基于新型指导核酸机制的基因功能调控

本公开涉及一种实现基因功能操纵的、对dna分子的位点特异性改变方法。

背景技术：

1、近年来，作为基于指导核酸的dna序列识别机制，细菌及古生菌所具有的crispr系统备受瞩目，被应用作为基因组编辑技术。crispr系统利用与入侵细菌的dna序列互补的低分子rna(指导rna)，促进对靶外源dna的靶向和降解。

技术实现思路

1、用于解决问题的技术手段

2、另一方面，已知一部分细菌来源的argonaute蛋白可以使用指导rna识别dna序列。该argonaute蛋白是在真核生物中负责rnai的、指导rna依赖性的rna靶标分子，本公开提供一种将该argonaute蛋白用作新型基因组编辑机制，实现基因功能操纵的、对dna分子的位点特异性改变方法。

3、因此，本公开提供以下内容。

4、(项目1)

5、一种用于对靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能的方法，所述方法包括：

6、提供包含argonaute蛋白、指导rna和附加序列的复合体的工序；以及

7、使该复合体与靶dna分子接触的工序，

8、其中，该指导rna被设计成将该复合体引导至靶dna分子中包含目标位点的区域。

9、(项目2)

10、根据上述项目所述的方法，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

11、(项目3)

12、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

13、(项目4)

14、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

15、(项目5)

16、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

17、(项目6)

18、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

19、(项目7)

20、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述复合体在生物体外形成。

21、(项目8)

22、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述复合体在生物体外形成，所述靶dna分子存在于生物体内。

23、(项目9)

24、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute-指导rna复合体被设计成指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子。

25、(项目10)

26、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控、基因序列改变和/或上述两者。

27、(项目11)

28、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控。

29、(项目12)

30、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述基因功能的操纵包括基因序列改变。

31、(项目a1)

32、一种用于调节靶dna分子的表达的方法，所述方法包括：

33、提供包含argonaute蛋白、指导rna和附加序列的复合体的工序；

34、使靶dna分子中双链dna序列的至少一部分解离的工序；以及

35、使该复合体与至少一部分解离的双链dna序列接触的工序；

36、其中，该指导rna被设计成将该复合体引导至包含至少一部分解离的该双链dna序列的区域。

37、(项目a2)

38、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

39、(项目a3)

40、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

41、(项目a4)

42、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

43、(项目a5)

44、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

45、(项目a6)

46、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

47、(项目a7)

48、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述复合体在生物体外形成。

49、(项目a8)

50、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，所述复合体在生物体外形成，所述靶dna分子存在于生物体内。

51、(项目b1)

52、一种argonaute-指导rna复合体，所述复合体包括：

53、argonaute蛋白；以及

54、合成的指导rna多核苷酸，

55、其中，所述指导序列被设计成使得argonaute-指导rna复合体指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子。

56、(项目b2)

57、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

58、(项目b3)

59、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

60、(项目b4)

61、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

62、(项目b5)

63、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

64、(项目b6)

65、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

66、(项目c1)

67、一种用于对靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能的argonaute-指导rna复合体，所述复合体包括：

68、argonaute蛋白；以及

69、合成的指导rna多核苷酸，

70、其中，所述指导序列被设计成使得argonaute-指导rna复合体指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子，通过该复合体与该靶分子结合，对该靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能。

71、(项目c2)

72、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

73、(项目c3)

74、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

75、(项目c4)

76、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

77、(项目c5)

78、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

79、(项目c6)

80、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

81、(项目c7)

82、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控、基因序列改变和/或上述两者。

83、(项目c8)

84、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控。

85、(项目c9)

86、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述基因功能的操纵包括基因序列改变。

87、(项目d1)

88、一种用于调节靶dna分子的表达的argonaute-指导rna复合体，所述复合体包括：

89、argonaute蛋白；以及

90、合成的指导rna多核苷酸，

91、其中，所述指导序列被设计成使得argonaute-指导rna复合体指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子，通过该复合体与该靶分子结合来调节该靶dna分子的表达。

92、(项目d2)

93、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

94、(项目d3)

95、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

96、(项目d4)

97、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

98、(项目d5)

99、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

100、(项目d6)

101、根据上述项目中任一项所述的复合体，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

102、(项目e1)

