杂合α病毒-SARS-CoV-2粒子及其制备和使用方法与流程

背景技术：

1、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2，或新型冠状病毒)是一种快速传播的新型β-冠状病毒,其导致了2019年冠状病毒病(covid-19)的全球大流行17-21。截至2021年4月，sars-cov-2已造成全球超过1.4亿人感染，300万人死亡。抗病毒药物和中和抗体可有效对抗疫情传播。尤其，由疫苗或病毒诱导的中和抗体在控制和预防感染方面可发挥关键作用。目前，仅有remdesivir一种药物获美国食品及药物管理局(fda)批准，可用于减少住院时间1。近期，多种疫苗在三期临床试验中显示出显著效果2-6，并获批在紧急情况下使用，其中一种疫苗于2021年8月获得了fda的完全批准。然而，疫苗的有效性仍需持续监测，以诱导出针对不断演变的病毒变异体的中和抗体。

2、当前，抗病毒药物筛选和中和抗体的定量依赖于sars-cov-2假病毒的使用7-14。使用活病毒需要满足生物安全等级(biosafety level，bsl)3级的设施和操作，从而限制了活病毒在普通实验室中的大规模测试和分析。慢病毒和以sars-cov-2蛋白为假型的水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)均用于基于细胞的中和试验和抗病毒药物筛选8-11。sars-cov-2含有四种结构蛋白：刺突蛋白(s蛋白)，膜蛋白(m蛋白)，包膜蛋白(e蛋白)，核衣壳蛋白(n蛋白)22,23。s蛋白是负责病毒附着和进入靶细胞的主要病毒蛋白24-26，因而通常用于病毒假型。然而，基于水泡口炎病毒和慢病毒的假病毒颗粒都只含有s蛋白，并且主要的病毒结构组分与sars-cov-2不同，从而可能影响受体结合中的病毒特性以及对抗体中和的反应15。此外，水泡口炎病毒假病毒的一个重要问题是残留的水泡口炎病毒可能导致假阳性结果高发27。而且，使用慢病毒-假病毒进行中和试验耗费时间，需要2-3天来感染并产生报告信号7-11。

技术实现思路

1、本发明的一个方面提供了一种杂合粒子，包括：a)一种来源于α病毒的rna基因组；以及b)至少一种sars-cov-2结构蛋白，其中所述结构蛋白为刺突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)和核衣壳蛋白(n蛋白)。

2、一个实施例中，所述杂合粒子为非复制型粒子。

3、另一个实施例中，来自α病毒的rna基因组包括报告基因或目标基因。在进一步的实施例中，报告基因包括绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)基因或荧光素酶基因。

4、另一个实施例中，所述rna基因组包括：a)5’非翻译区，b)编码非结构蛋白(nsp)1-4的开放阅读框，c)报告基因或目标基因，d)3’非翻译区，和e)聚(a)尾。在进一步的实施例中，所述rna基因组包括sars-cov-2包装信号，其中sars-cov-2包装信号位于报道基因的下游。

5、另一个实施例中，所述杂合粒子为sars-cov-2病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlps)。

6、在另一个实施例中，所述杂合粒子靶向表达血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)的细胞。

7、在另一个实施例中，所述杂合粒子包括两种sars-cov-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括s蛋白和e蛋白。

8、在另一个实施例中，所述杂合粒子包括四种sars-cov-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括s蛋白、e蛋白、m蛋白和n蛋白。在进一步的实施例中，所述杂合粒子在ic50值上与sars-cov-2具有直接相关性。

9、本发明的另一方面提供一种方法，包括(a)共转染编码至少一种sars-cov-2结构蛋白的第一载体和包含衍生于α病毒rna基因组的第二载体，其中所述α病毒rna基因组包括：(i)在5’末端的dna启动子，(ii)第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)报告基因，(v)sars-cov-2包装信号序列，(vi)病毒亚基因组rna启动子，(vii)目标基因(viii)第二非翻译区和(ix)聚(a)尾；以及(b)生成杂合粒子，其中所述杂合粒子包括α病毒rna基因组和至少一种sars-cov-2结构蛋白。

10、在一个实施例中，一种方法还包括用所述杂合粒子感染靶细胞，其中所述靶细胞表达ace2。

11、在另一个实施例中，报告基因的表达能够产生有助于检测和定量感染的信号。在另一个实施例中，在杂合粒子感染后约2至72小时后读取信号。

12、本发明的另一方面提供一种用于检测受试者对一种或多种sars-cov-2变异体的抗体应答的方法，包括：a)将来自所述受试者的血清样品与所述杂合粒子一起孵育；b)将孵育的杂合粒子引入含有ace2的细胞中；以及c)检测所述细胞中的报告基因表达，其中报告基因的表达表明受试者不具有阻断细胞病毒感染的中和抗体，而没有报告基因表达说明受试者具有阻断细胞病毒感染的抗体。

