。[11]实施例1-10中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，由天然启动子负责驱动rep多肽和cap多肽的表达。[12]实施例11所述的多核苷酸构建体，其中，天然启动子包括p5、p19和p40。[13]实施例7-12中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，外显子负责编码可检测标记物。[14]实施例13所述的多核苷酸构建体，其中，可检测标记物包含发光标记物、荧光标记物或放射性标记物。[15]实施例14所述的多核苷酸构建体，其中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。[16]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞适合于有条件地生产raav病毒，并且在缺少转染剂的情况下可诱导rep多肽和cap多肽的表达。[17]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞适合于有条件地生产raav病毒，并且在缺少质粒的情况下可诱导rep多肽和cap多肽的表达。[18]实施例16-17中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞包含实施例1-15中任一项所述的多核苷酸构建体，这些构建体被稳定地整合至细胞的核基因组中。[19]实施例18所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞系是单克隆细胞系。[20]实施例16-19中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞在加入切除元件后能够有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。[21]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞包含实施例1-14中任一实施例所述的稳定整合的多核苷酸构建体，并且其中所述细胞能够在加入切除元件后有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。[22]实施例21所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，切除元件是cre多肽或翻转酶。[23]实施例22所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二个多核苷酸构建体负责编码cre多肽。
[24]实施例21-23中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，切除元件的定位受激素调节。[25]实施例16-24中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞能够在至少加入两种触发剂后有条件地产生raav病毒粒子。[26]实施例25所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，至少两种触发剂包含多西环素和他莫昔芬。[27]一种编码突变型va rna的多核苷酸构建体，其中，突变型va rna基因序列包含内部启动子的至少两个突变。[28]实施例27所述的多核苷酸构建体，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。[29]实施例27-28中任一项所述的多核苷酸构建体，由包含突变型va rna基因序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一lox序列；c)填充片段序列；d)第二lox序列；e)u6启动子序列的第二部分。[30]实施例29所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列可被cre多肽切除。[31]实施例30所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽是外源性提供的。[32]实施例30所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽是由多核苷酸构建体编码的。[33]实施例30所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列位于u6启动子序列的第一部分和第二部分之间。[34]多核苷酸构建体，负责编码以下内容：a)一个或多个辅助蛋白；b)位于一个或多个辅助蛋白上游的自激发元件；以及c)位于自切元件上游的诱导型启动子。[35]实施例34所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件的表达是由tet-on-3g系统驱动的。[36]实施例34-35中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，多核苷酸构建体进一步包含一个tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)编码序列。[37]实施例36所述的多核苷酸构建体，其中，tet-on 3g激活蛋白的表达由e1α启动子驱动。[38]实施例37所述的多核苷酸构建体，其中，在存在第一触发剂的情况下，tet-on 3g激活蛋白与诱导型启动子结合。[39]实施例38所述的多核苷酸构建体，其中，诱导型启动子是tet诱导型启动子。[40]实施例34-39中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件是cre多肽编码序列。[41]实施例34-40中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件的表达受激素调节。
[42]实施例41所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件仅在激素存在时表达并自切。[43]实施例42所述的多核苷酸构建体，其中，激素是他莫昔芬。[44]实施例34-43中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2和e4。[45]实施例34-44中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，多核苷酸构建体进一步编码va rna。[46]实施例45所述的多核苷酸构建体，其中，va rna的表达是由e1α启动子驱动的。[47]实施例45-46中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，va rna是实施例27-33中任一项所述的突变型va rna。[48]实施例37或46所述的多核苷酸构建体，其中，e1α启动子包含至少一个突变。[49]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞适合于有条件地生产raav病毒粒子，其中，在缺少转染剂时，可诱导一种或多种辅助蛋白的表达。[50]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞适合于有条件地生产raav病毒粒子，其中，在缺少质粒时，可诱导一种或多种辅助蛋白的表达。[51]一种稳定哺乳动物细胞系，其中，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的细胞包含实施例27-48中任一项所述的多核苷酸构建体，该构建体被稳定地整合至细胞的核基因组中。[52]实施例49-51中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞系细胞包含实施例27-48中任一项所述的多核苷酸构建体，该构建体被稳定地整合至细胞的核基因组中。[53]实施例49-52中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其中细胞系的一个细胞能够在至少加入两种触发剂后有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。[54]一种稳定哺乳动物细胞系，其细胞系的一种细胞包含实施例27-48中任一实施例所述的稳定整合的多核苷酸构建体，并且能够在至少加入两种触发剂后有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。[55]实施例53-54中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，至少两种触发剂包含多西环素和他莫昔芬。[56]一种稳定哺乳动物细胞系，其中：细胞能够有条件地产生包装了编码有效载荷的可表达多核苷酸的重组aav(raav)病毒粒子；其中，由稳定细胞产生的病毒粒子群比由其他类似哺乳动物细胞在瞬时转染时产生的raav病毒粒子群具有更高的同质性。[57]实施例56所述的稳定哺乳动物细胞系，其稳定细胞产生的病毒粒子群的病毒基因组与转导单位的比例约为500:1至1:1。[58]实施例57所述的稳定哺乳动物细胞系，其稳定细胞产生的病毒粒子群的载体基因与感染单位的比率为100:1。[59]实施例56-58中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其在加入触发剂后
可诱导产生病毒粒子。[60]实施例56-58中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其在至少加入两种触发剂后可诱导产生病毒粒子。[61]实施例56-60中任一实施例所述的稳定哺乳动物细胞系，其细胞系的一种细胞包含实施例1-15、27-33和34-48中任一实施例所述的稳定整合的多核苷酸构建体。[62]一种稳定哺乳动物细胞系，其中：细胞能够有条件地产生包装了编码有效载荷的可表达多核苷酸的重组aav(raav)病毒粒子；加入触发剂后，可诱导产生病毒粒子。[63]一种稳定哺乳动物细胞系，其中：细胞能够有条件地产生包装了编码有效载荷的可表达多核苷酸的重组aav(raav)病毒粒子；病毒粒子的产生不以细胞内存在质粒为条件。[64]前面任一实施例所述的稳定细胞系，其可有条件地表达aav rep和cap蛋白。[65]前面任一实施例所述的稳定细胞系，其中，在向细胞培养基中至少加入第一表达触发剂之后，才能诱导aav rep和cap蛋白的表达。[66]实施例65所述的稳定细胞系，其中，在向细胞培养基中加入第一表达触发剂和第二表达触发剂后，才能诱导aav rep和cap蛋白的表达。[67]实施例66所述的稳定细胞系，其中，在向细胞培养基中同时加入第一表达触发剂和第二表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞毒性水平的rep蛋白。[68]实施例67所述的稳定细胞系，其中，在向细胞培养基中同时加入第一和第二表达触发剂之前，细胞不会表达具有细胞阻滞水平的rep蛋白。[69]实施例67或68所述的稳定细胞系，其中，细胞内rep蛋白的平均浓度小于向细胞培养基中加入第一和第二表达触发剂之前的平均浓度。[70]实施例65-69中任一项所述的稳定细胞系，其中，在向细胞培养基中加入所有这些第一表达触发剂后，rep和cap蛋白的表达为组成型。[71]实施例65-70中任一项所述的稳定细胞系，其中，腺病毒辅助蛋白的表达是有条件的。[72]实施例71所述的稳定细胞系，其中，表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是向细胞培养基中至少加入第三表达触发剂。[73]实施例72所述的稳定细胞系，其中第三表达触发剂与第一表达触发剂相同。[74]实施例72或73所述的稳定细胞系，其中，表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是向细胞培养基中加入第三表达触发剂和第四表达触发剂。[75]实施例74所述的稳定细胞系，其中，第四表达触发剂与第二表达触发剂相同。[76]实施例72或74所述的稳定细胞系，其中，第三表达触发剂与第一表达触发剂相同，第四表达触发剂与第二表达触发剂相同。[77]实施例76所述的稳定细胞系，其中，当细胞与至少第三表达触发剂接触并触发表达后，继续表达腺病毒辅助蛋白的前提条件是细胞培养基中只存在第三表达触发剂。[78]实施例77所述的稳定细胞系，其中，第三表达触发剂与第一表达触发剂相同。
[79]实施例71-78中任一项所述的稳定细胞系，其中，腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。[80]实施例65-75中任一项所述的稳定细胞系，其中，第一表达触发剂是四环素。[81]实施例80所述的稳定细胞系，其中，四环素是多西环素。[82]实施例74-76中任一项所述的稳定细胞系，其中，第四表达触发剂是雌激素受体配体。[83]实施例82所述的稳定细胞系，其中，雌激素受体配体是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。[84]实施例83所述的稳定细胞系，其中，雌激素受体配体是他莫昔芬。[85]之前任一实施例所述的稳定细胞系，其中，表达治疗性多核苷酸的前提条件是向细胞培养基中至少加入第五表达触发剂。[86]实施例62-84中任一项所述的稳定细胞系，其中，治疗性多核苷酸的表达不以向细胞培养基添加表达触发剂为条件。[87]实施例62-86中任一项所述的稳定细胞系，其中，只有向细胞培养基添加一种表达触发剂后，rep和cap蛋白、腺病毒辅助蛋白和可表达多核苷酸(编码有效载荷)的表达才会成为组成型。[88]实施例62-87中任一项所述的稳定细胞系，其中，只有向细胞培养基添加一种表达触发剂后，rep和cap蛋白以及腺病毒辅助蛋白的表达才会成为组成型。[89]实施例87或88所述的稳定细胞系，其中所述的一种表达触发剂是第一表达触发剂。[90]实施例89所述的稳定细胞系，其中，第一表达触发剂是四环素。[91]实施例90所述的稳定细胞系，其中，第一表达触发剂是多西环素。[92]实施例62-91中任一项所述的稳定细胞系，其细胞的核基因组包含多个整合的合成核酸构建体。[93]93.实施例92所述的稳定细胞系，其中，细胞的核基因组包含至少两个整合的合成构建体。[94]实施例93所述的稳定细胞系，其细胞的核基因组包含至少三个整合的合成构建体。[95]实施例92-94中任一项所述的稳定细胞系，其中，多个合成核酸构建体中的每一个均单独整合至细胞的核基因组中。[96]实施例92-94中任一项所述的稳定细胞系，其中，只需要单个非营养缺陷选择就可以将多个合成核酸构建体全部稳定地维持在细胞的核基因组中。[97]实施例92-96中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中：第一个整合的合成构建体包含条件性表达的aav rep和cap编码序列；第二个整合的合成构建体包含条件性表达的cre编码序列和条件性表达的腺病毒辅助蛋白编码序列；以及第三个整合的合成构建体包含可表达编码序列，用于编码有效载荷的可表达多核苷酸。[98]实施例97所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，当细胞与第一表达触发剂接触
之前，第一个整合构建体的rep编码序列被中间间隔区所阻断。[99]实施例98所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，中间间隔区包含(从5’端到3’端)：第一间隔区、第二间隔区和第三间隔区。[100]实施例99所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第一间隔区包含连接至第一间隔区元件5’端的5’端剪接位点(5’ss)。[101]实施例99-100中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第一间隔区包含与seq id no:1具有至少80％同源性的核酸序列。[102]实施例99-101所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二间隔区包含编码可检测蛋白质标记的多核苷酸，其两侧是lox位点。[103]实施例102所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可检测蛋白标记物是荧光蛋白。[104]实施例103所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，荧光蛋白是gfp。[105]实施例104所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，gfp是egfp。[106]实施例99所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二间隔区进一步包含一个polya序列。[107]实施例106所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya。[108]实施例99所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二间隔区进一步包含第一lox位点和编码蛋白质标记的多核苷酸之间的第一个3’端剪接位点(3’ss)。[109]实施例98-101中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二间隔区包含与seq id no:2具有至少80％同源性的核酸序列。[110]实施例99所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第三间隔区进一步包含第二个3’端剪接位点(3’ss)。[111]实施例110所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二个3’端剪接位点被定位在第二lox位点的3’端。[112]实施例98-111中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第三间隔区包含与seq id no:3具有至少80％同源性的核酸序列。[113]实施例98-112中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，通过操纵将rep编码序列连接至内源性p5启动子。[114]实施例98-113中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，通过操纵将rep编码序列连接至内源性p19启动子。[115]实施例98-114中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，间隔区在p19启动子下游位置被插入rep编码序列中。[116]实施例98-115中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，rep编码序列的5’端连接至cap编码序列。[117]实施例116所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，通过操纵将cap编码序列连接至内源性p40启动子。[118]实施例98-117中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第一个整合构建体进一步包含第一哺乳动物细胞选择元件。
[119]实施例118所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第一哺乳动物细胞选择元件是一种辅助选择元件。[120]实施例119所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，营养缺陷筛选元件负责编码一种活化蛋白。[121]实施例120所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，活化蛋白是dhfr。[122]实施例119-121中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一种非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二种营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[123]实施例122所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter(seq id no:5)。[124]实施例97-123中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，当细胞与第一表达触发剂接触之前，第二个整合构建体(从5’端到3’端)包含：诱导型启动子、cre编码序列、第一polya序列、腺病毒辅助蛋白编码序列、第二polya序列、组成型启动子、对第一表达触发剂有反应的蛋白编码序列和第二哺乳动物细胞选择元件。[125]实施例124所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，通过操纵将cre编码序列连接至诱导型启动子。[126]实施例125所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，诱导型启动子包含对第三表达触发剂有反应的元件。[127]实施例125所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，诱导型启动子包含多个四环素(tet)操纵子元件，当存在四环素时，能够与tet反应性激活蛋白结合。[128]实施例124-127中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，进一步包含对第四表达触发剂有反应的元件。[129]实施例128所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第四表达触发剂反应元件包含多个激素反应元件。[130]实施例129所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，激素反应元件是雌激素反应元件(ere)。[131]实施例124-130中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第三表达触发元件与第一表达触发元件相同，而第四表达触发元件与第二表达触发元件相同。[132]实施例124所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，cre编码序列的两侧是第一lox位点和第二lox位点。[133]实施例124所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，诱导型启动子包含多个tet操纵子元件，当存在第一表达触发剂时，能够与tet反应性激活蛋白结合。[134]实施例124-133中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，腺病毒辅助蛋白编码序列负责编码e2a和e4。[135]实施例124-133中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，通过操纵将第一表达触发剂反应蛋白编码序列连接至cmv启动子。[136]实施例124-135中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第一表达触发剂反应蛋白编码序列包含tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)编码序列。[137]实施例124-136中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中第二哺乳动物细
胞选择元件将赋予抗生素抗性。[138]实施例137所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，抗生素抗性赋予元件是杀稻瘟菌素抗性基因。[139]实施例98-138中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第三个整合的合成构建体包含可表达多核苷酸有效载荷的编码序列，以及第三哺乳动物细胞选择元件。[140]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达多核苷酸有效载荷负责编码用于rna编辑的向导rna。[141]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达的多核苷酸有效载荷负责编码用于cas蛋白定向dna编辑的向导rna。[142]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达多核苷酸有效载荷负责编码一种蛋白质。[143]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达的多核苷酸有效载荷包含用于替代基因治疗的基因。[144]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达多核苷酸有效载荷包含用于同源重组的同源构建体。[145]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达多核苷酸有效载荷负责编码治疗性抗体。[146]实施例139所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，可表达有效载荷多核苷酸负责编码疫苗免疫原。[147]实施例139-146中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第三哺乳动物细胞选择元件是一种辅助选择元件。[148]实施例147所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，营养缺陷筛选元件负责编码一种活化蛋白。[149]实施例148所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，活化蛋白是dhfr。[150]实施例147-149中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码一种非活化型蛋白质，该蛋白质需要表达第二种营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[151]实施例150所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-nter(seq id no:4)。[152]实施例123或151所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，dhfr选择压力包括将细胞放置在缺乏次黄嘌呤-胸苷的培养基中生长。[153]所述实施例中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，哺乳动物细胞系表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b，并且是人胚胎肾(hek)293细胞系、人hela细胞系、或中国仓鼠卵巢(cho)细胞系。[154]前述任一实施例中所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，哺乳动物细胞系是hek293细胞系。[155]前述实施例中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系，其中，哺乳动物细胞系表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b。[156]一种在培养液中生产raav病毒粒子的方法，包含将所有这些第一和第二表
