基因工程化细胞及其用途的制作方法

本技术提供基因工程化的诱导多能干细胞(ipsc)及其衍生细胞。本技术还提供ipsc或其衍生细胞表达用于同种异体细胞治疗的嵌合抗原受体的用途。本技术还提供相关载体、多核苷酸和药物组合物。电子提交的序列表的引用本技术含有序列表，其通过efs-web以ascii格式的序列表电子提交，文件名“cnty-001-wo-01_sequencelisting_st25”，创建日期2021年11月1日，大小为113kb。通过efs-web提交的序列表是本说明书的一部分，并且其整体援引加入本文。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(car)显著增强免疫效应细胞的抗肿瘤活性。car是工程化受体，通常包含与接头肽相连的胞外靶向结构域、跨膜(tm)结构域以及一个或多个胞内信号传导结构域。传统上，胞外域由对特定肿瘤相关抗原(taa)或细胞表面靶标具有特异性的抗体的抗原结合片段(如单链fv，scfv)组成。胞外域赋予car肿瘤特异性，而在与taa/靶标接触(engagement)时，胞内信号传导结构域激活已被基因工程化以表达car的t细胞。将工程化的免疫效应细胞重新注入癌症患者体内，在那里它们特异性地接触并杀死表达car的taa靶标的细胞(maus et al.,blood.2014apr 24；123(17):2625-35；curran and brentjens,jclin oncol.2015may 20；33(15):1703-6)。

2、自体的、患者特异性的car-t疗法已成为一种强大的、可能治愈癌症的疗法，特别是对cd19阳性的血液系统恶性肿瘤。然而，自体t细胞必须在定制的基础上产生，由于生产成本和生产失败的风险，这仍然是大规模临床应用的重要限制因素。car-t技术的开发及其更广泛的应用也由于其他一些关键缺点而受到限制，包括，例如，a)在实体瘤中的抗肿瘤反应效率低，b)过继转移的car t细胞对免疫抑制的肿瘤微环境(tme)的渗透性和易感性(susceptibility)有限，c)car-t细胞在体内的持久性差，d)患者出现严重的不良事件，包括car-t介导的细胞因子释放综合征(crs)和移植物抗宿主病(gvhd)，以及e)制造所需的时间。

3、因此，在免疫治疗中有效使用的治疗上足够和功能上抗原特异性的免疫细胞的需求尚未得到满足。

技术实现思路

1、在一个总的方面，本技术提供一种基因工程化诱导多能干细胞(ipsc)或其衍生细胞。所述细胞包含：(i)第一外源多核苷酸，其编码嵌合抗原受体(car)；(ii)第二外源多核苷酸，其编码失活的细胞表面受体和白介素15(il-15)，失活的细胞表面受体包含单克隆抗体特异性表位，优选截短的上皮生长因子(tegfr)变体，其中失活的细胞表面受体和il-15通过自体蛋白酶肽如1型猪捷申病毒2a(tesehovirus-1 2a(p2a))肽的自体蛋白酶肽可操作地连接；以及(iii)b2m、tap 1、tap 2、tapasin、rfxank、ciita、rfx5和rfxap基因中的一个或多个缺失或减少表达，优选b2m和ciita基因的缺失或减少表达。

2、本技术还提供一种ipsc细胞或其衍生细胞，其包含：(i)第一外源多核苷酸，其编码靶向cd19抗原的嵌合抗原受体(car)；(ii)第二外源多核苷酸，其编码截短的上皮生长因子(tegfr)变体和白介素15(il-15)，其中tegfr变体和il-15通过自体蛋白酶肽如1型猪捷申病毒2a肽的自体蛋白酶肽可操作地连接；以及(iii)b2m、tap 1、tap 2、tapasin、rfxank、ciita、rfx5和rfxap基因中的一个或多个缺失或减少表达，优选b2m和ciita基因的缺失或减少表达。

3、在某些实施方案中，ipsc细胞或其衍生细胞进一步包含第三外源多核苷酸，第三外源多核苷酸编码人白细胞抗原e(hla-e)或人白细胞抗原g(hla-g)。

4、在某些实施方案中，外源多核苷酸中的一个或多个整合在细胞染色体上的一个或多个基因座上，优选地一个或多个基因座是选自以下一个或多个基因的一个或多个基因座：aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、hl l、gapdh、runx1、b2m、tapi、tap2、tapasin、nlrc5、ciita、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcr a或b恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit基因，条件是外源多核苷酸中的至少一个整合在选自以下基因的基因座上：b2m、tap 1、tap 2、tapasin、rfxank、ciita、rfx5和rfxap基因，并且整合导致基因的缺失或减少表达，更优选地，外源多核苷酸中的一个或多个整合在ciita、aavs1和b2m基因的基因座上，并且整合导致ciita和b2m基因中的一个或多个缺失或减少表达。