13、在一个实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用不具有针对一种或多种sars-cov-2变异体的中和抗体的抗体、疫苗或治疗。

14、本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括含有至少一种sars-cov-2结构蛋白的杂合粒子，其中所述结构蛋白为刺突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)和核衣壳蛋白(n蛋白)。在另一个实施例中，所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。

15、本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括由四种sars-cov-2结构蛋白组成的杂合粒子，其中所述结构蛋白包括s蛋白、e蛋白、m蛋白和n蛋白。在另一个实施例中，所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。

16、本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括所述杂合粒子，其中所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。

17、本发明的另一方面提供一种杂合载体，包括：(i)5’端的dna启动子，(ii)5’端的第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)sars-cov-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组rna启动子，(vi)目标基因，(vii)3’端的第二非翻译区，以及(viii)3’端的聚a尾。在一些实施例中，所述杂合载体还包括报告基因。在一些实施例中，所述非结构蛋白包括rna聚合酶和相关因子。在一些实施例中，所述α病毒包括塞姆利基森林病毒。在一些实施例中，所述杂合载体经配置以在细胞中表达转基因。在一些实施例中，所述杂合载体经配置以促进抗病毒药物、抗体和/或抗病毒蛋白的筛选。

18、在一些实施例中，一种方法包括：(a)共转染编码sars-cov-2结构组分的第一载体和含有来自正义rna病毒或α病毒复制子载体或杂合载体的复制子载体的第二载体；所述杂合载体包括：(i)5’端的dna启动子，(ii)第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)sars-cov-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组rna启动子，(vi)目标基因，(vii)第二非翻译区，以及(viii)聚a尾；该方法还包括生成一种杂合α病毒-sars-cov-2(hybrid alphavirus-sars-cov-2，havs)粒子，其中所述havs粒子包括α病毒rna基因组和来自sars-cov-2的结构组分。在一些实施例中，所述结构组分包括选自刺突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)和包膜蛋白(e蛋白)中的至少一种。在一些实施例中，来自正义rna的α病毒复制子载体和杂合载体以及复制子载体还包括报告基因。在一些实施例中，非结构蛋白包括rna聚合酶和相关因子。在一些实施例中，所述havs粒子经配置以感染靶细胞，其中所述靶细胞表达ace2。在一些实施例中，报告基因的表达经配置以产生有助于检测和定量感染的信号。

19、在一些实施例中，havs粒子感染2至72小时后读取信号。在一些实施例中，所述方法经配置以测试sars-cov-2进入抑制剂和/或sars-cov-2中和抗体和/或筛选抗病毒药物和/或筛选抗病毒蛋白。在一些实施例中，病毒进入抑制剂包括阿比多尔(arbidol)。

20、本发明的一些实施例提供一种由杂合α病毒-sars-cov-2(havs)粒子组成的产品，该粒子包括α病毒rna基因组和来自sars-cov-2的结构组分。在一些实施例中，havs粒子由共转染编码sars-cov-2结构组分的第一载体和包括来自正义rna病毒的复制子载体或α病毒复制子载体的第二载体而形成，或杂合载体包括：(i)5’端的dna启动子，(ii)5’端的第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)sars-cov-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组rna启动子，(vi)目标基因，(vii)3’端的第二非翻译区，和(viii)3’端的聚a尾，其中所述havs粒子经配置以鉴定sars-cov-2进入抑制剂和/或sars-cov-2的中和抗体。在一些实施例中，所述杂合载体和来自所述正义rna的α病毒复制子载体和复制子载体还包括报告基因。在一些实施例中，所述报告基因经配置以产生有助于检测和定量由所述havs粒子引起的感染的信号。

21、在一些实施例中，所述结构组分包括选自刺突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)和包膜蛋白(e蛋白)中的至少一种。

22、即时sars-cov-2病毒样颗粒包装复制子是病毒样颗粒和以纳米颗粒为基础的技术领域的实质性进展。这些混合病毒样颗粒在模拟sars-cov-2感染中非常有效，可用于开发新药和疫苗。这是冠状病毒感染途径建模的一大进步，也可便捷适用于其他属的病毒。这也是免疫治疗和疫苗开发方面的一个进步，所转运的复制子可以刺激先天免疫应答，并且目标基因可以产生靶抗原。

23、杂合α病毒复制子病毒样颗粒是新型药物发现和抗体中和试验的一个重要模型，该颗粒生产成本低，并可用于快速评估病毒进入抑制剂。病毒样颗粒可以直接出售给从事药物研发的实验室。