达触发剂加入到实施例62-155中任一项所述的稳定哺乳动物细胞系中。[157]实施例156所述的方法，进一步包含仅当存在第一表达触发剂时培养稳定哺乳动物细胞系的后续步骤。[158]实施例157所述的方法，进一步包含从培养基中提纯raav病毒粒子的方法。[159]一种raav产品，通过实施例156-158的工艺制成。[160]一种治疗病症或疾病的方法，包括按照实施例159所述向有需要的患者施用治疗有效量的raav产品。[161]一种治疗单基因疾病的方法，包括按照实施例159所述向患有单基因疾病的患者施用治疗有效量的raav产品，其中raav有效载荷的表达将会改善疾病的症状。[162]实施例27-48、54-55和71中任一项所述的稳定细胞系，进一步包含诱导型va rna。[163]实施例162所述的稳定细胞系，其中，va rna是由构建体编码的，该构建体的启动子包含至少一个突变，可通过操纵将启动子连接至va rna编码序列。[164]164.实施例163所述的稳定细胞系，其中，至少一个突变是在a框启动子区域。[165]165.实施例163所述的稳定细胞系，其中，至少一个突变是在b框启动子区域。[166]166.实施例164所述的稳定细胞系，进一步包含b框启动子区域的至少一个突变。[167]167.实施例163所述的稳定细胞系，其中，va rna由相关构建体负责编码，该构建体的启动子区域中缺失约5-10个核苷酸。[168]168.实施例162-167中任一实施例所述的稳定细胞系，其中，通过操纵将诱导型腺病毒rna连接至u6启动子片段。[169]169.实施例168所述的稳定细胞系，其中，u6启动子片段包含一个填充片段或填充片段序列，该序列的两侧分别是第一lox位点和第二lox位点。5.16.第二部分编号实施例[1]一种包装细胞系，包含：第一个整合的多核苷酸构建体和第二个整合的多核苷酸构建体，其中，第一个整合的多核苷酸构建体包含条件性表达的aav rep蛋白和aav cap蛋白编码序列。第二个整合的多核苷酸构建体包含一个或多个条件性表达的腺病毒辅助蛋白编码序列，以及条件性表达的va rna编码序列；当不存在质粒时，rep蛋白、cap蛋白和一种或多种腺病毒辅助蛋白的表达是可以诱导的。[2]实施例1所述的包装细胞系，其中，当不存在转染剂时，rep蛋白、cap蛋白和腺病毒辅助蛋白的表达是可以诱导的。[3]实施例1或2所述的包装细胞系，其中，第一个整合的多核苷酸构建体包含：
a)aav rep蛋白编码序列的第一部分，b)aav rep蛋白编码序列的第二部分，c)aav rep蛋白编码序列的第一部分和第二部分之间的一个可切除元件，以及d)aav cap蛋白编码序列。[4]实施例3所述的包装细胞系，其中，可切除元件包含：a)包含第一内含子的第一间隔区，b)包含可检测标记物编码序列的第二间隔区，以及c)包含第二内含子的第三间隔区，其中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。[5]实施例4所述的包装细胞系，其中，可检测标记物是荧光标记物或发光标记物。[6]实施例4或5所述的包装细胞系，其中，第二间隔区能够被cre多肽切除。[7]前述任一实施例所述的包装细胞系，其中，aav rep蛋白和aav cap蛋白的表达是由天然启动子驱动的。[8]实施例7所述的包装细胞系，其中，天然启动子包括p5、p19和p40。[9]前述任一实施例所述的包装细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体包含：a)一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列，b)一个条件性自切元件，和c)一个诱导型启动子，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列的表达受到条件性自切元件和诱导型启动子的控制。[10]实施例9所述的包装细胞系，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4，其中e2a包含flag标签(备选项)。[11]实施例9或10所述的包装细胞系，其中，自切元件负责编码cre多肽。[12]实施例9-11中任一实施例所述的包装细胞系，其中，由自切元件编码的多肽易位至细胞核，并且只有当存在触发剂时才会自切。[13]实施例12所述的包装细胞系，其中，触发剂是他莫昔芬。[14]实施例9-13中任一实施例所述的包装细胞系，其中，诱导型启动子是tet诱导型启动子。[15]实施例9-14中任一实施例所述的包装细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体进一步包含tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)编码序列。[16]实施例15所述的包装细胞系，其中，tet-on 3g激活蛋白的表达是由e1α启动子驱动。[17]前述任一实施例所述的包装细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体进一步包含编码va rna序列的片段。[18]实施例17所述的包装细胞系，其中，va rna的表达是组成型的。[19]实施例17所述的包装细胞系，其中，va rna的表达是诱导型的。[20]实施例19所述的包装细胞系，其中，va rna序列包含va rna内部启动子的突变。
[21]实施例20所述的包装细胞系，其中，va rna序列包含g16a和g60a突变。[22]实施例19-21中任一项所述的包装细胞系，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。[23]实施例22的包装细胞系，其中u6启动子包含：a)u6启动子序列的第一部分，b)一个填充片段序列，和c)u6启动子序列的第二部分，以及其中，填充片段序列能够被cre多肽切除。[24]前述任一实施例所述的包装细胞系，其细胞系表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b。[25]前述任一实施例所述的包装细胞系，其中，aav cap蛋白是选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68细胞群的衣壳蛋白。[26]实施例25所述的包装细胞系，其中，aav cap蛋白是包含一个或多个突变或插入物的aav5衣壳蛋白。[27]一种生产重组aav(raav)病毒粒子的方法，该方法包含：使用多核苷酸构建体转染前述任一实施例所述的包装细胞系，该构建体包含用于有效载荷的可包装编码序列，以及负责诱导rep蛋白、cap蛋白、一种或多种腺病毒辅助蛋白、以及可选va rna的表达。其中，有效载荷的可包装编码序列被包封在aav衣壳中。[28]实施例27所述的方法，进一步包含随后从细胞培养基和/或细胞裂解液中纯化raav病毒粒子的步骤。[29]一种生产用细胞系，包含：实施例1至26中任一项所述的包装细胞系，以及包含用于有效载荷的可包装编码序列的一种多核苷酸构建体。[30]一种生产用细胞系，包含：第一个整合的多核苷酸构建体。第二个整合的多核苷酸构建体，和第三个整合的多核苷酸构建体，其中，第一个整合的多核苷酸构建体包含条件性表达的aav rep蛋白和aav cap蛋白编码序列。第二个整合的多核苷酸构建体包含一个或多个条件性表达的腺病毒辅助蛋白编
码序列，以及条件性表达的va rna编码序列(可选)。第三个整合的多核苷酸构建体包含用于有效载荷的可包装编码序列；当不存在质粒时，可诱导生产含有有效载荷编码序列的重组aav(raav)病毒粒子。[31]实施例30所述的生产用细胞系，其中，当不存在转染剂时，可诱导生产含有有效载荷编码序列的raav病毒粒子。[32]实施例30或31所述的生产用细胞系，其中，第一个整合的多核苷酸构建体包含：a)aav rep蛋白编码序列的第一部分，b)aav rep蛋白编码序列的第二部分，c)aav rep蛋白编码序列的第一部分和第二部分之间的一个可切除元件，以及d)aav cap蛋白编码序列。[33]实施例32所述的生产用细胞系，其中，可切除元件包含：a)包含第一内含子的第一间隔区，b)包含可检测标记物编码序列的第二间隔区，以及c)包含第二内含子的第三间隔区，其中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。[34]实施例33所述的生产用细胞系，其中，可检测标记物是荧光标记物或发光标记物。[35]实施例33或34所述的生产用细胞系，其中，第二间隔区能够被cre多肽切除。[36]实施例30-35中任一项所述的生产用细胞系，其中，aav rep蛋白和aav cap蛋白的表达是由天然启动子驱动。[37]实施例36所述的生产用细胞系，其中，天然启动子包括p5、p19和p40。[38]实施例30-37中任一项所述的生产用细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体包含：a)一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列，b)一个条件性自切元件，和c)一个诱导型启动子，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白编码序列的表达受到条件性自切元件和诱导型启动子的控制。[39]实施例38所述的生产用细胞系，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包括e2a和e4。[40]实施例38或39所述的生产用细胞系，其中，自切元件负责编码cre多肽。[41]实施例38-40中任一项所述的生产用细胞系，其中，自切元件编码的多肽将易位至细胞核，并且仅当触发剂存在时自切。[42]实施例41所述的生产用细胞系，其中，触发剂是他莫昔芬。[43]实施例38-42中任一项所述的生产用细胞系，其中，诱导型启动子是tet诱导型启动子。[44]实施例38-43中任一项所述的生产用细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体进一步包含tet反应性激活蛋白(tet-on-3g)编码序列。
[45]实施例44所述的生产用细胞系，其中tet-on 3g激活蛋白的表达是由e1α启动子驱动的。[46]实施例30-45中任一项所述的生产用细胞系，其中，第二个整合的多核苷酸构建体进一步包含va rna序列编码片段。[47]实施例46所述的生产用细胞系，其中，va rna的表达是组成型的。[48]实施例46所述的生产用细胞系，其中，va rna的表达是诱导型的。[49]实施例48所述的生产用细胞系，其中，va rna序列包含va rna内部启动子的突变。[50]实施例49所述的生产用细胞系，其中，va rna序列包含g16a和g60a突变。[51]实施例48-50中任一项所述的生产用细胞系，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。[52]实施例51所述的生产用细胞系，其中u6启动子包含：a)u6启动子序列的第一部分，b)一个填充片段序列，和c)u6启动子序列的第二部分，以及其中，填充片段序列能够被cre多肽切除。[53]实施例30-52中任一项所述的生产用细胞系，其细胞系表达腺病毒辅助蛋白e1a和e1b。[54]实施例30-53中任一实施例所述的生产用细胞系，其中，aav cap蛋白的血清型是选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。[55]实施例54所述的生产用细胞系，其中，aav cap蛋白包括vp1衣壳蛋白(包括一个或多个突变或插入物)，其中血清型可以选择aav5或aav9。[56]一种生产重组aav(raav)病毒粒子的方法，该方法包含：培养实施例29-55中任一项所述的生产用细胞系，以及诱导rep蛋白、cap蛋白、一种或多种腺病毒辅助蛋白、以及va rna(可选)的表达。[57]实施例56所述的方法，进一步包含随后从细胞培养基或细胞裂解液中纯化raav病毒粒子的步骤。[58]一种用于生产重组aav(raav)病毒粒子的生产用细胞系，其中，当不存在质粒时，可诱导raav病毒粒子的生产，并且在诱导后，生产用细胞系的纯化前raav病毒粒子产量不低于1
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个病毒基因组(vg)/l。[59]实施例58所述的生产用细胞系，其中，当不存在转染剂时，可诱导raav病毒粒子的生产。
[60]实施例58或59所述的生产用细胞系，其中，当不存在单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒时，可诱导raav病毒粒子的生产。[61]实施例58-60中任一项所述的生产用细胞系，其中，在诱导之后，生产用细胞系所获得的纯化前raav全衣壳与空衣壳之比不低于0.5。[62]实施例58-61中任一项所述的生产用细胞系，其中，在诱导、培养和下游处理之后，生产用细胞系能够在不进行超速离心的情况下达到不低于1
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病毒基因组(vg)/l的纯化后raav病毒粒子产量。[63]实施例58-62中任一项所述的生产用细胞系，其中，在诱导、培养和下游处理之后，生产用细胞系能够在不进行超速离心的情况下达到不低于0.5的纯化后raav全衣壳与空衣壳之比。[64]实施例58-63中任一项所述的生产用细胞系，其中，在诱导后，生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，并且相比由其他类似细胞系在瞬时三重转染后生产的raav病毒粒子群，该病毒粒子具有更高的同质性。[65]一种用于生产重组aav(raav)病毒粒子的生产用细胞系，其中，当不存在质粒时，可诱导raav病毒粒子的生产，并且在诱导之后，生产用细胞系能够生产纯化前raav全衣壳与空衣壳的比率不低于0.5的raav病毒粒子。[66]实施例[65]所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，在纯化并施用给受试者后，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和raav病毒基因组的raav病毒粒子群相比(并通过相同的给药方式给予类似的受试者使用)，每次施用该raav病毒粒子基因组诱发的中和抗体滴度较低。[67]实施例[65]或[66]所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，在纯化并施用给受试者后，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和raav病毒基因组的raav病毒粒子群相比(并通过相同的给药方式给予类似的受试者使用)，每次施用该raav病毒粒子基因组所引起的不良反应较少和/或强度较低。[68]实施例[67]所述的生产用细胞系，其中，不良反应有：肝功能障碍、肝脏炎症、胃肠道感染、呕吐、细菌感染、脓毒症、肌钙蛋白水平增加、红细胞计数减少、血小板计数减少、激活补体免疫系统反应、急性肾脏损伤、心肺功能不全和死亡。[69]实施例[67]所述的生产用细胞系，其中，不良反应是干扰素γ(ifnγ)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)中的一种或多种血清水平增加。[70]实施例[65]-[69]中任一项所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产有效剂量小于1
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1014病毒颗粒(vp)/kg的raav病毒粒子。[71]实施例[65]-[70]中任一项所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产可对患者进行多次给药的raav病毒粒子。[72]实施例[65]-[71]中任一项所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后生产的raav病毒粒子群相比，该raav病毒粒子纯化前质量变异性更低。[73]实施例[65]-[71]中任一项所述的生产用细胞系，其生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，与其他可比胞系在瞬时三重转染后生产的raav病毒粒子群相比，该raav病毒粒子纯化后质量变异性更低。
[74]实施例[72]-[73]所述的生产用细胞系，其中纯化质量变异性选自：病毒基因组与病毒颗粒比例变异性、产量变异性、效力变异性、纯度变异性、dna含量变异性和衣壳变异性。[75]一种用于生产重组aav(raav)病毒粒子的生产用细胞系，其中，当不存在质粒时，可诱导raav病毒粒子的生产，并且在诱导之后，生产用细胞系能够生产raav病毒粒子，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和raav病毒基因组的raav病毒粒子群相比，该raav病毒粒子的raav批间一致性更高。[76]实施例[75]所述的生产用细胞系，其中，批间一致性是通过具有预定数量的病毒基因组(vg)的不同批次raav病毒颗粒数(vp)的变化来衡量的。[77]实施例[75]或[76]所述的生产用细胞系，其中，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和vg的raav病毒粒子群相比，批间一致性提高了2倍。[78]实施例[77]所述的生产用细胞系，其中，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和vg的raav病毒粒子群相比，批间一致性提高了5倍。[79]实施例[78]所述的生产用细胞系，其中，与其他类似细胞系在瞬时三重转染后产生的具有相同衣壳和vg的raav病毒粒子群相比，批间一致性提高了10倍。[80]实施例[75]-[79]中任一项所述的生产用细胞系，其中，具有预定数量的病毒基因组(vg)的raav批次之间的病毒颗粒(vp)数量变化不超过20％。[81]实施例[80]所述的生产用细胞系，其中，具有预定数量的病毒基因组(vg)的raav批次之间的病毒颗粒(vp)数量变化不超过10％。[82]实施例[81]所述的生产用细胞系，其中，具有预定数量的病毒基因组(vg)的raav批次之间的病毒颗粒(vp)数量变化不超过5％。[83]一种细胞培养组合物，包含：a)悬浮适应型哺乳动物细胞，b)无血清细胞培养基，和c)重组aav(raav)病毒粒子，其中，细胞培养物不含单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒；其中，细胞培养物不含质粒和转染剂。[84]实施例83所述的细胞培养组合物，其细胞培养组合物不含聚乙烯亚胺(pei)。[85]实施例83或84所述的细胞培养组合物，其中，悬浮适应型哺乳动物细胞是悬浮适应型hek293细胞或其衍生物。[86]实施例83-85中任一项所述的细胞培养组合物，其中，悬浮适应型哺乳动物细胞是实施例1-26中任一项所述的包装细胞系细胞或实施例29-55中任一项所述的生产用细胞系细胞。[87]实施例83-86中任一项所述的细胞培养组合物，其细胞培养组合物的纯化前raav浓度大于1
×
10
14
病毒基因组(vg)/l。[88]实施例83-87中任一项所述的细胞培养组合物，其细胞培养组合物的纯化前raav病毒颗粒与病毒基因组(vg)的比率不低于0.5。[89]一种生物反应器，含有实施例59-88中任一项所述的细胞培养组合物。[90]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个1l生物反应器。
[91]实施例90所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
14
个病毒基因组(vg)。[92]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个5l生物反应器。[93]实施例92所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
14
个病毒基因组(vg)。[94]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个50l生物反应器。[95]实施例94所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
15
个病毒基因组(vg)。[96]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个100l生物反应器。[97]实施例96所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
16
个病毒基因组(vg)。[98]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个500l生物反应器。[99]实施例98所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
16
个病毒基因组(vg)。[100]实施例89所述的生物反应器，其生物反应器是一个2000l生物反应器。[101]实施例100所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于2
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10
17
个病毒基因组(vg)。[102]实施例89至101中任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一次性使用的生物反应器。[103]一种使用生物反应器生产重组aav(raav)病毒粒子的方法，该方法包含：在生物反应器中培养实施例1-26中任一项所述的包装细胞系，使用多核苷酸构建体转染包装细胞系，该构建体包含用于有效载荷的可包装编码序列，并且诱导rep蛋白、cap蛋白、一种或多种腺病毒辅助蛋白、以及va rna(可选)的表达。[104]一种使用生物反应器生产重组aav(raav)病毒粒子的方法，该方法包含：在生物反应器中培养实施例29-55中任一项所述的生产用细胞系，并且诱导rep蛋白、cap蛋白、一种或多种腺病毒辅助蛋白、以及va rna(可选)的表达。[105]实施例103或104所述的方法，进一步包括随后从细胞培养组合物中纯化raav病毒粒子的步骤。[106]一种药用组合物，包含：使用包装细胞系、生产用细胞系、细胞培养物、生物反应器或前述任何实施例所述的方法生产的cgmp级raav病毒粒子，以及一种药学上可接受的载体。[107]实施例106所述的药用组合物，其药用组合物不含质粒和转染剂。[108]实施例106或107所述的药用组合物，其药用组合物不含单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒。[109]实施例106-108中任一项所述的药用组合物，其药用组合物不含单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒dna。[110]实施例106-109中任一项所述的药用组合物，其药用组合物的纯化后raav浓
度至少为1x10
11
病毒基因组(vg)/ml。[111]实施例106-110中任一项所述的药用组合物，其药用组合物的纯化后raav病毒颗粒与病毒基因组(vg)的比率不低于0.8。[112]一种药物单位剂量，包含实施例106-111中任一项所述药用组合物。[113]实施例112所述的药物单位剂量，其中，具有预定数量病毒基因组的raav各剂量之间的病毒颗粒的数量变化不超过20％。[114]实施例[113]所述的药物单位剂量，其中，具有预定数量病毒基因组的raav各剂量之间的病毒颗粒的数量变化不超过10％。[115]实施例[114]所述的药物单位剂量，其中，具有预定数量病毒基因组的raav各剂量之间的病毒颗粒的数量变化不超过5％。[116]一种药物单位剂量，包含：在2ml溶液中，至少1x1011个raav病毒基因组，以及纯化后raav全壳与空壳比率不低于0.8。[117]一种降低具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量的免疫原性的方法，与通过瞬时三重转染制备的raav vg相同剂量相比，该方法包括：使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产ravv。[118]与通过瞬时三重转染制备的raav vg相同剂量相比，一种用于减少由施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量引起的不良反应的数量或强度的方法，该方法包括：使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产ravv。[119]实施例[118]所述的方法，其中，不良反应有：肝功能障碍、肝脏炎症、胃肠道感染、呕吐、细菌感染、脓毒症、肌钙蛋白水平上升、红细胞计数下降、血小板计数下降、激活补体免疫系统反应、急性肾损伤、心肺功能不全和死亡。[120]实施例[118]所述的方法，其中，不良反应是干扰素γ(ifnγ)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)中的一种或多种血清水平增加。[121]一种向受试者施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量的方法，与施用通过瞬时三重转染制备的raav vg相同剂量后产生的中和抗体相比，受试者产生的中和抗体减少，该方法包括：施用通过实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法所生产的第一剂raav。[122]实施例[121]所述的方法，进一步包括：至少施用通过实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任