5、在某些实施方案中，ipsc是由整个外周血单个核细胞(pbmc)重编程的。

6、在某些实施方案中，ipsc源自重编程的t-细胞。

7、在某些实施方案中，car包含：(i)信号肽，如包含gmcsfr信号肽或为gmcsfr信号肽的信号肽；(ii)胞外域，其包含特异性结合cd19抗原的结合结构域；(iii)铰链区，如包含cd28铰链区的铰链区；(iv)跨膜结构域，如包含cd28跨膜结构域的跨膜结构域；(v)胞内信号传导结构域，如包含cd3ζ胞内结构域的胞内信号传导结构域；以及(vi)共刺激结构域，如包含cd28信号传导结构域的共刺激结构域。

8、在某些实施方案中，胞外域包含源自特异性结合cd19抗原的抗体的scfv。

9、在某些实施方案中，car包含：(i)信号肽；(ii)胞外域，其包含特异性结合抗原的结合结构域；(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域；(v)胞内信号传导结构域；以及(vi)共刺激结构域，如包含cd28信号传导结构域的共刺激结构域。

10、在某些实施方案中，信号肽包含gmcsfr信号肽或为gmcsfr信号肽。

11、在某些实施方案中，胞外域包含vhh结构域。

12、在某些实施方案中，铰链区包含cd28铰链区。

13、在某些实施方案中，跨膜结构域包含cd28跨膜结构域。

14、在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包含cd3ζ胞内结构域。

15、在某些实施方案中，共刺激结构域包含cd28信号传导结构域。

16、在某些实施方案中，car包含：

17、(i)信号肽，其包含与seq id no:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

18、(ii)胞外域，其包含与seq id no:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

19、(iii)铰链区，其包含与seq id no:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

20、(iv)跨膜结构域，其包含与seq id no:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

21、(v)胞内信号传导结构域，其包含与seq id no:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；以及

22、(vi)共刺激结构域，其包含与seq id no:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。

23、在某些实施方案中，car包含：

24、(i)信号肽，其包含与seq id no:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

25、(ii)铰链区，其包含与seq id no:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

26、(iii)跨膜结构域，其包含与seq id no:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；

27、(iv)胞内信号传导结构域，其包含与seq id no:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列；以及

28、(v)共刺激结构域，其包含与seq id no:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。

29、在某些实施方案中，car包含：(i)信号肽，其包含seq id no:1的氨基酸序列；(ii)胞外域，其包含scfv或vhh结构域；(iii)铰链区，其包含seq id no:22的氨基酸序列；(iv)跨膜结构域，其包含seq id no:24的氨基酸序列；(v)胞内信号传导结构域，其包含seq idno:6的氨基酸序列；以及(vi)共刺激结构域，其包含seq id no:20的氨基酸序列。

30、在某些实施方案中，car包含：(i)信号肽，其包含seq id no:1的氨基酸序列；(ii)胞外域，其包含seq id no:7的氨基酸序列；(iii)铰链区，其包含seq id no:22的氨基酸序列；(iv)跨膜结构域，其包含seq id no:24的氨基酸序列；(v)胞内信号传导结构域，其包含seq id no:6的氨基酸序列；以及(vi)共刺激结构域，其包含seq id no:20的氨基酸序列。

31、在某些实施方案中，失活的细胞表面蛋白选自单克隆抗体特异性表位，其选自替伊莫单抗(ibritumomab,tiuxetan)、莫罗单抗-cd3(muromonab-cd3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、维泊妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、雷珠单抗(ranibizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维得利珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利尤单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地舒单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)和乌司奴单抗(ustekinumab)特异性识别的表位。

32、在某些实施方案中，失活的细胞表面蛋白是截短的上皮生长因子(tegfr)变体。

33、在某些实施方案中，tegfr变体具有与seq id no:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列或由与seq idno:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成。优选地，tegfr变体具有seq id no:71的氨基酸序列或由seq id no:71的氨基酸序列组成。

