对生物样品的诊断方法、对生物样品的诊断试剂盒和寡核苷酸与流程

本发明涉及诊断医学和生物。具体地说，本发明涉及用于疾病的快速分子诊断的方法。更准确地说，用于利什曼病的诊断。

背景技术：

1、利什曼病是由属于锥虫科(trypanosomatidae)利什曼原虫属(leishmania)的有鞭毛原生动物引起的一组传染性寄生虫疾病。被世界卫生组织(who)列为优先控制的六大传染性寄生虫疾病之一，是全球性的公共卫生问题。它们在98个国家和三个地区流行(who,2010；alvar等人,2012)。

2、这些原生动物具有异型生命周期，交替生活在脊椎动物宿主(包括人类和其它野生和/或家养哺乳动物，例如狗)和昆虫双翅目介体中，后者属于白蛉属(phlebotomus)和罗蛉属(lutzomyia)(akhoundi等人,2016；pace,2014)。

3、利什曼原虫属的原生动物具有两种功能和形态都非常不同的进化形式，即前鞭毛体和无鞭毛体。

4、无鞭毛体形式存在于脊椎动物宿主中，呈球体至卵形。它们是固定的专性细胞内形式，因为它们的鞭毛袋内有一根短鞭毛，其主要用作胞吞和胞吐作用的场所。它们在单核吞噬系统细胞的液泡中发育，因此是适应这种环境的低ph的嗜酸细胞。

5、前鞭毛体存在于介体(无脊椎动物宿主)的肠道中，并且随着长度的变化而被拉长。它们是细胞外的有鞭毛的形式，可以表现为前循环前鞭毛体，定义为具有复制活性的更卵形、能动的细胞，或后循环前鞭毛体，即更细长且缺乏增殖能力的感染形式(kaye&scott,2011；murray等人,2005).

6、目前有约30种已知的利什曼原虫物种，其中10种存在于旧大陆，另外20种存在于新大陆。根据利什曼原虫的物种和与宿主的相互作用，该疾病以不同形式(内脏和外皮)为特征(saravia等人,1989；gontijo&carvalho,2003)。

7、内脏利什曼病(lv)是目前世界优先考虑的八种流行病之一，全球每年新发病例数为20至40万，致死率在10％至20％之间。大约90％的病例集中在六个国家：巴西、埃塞俄比亚、印度、索马里、南苏丹和苏丹(alvar等人,2012)。在美洲，巴西的lv病例占记录总数的95％(paho,2017)。在巴西多个城市中心进行的研究表明，狗是主要保虫宿主(dantas-torres等人.,2009；rocha等人,2020)。然而，其它动物也可以充当保虫宿主(reservatórios)，例如野生啮齿动物和有袋动物、食蚁兽、树懒和狐狸，以及马和骡子。

8、外皮利什曼病(lt)是一个全球性的公共卫生问题。该疾病在88个国家流行，其中72个是发展中国家，90％的病例发生在阿富汗、阿尔及利亚、巴西、巴基斯坦、秘鲁、沙特阿拉伯和叙利亚(desjeux,2004；reithinger,2007；who,2020)。在美洲，这种疾病从美国南部到阿根廷北部都有分布，被称为美洲外皮利什曼病(oumeish,1999；soto,2004；brazil,2017)。lt的四种主要临床形式是皮肤利什曼病(lc)、粘膜利什曼病(lm)、弥漫性皮肤利什曼病(lcd)和播散性利什曼病(ld)。

9、在该疾病的临床形式中，lv是最严重的形式，因为如果不及时诊断和治疗它可能致命(sundar&rai,2002；desjeux,2004)。利什曼原虫/hiv关联进一步使lv的诊断复杂化并降低治疗反应，增加死亡率，因为这两种感染都会抑制患者的细胞免疫应答(sundar&rai,2002；cota等人,2013)。

10、根据卫生部(ms)的数据，2017年，巴西报告了4,103例lv，死亡率为8.8％。在所有病例中，7.8％为利什曼原虫和hiv合并感染。2017年，在23个联邦单位(uf)中，该疾病的发病率为每100,000名居民1.98例(brazil,2017)。巴西卫生部针对内脏利什曼病的健康监测计划(pvclv)旨在通过提倡早期和准确诊断、治疗人类病例以及控制保虫宿主(主要是狗)和介体来降低报告的该疾病的高发病率和死亡率(brazil,2006)。