一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法所生产的第二剂raav。[123]一种向受试者施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav剂量的方法，与施用通过瞬时三重转染制备的raav vg相同剂量相比，不良反应的数量或强度有所降低，该方法包括：施用通过实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法所生产的raav剂量。[124]实施例[123]所述的方法，其中，不良反应有：肝功能障碍、肝脏炎症、胃肠道感染、呕吐、细菌感染、脓毒症、肌钙蛋白水平升高、红细胞计数下降、血小板计数下降、激活补体免疫系统反应、急性肾损伤、心肺功能不全和死亡。[125]实施例[123]所述的方法，其中，不良反应是干扰素γ(ifnγ)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)中的一种或多种血清水平增加。[126]一种向需要的受试者重复施用raav剂量的方法，该方法包括：通过第一给药方式施用第一剂raav，其中，raav是通过实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法所生产的，然后通过第一给药方式或第二给药方式施用至少第二剂raav，其中raav是通过实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法所生产的。其中，在施用第一剂后与施用至少第二剂后相比，有效载荷的治疗效果变化小于10％、20％、30％、40％或50％。[127]实施例126所述的方法，其中，在施用第一剂后与施用至少第二剂后相比，有效载荷的治疗效果变化小于10％、20％、30％、40％或50％。[128]一种用于生产具有多个病毒基因组(vg)的多个raav批次的方法与通过瞬时三重转染制备的raav-vg相同批次相比，该方法包括：使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产多个raav批次。[129]实施例128所述的方法，其中，多个raav批次之间的病毒基因组(vg)的数量变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[130]实施例128或实施例129所述的方法，其中，多个raav批次之间的病毒颗粒的数量变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[131]实施例128-130中任一项所述的方法，其中，病毒颗粒(vp)的数量或病毒基
因组的数量是由多个纯化前批次决定的。[132]一种用于提高具有预定数量病毒基因组(vg)的第一批raav和第二批raav的批间一致性的方法，该方法包括：使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产第一批raav；和使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产第二批raav；其中，与第二批raav中的病毒颗粒(vp)数量和病毒基因组数量相比，第一批raav中的一些病毒颗粒(vp)具有预定数量变化不超过50％、40％、30％或20％的病毒基因组(vg)。[133]一种提高第一批raav和第二批raav的批间一致性的方法，该方法包括：使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产第一批raav；和使用实施例1-26中任一项所述的包装细胞系、实施例29-55和58-74中任一项所述的生产用细胞系、或实施例83-88中任一项所述的细胞培养组合物、或实施例89-94中任一项所述的生物反应器、或实施例27、28、56、57和103-105中任一项所述的生产方法生产第二批raav；其中，第二批raav的病毒基因组数量与第一批raav的病毒基因组数量相比，变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[134]实施例133所述的方法，其中，与第一批raav中的病毒基因组数量相比，纯化前第二批raav的病毒基因组的数量变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[135]实施例133或134所述的方法，其中，与第一批raav中的病毒颗粒的数量相比，第二批raav的病毒颗粒的数量变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[136]实施例133-135中任一项所述的方法，其中，与第一批raav中的病毒颗粒数量相比，纯化前第二批raav的病毒颗粒的数量变化不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％。[137]实施例133-136中任一项所述的方法，其中，第一批raav和第二批raav是使用单克隆细胞生产的。[138]实施例133-137中任一项所述的方法，其中，第一批raav和第二批raav是使用来自不同单克隆细胞系的细胞生产的。[139]实施例128-138中任一项所述的方法，还包括从细胞培养基和/或细胞裂解物中纯化raav病毒粒子的后续步骤。[140]一种raav产品，使用实施例27、28、56、57和103至105中任一项所述的方法制
成。5.17.第3部分编号实施例[1]多核苷酸构建体，负责编码以下内容：a)一个或多个辅助蛋白；b)位于一个或多个辅助蛋白上游的自激发元件；以及c)位于自切元件上游的诱导型启动子。[2]实施例1所述的多核苷酸构建体，其中，通过操纵将自切元件连接至与诱导型启动子。[3]实施例2所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件的表达由诱导型启动子驱动。[4]实施例2-3中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，诱导型启动子是四环素反应性启动子元件(tre)。[5]实施例4所述的多核苷酸构建体，其中，tre包含与最小启动子融合的tet操作子(teto)序列多联体。[6]实施例5所述的多核苷酸构建体，其中，最小启动子是人巨细胞病毒启动子。[7]实施例2-6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，诱导型启动子包含与seq id no:22具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[8]实施例2-7中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，在与激活剂结合后，通过诱导型启动子激活转录过程。[9]实施例8所述的多核苷酸构建体，其中，当存在第一触发剂时，激活剂与诱导型启动子结合。[10]实施例8-9中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含激活剂。[11]实施例8-10中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，通过操纵将激活剂连接至组成型启动子。[12]实施例11所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子是e1α启动子或人巨细胞病毒启动子。[13]实施例12所述的多核苷酸构建体，其中，e1α启动子包含至少一个突变。[14]实施例11-13中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[15]实施例8-14中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，激活剂是反向四环素控制性反式激活子(rta)，包含与vp16转导结构域融合的tet阻遏物结合蛋白(tetr)。[16]实施例15所述的多核苷酸构建体，其中，rta包含tetr dna结合部分的四个突变。[17]实施例15-16中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，rta包含与seq id no:21具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[18]实施例2-7中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，在缺少第一触发剂的情况下，诱导型启动子被阻遏物结合。[19]实施例2-19中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，诱导型启动子在第一触发剂存在下被激活。[20]实施例18-19中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，第一触发剂与阻遏物结
合。[21]实施例18-20中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，阻遏物是四环素控制性反式激活子。[22]实施例18-21中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含阻遏物。[23]实施例18-22中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，通过操纵将阻遏物连接至组成型启动子。[24]实施例18-23中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含一个四环素控制性反式激活子。[25]实施例18-24中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，通过操纵将四环素控制性反式激活子连接至组成型启动子。[26]实施例18-25中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子是e1α启动子。[27]实施例18-26中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，e1α启动子包含至少一个突变。[28]实施例27所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[29]实施例21或24-28中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，当存在第一触发剂时，四环素控制性反式激活子不会被结合。[30]实施例21或24-29中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，当存在第一触发剂时，四环素控制性反式激活子不会与诱导型启动子结合。[31]实施例18-30中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子是e1α启动子。[32]实施例31所述的多核苷酸构建体，其中，e1α启动子包含至少一个突变。[33]实施例31-32中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[34]实施例18-33中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，在第一触发剂与阻遏物结合后，通过诱导型启动子激活转录过程。[35]实施例18-34中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，阻遏物与第一触发剂结合。[36]实施例18-35中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，第一触发剂是四环素。[37]实施例36所述的多核苷酸构建体，其中，四环素是多西环素。[38]实施例2-3中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，诱导型启动子是一个cumate操纵子序列。[39]实施例38所述的多核苷酸构建体，其中，cumate操纵子序列位于组成型启动子的下游。[40]实施例39所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子是人巨细胞病毒启动子。[41]实施例38-40中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，在缺少第一触发剂的情况下，诱导型启动子与cymr阻遏物结合。
[42]实施例38-41中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，当存在第一触发剂时，诱导型启动子将会被激活。[43]实施例41所述的多核苷酸构建体，其中，第一触发剂与cymr阻遏物结合。[44]实施例41或43中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含cymr阻遏物。[45]实施例41或43-44中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，通过操纵将cymr阻遏物连接至组成型启动子。[46]实施例45所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子是e1α启动子。[47]实施例46中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，e1α启动子包含至少一个突变。[48]实施例46-47中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，组成型启动子包含与seq id no:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[49]实施例41-49中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，第一触发剂是cumate。[50]实施例1-49中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件编码序列包含polya序列。[51]实施例1-50中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，自切元件是重组酶。[52]实施例51所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶为位点特异性重组酶。[53]实施例51所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶与配体结合域融合。[54]实施例51所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。[55]实施例54所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽与配体结合域融合。[56]实施例55所述的多核苷酸构建体，其中，配体结合结构域是激素受体。[57]实施例56所述的多核苷酸构建体，其中，激素受体是一种雌激素受体。[58]实施例57所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体包含一个点突变。[59]实施例58所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体是ert2。[60]实施例51所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre-ert2多肽。[61]实施例1-61中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，当存在第二触发剂时，自切元件将易位至细胞核。[62]实施例61所述的多核苷酸构建体，其中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。[63]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。[64]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二触发剂是他莫昔芬。[65]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶的两侧分别是重组位点。[66]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组位点是lox位点或翻转酶识别靶点(frt)。[67]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，lox位点是loxp位点。[68]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含e2a和e4。[69]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白进一步包含一个蛋白质标签。
[70]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，蛋白质标签是flag-标签。[71]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，e2a是flag标记的e2a。[72]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，e2编码序列和e4编码序列被内部核糖体进入位点(ires)或p2a分隔开。[73]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，进一步包含一个可选标记物编码序列。[74]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[75]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[76]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[77]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[78]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，进一步包含va rna编码序列。[79]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，va rna编码序列是转录死亡序列。[80]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。[81]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。[82]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，由va rna基因编码序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。[83]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列可被重组酶切除。[84]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含基因编码序列。[85]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含启动子。[86]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是组成型启动子。[87]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是cmv启动子。[88]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，基因负责编码可检测标记物或可选标记物。[89]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。
[90]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[91]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[92]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。[93]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是营养缺陷筛选元件。[94]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。[95]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，活化蛋白是dhfr。[96]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码非活化型蛋白，该蛋白需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[97]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。[98]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，非活化型蛋白包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。[99]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。[100]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seq id no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[101]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seq id no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[102]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[103]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。[104]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。[105]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。[106]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一lox序列是第一loxp位点，第二lox序列是第二loxp位点。[107]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。[108]实施例1-107中任一项所述的多核苷酸构建体存在于载体中。[109]实施例1-107中任一项所述的多核苷酸构建体存在于质粒中。[110]实施例1-107中任一项所述的多核苷酸构建体存在于细菌人工染色体或酵母人工染色体中的。