34、在某些实施方案中，il-15具有与seq id no:72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，il-15包含seq id no:72的氨基酸序列。

35、在某些实施方案中，自体蛋白酶肽具有与seq id no:73具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，自体蛋白酶肽具有seq id no:73的氨基酸序列。

36、在某些实施方案中，ipsc或衍生物具有b2m和/或ciita基因中一个或多个的缺失或减少表达。

37、在某些实施方案中，tegfr变体由seq id no:71的氨基酸序列组成，自体蛋白酶肽具有seq id no:73的氨基酸序列，并且il-15包含seq id no:72的氨基酸序列。

38、在某些实施方案中，hla-e具有与seq id no:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，hla-e具有seq id no:66的氨基酸序列。

39、在某些实施方案中，hla-g具有与seq id no:69具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，hla-g具有seq id no:69的氨基酸序列。

40、在某些实施方案中，基因工程化ipsc或其衍生细胞包含：

41、(1)第一外源多核苷酸，其编码car，car具有：(i)信号肽，其包含seq id no:1的氨基酸序列；(ii)胞外域，其包含seq id no:7的氨基酸序列；(iii)铰链区，其包含seq idno:22的氨基酸序列；(iv)跨膜结构域，其包含seq id no:24的氨基酸序列；(v)胞内信号传导结构域，其包含seq id no:6的氨基酸序列；以及(vi)共刺激结构域，其包含seq id no:20的氨基酸序列；以及

42、(2)第二外源多核苷酸，其编码由seq id no:71的氨基酸序列组成的tegfr变体和包含seq id no:72的氨基酸序列的il-15，其中tegfr变体和il-15通过包含seq id no:73的氨基酸序列的自体蛋白酶肽可操作地连接，

43、其中第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸整合在选自以下两个基因的基因座：b2m、tap 1、tap 2、tapasin、rfxank、ciita、rfx5和rfxap基因，优选b2m和ciita基因，并且整合导致这两个基因的缺失或减少表达。

44、在某些实施方案中，(i)第二外源多核苷酸包含与seq id no:75具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列；并且(ii)第三外源多核苷酸包含与seq id no:67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。

45、在某些实施方案中，第一外源多核苷酸整合在aavs1基因的基因座上；(i)第二外源多肽整合在ciita基因的基因座上；并且(ii)第三外源多肽整合在b2m基因的基因座上；其中外源多核苷酸的整合缺失或者减少ciita和b2m的表达，优选地，第二外源多核苷酸包含seq id no:75的多核苷酸序列，并且第三外源多核苷酸包含seq id no:67的多核苷酸序列。

46、在某些实施方案中，衍生细胞是自然杀伤(nk)细胞或t细胞。

47、任选地，基因工程化ipsc或其衍生细胞进一步包含第三外源多核苷酸，其编码具有seq id no:66的氨基酸序列的hla-e或具有seq id no:69的氨基酸序列的hla-g。优选地，第三外源多核苷酸整合在选自以下基因的基因座上：aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、hl l、gapdh、runx1、tapi、tap2、tapasin、nlrc5、rfxank、ciita、rfx5、rfxap、tcr a或b恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3以及tigit基因，优选aavs1基因。

48、在某些实施方案中，第一外源多核苷酸包含与seq id no:62具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，第二外源多核苷酸包含与seq id no:75具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，第三外源多核苷酸包含与seq id no:67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。

49、在某些实施方案中，第一外源多核苷酸包含seq id no:62的多核苷酸序列；第二外源多核苷酸包含seq id no:75的多核苷酸序列；并且第三外源多核苷酸包含seq id no:67的多核苷酸序列。

50、在某些实施方案中，第一外源多核苷酸整合在aavs1基因的基因座上；第二外源多核苷酸整合在ciita基因的基因座上；并且第三外源多核苷酸整合在b2m基因的基因座上；其中外源多核苷酸的整合缺失或者减少ciita和b2m基因的表达，优选地，第一外源多核苷酸包含seq id no:62的多核苷酸序列，第二外源多核苷酸包含seq id no:75的多核苷酸序列，并且第三外源多核苷酸包含seq id no:67的多核苷酸序列。

51、在某些实施方案中，衍生细胞是自然杀伤(nk)细胞或t细胞。

52、本技术还提供一种诱导多能干细胞(ipsc)细胞或者由ipsc(即，ink或it)衍生的自然杀伤(nk)细胞或t细胞，其包含：

53、(i)第一外源多核苷酸，其编码包含与seq id no:61具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列的car；