11、在巴西，由于其严重程度、治疗困难以及可能在受影响的人中产生畸形和后遗症的风险，lt是主要的皮肤病之一。2007年至2017年间，报告的lt病例超过235,000例，年均21,000例(brazil,2017)。

12、迄今为止，还没有一种技术被认为是诊断利什曼病的金标准。

13、利什曼病临床诊断的主要挑战是由于与该疾病相关的广泛体征/症状。对于lv，在人类中，这些包括长时间发烧、体重减轻、进行性贫血、肝肿大和脾肿大，并且可能与具有类似症状的其它疾病(例如疟疾、伤寒和结核病)混淆。在犬lv中，主要症状是皮肤损伤、淋巴结病、体重减轻、肌肉萎缩、食欲不振、嗜睡、脾肿大、甲弯曲、贫血、呕吐和腹泻。此外，许多狗无症状(baneth等人,2008)。lt的临床表现的范围包括从白蛉叮咬部位的溃疡性皮肤损伤到多个非溃疡性结节或甚至损毁的皮肤粘膜形式，这取决于患者的免疫状态和利什曼原虫物种(lessa等人,2007；gontijo&carvalho,2003；hallack等人,2000)。此外，在lt流行区域，还常出现具有相似临床表现的其它疾病(例如麻风病、皮肤癌症、皮肤结核病和孢子丝菌病)，给临床诊断带来困难。

14、因此，实验室诊断对于确认利什曼病的临床怀疑和鉴定正在传播的利什曼原虫的物种从而为利什曼病的流行病学监测和控制提供重要信息极其重要(reitinger&dujardin,2007；brasil,2006；brasil,2017)。

15、利什曼病的实验室诊断由三组测试组成：寄生虫学、免疫学和分子学。

16、寄生虫学检查

17、尽管寄生虫学检查被认为是诊断利什曼病的参考方法，但它们是侵入性的，需要基础设施和专门的专业人员进行，并且仍然没有表现出令人满意的表现(brasil,2006；sundar&raí,2002)。

18、关于lv，虽然寄生虫学检查具有100％的特异性，但该技术的灵敏度根据样品类型而变化：脾脏抽吸物为95％至98％(zijlstra等人,1992；who,2010)，骨髓抽吸为52％至89％，淋巴结抽吸物为52％至69％(zijlstra等人,1992；ho等人,1948；babiker等人,2007；who,2010)。脾脏抽吸物具有高灵敏度，然而该程序具有高侵入性和高风险的特点，具有很高的技术和操作难度(sundar&raí,2002)。在巴西，用于直接检查的参考生物材料是骨髓抽吸穿刺，这也是侵入性的并且需要适当的收集位置(brasil,2006)。骨髓抽吸物的培养提高了测试的灵敏度(高于80％)，但由于获得结果和随后的治疗所需的时间而延迟了病例定义(guerin,2002)。

19、lt的寄生虫学诊断具有高度特异性(herwaldt,1999)。程序通过划痕和/或活检进行，并通过载玻片并置、组织病理学检查、活检碎片培养或抽吸穿刺取得印记(escobar等人,1992；reitinger,2007)。通过划痕或活检碎片印记直接检测利什曼原虫属物种的无鞭毛体具有低成本并且执行速度快，这使其成为首选程序，是流行地区基层卫生单位使用的主要技术(reitinger,2007)。然而，这些测试的灵敏度值存在很大差异：从32.7％(weigle等人,1987)到90.0％(ramirez等人,2000)。影响直接检查的灵敏度的一些因素是：寄生虫负荷(较长的损伤时间和继发感染影响灵敏度)、执行采集程序的病变部位、导致病例的利什曼原虫物种以及在通过光学显微镜鉴定无鞭毛体方面需要高超的专业技能(ashford,2000；marfurt等人,2003；brustoloni,2007)。直接检查(de)和培养最常用于lc。对于粘膜利什曼病(ml)，灵敏度甚至更低，约为10％，因为寄生虫负荷往往非常低，因此很难检测到de中的无鞭毛体或培养物中的前鞭毛体。