[111]实施例1-110中任一项所述的多核苷酸构建体，其多核苷酸构建体是合成核酸构建体。[112]实施例1-111中任一项所述的多核苷酸构建体，包含与seq id no:9-seq id no:19、seq id 23-seq id no:32或seq id no:35中任一序列具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[113]一种细胞，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体。[114]实施例113所述的细胞，其中，多核苷酸被稳定地整合至细胞的基因组中。[115]实施例113-114中任一项所述的细胞，其细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。[116]实施例113-114中任一项所述的细胞，其细胞是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞。[117]实施例113-116中任一项所述的细胞，其细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。[118]实施例113-117中任一项所述的细胞，其细胞是dhfr裸细胞。[119]一种多核苷酸构建体，包含：a)rep基因序列的第一部分；b)rep基因序列的第二部分；c)cap基因的序列；和d)位于rep基因序列第一部分和第二部分之间的可切除元件。[120]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含停止信号序列。[121]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含兔β球蛋白内含子。[122]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含一个外显子。[123]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含一个内含子和一个外显子。[124]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含内含子。[125]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，两个剪接位点位于rep基因序列第一部分和第二部分之间。[126]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，两个剪接位点是一个5’端剪接位点和一个3’端剪接位点。[127]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，5’端剪接位点是兔β球蛋白5’端剪接位点。[128]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。[129]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，三个剪接位点位于rep基因序列第一部分和第二部分之间。[130]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，三个剪接位点是5’端剪接位点、第一个3’端剪接位点和第二个3’端剪接位点。[131]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一个3’端剪接位点是第二
个3’端剪接位点的重复。[132]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一个3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。[133]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二个3’端剪接位点是兔β球蛋白3’端剪接位点。[134]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含重组位点。[135]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组位点是lox位点或frt位点。[136]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，lox位点是loxp位点。[137]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点；b)第一重组位点；c)第一个3’端剪接位点；d)停止信号序列；e)第二重组位点；以及f)第二个3’端剪接位点。[138]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可切除元件包含(从5’端到3’端)：a)5’端剪接位点。b)第一间隔区。c)第二间隔区，其包含：i)第一重组位点。ii)第一个3’端剪接位点。iii)停止信号序列；和iv)第二重组位点；和d)包含第二个3’端剪接位点的第三间隔区。[139]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一间隔区序列包含内含子。[140]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一间隔区包含与seq id no:1具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[141]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区包含与seq id no:2具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[142]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第三间隔区包含与seq id no:3具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[143]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第三间隔区包含一个内含子。[144]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一间隔区和第三间隔区能够被内源性细胞机制切除。
[145]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区包含一个外显子。[146]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区进一步包含polya序列。[147]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，polya序列是外显子的3’端部分。[148]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。[149]实施例中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区包含(从5’端到3’端)：a)第一重组位点；b)第一个3’端剪切位点；c)外显子；d)停止信令序列；和e)第二重组位点；[150]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。[151]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一loxp序列，第二重组位点是第二loxp序列。[152]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一frt序列，第二重组位点是第二frt序列。[153]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，停止信号序列是外显子的终止密码子或polya序列。[154]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，polya序列包含兔β球蛋白(rbg)polya序列。[155]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，外显子负责编码一个可检测标记物或可选标记物。[156]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。[157]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。[158]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二间隔区可被重组酶切除。[159]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是位点特异性重组酶。[160]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。[161]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽与配体结合域融合。[162]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，配体结合结构域是激素受
体。[163]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，激素受体是一种雌激素受体。[164]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体包含一个点突变。[165]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体是ert2。[166]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre-ert2多肽。[167]前述实施例的多核苷酸构建体，其中，重组酶由第二个多核苷酸构建体编码或由外源提供。[168]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，rep基因负责编码rep多肽。[169]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，cap基因负责编码cap多肽。[170]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，rep基因和cap基因的转录是由天然启动子驱动的。[171]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，天然启动子包括p5、p19和p40。[172]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，rep多肽是野生型rep多肽。[173]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，rep多肽包含rep78、rep68、rep52和rep40。[174]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，在缺少重组酶的情况下，能够表达截短复制相关蛋白(其包含由rep基因序列的第一部分和外显子表达的多肽)。[175]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，cap多肽是野生型cap多肽。[176]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，cap多肽是aav衣壳蛋白。[177]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，aav衣壳蛋白包含vp1、vp2和vp3。[178]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，aav衣壳蛋白的血清型选自包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11、aav 12、aav13、aav 14、aav 15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。[179]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，进一步包含一个可选标记物编码序列。[180]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。[181]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是营养缺陷筛选元件。[182]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。
[183]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，活化蛋白是dhfr。[184]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码非活化型蛋白，该蛋白需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[185]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。[186]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，非活化型蛋白包括dhfr z-nter或dhfr z-cter。[187]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。[188]实施例185-187中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seqid no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[189]实施例185-188中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seqid no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[190]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[191]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[192]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[193]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[194]实施例119-193中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体。[195]实施例119-194中任一项所述的多核苷酸构建体存在于载体中。[196]实施例119-194中任一项所述的多核苷酸构建体存在于质粒中。[197]实施例119-194中任一项所述的多核苷酸构建体存在于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。[198]实施例119-197中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，多核苷酸构建体是合成核酸构建体。[199]实施例119-198中任一项所述的多核苷酸构建体，包含与seq id no:1-seq id no:3、seq id 6-seq id no:8、或seq id no:32中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[200]实施例119-199中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含va rna编码序列。[201]实施例200的多核苷酸构建体，va rna编码序列是一个转录死亡序列。[202]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。[203]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。
[204]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，由va rna基因编码序列的上游组成，包含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。[205]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列可被重组酶切除。[206]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含基因编码序列。[207]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含启动子。[208]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是组成型启动子。[209]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是cmv启动子。[210]一种细胞，包含实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体。[211]实施例210所述的细胞，其中，多核苷酸被稳定地整合至细胞的基因组中。[212]实施例210-211中任一实施例所述的细胞，其细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。[213]实施例210-211中任一实施例所述的细胞，其细胞是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞。[214]实施例210-213中任一实施例所述的细胞，其细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。[215]实施例210-214中任一实施例所述的细胞，其细胞是dhfr裸细胞。[216]一种编码va rna的多核苷酸构建体，其中，va rna编码序列包含内部启动子的至少两个突变。[217]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna编码序列包含va rna转录死亡编码序列。[218]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna编码序列包含缺失5-10个核苷酸的启动子区域。[219]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna编码序列包含至少一个突变。[220]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，至少一个突变是在a框启动子区域。[221]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，至少一个突变是在b框启动子区域。[222]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，至少一个突变是g16a和g60a。[223]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，va rna的表达是由u6启动子驱动的。[224]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，由va rna基因序列的上游组成，包
含(从5’端到3’端)：a)u6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；e)u6启动子序列的第二部分。[225]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列可被重组酶切除。[226]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含基因编码序列。[227]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，填充片段序列包含启动子。[228]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是组成型启动子。[229]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，启动子是cmv启动子。[230]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，基因负责编码可检测标记物或可选标记物。[231]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。[232]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是营养缺陷筛选元件。[233]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。[234]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，活化蛋白是dhfr。[235]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码非活化型蛋白，该蛋白需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[236]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。[237]实施例236所述的多核苷酸构建体，其中，非活化型蛋白包含dhfr z-nter或dhfrz-cter。[238]实施例236-237中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。[239]实施例236-238中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seqid no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[240]实施例236-239中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seqid no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[241]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[242]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。
[243]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[244]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[245]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可检测标记物包含发光标记物或荧光标记物。[246]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，荧光标记物是gfp、egfp、rfp、cfp、bfp、yfp或mcherry。[247]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，进一步包含重组酶编码序列。[248]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是外源性提供的。[249]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是位点特异性重组酶。[250]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre多肽或翻转酶多肽。[251]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，cre多肽与配体结合域融合。[252]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，配体结合结构域是激素受体。[253]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，激素受体是一种雌激素受体。[254]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体包含一个点突变。[255]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，雌激素受体是ert2。[256]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，重组酶是cre-ert2多肽。[257]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一lox序列，第二重组位点是第二lox序列。[258]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一lox序列是第一loxp位点，第二lox序列是第二loxp位点。[259]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第一重组位点是第一frt位点，第二重组位点是第二frt位点。[260]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，进一步包含一个可选标记物编码序列。[261]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[262]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[263]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[264]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