54、(ii)第二外源多核苷酸，其编码包含与seq id no:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列或由与seq idno:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成的tegfr变体，包含与seq id no:73具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列的自体蛋白酶肽，以及包含与seq id no:72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列的il-15，其中tegfr通过自体蛋白酶肽与il-15可操作地连接；以及

55、(iii)第三外源多核苷酸，其编码包含与seq id no:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列的人白细胞抗原e(hla-e)，或者包含与seq id no:69具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列的hla-g；

56、其中第一外源多核苷酸、第二外源多核苷酸和第三外源多核苷酸整合在aavs1、ciita和b2m基因的基因座上，从而缺失或者减少ciita和b2m基因的表达。

57、在某些实施方案中，本技术的ipsc、nk细胞或t细胞包含：

58、(i)第一外源多核苷酸，其编码具有seq id no:61的氨基酸序列的car；

59、(ii)第二外源多核苷酸，其编码具有seq id no:71的氨基酸序列或由seq id no:71的氨基酸序列组成的tegfr变体，具有seq id no:73的氨基酸序列的自体蛋白酶肽，和具有seq id no:72的氨基酸序列的il-15；以及

60、(iii)第三外源多核苷酸，其编码具有seq id no:66的氨基酸序列的人白细胞抗原e(hla-e)；

61、其中第一外源多核苷酸、第二外源多核苷酸和第三外源多核苷酸分别整合在aavs1、ciita和b2m基因的基因座上，从而缺失或者减少ciita和b2m基因的表达。

62、在某些实施方案中，第一外源多核苷酸包含seq id no:62的多核苷酸序列；第二外源多核苷酸包含seq id no:75的多核苷酸序列；并且·第三外源多核苷酸包含seq idno:67的多核苷酸序列。

63、本技术还提供一种ipsc、自然杀伤(nk)细胞或t细胞，其包含：

64、(i)第一外源多核苷酸，其编码嵌合抗原受体(car)；

65、(ii)第二外源多核苷酸，其编码具有seq id no:71的氨基酸序列的截短的上皮生长因子(tegfr)变体，具有seq id no:73的氨基酸序列的自体蛋白酶肽，和具有seq id no:72的氨基酸序列的白介素15(il-15)；以及

66、(iii)任选存在的第三外源多核苷酸，其编码具有seq id no:66的氨基酸序列的人白细胞抗原e(hla-e)；

67、其中第一外源多核苷酸、第二外源多核苷酸和第三外源多核苷酸整合在aavs1、ciita和b2m基因的基因座上，从而缺失或者减少ciita和b2m的表达。

68、在某些实施方案中，(i)第二外源多核苷酸包含seq id no:75的多核苷酸序列；(ii)第三外源多核苷酸包含seq id no:67的多核苷酸序列，并且第一外源多核苷酸、第二外源多核苷酸和第三外源多核苷酸分别整合在aavs1、ciita和b2m基因的基因座上。

69、本技术还提供一种组合物，其包含本技术的细胞。

70、在某些实施方案中，本技术的组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂，或者与一种或多种其他治疗剂联合使用。这类其他治疗剂的实例包括但不限于肽、细胞因子、检查点抑制剂、有丝分裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、sirna、寡核苷酸、单个核血细胞、包含一种或多种所关注的多核酸的载体、抗体、化疗剂或放射性基团(radioactivemoiety)或者免疫调节药物(imid)。

71、本技术还提供一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，方法包括向有此需要的受试者给药本技术的细胞或本技术的组合物。

72、在某些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(nhl)。

73、本技术还提供一种制造本技术的衍生细胞的方法，方法包括在细胞分化的条件下对本技术的ipsc进行分化，从而获得所述衍生细胞。

74、本技术进一步提供一种获得本技术的基因工程化ipsc的方法，方法包括向ipsc细胞引入第一外源多核苷酸、第二外源多核苷酸和任选存在的第三外源多核苷酸，从而获得基因工程化ipsc。任何基因工程方法都可以用于获得本技术的基因工程化ipsc。优选地，基因工程化包括靶向编辑，更优选地，靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失(in/del)，并且其中靶向编辑是通过crispr、zfn、talen、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其他功能变化进行的。

75、本技术还提供一种将诱导多能干细胞(ipsc)分化为nk细胞的方法，方法是使细胞进行分化方案，分化方案包括在培养的最后24小时添加重组人il-12。优选地，重组il-12包含il12p70或是il12p70。