103、一种用于对靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括：

104、包含argonaute蛋白、指导rna和附加序列、或它们中的两种及以上的两种及以上的复合体；以及

105、使该复合体与靶dna分子接触的工具或试剂，

106、其中，该指导rna被设计成将该复合体引导至靶dna分子中包含目标位点的区域。

107、(项目e2)

108、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

109、(项目e3)

110、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

111、(项目e4)

112、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

113、(项目e5)

114、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

115、(项目e6)

116、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

117、(项目e7)

118、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括用于在生物体外形成所述复合体的工具。

119、(项目e8)

120、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括用于在生物体外形成所述复合体的工具，其中，所述靶dna分子存在于生物体内。

121、(项目e9)

122、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute-指导rna复合体被设计成指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子。

123、(项目e10)

124、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控、基因序列改变和/或上述两者。

125、(项目e11)

126、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控。

127、(项目e12)

128、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述基因功能的操纵包括基因序列改变。

129、(项目f1)

130、一种用于调节靶dna分子的表达的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括：

131、包含argonaute蛋白、指导rna和附加序列、或它们中的两种及以上的两种及以上的复合体；

132、使靶dna分子中双链dna序列的至少一部分解离的工具或试剂；以及

133、使该复合体与至少一部分解离的双链dna序列接触的工具或试剂，

134、其中，该指导rna被设计成将该复合体引导至包含至少一部分解离的该双链dna序列的区域。

135、(项目f2)

136、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

137、(项目f3)

138、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

139、(项目f4)

140、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

141、(项目f5)

142、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

143、(项目f6)

144、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

145、(项目f7)

146、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒进一步包括用于在生物体外形成所述复合体的工具。

147、(项目f8)

148、根据上述项目中任一项所述的系统或试剂盒，所述系统或试剂盒进一步包括用于在生物体外形成所述复合体的工具，其中，所述靶dna分子存在于生物体内。

149、(项目g1)

150、一种用于对靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能的argonaute-指导rna复合体的用途，其中，所述argonaute-指导rna复合体包括：

151、argonaute蛋白；以及

152、合成的指导rna多核苷酸，

153、其中，所述指导序列被设计成使得argonaute-指导rna复合体指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子，通过该复合体与该靶分子结合，对该靶dna分子进行位点特异性作用来操纵基因功能。

154、(项目g2)

155、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

156、(项目g3)

157、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

158、(项目g4)

159、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

160、(项目g5)

161、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

162、(项目g6)

163、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

164、(项目g7)

165、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控、基因序列改变和/或上述两者。

166、(项目g8)

167、根据上述项目中任一项所述的重复用途，其中，所述基因功能的操纵包括基因表达调控。

168、(项目g9)

169、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述基因功能的操纵包括基因序列改变。

170、(项目h1)

171、一种用于调节靶dna分子的表达的argonaute-指导rna复合体的用途，所述argonaute-指导rna复合体包括：

172、argonaute蛋白；以及

173、合成的指导rna多核苷酸，

174、其中，所述指导序列被设计成使得argonaute-指导rna复合体指向具有靶邻近基序序列的靶dna分子，通过该复合体与该靶分子结合来调节该靶dna分子的表达。

175、(项目h2)

176、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白具有靶向dna的活性。

177、(项目h3)

178、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白在生理温度下具有靶向dna的活性。

179、(项目h4)

180、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白来源于原核生物。

181、(项目h5)

182、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白来源于细菌。

183、(项目h6)

184、根据上述项目中任一项所述的用途，其中，所述argonaute蛋白是rhodobactor来源的rsago。

185、在本公开中旨在表明上述的一个或多个特征除了所明示的组合以外还可进一步组合来提供。需要注意的是，对于本公开的另一方面的实施方案及优点，只要根据需要阅读以下的详细说明并加以理解，就能被本领域技术人员所认识。

186、需要注意的是，对于除上述以外的本公开的特征及显著的作用/效果，本领域技术人员通过参照以下的发明的实施方案的项及附图便可明确获得。

187、发明效果

188、通过本公开的方法，可以提供一种比以往的crispr系统分子尺寸小、且对靶序列的制约也少的新的基因改变技术。此外，本公开的argonaute蛋白-指导rna复合体能够靶向特异性调节基因表达，并且还可以经由指导rna上附加的适体等定位作用于dna的效应子，因此能够期待应用于各种基因组编辑。