[265]实施例216-264中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含实施例1-112中任一实施例所述多核苷酸构建体的序列。[266]实施例216-265中任一项所述的多核苷酸构建体，进一步包含实施例119-209中任一实施例所述多核苷酸序列的序列。[267]实施例216-266中任一项所述的多核苷酸构建体存在于载体中。[268]实施例216-266中任一项所述的多核苷酸构建体存在于质粒中。[269]实施例216-266中任一项所述的多核苷酸构建体存在于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。[270]实施例216-269中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，多核苷酸构建体是合成核酸构建体。[271]实施例216-270中任一项所述的多核苷酸构建体，包含与seq id no:13-seq id no:19或seq id 23-seq id no:26中任一项具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[272]一种细胞，包含实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体。[273]实施例272的细胞，其中，多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[274]实施例272-273中任一项所述的细胞，其细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。[275]实施例272-273中任一项所述的细胞，其细胞是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞。[276]实施例272-275中任一项所述的细胞，其细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。[277]实施例272-276中任一项所述的细胞，其细胞是dhfr裸细胞。[278]一种细胞，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体。[279]一种细胞，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体。[280]一种细胞，包含实施例z中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体。[281]一种细胞，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸序列、以及实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体。[282]实施例278-281中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[283]实施例278-282中任一项所述的细胞，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[284]实施例278-283中任一项所述的细胞，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[285]实施例278-284中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[286]实施例278-285中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞
的基因组中。[287]实施例278-286中任一项所述的细胞，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[288]实施例278-287中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[289]实施例278-288中任一项所述的细胞，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[290]实施例278-289中任一项所述的细胞，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[291]实施例278-290中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[292]实施例278-291中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[293]实施例278-292中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[294]实施例278-293中任一项所述的细胞，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[295]实施例278-294中任一项所述的细胞，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[296]实施例278-295中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[297]实施例278-296中任一项所述的细胞，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[298]实施例278-297中任一项所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209所述的多核苷酸构建体稳定整合至细胞的基因组中。[299]实施例278-298中任一项所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例216-271所述的多核苷酸构建体稳定整合至细胞的基因组中。[300]实施例278-299中任一项所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209所述的多核苷酸构建体稳定整合至细胞的基因组中。[301]实施例278-300中任一项所述的细胞，其中，细胞是哺乳动物细胞或昆虫细
胞。[302]实施例278-301中任一项所述的细胞，其中，细胞是hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞。[303]实施例278-302中任一项所述的细胞，其中，细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。[304]实施例278-303中任何一个的电池，进一步包含一个有效载荷构建体。[305]实施例304所述的细胞，其中，有效载荷构建体包含与seq id no:33具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[306]实施例304-305中任一项所述的细胞，其中，有效载荷构建体包含一个有效载荷序列，有效载荷序列两侧是itr序列。[307]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列的表达是由组成型启动子驱动的。[308]前述任一实施例所述的细胞，其中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧是itr序列。[309]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列包含多核苷酸基因编码序列。[310]前述任一实施例所述的细胞，其中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。[311]前述任一实施例所述的细胞，其中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。[312]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。[313]前述任一实施例所述的细胞，其中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。[314]前述任一实施例所述的细胞，其中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。[315]前述任一实施例所述的细胞，其中，蛋白质是核酸酶。[316]前述任一实施例所述的细胞，其中，蛋白是cas蛋白、adar蛋白、或adat蛋白。[317]前述任一实施例所述的细胞，其中，cas蛋白是具有催化作用的非活化cas蛋白。[318]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[319]前述任一实施例所述的细胞，其中，多个有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[320]前述任一实施例所述的细胞，其中，多个有效载荷构建体被分别稳定地整合至细胞的基因组中。[321]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物的编码序列。[322]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是哺乳动物细胞选择元件。
[323]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是营养缺陷筛选元件。[324]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选元件负责编码活化蛋白。[325]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，活化蛋白是dhfr。[326]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，营养缺陷筛选编码序列负责编码非活化型蛋白，该蛋白需要表达第二营养缺陷筛选编码序列才具有活性。[327]前述任一实施例所述的多核苷酸构建体，其中，第二营养缺陷筛选编码序列负责编码dhfr z-cter或dhfr z-nter。[328]实施例327的多核苷酸构建体，其中，非活化型蛋白包含dhfr z-nter或dhfr z-cter。[329]实施例327-328中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，可选标记物是dhfr z-nter或dhfr z-cter。[330]实施例327-329中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-nter包含与seqid no:4具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[331]实施例327-330中任一项所述的多核苷酸构建体，其中，dhfr z-cter包含与seqid no:5具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。[332]前述任一实施例所述的细胞，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[333]前述任一实施例所述的细胞，其中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[334]前述任一实施例所述的细胞，其中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[335]前述任一实施例所述的细胞，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[336]前述任一实施例所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209所述的多核苷酸构建体和前述任一实施例所述的有效载荷构建体稳定整合至细胞的基因组中。[337]前述任一实施例所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和前述任一实施例所述的有效载荷构建体稳定整合至细胞的基因组中。[338]前述任一实施例所述的细胞，其中，只需要单个非营养缺陷筛选，以便将实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209所述的多核苷酸构建体和前述任一实施例所述的有效载荷构建体稳定整合至细胞的基因组中。[339]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体存在于质粒中。[340]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体存在于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。[341]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[342]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体是合成核酸构建体。
[343]前述任一实施例所述的细胞，其细胞能够产生有效载荷序列衣壳化的raav病毒粒子。[344]前述任一实施例所述的细胞，其细胞在至少加入一种触发剂后能够产生raav病毒粒子。[345]前述实施例中任一实施例所述的细胞，其中，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％。[346]前述任一实施例所述的细胞，其中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子具有更强的感染性。[347]前述任一实施例所述的细胞，其中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子具有至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％的感染性。[348]前述任一实施例所述的细胞，与含有野生型aav的细胞在相同moi条件下产生的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子至少具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的感染性。[349]前述任一实施例所述的细胞，与相同moi条件下的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[350]前述任一实施例所述的细胞，其中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。[351]前述任一实施例所述的细胞，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。[352]前述任一实施例所述的细胞，其中moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。[353]前述任一实施例所述的细胞，其细胞能够有条件地产生衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99的raav病毒粒子。[354]前述任一实施例所述的细胞，其中，raav病毒在纯化前的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。[355]前述任一实施例所述的细胞，其中，raav病毒在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。[356]前述任一实施例所述的细胞，其细胞能够产生包含有效载荷核酸序列的raav病毒粒子，该raav病毒粒子的滴度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。[357]前述任一实施例所述的细胞，其细胞能够产生包含有效载荷核酸序列并且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。[358]一种细胞群，能够产生衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99的raav病毒粒子。[359]一种细胞群，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体。[360]一种细胞群，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例
[361]216-271中任一项所述的多核苷酸构建体。[362]一种细胞群，包含实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体。[363]一种细胞群，包含实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸序列和实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体。[364]前述任一实施例所述的细胞群，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞群的基因组中。[365]前述任一实施例所述的细胞群，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[366]前述任一实施例所述的细胞群，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[367]前述任一实施例所述的细胞群，其中，前述任一实施例所述的有效载荷构建体被稳定地整合至细胞群的基因组中。[368]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群是前述任一实施例所述的多个细胞组成的细胞群。[369]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群是哺乳动物细胞群或昆虫细胞群。[370]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群是由hek293细胞、hela细胞、cho细胞或sf9细胞组成的细胞群。[371]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞表达e1a蛋白和e1b蛋白。[372]前述任一实施例所述的细胞群，进一步包含一个有效载荷构建体。[373]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体包含两侧分别是itr序列的有效载荷序列。[374]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷的表达是由组成型启动子驱动的。[375]前述任一实施例所述的细胞群，其中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧分别是itr序列。[376]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷包含多核苷酸基因编码序列。[377]前述任一实施例所述的细胞群，其中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。[378]前述任一实施例所述的细胞群，其中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。[379]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。[380]前述任一实施例所述的细胞群，其中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。[381]前述任一实施例所述的细胞群，其中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。[382]前述任一实施例所述的细胞群，其中，蛋白质是核酸酶。[383]前述任一实施例所述的细胞群，其中，蛋白是cas蛋白、adar蛋白或adat蛋
白。[384]前述任一实施例所述的细胞群，其中，cas蛋白是具有催化作用的非活化cas蛋白。[385]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[386]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体进一步包含itr序列之外的可选标记物或可检测标记物编码序列。[387]前述任一实施例所述的细胞群，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。[388]前述实施例中任一实施例所述的细胞群，其中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的断裂蛋白质内含子。[389]前述任一实施例所述的细胞群，其中，itr序列之外的可选标记物是与抗生素抗性蛋白的n端或c端相连的亮氨酸拉链。[390]前述任一实施例所述的细胞群，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。[391]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体位于质粒中。[392]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体位于细菌人工染色体或酵母人工染色体中。[393]前述任一实施例所述的细胞群，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞群的基因组中。[394]一种细胞群，通过扩增前述任一实施例所述的细胞产生。[395]前述任一实施例所述的细胞群，其中，扩增过程会将细胞至少传代三次。[396]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群细胞在至少加入两种触发剂后能够有条件地产生重组aav(raav)病毒粒子。[397]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞在至少加入两种触发剂后能够有条件地产生raav病毒粒子。[398]前述任一实施例所述的细胞群，其中，至少两个触发剂包含多西环素和他莫西芬。[399]前面任一实施例所述的细胞群，其中，至少两个触发剂诱导切除元件的表达，并且将其易位至细胞核。[400]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群细胞在加入切除元件后能够有条件地产生raav病毒粒子。[401]前述任一实施例所述的细胞群，其中，切除元件是重组酶。[402]前面任一实施例所述的细胞群，其中，切除元件是一种位点特异性重组酶。[403]前述任一实施例所述的细胞群，其中，切除元件是cre多肽或翻转酶多肽。[404]前述任一实施例所述的细胞群，其中，切除元件是受激素调节的。[405]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群能够有条件地产生包装了编码有效载荷的可表达多核苷酸的raav病毒粒子；并且，细胞群产生的病毒粒子群比由其他能够在瞬时转染时产生raav病毒粒子的类似细胞群产生的病毒粒子群具有更高的同质性。[406]前述任一实施例所述的细胞群，其中，由细胞群产生的病毒粒子群的病毒基
因组与转导单位的比例约为500：1至1：1。[407]前述任一实施例所述的细胞群，其中，由细胞群产生的病毒粒子群的载体基因组与感染单位的比例为100:1。[408]前述任一实施例所述的细胞群，其中，在加入触发剂后，可诱导产生病毒粒子。[409]前述任一实施例所述的细胞群，其中，在至少加入两种触发剂后，可诱导产生病毒粒子。[410]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群能够有条件地产生具有不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99衣壳化比率的raav病毒粒子。[411]前述任一实施例所述的细胞群，其中，raav病毒粒子在纯化前的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99。[412]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群能够达到不低于1
×
106、2
×
106、5
×
106或1
×
107个细胞/毫升的活细胞密度。[413]前述任一实施例所述的细胞群，其中，raav病毒粒子在纯化前的浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。[414]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群能够产生包含有效载荷核酸序列并且滴度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。[415]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞群能够产生包含有效载荷核酸序列并且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。[416]前述任一实施例所述的细胞群，其中，在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。[417]前述任一实施例所述的细胞群，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性有所提高。[418]前述任一实施例所述的细胞群，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性至少提高1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％以上。[419]前述任一实施例所述的细胞群，其中，与相同moi条件下的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[420]前述任一实施例所述的细胞群，其中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。[421]前述任一实施例所述的细胞群，其中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104、或1
×