20、免疫学检查

21、lv的血清学诊断(elisa、rifi和免疫层析测试)本身可作为寄生虫学技术的替代方法，因为它侵入性较小，并且在婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)感染中抗体的产生量很高。目前，使用基于抗rk39和其它重组抗原检测的免疫层析测试、间接免疫荧光反应(ifr)和elisa免疫酶测定。然而，在这些技术中存在共同的限制因素，例如：可能与其它疾病发生交叉反应；循环抗体持续存在很长时间，即使在治疗后也是如此；在免疫抑制患者中的低灵敏度；以及通常需要实验室基础设施和训练有素的专业人员(hailu,1990；desjeux&alvar,2003)。在巴西，在犬lv控制计划中，血清学诊断基于快速免疫层析测试(tr-dpp)和elisa，然而这些测试在灵敏度和特异性方面存在局限性(grimaldi jr等人,2012)。

22、在巴西用于诊断lt的免疫学测试中，黑山皮肤测试(mst)多年来被用作基层卫生单位中最有价值的资源。与此同时，巴拉那州的免疫生物学生产和研究中心(cppi)不再生产黑山抗原。生产由该公司独家提供，最终导致自2016年以来完全供应不足(braz,2019)。这种生产中断在lt的诊断中留下了空白，特别是在疑似lm的情况下，因为寄生虫学技术的准确性较低，如先前报道的。在患有弥漫性皮肤利什曼病、免疫抑制或进展不到一个月的患者中，idrm可能会显示阴性结果(brasil,2017)。目前，lm的诊断基于临床标准，并在可能的情况下，基于仅限于参考中心的pcr检测。应用此诊断测试的一个困难是对结果的解释，因为idrm不区分当前疾病和以前的疾病，此外还表现出与南美锥虫病、孢子丝菌病(esporotricose)等的交叉反应(marsden,1994；de lima barros等人,2005；costa等人,2009；brasil,2013)。

23、与idrm不同，应用于lt诊断的血清学测试基于检测患者血清中由体液免疫应答产生的循环抗利什曼原虫抗体。然而，lt的体液应答的特点是抗体水平低(lm病例除外)，此外还会与其它传染性疾病发生交叉反应，这会影响这些测试的灵敏度和特异性值(salman等人,1999；brasil,2013)。在巴西，最常用的测试是使用粗抗原或重组抗原的rifi(间接免疫荧光反应)和elisa(酶联免疫吸附测定)(gontijo&carvalho,2003；brasil,2013；2017)。

24、总之，寄生虫学和免疫学技术对利什曼病的诊断都有局限性。在引用的各种限制中，我们强调诊断准确性低，并且在免疫学技术的情况下，与其它疾病发生交叉反应的可能性。

25、分子检查

26、近年来，一些具有高诊断准确率的分子测试方案(常规pcr-cpcr和定量pcr-qpcr)已经针对利什曼病进行了标准化，但由于执行它们所需的高度实验室复杂性，这些方案仅限于参考中心。主要的分子靶标是核糖体rna基因序列(srivastava等人,2011；cota等人,2013)、动质体dna-kdna(cortes等人,2004；mohammadiha等人,2013；sudarshan&sundar,2014)，rna衍生的小外显子(kuhls等人,2007)；β-微管蛋白(akman等人,2000)、糖蛋白63(guerbouj等人,2001)和内转录间隔区-its(mauricio等人,2004)。

27、为了特异性鉴定利什曼原虫，已经使用了同工酶分析和通过使用限制酶切割pcr产物产生的片段大小分析(pcr-rflp)。此表征中使用的主要靶标是小外显子的基因序列(marfurt等人,2003)和hsp70蛋白的编码基因(montalvo等人,2014)。

28、针对利什曼病的分子测试的应用已针对不同目的进行了评估，包括感染诊断、疾病和治愈控制(disch等人,2003and 2004；viana等人2008；cota等人,2013；sudarshan&sundar,2014；paiva-cavalcanti等人,2015)。尽管有进口的用于利什曼病诊断的商业常规pcr试剂盒(leishmania sp.pcr detection kit-cinnagen)和实时pcr-qpcr(bmlaboratuvar和leishmania spp.)，但在巴西，迄今为止还没有在anvisa验证和注册的试剂盒。不同类型的样品可用于利什曼病的分子诊断，突出的是用于lv的外周血和骨髓抽吸物；以及用于lt的皮肤活检、病变边界划痕、拭子样品和血液(paiva-cavalcanti等人,2015)。

29、传染性疾病诊断中的最新进展是“环介导的等温扩增-lamp”技术的发展。该方法使用酶bst dna聚合酶，其能够在30-60分钟内在等温条件下扩增大量dna，并与识别dna靶标序列的六至八个特定区域的四至六种引物联合作用(notomi等人,2000)。lamp技术在恒温(通常为60–65℃)下进行，并且由于它使用多种引物来扩增靶标序列，因此具有高度特异性。