76、本技术还提供一种源自诱导多能干细胞(ipsc)的cd34+造血祖细胞(hpc)，其包含：(i)第一外源多核苷酸，其编码嵌合抗原受体(car)；(ii)第二外源多核苷酸，其编码包含单克隆抗体特异性表位的失活的细胞表面受体和白介素15(il-15)，其中失活的细胞表面受体和il-15通过自体蛋白酶肽可操作地连接；以及(iii)b2m、tap 1、tap 2、tapasin、rfxank、ciita、rfx5和rfxap基因中的一个或多个缺失或减少表达。

77、本技术的其他实施方案包括基因工程化ipsc或其衍生细胞用于治疗有此需要的受试者的癌症。

78、在一些实施方案中，本发明的工程化ipsc衍生细胞的持久性提高，对免疫细胞的抵抗力增加，或免疫抵抗力增加；或者基因组工程化ipsc对τ细胞和/或νk细胞的抵抗力增加。特别地，本发明的il-15转基因，一旦转染至ipsc中并按照本发明分化为nk细胞，与没有本发明的il-15转基因的源自ipsc细胞的nk细胞相比，证明持久性增加，耗竭减少和连续杀伤增加。本发明的基因组工程化ipsc有潜能分化为非多能细胞，包括具有相同功能的靶向基因组编辑的造血谱系细胞。在一些实施方案中，本发明的基因组工程化ipsc有潜能分化为中胚层细胞、cd34细胞、生血内皮细胞、造血干/祖细胞、造血多能祖细胞、τ细胞祖细胞、νk细胞祖细胞、τ细胞、νkτ细胞、νk细胞或β细胞。

79、在一个总的方面，本技术提供一种编码人工细胞死亡多肽的多核苷酸。在某些实施方案，多核苷酸编码包含单克隆抗体特异性表位的失活的细胞表面受体和白介素15(il-15)，其中失活的细胞表面受体和il-15通过自体蛋白酶肽可操作地连接。

80、在某些实施方案中，失活的细胞表面受体选自单克隆抗体特异性表位，其选自替伊莫单抗、莫罗单抗-cd3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、维布妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐珠单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、维泊妥珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维得利珠单抗、阿达木单抗、贝利尤单抗、卡那单抗、地舒单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗和乌司奴单抗特异性识别的表位。

81、在某些实施方案中，失活的细胞表面受体是截短的上皮生长因子(tegfr)变体。

82、在某些实施方案中，自体蛋白酶肽包含1型猪捷申病毒2a(p2a)肽或是1型猪捷申病毒2a(p2a)肽。

83、在某些实施方案中，tegfr变体由与seq id no:71具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列组成，优选seqid no:71。

84、在某些实施方案中，il-15包含与seq id no:72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，优选seq id no:72。

85、在某些实施方案中，自体蛋白酶肽包含与seq id no:73具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，优选seqid no:73。

86、在某些实施方案中，所述多核苷酸由可操作地连接的多核苷酸组成，多核苷酸编码具有seq id no:71的氨基酸序列的截短的上皮生长因子(tegfr)变体，具有seq id no:73的氨基酸序列的自体蛋白酶肽，和具有seq id no:72的氨基酸序列的白介素15(il-15)。

87、本技术还提供一种多核苷酸，其编码失活的细胞表面受体，失活的细胞表面受体包含选自西妥昔单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、帕尼单抗、维泊妥珠单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗的抗体特异性识别的表位和il-15，其中表位和细胞因子通过p2a序列可操作地连接。

88、在某些实施方案中，失活的细胞表面受体包含选自seq id no:74、79、81和83的氨基酸序列。

89、本技术还提供一种蛋白，其由本技术的多核苷酸编码。

90、本技术还提供一种诱导多能干细胞(ipsc)或其衍生细胞，其包含本技术的多核苷酸。

91、本技术还提供一种载体，其包含本技术的多核苷酸。

92、在某些实施方案中，载体进一步包含：

93、(i)启动子；

94、(ii)终止子和/或多腺苷酸化信号序列；

95、(iii)左侧同源序列；以及

96、(iv)右侧同源序列。

97、在某些实施方案中，左侧同源序列包含与seq id no:84的多核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。

98、在某些实施方案中，右侧同源序列包含与seq id no:85的多核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。

99、在某些实施方案中，载体包含与seq id no:86具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸序列。