105vg/靶细胞。[422]前述任一实施例所述的细胞群，其中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。[423]前述任一实施例所述的细胞群，其细胞是冷冻保存的。
rep和cap蛋白的表达。[448]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，当不存在质粒时，可诱导产生raav病毒粒子。[449]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，当不存在转染剂时，可诱导产生raav病毒粒子。[450]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其稳定细胞系能够产生包含有效载荷核酸序列并且浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。[451]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其稳定细胞系能够产生包含有效载荷核酸序列并且在纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升的raav病毒粒子。[452]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其稳定细胞系能够有条件地产生衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97或0.99的raav病毒粒子。[453]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，raav病毒在纯化前的衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。[454]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，包含衣壳蛋白和有效载荷核酸序列的raav病毒粒子的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。[455]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性有所提高。[456]前述任一实施例所述的稳定细胞系，与能够在相同moi下瞬时转染产生raav病毒粒子的类似细胞群所产生的raav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性至少提高1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％以上。[457]前述任一实施例所述的稳定细胞系，与含有野生型aav的细胞在相同moi条件下产生的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子至少具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的感染性。[458]前述任一实施例所述的稳定细胞系，与相同moi条件下的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[459]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，aav病毒粒子是由含有野生型aav的细胞产生的野生型aav病毒粒子。[460]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，moi为1
×
101、1
×
102、2
×
103、5
×
104或1
×
105vg/靶细胞。[461]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其中，moi选自1
×
101至1
×
105vg/靶细胞范围。[462]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其稳定细胞系的至少一种细胞被低温保存。[463]前述任一实施例所述的稳定细胞系，其稳定细胞系的至少一种细胞保存在
小瓶、烧瓶、注射器或其他合适的细胞储存容器中。[464]一种细胞培养组合物，包含：a)悬浮适应型细胞，b)无血清细胞培养基，和c)重组aav(raav)病毒粒子，其中，细胞培养物不含单纯疱疹病毒、杆状病毒和腺病毒；其中，细胞培养物不含质粒和转染剂。[465]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其中，细胞培养组合物不含聚乙烯亚胺(pei)。[466]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其中，悬浮适应型细胞是悬浮适应型哺乳动物细胞。[467]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其中，悬浮适应型细胞是悬浮适应型hek293细胞或其衍生物。[468]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其中，悬浮适应型哺乳动物细胞是来自前述任一实施例所述的稳定细胞系、细胞群，或包含前述任一实施例所述的细胞。[469]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其细胞培养组合物的纯化前raav浓度不低于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l。[470]前述任一实施例所述的细胞培养组合物，其细胞培养组合物的纯化前raav病毒粒子衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。[471]一种生物反应器，包含前述任一实施例所述的稳定细胞系。[472]一种生物反应器，包含前述任一实施例所述的细胞群。[473]一种生物反应器，包含前述任一实施例所述的细胞。[474]一种生物反应器，包含前述任一实施例所述的细胞培养物。[475]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个1l生物反应器。[476]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个1l生物反应器。[477]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
14
病毒基因组(vg)。[478]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个5l生物反应器。[479]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
14
病毒基因组(vg)。[480]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个50l生物反应器。[481]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于5
×
10
15
病毒基因组(vg)。[482]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个100l生物反应器。[483]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于1
×
10
16
病毒基因组(vg)。[484]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个500l生物反应器。[485]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量
大于5
×
10
16
病毒基因组(vg)。[486]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一个2000l生物反应器。[487]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器的raav病毒粒子总产量大于2
×
10
17
病毒基因组(vg)。[488]一种生物反应器，包含多个raav病毒粒子，raav病毒粒子浓度大于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l。[489]一种生物反应器，包含多个raav病毒粒子，纯化前raav病毒粒子浓度大于1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
或5
×
10
15
病毒基因组(vg)/l。[490]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是1l、5l、50l、100l、500l或2000l的生物反应器。[491]前述任一实施例所述的生物反应器，其生物反应器是一次性使用的生物反应器。[492]一种包含多个病毒基因组衣壳化raav病毒粒子的组合物，raav病毒粒子被其组合物的纯化前浓度大于每毫升1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组。[493]一种包含多个病毒基因组衣壳化raav病毒粒子的组合物，其组合物的纯化前衣壳化比率不低于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.97、或0.99。[494]一种包含多个病毒基因组衣壳化raav病毒粒子的组合物，其中，在moi为1
×
105vg/靶细胞或更低时，该组合物的感染性不低于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。[495]前述任一实施例所述的组合物，其中，与其他类似细胞产生的raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，该raav病毒粒子具有更强的感染性。[496]前述任一实施例所述的组合物，其中，与其他类似细胞产生的raav病毒粒子相比(能够在相同moi条件下瞬时转染时产生raav病毒粒子)，该raav病毒粒子的感染性至少提高1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。[497]前述任一实施例所述的组合物，其中，与相同moi条件下由含有野生型aav的细胞产生的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[498]前述任一实施例所述的组合物，其中，与相同moi条件下由含有野生型aav的细胞产生的aav病毒粒子相比，该raav病毒粒子的感染性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。[499]实施例的组合物，进一步包含多个raav病毒粒子。[500]前述任一实施例所述的组合物，其中，多个raav病毒粒子的纯化前浓度大于1
×
10
11
或不小于5
×
10
11
、1
×
10
12
、5
×
10
12
、1
×
10
13
或1
×
10
14
病毒基因组/毫升。[501]前述任一实施例所述的组合物，其中，多个raav病毒粒子的纯化前衣壳化比
15和aav 16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh 20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.acc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.shc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.shc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav-hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15、aav.hsc16和aavhu68的细胞群。[523]第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物包含前述任一实施例所述的组合物，并且第二种药用组合物包含前述任一实施例所述的组合物。[524]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物和第二种药用组合物的衣壳化比率变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[525]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物和第二种药用组合物的浓度(单位：病毒基因组/毫升)变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[526]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物和第二种药用组合物的感染性变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[527]前述任一实施例中的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物是第一剂，第二种药用组合物是第二剂。[528]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物前至少1、2、3、4、5、6或7天生产第一种药用组合物。[529]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物的多个raav病毒粒子之前至少1、2、3、4、5、6或7天生产第一种药用组合物的多个raav病毒粒子。[530]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第一种药用组合物。[531]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第一种药用组合物的多个raav病毒粒子。[532]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第一种药用组合物。[533]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在生产第二种药用组合物前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第一种药用组合物的多个raav病毒粒子。[534]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，利用来自第一生物反应器的多个病毒粒子生产第一种药用组合物，并且利用来自第二生物反应器的多个病毒粒子生产第二种药用组合物。[535]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，进一步包含第三种组合物。[536]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一
种药用组合物、第二种药用组合物和第三种组合物的衣壳化比率变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[537]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物、第二种药用组合物和第三种组合物的浓度(单位：病毒基因组/毫升)变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[538]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第一种药用组合物、第二种药用组合物和第三种组合物的感染性变化不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[539]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第三种组合物是第三剂。[540]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第三种组合物在第二种药用组合物生产后至少1、2、3、4、5、6或7天生产。[541]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在第二种药用组合物的多个raav病毒生产后至少1、2、3、4、5、6或7天生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。[542]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在第二种药用组合物生产后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第三种组合物。[543]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在第二种药用组合物生产后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。[544]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在第二种药用组合物生产后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第三种组合物。[545]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，在第二种药用组合物生产后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年生产第三种组合物的多个raav病毒粒子。[546]前述任一实施例所述的第一种药用组合物和第二种药用组合物，其中，第三种组合物是使用来自第三生物反应器的多个病毒粒子生产的。[547]一种药用组合物，包含前述任一实施例中的多个raav病毒粒子和药学上可接受的载体。[548]多个药物剂量，其中，每个剂量独立地包含实施例546的药用组合物。[549]实施例547所述的多个药物剂量，其中，第一剂和第二剂之间衣壳化比率差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[550]前述任一实施例所述的多个药物剂量，其中，第一剂和第二剂之间病毒基因组的浓度差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[551]前述任一实施例所述的多个药物剂量，其中，第一剂和第二剂之间载体基因组的浓度差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[552]前述任一实施例所述的多个药物剂量，其中，第一剂和第二剂之间raav病毒感染性的差异不超过20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。[553]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：
将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[554]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[555]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[556]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例z中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[557]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[558]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[559]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。
[560]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[561]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[562]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组中。[563]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[564]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组中。[565]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[566]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[567]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[568]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[569]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中的多个多核苷酸构建体、实施例216-271中的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组中。[570]前述任一实施例所述的方法，进一步包含将细胞与有效载荷构建物接触。
[571]前述任一实施例所述的方法，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[572]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[573]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[574]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[575]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[576]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、任一实施例216-271的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[577]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[578]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体以及有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[579]前述任一实施例所述的方法，进一步包含将细胞与多个有效载荷构建体接触。[580]前述任一实施例所述的方法，其中，多个有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[581]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[582]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例119-209的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[583]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[584]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[585]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[586]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271的多个多核苷酸构建体、实施例119-209的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[587]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一
项所述的多个多核苷酸构建体和前述实施例中任一项所述的多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[588]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含选择压力的细胞培养基中进行的。[589]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含至少两种选择压力的细胞培养基中进行的。[590]前述任一实施例所述的方法，其中，选择压力是一种抗生素。[591]前述任一实施例所述的方法，其中，抗生素是杀稻瘟菌素或嘌呤霉素。[592]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含至少两种抗生素的细胞培养基中进行的。[593]前述任一实施例所述的方法，其中，选择压力是缺乏营养物质。[594]前述任一实施例所述的方法，其中，缺乏的营养物质是缺乏次黄嘌呤和缺乏胸苷。[595]前述任一实施例所述的方法，其中，稳定细胞系能够达到不低于1
×
106、2
×
106、5
×
106或1
×