30、lamp技术已越来越多地用作检测分子靶标(dna/rna)的替代方法，因为它具有高灵敏度、特异性、减少的反应时间以及不需要复杂的实验室结构来进行等温扩增反应的优点。

31、由于以下原因，lamp技术可被认为优于pcr：1)其不需要热循环仪，因为所有反应都可以在恒温下进行，允许使用公共卫生实验室中常见的低成本设备(例如水浴)；2)反应特异性高；3)检测限等于或大于pcr，具有检测时间更短的优点；4)使用简单的检测方法对dna产物进行可视化，例如存在“肉眼”可见的混浊，这是由于阳性反应中焦磷酸镁的积累，或者是由于添加了染料如sybr green、picogreen或blue hydroxinaphthol(mori等人,2004；goto等人,2009)。

32、仍然很少有论文评估用于利什曼病(lt和lv)的lamp。对诊断准确性的评估表明，灵敏度在80％至98％之间，特异性在98％至100％之间(takagi等人,2009；adams等人,2010；khan等人,2012；verma等人,2013)。在已经开发的针对利什曼病的少数lamp方案中，通常将18s、kdna和k26区域用作分子靶标(takagi等人,2009；adams等人,2010；de avelar等人,2019)。此外，迄今为止，巴西还没有用于诊断利什曼病的anvisa注册的基于lamp的诊断试剂盒。

33、ramos及同事使用lamp技术评估了hsp70在利什曼病诊断中的用途。然而，使用的扩增区域和引物与本发明中使用的不同。此外，使用设计的引物会导致与其它物种(即克氏锥虫(trypanosoma cruzi)和申克孢子丝菌(sporothrix schenckii))发生交叉反应，并且检测限为1×10-1寄生虫/ml。这种交叉反应对测试的可行性有负面影响，因为没有与南美锥虫疾病的交叉反应对于诊断至关重要，因为在巴西，这种疾病与lv在地域上重叠，而孢子丝菌病是lt的鉴别诊断之一。

34、本研究中开发的靶向利什曼原虫属物种的hsp70区域的引物组和lamp测定法不仅新颖，而且有可能通过lamp用于利什曼病的分子诊断试剂盒，这可以使有效的诊断变得容易获得、易于执行和解释。以下数据参考本发明的描述。

35、在这些测定中，简而言之，将试剂添加到待分析的生物样品中，并将组件在lamp测定室中加热到给定温度，通常为60-65℃。然后在测定过程中监测这些样品，其结果可以通过指示阳性样品的反应颜色(或荧光或浊度)的改变来测量，或在荧光与时间曲线的构建中使用可位移探针进行实时读取，并确认所讨论的病原体的存在。

36、因此，根据引用的现有技术文献，注意到在现有技术中很少有针对利什曼病的lamp方案，其中大多数使用18s、kdna和k26区域作为分子靶标。

37、因此，如将在下一节中进一步详述的，本发明旨在提出一种基于lamp测定的诊断方法，其使用用于lamp的引物组(f3、b3、fip和bip)，允许扩增来自的利什曼原虫的14个物种的dna的hsp70区域。

38、本发明还公开了针对14个利什曼原虫物种的诊断试剂盒。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种基于lamp测定的诊断方法，用于病原体鉴定，更准确地说，用于14个利什曼原虫物种的诊断。

2、在第一实施方案中，本发明提供了一种用于对生物样品进行诊断的方法，包括：

3、(i)使用对靶标核酸具有特异性的引物组对样品进行环介导的等温扩增(lamp)，其中引物组包括：

4、四种引物，每种分别具有与seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq idno:6至少90％相同的序列；

5、(ii)检测生物样品中的靶标核酸扩增产物。

6、在第二实施方案中，在该方法中，在其步骤(i)中，靶标核酸是利什曼原虫核酸。

7、在第三实施方案中，在该方法中，lamp反应在约60℃至70℃范围内的温度进行。

8、在第四实施方案中，本发明提供了对生物样品的诊断试剂盒，包含四种引物的组，每种引物分别具有与seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6至少90％相同的序列。

9、在第四实施方案中，本发明提供了寡核苷酸，包括如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所定义的序列，或与其具有90％同一性的序列。