一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子ISWI及其编码基因和应用

一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及昆虫防治领域，具体涉及一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi及其编码基因和应用。


背景技术：

2.番茄潜叶蛾tuta absoluta原产于南美洲秘鲁，是一种世界检疫性害虫，对番茄等作物造成毁灭性的灾害。番茄潜叶蛾主要以幼虫进行危害，雌成虫在刚刚展开的叶片上产卵，幼虫一经孵化便潜入寄主植物的组织中，潜食叶片。如不采取防治措施，该害虫可导致番茄减产80-100％。与此同时，随着化学农药的持续使用，促使其抗药性不断增强，能迅速的对各种药剂靶标产生抗性。
3.rna干扰(rnainterference,rnai)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。rnai广泛存在于生物界，通过rnai技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段。由于rna干扰技术具有昆虫选择性和基因特异性，其不仅是基因功能研究的重要手段，也是至今为止最有可能应用于害虫防治的生物工程技术。利用rnai技术进行害虫生物防治，其关键步骤之一是筛选靶标基因。
4.染色质重塑(chromatin remodeling)是表观遗传学重要的组成部分之一。在真核生物细胞内存在一系列特异的染色质重塑因子它们可以促进染色质中dna与蛋白质的动态结合。这些因子是多亚基复合物，利用atp水解产生的能量，通过滑动核小体等方式改变染色质的状态，从而调控特定基因的表达。染色质重塑在生物发育繁殖相关基因的表达调控中发挥着关键作用，染色质重塑因子iswi(imitation swi)能参与生物发育生殖的调控，在调节发育生殖相关基因的表达中起重要作用。iswi沉默出现寿命缩短、卵巢畸形以及产卵量降低等。因此，本发明基于rna干扰技术，提供了新型害虫防治分子靶标，期望为番茄潜叶蛾的防控提供新的思路，达到有效的防控的效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种番茄潜叶蛾染色质重塑因子。
6.本发明的再一目的是提供上述番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi的编码基因。
7.本发明的再一目的是提供上述编码基因的应用。
8.根据本发明的具体实施方式，首次克隆出番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi，其cdna全长核苷酸序列如seq id no:1所示：
9.atgtcacaacctgatgaagctatggatgtaggggacgtggaagaaaactctaatgagtcgtccagcgataccacgtcctcaaagggtaaagaaggagacttcgaaagtaaaattgagaccgatcgttccaagcgttttgattttttgttgaaacaaactgaaatattctcgcatttcatgaccaatgcgcctaaaaccagtagtcctcctaaggctaaagccggtcgacctaaaaaggtgaaagaagatctgcctgagcagtctgaggatgcttctgcagcagaccatcggcaccgcaagactgaacaggaagaagatgaggaactccttgctgagacaaacgctaagattaagccaatatttcgctttgaagcatc
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10.番茄潜叶蛾染色质重塑因子isw的氨基酸序列如seq id no:2所示：
11.msqpdeamdvgdveensnesssdttsskgkegdfeskietdrskrfdfllkqteifshfmtnapktssppkakagrpkkvkedlpeqsedasaadhrhrkteqeedeellaetnakikpifrfeasppyikngemrdyqvrglnwm
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12.上述氨基酸序列具有iswi蛋白典型的结构特征，包含n-末端atp酶结构域(dexdc和helicc)和c-末端hand-sant-slide结构域。
13.本发明提供了上述番茄潜叶蛾染色质重塑因子iswi的应用。对番茄潜叶蛾进行rnai，结果显示，取食dsiswi的番茄潜叶蛾卵巢发生畸形、成虫产卵量显著性降低，说明iswi基因在番茄潜叶蛾生殖发育中起关键作用。基于本发明的番茄潜叶蛾iswi基因片段合成的dsrna促使其卵巢畸形和显著降低成虫产卵量，以及显著缩短成虫寿命，可以作为番茄潜叶蛾rnai防治的分子靶标，对于防治该入侵害虫具有重要的现实意义。
14.本发明首次从新发重要入侵害虫番茄潜叶蛾中克隆获得染色质重塑因子iswi基因，上述入侵害虫卵注射基因dsrna后导致卵巢畸形、产卵量显著降低和成虫寿命显著缩短。所获得的结果为利用rnai防治新发入侵害虫提供新的途径。