107个细胞/毫升的活细胞密度。[596]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[597]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞与实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[598]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[599]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[600]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；并且将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[601]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：
将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；并且将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[602]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；并且将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[603]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[604]一种产生稳定细胞的方法，该方法包含：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[605]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[606]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[607]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及传代细胞以产生稳定的细胞群。
[608]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及传代细胞以产生稳定的细胞群。[609]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[610]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[611]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[612]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和传代细胞以产生稳定的细胞群。[613]一种产生稳定细胞群的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和
传代细胞以产生稳定的细胞群。[614]前述任一实施例所述的方法，其中，稳定细胞群能够达到不低于1
×
106、2
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106、5
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106或1
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107个细胞/毫升的活细胞密度。[615]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[616]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[617]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及将细胞传代以产生稳定细胞系。[618]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；将细胞与实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；以及将细胞传代以产生稳定细胞系。[619]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[620]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[621]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例
216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[622]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[623]一种生成稳定细胞系的方法，该方法包括：将细胞与实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。将细胞与实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体接触，其中，实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被稳定地整合至细胞的基因组中；和将细胞传代以产生稳定细胞系。[624]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组中。[625]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[626]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体分别整合至细胞的基因组中。[627]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[628]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[629]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体和实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[630]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组。[631]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中所述的多个多核苷酸构
建体、实施例216-271中所述的多个多核苷酸构建体和实施例y中所述的多个多核苷酸构建体被分别整合至细胞的基因组中。[632]前述任一实施例所述的方法，进一步包含将细胞与有效载荷构建物接触。[633]前述任一实施例所述的方法，其中，有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[634]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体分别整合至细胞中。[635]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[636]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[637]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[638]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[639]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体和有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[640]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多核苷酸构建体以及有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[641]前述任一实施例所述的方法，进一步包含将细胞与多个有效载荷构建体接触。[642]前述任一实施例所述的方法，其中，多个有效载荷构建体被稳定地整合至细胞的基因组中。[643]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[644]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例119-209的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体分别整合至细胞中。[645]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[646]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[647]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。
[648]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例216-271的多个多核苷酸构建体、实施例119-209的多个多核苷酸构建体和多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[649]前述任一实施例所述的方法，其中，实施例1-112中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例216-271中任一项所述的多个多核苷酸构建体、实施例119-209中任一项所述的多个多核苷酸构建体以及多个有效载荷构建体被分别整合至细胞中。[650]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷构建体包含一个两侧由itr序列组成的有效载荷序列。[651]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列的表达是由组成型启动子驱动的。[652]前述任一实施例所述的细胞，其中，组成型启动子和有效载荷序列的两侧是itr序列。[653]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列包含多核苷酸基因编码序列。[654]前述任一实施例所述的细胞，其中，基因负责编码可选标记物或可检测标记物。[655]前述任一实施例所述的细胞，其中，基因负责编码治疗性多肽或转基因。[656]前述任一实施例所述的细胞，其中，有效载荷序列包含编码治疗性多核苷酸的多核苷酸序列。[657]前述任一实施例所述的细胞，其中，治疗性多核苷酸是trna抑制剂或向导rna。[658]前述任一实施例所述的细胞，其中，向导rna是一种能够与蛋白质结合的多核苷酸。[659]前述任一实施例所述的细胞，其中，蛋白质是核酸酶。[660]前述任一实施例所述的细胞，其中，蛋白是cas蛋白、adar蛋白、或adat蛋白。[661]前述任一实施例所述的细胞，其中，cas蛋白是具有催化作用的非活化cas蛋白。[662]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含选择压力的细胞培养基中进行的。[663]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含至少两种选择压力的细胞培养基中进行的。[664]前述任一实施例所述的方法，其中，选择压力是一种抗生素。[665]前述任一实施例所述的方法，其中，抗生素是杀稻瘟菌素或嘌呤霉素。[666]前述任一实施例所述的方法，其中，传代是在包含至少两种抗生素的细胞培养基中进行的。[667]前述任一实施例所述的方法，其中，选择压力是缺乏营养物质。[668]前述任一实施例所述的方法，其中，缺乏的营养物质是缺乏次黄嘌呤和缺乏胸苷。[669]前述任一实施例所述的方法，其中，稳定细胞系能够达到不低于1
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106、2
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106或1
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107个细胞/毫升的活细胞密度。
[670]一种诱导前述任一实施例所述的细胞、细胞群或稳定细胞系的方法，该方法包括向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第一触发剂，从而诱导细胞、细胞群或稳定细胞系表达rep多肽、cap多肽和一种或多种腺病毒辅助蛋白。[671]前述任一实施例所述的方法，其中，第一触发剂与激活剂或阻遏物结合。[672]前述任一实施例所述的方法，其中，诱导型启动子的激活可以诱导实现。[673]前述任一实施例所述的方法，其中，激活的诱导型启动子负责转录重组酶。[674]前述任一实施例所述的方法，其中，第一触发剂是四环素或cumate。[675]前述任一实施例所述的方法，其中，四环素是多西环素。[676]前述任一实施例所述的方法，进一步包含用第二触发剂培养细胞、细胞群或稳定细胞系的方法。[677]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。[678]前述任一实施例中的方法，其中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。[679]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂为他莫昔芬。[680]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂与重组酶结合。[681]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂诱导重组酶易位至细胞、细胞群细胞、稳定细胞系细胞的细胞核。[682]一种生产raav病毒粒子的方法，该方法包括向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第一触发剂，向细胞、细胞群或稳定细胞系施用第二触发剂，从而在细胞、细胞群或稳定细胞系中产生raav病毒粒子。[683]前述任一实施例所述的方法，其中，第一触发剂与激活剂或阻遏物结合。[684]前述任一实施例所述的方法，其中，诱导型启动子的激活可以诱导实现。[685]前述任一实施例所述的方法，其中，激活的诱导型启动子负责转录重组酶。[686]前述任一实施例所述的方法，其中，第一触发剂是四环素或cumate。[687]前述任一实施例所述的方法，其中，四环素是多西环素。[688]前述任一实施例所述的方法，进一步包含用第二触发剂培养细胞、细胞群或稳定细胞系的方法。[689]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。[690]前述任一实施例中的方法，其中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)。[691]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂为他莫昔芬。[692]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂与重组酶结合。[693]前述任一实施例所述的方法，其中，第二触发剂诱导重组酶易位至细胞、细胞群细胞、稳定细胞系细胞的细胞核。[694]前述任一实施例所述的方法，其中，重组酶在重组位点切除。[695]前述任一实施例所述的方法，其中，至少一种腺病毒辅助蛋白、rep多肽和cap多肽被表达。[696]前述任一实施例所述的方法，其中，rep多肽和cap多肽组装成了raav病毒粒
子。[697]前述任一实施例所述的方法，其中，raav病毒粒子包封了一个有效载荷序列。[698]前述任一实施例所述的方法，其中，在同时施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞毒性水平的rep多肽。[699]前述任一实施例所述的方法，其中，在施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞毒性水平的cap多肽。[700]前述任一实施例所述的方法，其中，在施用第一触发剂和第二触发剂之前，细胞、细胞群或稳定细胞系不会表达具有细胞阻滞水平的rep多肽。[701]前述任一实施例所述的方法，其中，细胞、细胞群或稳定细胞系中rep多肽的平均浓度低于施用第一触发剂和第二触发剂之前的平均浓度。[702]前述任一实施例所述的方法，其中，在施用第一触发剂和第二触发剂之后，rep多肽和cap多肽的表达为组成型。[703]前述任一实施例所述的方法，进一步包括至少在生物反应器中执行方法部分。[704]前述任一实施例所述的方法，其中，生物反应器的尺寸不小于20l、30、l、40l、50l、100l、250l、300l或500l。[705]前述任一实施例所述的方法，进一步包括以多个批次生产raav病毒粒子的方法。[706]前述任一实施例所述的方法，进一步包括，在第一批和第二批之间生产的raav病毒粒子的有效载荷衣壳化比率差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。[707]前述任一实施例所述的方法，进一步包括，在第一批和第二批之间生产的raav病毒粒子的病毒基因组浓度差异不超过20％，15％，10％，5％，3％，2％，或1％。[708]前述任一实施例所述的方法，进一步包括，在第一批和第二批之间生产的raav病毒粒子的载体基因组浓度差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。[709]前述任一实施例所述的方法，进一步包括，在第一批和第二批之间生产的raav病毒粒子的感染性差异不超过20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。[710]前述任一实施例所述的方法，进一步包括根据良好生产规范(gmp)标准执行方法。[711]前述任一实施例所述的方法，进一步包括在符合gmp要求的工厂中执行方法。[712]前述任一实施例所述的方法，进一步包括在培养基中培养细胞，并从培养基中收集部分多个raav病毒粒子。[713]前述任一实施例所述的方法，进一步包括对培养基中收集的部分多个raav病毒粒子进行纯化处理，以获得纯化的raav细胞群。[714]前述任一实施例所述的方法，其中，纯化方法包括色谱纯化方法。[715]前述任一实施例所述的方法，其中，色谱纯化方法包括使用带正电的阴离子交换树脂、带负电的阴离子交换树脂、阳离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法或其组合。
[716]前述任一实施例所述的方法，其中，色谱纯化方法包括色谱柱分馏法。[717]一种治疗病症或疾病的方法，该方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的前述任一实施例所述的药用组合物。[718]实施例716的方法，其中，疾病是一种单基因疾病。[719]实施例716-717中任一项所述的方法，其中，治疗将会导致至少一种非预期副作用，并且相对于偏离预期剂量超过50％、40％、30％、30％、15％、10％、5％或2％的日剂量，给药的非预期副作用减少。[720]实施例716-719中任一项所述的方法，其中，给药方式为注射给药。[721]实施例719所述的方法，其中，注射方式是输液。[722]实施例716-720中任一项所述的方法，其中，日剂量是为患者给药一次。[723]实施例716-720中任一项所述的方法，其中，日剂量是为患者给药两次或更多次。[724]实施例716-722中任一项所述的方法，其中，治疗导致至少一种非预期副作用，并且非预期副作用相对于施用由三重转染方法产生的多个raav病毒粒子而言有所减少。[725]实施例716-723中任一项所述的方法，其中，相对于施用由三重转染方法制备的多个raav病毒粒子的中和抗体的浓度而言，患者血清中的raav病毒粒子的中和抗体的浓度有所下降。[726]实施例724的方法，其中，raav病毒粒子中和抗体的浓度是通过elisa方法测定的。[727]一种向受试者施用具有预定数量病毒基因组(vg)的raav病毒粒子剂量的方法，与施用通过瞬时三重转染方法制备的raav vg相同剂量相比，不良反应的数量或强度有所降低，该方法包括：施用在前述任一实施例所述的细胞、细胞群或稳定细胞中产生的raav剂量。[728]实施例726所述的方法，其中，不良反应有：肝功能障碍、肝脏炎症、胃肠道感染、呕吐、细菌感染、脓毒症、肌钙蛋白水平增加、红细胞计数减少、血小板计数减少、激活补体免疫系统反应、急性肾损伤、心肺功能不全和死亡。[729]实施例726-727中任一项所述的方法，其中，不良反应是干扰素γ(ifnγ)、白细胞介素1β(il-1β)和白细胞介素6(il-6)中的一种或多种血清水平增加。[730]一种治疗病症或疾病的方法，包括向有需要的患者施用具有预定数量病毒基因组的第一治疗有效量的本发明公开的药用组合物，以及向有需要的患者施用具有预定数量病毒基因组的第二治疗有效量的本发明公开的药用组合物。[731]实施例729所述的方法，其中，第一治疗有效量和第二治疗有效量的变化不超过1％、5％、10％、或15％。[732]一种raav病毒粒子，由前述任一实施例所述的方法制成。[733]一种药用组合物，包含由前述任一实施例所述的方法生产的多个raav病毒粒子。[734]一种raav病毒粒子，由前述任一实施例所述的方法制成。[735]一种药用组合物，包含由前述任一实施例所述的方法生产的多个raav病毒
粒子。5.18.示例
[0299]
以下是用于实施本发明的具体实施例的示例。这些示例仅用于说明用途，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。我们已尽全力确保所用数字(如数量、温度等)的准确性，但当然应允许存在一些实验误差和偏差。
[0300]
除非另有说明，在本领域的技术范畴内，本发明的实践将采用蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。参考文献中将充分解释这些技术。5.18.1.示例1-具有三个稳定整合质粒的哺乳动物细胞系
[0301]
一种稳定哺乳动物细胞系，通过将三个核酸构建体整合至表达腺病毒e1a和e1b的细胞系的核基因组中构建，能够诱导表达有效载荷衣壳化raav病毒粒子(图1，5b和6)。如图6所述，细胞系是一个dhfr hek293裸细胞系。选择成功整合所有3个构建体的细胞，并且通过在缺乏次黄嘌呤和胸苷但含有杀稻瘟菌素的培养基中培养，以维持细胞的生长。通过在触发之前确认egfp是否发射荧光来确认成功整合构建体1，同时抑制构建体2的cre表达。5.18.2.示例2-cre诱导表达rep/cap蛋白
[0302]
如图3a所示，进行了实验以测试构建体1的性能。构建体的设计使cre介导的重组能够切除第二间隔区(图3b)。切除第二间隔区(i)阻止了egfp的表达(图7a-7b)，(ii)导致通过内源性p5和p19启动子产生rep转录本，以及(iii)促进通过内源性p40启动子产生cap转录本。cap基因被克隆在rep基因的下游，并且可通过操纵连接至内源性p40启动子。因此，rep蛋白的表达促进了cap蛋白的表达。
[0303]
hek293细胞被涂覆在24孔板中。将微孔板在室温下离心30分钟，然后在37℃下孵育30分钟。将培养基换成生长培养基，使用transit 293试剂，立即用aav2阳性对照质粒(aav2)或aav2构建体1质粒(aav code)转染细胞。模拟样本未被转染。将不同体积的cre纳米囊泡加入到孔中。在图7a中所示的成像孔中未添加cre纳米囊泡。在图7b所示的孔中，未添加cre纳米囊泡、5μl cre纳米囊泡或10μl cre纳米囊泡。转染后24小时对细胞进行成像，然后收获细胞进行蛋白质分析。
[0304]
结果显示在图7a-7b中，这分别是光学显微镜图像和荧光显微镜图像。光学显微镜图像显示在最左边一栏。绿色荧光显微镜图像显示在中间一栏。红色荧光图像显示在最右边一栏。
[0305]
如图2b所示，在不添加cre的情况下，用构建体1转染的细胞显示出密集egfp荧光，这是由于rep-egfp融合转录本的表达、内含子的剪接和翻译引起的(见图3a)。图7b显示了cre导入后gfp荧光减少。cre是通过装载cre蛋白和红色荧光标记蛋白的纳米囊泡来导入的，以跟踪细胞内导入过程。导入cre会影响重组，并且会删除构建体1的egfp基因盒。
[0306]
图8a显示了蛋白质免疫印迹(western blot)，表明可切除间隔区的cre介导切除诱导了触发后质粒构建体1的rep蛋白生产。此外，兔β球蛋白内含子的存在并不影响rep蛋白的表达水平。图8b显示了含有rep/cap构建体的细胞的gfp表达、活力和密度图，并且显示了rep生产过程和总蛋白生产过程的印迹图。5.18.3.示例3-构建体1(rep/cap构建体)的示范性序列和结构
[0307]
利用atcc的aav2基因组编码质粒(pav2)来扩增aav2基因组，切去itr。扩增后的构建体被克隆到pcr blunt ii topo载体上，形成构建体1的骨架。构建体1的中间间隔区和
rep/cap编码序列由gblocks组装而成，并插入核苷酸位置1022(参考wt aav2)。这个克隆位置位于p19启动子的下游，远离任何已知的顺式调节元件。第二可切除间隔区元件中的egfp基因盒与p5和p19转录本产生的蛋白质同框。预触发构建体1的详情显示在图3a中，seq id no:6提供了一个示例性序列，附带的特征描述如下所示。5.18.4.示例4-修饰或抑制抗病毒反应
[0308]
形成aav病毒粒子所需的病毒蛋白被宿主细胞机制所抑制。抑制这些宿主细胞机制以最大限度地提高本文所述稳定细胞系中的aav病毒滴度，包括但不限于：敲除在起始细胞系(p0)中的pkr(pkr ko)(这是一条负责抑制病毒蛋白的通路)，在起始细胞系(p0)中引入突变型eif2α(在pkr通路中)，和/或操纵或调节va rna(一种pkr的抑制剂)。就这一点来说，有三种策略(va rna操纵、pkr ko和eif2α突变)正在研发中，以便在本文所述的aav生产系统中任意组合使用。这三种策略都可以任意组合。a.修饰va rna以优化表达
[0309]
