靶向源自溶瘤病毒的蛋白的嵌合抗原受体、表达其的免疫细胞及两者的用途的制作方法

本发明涉及靶向源自溶瘤病毒的蛋白的嵌合抗原受体、表达其的免疫细胞及其用途。具体地，本发明涉及一种靶向在感染牛痘病毒的癌细胞表面上表达的蛋白a56的嵌合抗原受体、表达其的免疫细胞及其用途。

背景技术：

1、癌症也称为肿瘤，是指由于身体组织的自主过度生长而异常生长的细胞。由于现代社会中人口老龄化、吸烟人口增加、饮酒量增加、饮食习惯西方化以及环境污染，癌症发病率持续增加。

2、治疗癌症的方法包括手术、放射疗法、化学疗法等。具体地，手术是一种从体内去除癌组织的治疗方法，并且对于早期癌症或其中病变仅限于某个位置的癌症非常有效。然而，难以去除已经侵入病变周围组织或已经转移至淋巴结的癌症，并且这种癌症复发的可能性很高。在这种情况下，放射疗法或化学疗法与手术组合使用。放射疗法或化学疗法主要用于治疗晚期或末期癌症；然而，该疗法也会影响正常细胞，从而引起严重的不良反应。

3、同时，随着基因重组技术的全面使用，已经启动了使用具有增加的肿瘤选择性和抗癌功效的溶瘤病毒的临床研究。文献中报道的第一种重组溶瘤病毒是单纯疱疹病毒。从那时起，一直在积极进行使用其他病毒的溶瘤研究。

4、其中，已经进行了对通过使用牛痘病毒获得的胸苷激酶(tk)基因缺陷牛痘病毒的研究；然而，尽管临床上有用，但由于治疗窗狭窄，病毒在使其临床效果最大化的方面存在局限性。对于tk缺陷牛痘病毒，狭窄的治疗窗意味着高病毒剂量具有很好的临床功效，但由于病毒的毒性而可能导致临床风险。为了克服该问题，已经进行了研究，通过删除编码非必需蛋白质(如蛋白a56)的基因区域以及删除tk基因来增加此类病毒的治疗功效并降低毒性(izmailyan r,chang w.journal of virology.2008年10月；82(20):10079-87)。

5、最近，积极研究了免疫细胞疗法作为一种癌症治疗方法。免疫细胞疗法与现有的治疗方法不同，在于它使用患者的免疫细胞来杀伤癌细胞。具体地，免疫细胞疗法是一种从患者获得免疫细胞，将其激活以特异性攻击增殖细胞或癌细胞，然后返回患者体内的方法；并且该方法使抗癌效果最大化，同时使药物诱导的不良反应最小化。

6、在过去的5年中，积极研究了免疫检查点抑制剂用于治疗癌症的免疫疗法。特别是，已经研究了针对免疫检查点的抑制剂，如细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)和pd-l1。免疫检查点抑制剂(如伊匹单抗(抗ctla-4)、纳武单抗(抗pd-1)和派姆单抗(抗pd-1))已被监管机构批准用于治疗数种类型的癌症。然而，免疫检查点抑制剂仅限用于治疗患有某些类型癌症(如黑色素瘤、肺癌、头颈癌、肾癌和膀胱癌)的患者。

7、此外，嵌合抗原受体表达t细胞(在下文中为car-t细胞)针对各种类型的血液癌症表现出优异的治疗功效。然而，对于实体癌，几乎没有car-t细胞临床成功病例的报道。与此相关的原因包括car-t细胞难以运输并浸润至肿瘤中，car-t细胞的持久性和增殖问题，以及由于不利的肿瘤微环境而无法发挥治疗效果的car-t细胞的限制；然而，最大的限制是由于缺乏在肿瘤中特异性表达的合适靶抗原而出现严重的安全性问题。事实上，用于实体癌car-t细胞临床开发的大多数靶抗原在肿瘤中过度表达，在正常细胞中也以低水平表达。出于该原因，报道了car-t细胞也与正常细胞结合并引起严重毒性问题的病例。为了克服这种脱瘤中靶的毒性问题，需要一种满足肿瘤特异性、高且均匀的覆盖率以及表达稳定性的条件的靶抗原。然而，目前几乎没有满足所有三个条件的实体癌靶抗原。因此，需要不断研究并开发能够以安全且有效的方式靶向实体癌的癌细胞靶向方法。

8、[现有技术文献]

9、[非专利文献]