附图说明
15.图1显示注射iswi基因dsrna和dsegfp条件下雌成虫卵巢的变化情况；
16.图2不同发育阶段iswi基因表达谱变化；
17.图3显示注射iswi基因dsrna和dsegfp条件下iswi的表达量变化情况；
18.图4显示注射iswi基因dsrna处理对番茄潜叶蛾成虫寿命的变化情况；
19.图5显示注射iswi基因dsrna处理对番茄潜叶蛾成虫产卵量的变化情况；
20.图6显示注射iswi基因dsrna处理对番茄潜叶蛾卵孵化率的变化情况。
具体实施方式
21.实施例1：番茄潜叶蛾iswi基因全长cdna序列克隆
22.取番茄潜叶蛾幼虫4头放入1.5ml的离心管，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后提取rna，-80℃保存以备用。根据全式金反转录试剂盒(transscript all-in-one first-strand cdna synthesis supermix for pcr)说明，对提取的rna进行反转录合成cdna。以cdna为模板，设计引物，进行pcr扩增。设计引物如表1所示：
23.表1克隆taiswi基因全长cdna的引物序列
[0024][0025][0026]
利用表1的引物，通过pcr扩增，获得iswi基因的cdna序列全长为3078bp，所得的基因具有如seq id no:1所示的核苷酸序列，该基因编码1025个如seq id no:2所示的氨基酸序列。克隆获得的基因编码的氨基酸序列的保守结构域分析表明，其具有iswi蛋白典型的结构特征：包含n-末端atp酶结构域(dexdc和helicc)和c-末端hand-sant-slide结构域。
[0027]
实施例2：分析iswi基因对番茄潜叶蛾生殖发育的影响
[0028]
1、合成dsrna
[0029]
(1)设计合成加上t7启动子的引物序列：
[0030]
t7+dsiswi-f：5
’‑
taatacgactcactatagggtatggatgtaggggacg-3’[0031]
t7+dsiswi-r：5
’‑
taatacgactcactatagggccagttggttagggttg-3’。
[0032]
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0033]
(2)总rna提取及cdna合成：同实施例1。
[0034]
(3)t7引物pcr扩增、产物纯化，纯化所得的pcr产物即为合成dsrna的模板。使用试剂盒合成和纯化dsrna，按照试剂盒说明书进行操作。
[0035]
2、dsrna注射法
[0036]
(1)收集番茄潜叶蛾羽化前的老熟雌蛹，排列并粘附在事先贴有透气双面胶的盖玻片表面上。使用femtojet express(eppendorf)显微注射仪，在节间进行注射dsiswi(注射量为0.6μg dsrna)、dsegfp和ddh2o(0.1μl)。注射后，将雌蛹单头放置在透气的1.5ml离心管里，一旦羽化，将其与新羽化的野生型雄成虫配对单独放置在塑料盒，并提供足够的新鲜番茄叶供其取食，统计成虫的产卵量和寿命。同时，随机取羽化4天的成虫，解剖其卵巢并观察其形态特征。为检测rnai干扰效率，将注射72h后的4头番茄潜叶蛾用于表达量的检测，各处理均设置4个生物学重复。如图1所示，显示注射iswi基因dsrna和dsegfp条件下雌成虫卵巢的变化情况，与对照处理相比，注射iswi基因dsrna后雌成虫卵巢中成熟卵子的数量明显减少。
[0037]
(2)通过2-δδct
方法计算基因的相对表达量，结果如图2所示，显示不同发育阶段iswi基因表达谱变化，iswi基因在卵和蛹这两个发育阶段的表达量最高。图3显示注射iswi基因dsrna和dsegfp条件下iswi的表达量变化情况，结果表明注射dsiswi的dsrna可以显著敲低iswi基因的表达。
[0038]
利用sas 9.4统计软件分析注射不同溶液后番茄潜叶蛾成虫的产卵量(图5)和雌虫寿命(图4)，结果显示，饲喂dsiswi基因dsrna的番茄潜叶蛾的总产卵量和寿命均显著低于注射dsegfp组(p《0.05)。图6显示注射iswi基因dsrna后番茄潜叶蛾卵孵化率的变化情
况，与对照相比，注射dsiswi可以显著抑制番茄潜叶蛾卵的孵化。
[0039]
同时在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)blast显示，所注射的靶序列片度为iswi基因特有的序列，由此确保了干扰效果为番茄潜叶蛾的iswi基因所产生，因此，说明本发明的iswi基因在番茄潜叶蛾发育生殖过程中起着关键作用。
[0040]
本发明从番茄潜叶蛾中克隆得到iswi基因的全长cdna，荧光定量pcr显示注射靶基因双链rna后iswi基因的表达量显著降低；最后通过注射iswi基因dsrna，进而导致番茄潜叶蛾雌虫产卵量和寿命显著性降低。根据本发明的具体实施方式，试验结果明确了iswi基因在南美番茄潜叶蛾发育生殖过程中起着关键作用。本发明为利用rnai有效防治番茄潜叶蛾的研究奠定了基础，为日后通过染色质重塑因子的相关研究降低番茄潜叶蛾的危害提供了方法依据。
[0041]
以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限制本技术的保护范围。