通过四种方式对va rna表达进行分析：1.以va rna的组成型表达(传统方法)作为对照，不操纵va rna启动子或序列。2.诱导型va rna
[0310]
va rna天然具有内部组成型启动子(a框和b框；见图9b右上角的构造图)。对于创建诱导型va rna构建体的实验，首先在内部启动子中引入突变以使其失去活性。
[0311]
如图2c和图18-20所示，一个诱导型u6启动子系统被用来驱动va rna的表达。这种策略的一个优点是，当使用诱导型va rna系统时，预计能够获得更好的细胞活力和更高的aav滴度，其中在生产用细胞系统中有一个数量优化的va rna，因为可能存在一些与va rna的组成型表达相关的细胞毒性。3.无va rna+补偿/类似病毒蛋白
[0312]
目前正在制定第三种方案，即从系统中完全删除va rna，并测试另一种病毒蛋白(如来自hsv的ic34.5；va rna的类似物)以取代va rna的功能(对pkr的抑制)，从而确定与生产系统中的va rna相比，类似物是否能补偿和/或提高最终aav滴度。4.无va rna
[0313]
一旦病毒蛋白合成不受影响，并且在完全不含va rna的辅助构建体中，aav的滴度没有真正受到影响，则可以从生产用细胞系统中删除va rna。这种做法仅适用于已被设计为最适合生产aav的细胞系(例如lv max细胞)，请参见图13。13。
[0314]
下面的实验都是通过三重转染进行的。预计三重转染实验的结果可以在稳定细胞系环境(例如，本文所述的构建体)中应用、优化和测试。b:测试替代病毒蛋白以补偿va rna
[0315]
用另一种病毒蛋白(受感染的细胞蛋白34.5(icp34.5))代替va rna进行实验，以观察是否可以提高aav滴度。如图2b所示，一共测试了三个细胞群：
·
phelper(辅助质粒无变化，并且存在va rna)
[0316]
这是va rna的阳性对照，在这些实验中，用以下质粒进行了三重转染：phelper载体，以及stx295(构建体3，其中有效载荷是一个荧光标记物，荧光标记物两侧是aav2 itr序列)，和prc2(这是rep/cap构建体，rep/itr来自aav2，cap来自aav2)。
●
stxc0002(va rna敲除)
[0317]
这是va rna的阴性对照，在这些实验中，用以下质粒进行了三重转染：stxc0002辅助载体，以及质粒stx295(构建体3，其中有效载荷是一个荧光标记物，荧光标记物两侧是aav2 itr序列)和prc2(这是rep/cap构建体，rep/itr来自aav2，cap来自aav2)。
●
stxc0016(敲除va rna，添加ic34.5)。
[0318]
这是一个实验组，用以下质粒进行了三重转染：stxc0016辅助载体(敲除va rna，并添加编码在0016质粒上的ic34.5)，质粒stx295(构建体3，其中有效载荷是一个荧光标记物，荧光标记物两侧是aav2 itr序列)和prc2(这是rep/cap构建体，rep/itr来自aav2，cap来自aav2)。
[0319]
结果：用于补偿va rna的替代病毒蛋白
[0320]
图10b显示了使用图10a中的293细胞、293t细胞和lv max细胞三组细胞进行三重转染得到的相对aav滴度。通过qpcr测定aav的滴度。使用stxc0002(va rna敲除)进行三重转染后，aav的滴度相对减弱。在293t细胞中，使用stxc0016(敲除va rna，添加ic34.5)进行三重转染后，aav滴度得到恢复。在lv max细胞中，stxc0002(va rna敲除)和stxc0016(敲除va rna，添加ic34.5)的aav滴度相似(图10b)。野生型va rna的结果显示为phelper构建体，其用作阳性对照。c.测试已修饰或诱导型va rna构建体
[0321]
为了测试已修饰va rna构建体，对va-rna的内部启动子进行了敲除或致突变处理，包含对a框和b框的敲除或致突变处理。图11a是对每个被测质粒和va-rna相应敲除或突变的描述。g16a是a框的突变，g60a是b框启动子区域的突变。图11b显示了va rna相对于阳性对照(stxc0032；也就是添加了wt va的stxc0002)的表达。
[0322]
为了测试诱导型va rna系统，制作了含有cre诱导型u6启动子的构建体，来驱动图11a所示的每个突变型va-rna构建体的表达。图12a是诱导型u6启动子的示意图(类似的示意图请参见图2c)。在这个示例中，u6启动子被一个两侧由lox位点组成的填充片段序列(pgk-neo)分隔开。当存在cre时，会切除填充片段序列，从而介导重组，并产生一个诱导型u6启动子。将图11a中的stxc0033、stxc0035和stxc0037构建体修饰为包含子，cre诱导型u6启动分别得到stxc0041、stxc0042和stxc0043(图12b)。
[0323]
结果：诱导型va rna构建体
[0324]
虽然stxc0041和stxc0043显示出相似的va rna相对表达水平，但与stxc0043质粒(在其b框启动子区域有6个核苷酸敲除)相比，stxc0041既实现了这种水平的va rna表达，同时对va rna的干扰较小(仅具有两个突变：g16a和g60a)(图12c-12d)。
[0325]
图13a-13b显示了三重转染实验的结果，该实验是针对图12b中的一个质粒构建体子集进行的，在hek293t细胞中使用aav9(图13a)，在lv max细胞中使用aav2(图13b)。使用stxc0041和stxc0043构建体进行的三重转染获得了最高水平的滴度。
[0326]
下面的表格显示了上述构建体中各种元件的顺序。
5.18.5.示例5-rep/cap构建物整合至稳定细胞系中
[0327]
本示例介绍了将编码rep和cap多肽(seq id no：7)的构建体1整合至稳定细胞系中，并介绍了在所述稳定细胞系中诱导表达rep和cap多肽。一个不含itr且具有图8b右上方所示多核苷酸构建体的aav2基因组被克隆至具有杀稻瘟菌素抗性基因(seq id no:8)的piggybac载体中。负责阻断rep的可切除元件被插入p19启动子下游，如图8b所示。
[0328]
使用pei pro转染试剂对悬浮hek293细胞(病毒生产用细胞，vpc；也被称为亲本细胞或亲本vpc细胞池)进行转染。使用的转位子和转位酶的比例为2:1。让细胞在非选择性培养基中恢复72小时，然后传代到选择性培养基(10μg/ml杀稻瘟菌素)中。使用vicell细胞计数器每隔3-4天监测一次细胞生长和活力。完全恢复后，细胞池的倍增时间约为25小时，与亲本vpc细胞池的倍增时间相当，表明整合的aav序列无副作用(图8b，上图)。
[0329]
采用流式细胞仪分析细胞来量化gfp表达细胞。如图2b所示，几乎所有的细胞都呈gfp阳性，因此，证实了图8b所示的rep/cap多核苷酸构建体成功整合至细胞中。5.18.6.示例6-cre介导下诱导表达rep蛋白
[0330]
本示例介绍了在整合了图8b中rep/cap构建体的稳定细胞系中诱导rep蛋白的cre介导表达，其描述见示例5。使用cre纳米囊泡处理与图8b中aav2 rep/cap构建体整合的vpc。简而言之，在10μg/ml聚凝胺培养基中加入5μl cre纳米囊泡，对20万个细胞进行处理。将细胞以25000rpm离心30分钟，并在37℃下孵育2小时。亲代细胞被用作对照。孵育后，将细胞重新悬浮在新鲜培养基中，再孵育24小时。使用抗rep抗体，通过蛋白质免疫印迹法(western blot)分析rep的表达。图8b所示的结果表明，经过cre处理后，可诱导表达各种rep异构体。5.18.7.例7-诱导型辅助构建体
[0331]
本示例描述了本发明公开的诱导型辅助构建体。图24中显示了本发明公开的两个版本的诱导型辅助构建体。四环素/多西环素(“dox”)诱导型启动子(tre3g)负责驱动雌激素诱导型cre(er2 cre)的表达。雌激素诱导型cre在其3’端有一个聚腺苷酸化强信号(停止信号)。cre基因和聚腺苷酸化信号的两侧是lox位点。在这之后是一个双顺反子e2a e4或f6基因盒。质粒还有一个组成型启动子(突变型ef1a)，它负责驱动tet-on 3g(tet反应性激活蛋白)的表达。
[0332]
作用机制：在关闭状态下(dox缺失)，tet-on 3g无法与tre3g启动子中的tet操纵子元件结合，因此，tre3g启动子是非活化的。在系统的一个实施例中，使用雌激素反应cre而不是简单型cre，以抵消tre3g启动子的任何基础(或“泄漏”)表达。因此，即使系统产生了cre基因的泄漏表达，表达的cre蛋白也将在细胞质中保持非活化状态。位于cre基因3’端的聚腺苷酸化强停止信号将阻止腺病毒辅助基因(e2a和e4)的基础表达。
[0333]
为了诱导表达，在细胞培养中加入dox和他莫昔芬。dox与tet-on 3g蛋白结合，促进tet-on 3g与tre3g启动子中的tet操纵子元件结合。这触发了启动子的激活。er2 cre高水平表达，他莫昔芬将把cre带入细胞核中。cre将重组lox位点，导致cre-聚腺苷酸化基因盒的切除。这使得双顺反子e2a和e4基因盒靠近触发其表达的tet诱导型启动子。cre自切将限制cre在细胞中表达的时间，从而限制cre相关的毒性和混杂重组事件。
[0334]
图24中显示了诱导型辅助构建体的第一个版本，见左图。图24所示的构建体(见左图)也有一个由u6启动子驱动的va rna突变体(g16a和g60a，使内部poliii启动子失效)。u6
启动子的近端序列元件(pse)和远端序列元件(dse)被一个lox序列两侧的填充片段序列(pgk驱动的fusion red-puror)分隔开，从而使启动子失效。启动子通过填充片段序列的cre介导切除而重组，导致va rna的表达取决于cre的表达。
[0335]
图24中显示了诱导型辅助构建体的第二个版本，见右图。图24中所示的构建体(见右图)有一个由其内部天然启动子驱动的组成型表达的va rna元件。
[0336]
图25显示了图24(左图)所示的诱导型辅助构建体的多种变异体。fusion red-puror被puromycinr取代，pgk启动子被两个不同方向的cmv启动子取代。使用pei pro转染试剂，采用质粒中编码的诱导性辅助构建体(如图25所示)的不同变异体转染悬浮hek293细胞(病毒生产用细胞，vpc)。使用的转位子和转位酶的比例为2:1。让细胞在非选择性培养基中恢复72小时，然后并传代到选择性培养基(1.5μg/ml嘌呤霉素)中。使用vicell细胞计数器每隔3-4天监测一次细胞生长和活力。结果显示在图27的上图中。完全恢复后，细胞池的倍增时间约为23小时，与亲代vpc的倍增时间相当，表明整合序列无副作用。5.18.8.示例8-辅助构建体被稳定地整合至细胞系中
[0337]
本示例介绍了本发明公开的诱导型辅助构建体与细胞系的稳定整合。使用20ng/ml dox和2um他莫昔芬对细胞池进行诱导，并在诱导后48小时进行分析。通过蛋白质免疫印迹法(western blot)(图27)进行分析以及使用抗flag抗体检测细胞内染色，细胞池显示诱导后e2a未出现基础表达和强劲表达。使用va rna特异性引物和探针对rna样本进行rt qpcr分析，以显示诱导后va rna表达的上调(图27)。(图27)。图27显示了含有稳定整合辅助质粒的hek293细胞的概况，这种辅助质粒无细胞毒性，可诱导cre和生产va rna，以及具有e2a表达的良好分布。5.18.9.示例9-诱导型稳定细胞系
[0338]
本示例介绍了使用本发明公开的构建体生产诱导型稳定细胞系的过程。图28中显示了本发明公开的两个版本的诱导型辅助构建体(版本1：stxc0123和版本2：stxc0133)。在两个诱导型辅助构建体中，四环素/多西环素(“dox”)诱导型启动子(tre3g)驱动雌激素诱导型cre(er2 cre)的表达。雌激素诱导型cre在其3’端有一个聚腺苷酸化强信号(停止信号)。cre基因和聚腺苷酸化信号的两侧是lox位点。在这之后是一个双顺反子e2a e4或f6基因盒。质粒还有一个组成型启动子(突变型ef1a)，它负责驱动tet-on 3g(tet反应性激活蛋白)的表达。
[0339]
然而，stxc0123包含一个由u6启动子驱动的va rna突变体(g16a和g60a，使内部poliii启动子失效)。u6启动子的近端序列元件(pse)和远端序列元件(dse)被一个lox序列两侧的填充片段序列(cmv驱动的嘌呤霉素抗性基因)分隔开，从而使启动子失效。启动子通过填充片段序列的cre介导切除而重组，导致va rna的表达取决于cre的表达。
[0340]
相反，stxc0133包含一个teton-3g嘌呤霉素抗性基因盒和一个由其内部天然启动子驱动的组成型表达的va rna元件。
[0341]
使用转染试剂，采用stxc0123或stxc0133(编码至质粒中)转染悬浮hek293细胞(病毒产生细胞，vpc)。让细胞在非选择性培养基中恢复，并传代到含有嘌呤霉素的培养基中。对于这两个版本，使用嘌呤霉素抗性基因选择压力以确保构建体整合至病毒生产用细胞(vpc)中。stxc0123产生了t33(p1v1)细胞系，stc0133产生了t44(p1v2)细胞系。每3天对t33和t44的活细胞密度和活力进行监测。结果显示在图29的图表中。完全恢复后，t33细胞
池的倍增时间约为24.6小时，t44细胞池的加倍时间约为26.3小时，这与亲代vpc的倍增时间相当，表明整合序列无副作用。
[0342]
为了确认t33和t44细胞池的稳定整合和可诱导性，对这些细胞池细胞的e2a表达、va rna表达、培养密度和细胞活力进行了检测。t33池和t44细胞池细胞以100万个细胞/毫升的密度进行接种，用160ng/ml dox和4um他莫昔芬诱导，并在诱导后24小时和48小时进行分析。细胞池在诱导后的24小时和48小时显示出了e2a的最小基础表达和强劲表达(图30中的顶部图)。使用va rna特异性引物和探针对rna样本进行rt qpcr分析，以显示在诱导后24小时和48小时，未诱导vpc的va rna表达(图30中从上到下的第二张图)，或未诱导的t33或t44细胞的va rna表达(图30中从上到下的第三张图)。培养密度(图30中从上到下的第四张图)和细胞活力(图30中的下图)也在诱导后24小时和48小时进行检测。
[0343]
接下来，使用转染试剂将rep/cap构建体(stxc0137)和有效载荷构建体(stc0136)转染到t33(p1v1)细胞系和t44(p1v2)细胞系中，以进行整合。对于t33和t44细胞系，rep/cap构建体被设计成允许组成型表达分裂杀稻瘟菌素抗性基因的一半，并在诱导后通过其内源启动子表达aav rep和cap蛋白。图28所示的构建体(见左图)是整合核酸构建体的预诱导。中间间隔区中断了rep编码序列。间隔区包含第一间隔区，可切除的第二间隔区(bfp两侧为lox位点)，以及第三间隔区。该转录本含有一个内含子，内含子的两侧分别是5’端和3’端剪接位点。
[0344]
有效载荷构建体(stxc0136)包含一个gfp编码序列，其两侧是itr(stx650(sc gfp aav))和另一半分裂杀稻瘟菌素抗性基因，两者都受一个组成型启动子的控制。
[0345]
转染后，允许细胞在非选择性培养基中恢复，然后将其传代到包含杀稻瘟菌素的培养基中。对于这两个版本，使用杀稻瘟菌素抗性基因选择压力以确保两个构建体都整合至t33稳定细胞系和t44稳定细胞系中。整合至t33产生了三个稳定细胞系。t40(p2v1)、t41(p2v1)和t42(p2v1)。整合至t44产生了三个稳定细胞系。t56(p2v2)、t57(p2v2)和t58(p2v2)。对t40、t41和t42(图31)以及t59、t60和t62(图32)进行活细胞密度和活力监测。
[0346]
在关闭状态下(dox缺失)，tet-on 3g无法与tre3g启动子中的tet操纵子元件结合，因此，tre3g启动子是非活化的。在图28所述的构建体中，使用了雌激素反应cre而不是简单的cre，以抵消tre3g启动子的任何基础(或“泄漏”)表达。因此，即使系统产生了cre基因的泄漏表达，表达的cre蛋白也将在细胞质中保持非活化状态。位于cre基因3’端的聚腺苷酸化强停止信号将阻止腺病毒辅助基因(e2a和e4)的基础表达。
[0347]
为了诱导表达，在t40、t41、t42、t56、t57和t58稳定细胞系的细胞培养物中加入dox和他莫昔芬。dox与tet-on 3g蛋白结合，促进tet-on 3g与tre3g启动子中的tet操纵子元件结合。这触发了启动子的激活。er2 cre高水平表达，他莫昔芬将把cre带入细胞核中。cre将重组lox位点，导致cre-聚腺苷酸化基因盒的切除。这使得双顺反子e2a和e4基因盒靠近触发其表达的tet诱导型启动子。cre还切除了stxc0123的抗嘌呤霉素基因盒，重组了u6启动子，随后允许表达突变型va rna1 g16a和g60a。cre还切除了stx0137的第二间隔区，其中包含bfp标记的编码序列和上游3’端剪接位点。经过重排，stx0137构建体允许从它们各自的内源性启动子表达功能性rep和cap转录本。cre自切限制了cre在细胞中表达的时间，从而限制了cre相关的毒性和混杂重组事件。辅助构建体和rep/cap构建体的诱导表达可随后允许衣壳产生，并且将stxc0136包装入所生产的衣壳中。
5.18.10.示例10-诱导型稳定细胞系的诱导
[0348]
本示例描述了本发明公开的诱导型稳定细胞系的诱导过程。在不同的细胞培养基中诱导来自t42池细胞系(t42)的细胞和来自vpc三重转染(3xtfxn)的细胞。进行衣壳elisa检测以确定衣壳总滴度。进行核酸酶处理和qpcr，以确定病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。图33显示了诱导后在来自t42池稳定细胞系的不同细胞培养基中衣壳产生情况的曲线图，并且与三重转染后细胞中的衣壳生产情况进行了对比。每种培养基类型的左侧条形图表示衣壳总滴度，其右侧条形图表示病毒基因组(例如，有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。elisa测定结果显示，与三重转染产生的细胞的衣壳总滴度相比，在fuji 7、fuji 7-2和he 300培养基中诱导的t42细胞的衣壳总滴度更高。下表1显示了图33的衣壳总滴度以及图33中所示病毒基因组衣壳化的衣壳滴度。表1:在不同的细胞培养基中诱导后，t42细胞与3xtfxn细胞的衣壳总滴度和病毒基因组衣壳化的衣壳滴度。
*bloq＝低于定量测定限
[0349]
在he300培养基中，来自t42稳定细胞系池、t59稳定细胞系、t60稳定细胞系或t61稳定细胞系的细胞未被诱导(-)或被诱导(+)。进行核酸酶处理和qpcr，以确定病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度(图34)。
[0350]
将t42池稳定细胞系诱导产生的衣壳和t61池稳定细胞细胞系诱导产生的衣壳用于感染细胞并确定感染性。使用衣壳对细胞进行感染后(有效载荷为gfp)，gfp+细胞的百分比如图35所示。每种细胞系类型/培养基的左侧条形图是稀释系数为1的数据，右侧条形图是稀释系数为4的数据。
[0351]
经过诱导后，还测试了t42池稳定细胞系中单个细胞产生的病毒(滴度生产率)，并且与三重转染的亲代细胞(vpc)进行了比较。按照3x106个细胞/ml的密度诱导t42稳定细胞系的培养物，并在诱导后96小时收获。将亲代细胞系(vpcs)的培养液以3x106个细胞/ml密度进行三转染，并在转染后96小时收获。收获的细胞经过核酸酶处理(苯并酶)，并进行qpcr以确定病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。通过将qpcr总滴度除以收获时的活细胞密度来计算单个细胞的滴度生产率(vg/细胞)。图36显示了诱导后t42稳定细胞系池的不同细胞培养基中病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳图表，并且与三重转染的亲代细胞(vpc)进行了对比。每种培养基类型的左侧条形图表示t42稳定细胞系池中单个细胞产生的病毒基因组衣壳化的衣壳滴度，右侧条形图表示三重转染亲代细胞系(vpc)中单个细胞产生的病毒基因组衣壳化的衣壳滴度。5.18.11.例11-培养基筛选
[0352]
本示例介绍了在不同的细胞培养基中诱导本发明公开的诱导型稳定细胞系的情况。在18种不同的细胞培养基中测试来自t42池细胞系(t42)的细胞。以5x106细胞/毫升、6.5x106细胞/毫升、8x106细胞/毫升或9.5x106细胞/毫升的密度接种细胞。然后用他莫昔芬和dox诱导细胞。在70％活力时收获细胞。收获的细胞经过核酸酶处理(苯并酶)，并进行qpcr以确定病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。图37中显示了诱导后每个种子密度下每个细胞培养基中病毒基因组(如有效载荷构建体)衣壳化的衣壳滴度。5.18.12.示例12-诱导表达诱导型稳定细胞系
[0353]
本示例介绍了与t42池细胞系相比，对来自t42池细胞系的迷你池克隆细胞的诱导
过程。来自t42池细胞系的迷你池克隆细胞将至少传代三次。每种迷你池克隆细胞都在八种不同的培养基中进行测试。以5x106细胞/毫升的密度诱导迷你池克隆细胞或t42池细胞系细胞，然后在诱导96小时后用他莫昔芬和多西环素进行收获。如图38所示，在对各种细胞培养基进行诱导后，对每种迷你池克隆细胞和诱导后的t42稳定细胞系池进行衣壳elisa检测，以确定各种细胞培养基的衣壳总滴度。然后，在各种细胞培养基中诱导后，对来自选定的迷你池克隆细胞和t42稳定细胞系的衣壳的感染性进行测试。图39和图40显示了用衣壳(有效载荷为gfp)感染靶细胞(cho pro-5细胞)后gfp+细胞的百分比与病毒感染复数(moi；vg/靶细胞)的比较。当moi小于1x105时，he300中的迷你池克隆细胞1d3和fuji7中的1d3显示出大于50％的感染性。5.18.13.例13-生物反应器生产
[0354]
本示例介绍了在50l生物反应器中用本发明公开的稳定细胞生产的raav病毒粒子与瞬时转染细胞生产的raav病毒粒子的对比。培养三重瞬时转染得到的细胞、当前稳定细胞系(例如，采用示例12的t42稳定细胞系克隆细胞扩增得到的稳定细胞系)或新稳定细胞系，并在一个50l的生物反应器中进行诱导。来自这些50l生物反应器的raav病毒产量如表2所示。与当前稳定细胞系或新稳定细胞系相比，三重瞬时转染得到的细胞在生物反应器中产生的滴度较低。使用标准纯化工艺，使用三重瞬时转染细胞和当前稳定细胞系所获得的raav病毒粒子下游产量为40％。当采用新的细胞系可生产出更高质量的raav病毒粒子(如更高的全衣壳：空衣壳比率)，以及当针对新的细胞系改进纯化工艺时，产量将提高至60％。因此，与三重瞬时转染细胞相比，来自新稳定细胞系的新克隆细胞和来自当前稳定细胞系的克隆细胞具有更高的raav病毒粒子净加工产量。表2：50l生物反应器生产的raav病毒粒子5.18.14.示例14-raav病毒粒子剂量
[0355]
本示例介绍了对患者非静脉或静脉给药时的raav病毒粒子给药情况。表3显示了病毒感染复数(moi)、平均剂量、以及三重瞬时转染细胞、当前稳定细胞系(例如，采用示例12的t42稳定细胞系的克隆细胞扩增的稳定细胞系)或用于非静脉或静脉给药的新稳定细胞系的raav病毒粒子产量。与当前细胞系或三重瞬时转染细胞相比，对于新稳定细胞系产生的raav病毒粒子而言，moi会增加。因此，与当前细胞系或三重瞬时转染细胞相比，对于新稳定细胞系产生的raav病毒粒子而言，平均剂量会降低。表3:
[0356]
表4显示了用于非静脉或静脉给药的每批raav病毒粒子的患者剂量数，raav病毒粒子病毒粒子是由三重瞬时转染细胞、当前稳定细胞系或新稳定细胞系在50l生物反应器或500l生物反应器中产生的。与三瞬时转染细胞产生的raav病毒粒子相比，当前稳定细胞系或新稳定细胞系产生的raav病毒粒子的产量将会提高(见表3)。因此，与三瞬时转染细胞产生的raav病毒粒子相比，由新稳定细胞系或当前细胞系产生的raav病毒粒子的每批剂量数会增加。表4:6.非正式序列列表第一间隔区-seq id no:1:第二间隔区-seq id no:2:
第三间隔区-seq id no:3:dhfr z-nter-seq id no:4:dhfr z-cter-seq id no:5:itr敲除的aav2基因组与构建体1(在pcrii topo载体中克隆)seq id no:6
seq id no:7(用于表达aav2的rep/cap构建体)
seq id no:8(stxc0068)
seq id no:9(stxc0090)
seq id no:10(stxc0110)
seq id no:11(辅助构建体,v1)
seq id no:12(辅助构建体，v2)
seq id no:21(反向四环素控制性反式激活子突变体)seq id no:22(tet诱导型启动子序列)seq id no:23(stxc0034)
seq id no:24(stxc0036)
seq id no:25(stxc0030)
seq id no:26(stxc0031)
seq id no:27(stxc00124)
seq id no:28(stxc0125)
seq id no:29(stxc0126)
seq id no:30(stxc0123)
seq id no:31(stxc0133)
seq id no:32(stxc0137)
seq id no:33(stxc0136)
seq id no:34(stx650)
seq id no:35(stxc002)
示范性构建体1/rep/cap特征
7.同等文献和引用并入
[0357]
若各单个出版物、数据库条目(如genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利因所有目的特别和单独指出需通过引用以整体并入，则本文引用的所有参考文献均以相同程度的引用并入。根据37c.f.r.
§
1.57(b)(1)的规定，申请人需要将各单个出版物、数据库条目(例如genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利关联入“引用并入声明”中，并按照37c.f.r.
§
1.57(b)(2)的规定对其进行明确标识，即使此类引用与引用并入专门声明不存在即刻关联性。在说明书中纳入“引用并入专门声明”(如有)不会以任何方式削弱“引用并入一般声明”。此处的参考文献引用并不意味着承认参考文献为相关现有技术，也不构成对这些出版物或文献内容或日期的任何承认。
[0358]
虽然本发明已经参照优选实施例和各种备选实施例进行了特别的展示和描述，但相关领域的技术人员将理解，在不违背本发明的精神和范围的情况下，可以对其中的形式
和细节进行各种更改。