10、(非专利文献1)izmailyan r,chang w.journal of virology.2008年10月；82(20):10079-87

11、(非专利文献2)anthony k.park等人,science translational medicine.2020年9月；12(559)

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明人已经研究开发了一种使用car-t治疗剂安全且有效地靶向或治疗实体癌的方法。作为结果，本发明人已经试图诱导抗癌效果，通过使用具有肿瘤选择性的溶瘤病毒(载体)，使得可以被car-t靶向的源自病毒的蛋白在实体癌细胞表面上表达，然后注射与其结合的car-t治疗剂来进行。在本发明之前，提出了免疫疗法，其中将cd19基因插入溶瘤病毒中，使得蛋白cd19在实体癌细胞表面上表达，然后施用cd19特异性car-t细胞(anthonyk.park等人,science translational medicine.2020年9月；12(559))；然而，先前从未提出过使用溶瘤病毒中天然存在的蛋白来靶向实体癌的方法。人体中天然存在的蛋白(如cd19)也分布于其他器官或正常细胞中。然而，在如上所述使用并靶向溶瘤病毒中天然存在的蛋白的情况下，由于溶瘤病毒已被基因工程改造为以肿瘤选择性方式增殖，因此car-t与正常细胞中的抗原结合的风险降低。

3、作为深入研究的结果，本发明人已经发现，对于各种癌，在通过注射含有编码牛痘病毒蛋白a56或其片段的核酸的载体来治疗癌细胞的情况下，蛋白a56以肿瘤特异性且稳定的方式在癌细胞表面上表达。此外，对于与蛋白a56或其片段结合的多种抗体，本发明人分析了它们与a56的结合。作为结果，本发明人已经发现，抗体交叉抑制与a56的结合，尽管它们的表位序列并不完全相同，这是独特的。然后，本发明人已经鉴定了决定与a56的结合的构象表位，并发现与这种构象表位结合的car-t细胞在降低癌细胞负担方面发挥优异的效果，从而完成了本发明。

4、问题的解决方案

5、为了解决以上提及的问题，在本发明的一方面，提供一种基因工程改造的免疫细胞，其表达嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体包含(i)细胞外抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)细胞内信号传导结构域，其中所述嵌合抗原受体与癌细胞表面上存在而正常细胞表面上不存在的抗原特异性结合，并且所述抗原是癌细胞天然不表达的蛋白。

6、在本发明的另一方面，提供一种嵌合抗原受体(car)，其包含(i)细胞外抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内信号传导结构域，其中所述嵌合抗原受体与暴露在癌细胞表面上的蛋白a56或其片段特异性结合。

7、在本发明的又一方面，提供一种编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸。

8、在本发明的又一方面，提供一种包含所述多核苷酸的载体。

9、在本发明的又一方面，提供一种基因工程改造的免疫细胞，其中引入所述载体。

10、在本发明的又一方面，提供一种用于产生基因工程改造的免疫细胞的方法，其包括将所述载体引入免疫细胞的步骤。

11、在本发明的又一方面，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述基因工程改造的免疫细胞。

12、在本发明的又一方面，提供一种用于减轻癌细胞负担的方法，其包括施用所述基因工程改造的免疫细胞的步骤。

13、在本发明的又一方面，提供一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包含所述基因工程改造的免疫细胞和溶瘤病毒。

14、在本发明的又一方面，提供一种用于治疗个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用i)溶瘤病毒和ii)所述基因工程改造的免疫细胞的步骤。

15、在本发明的又一方面，提供所述基因工程改造的免疫细胞用于预防或治疗癌症的用途。

16、在本发明的又一方面，提供所述基因工程改造的免疫细胞用于制造用于预防或治疗癌症的药物的用途。

17、发明的有利效果

18、本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞可以有效地靶向癌细胞表面上特异性表达的蛋白a56，这使得用于甚至在溶瘤病毒感染后存活的癌细胞的靶向疗法成为可能，从而提供有效的抗癌疗法。本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞可以特异性地针对蛋白a56具有增加的激活和增殖能力，并表现出优异的细胞毒性效应，从而针对表达蛋白a56的癌细胞提供有效的抗癌疗法。免疫细胞优选与溶瘤病毒组合使用，并且可以另外与能够增强溶瘤病毒抗癌效果的药物(例如羟基脲、用于调节淋巴细胞去除的化学治疗剂(例如环磷酰胺和氟达拉滨)或免疫治疗剂)组合使用。