用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记引物及应用

1.本发明属于植物分子标记领域，具体涉及一种用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记引物及其应用。


背景技术：

2.软枣猕猴桃为猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidia)多年生落叶藤本植物，果实大小与枣相似，味道鲜美，风味独特，果皮光滑可食用，具有丰富的维生素、膳食纤维、氨基酸、多糖等营养价值。另外，它是一种药食同源的植物，根茎叶均可入药，对于降血压、降血脂、预防心脑血管疾病都有良好的作用。软枣猕猴桃分布十分广泛，在我国的东北、华北、西北及华南等地区均有分布，给育种工作提供了大量的野生资源。但是软枣猕猴桃属于功能性雌雄异株，实生育种过程中存在3-5年的童期，开花前无法区分的雄株占用了大量的人力和物力，造成了极大的浪费。另外，在软枣猕猴桃种质资源的野外收集过程中，如何对无花无果的植株快速有效的鉴定性别加速资源收集进程也是育种家关心的问题。
3.近年来，已有一些关于猕猴桃属植物性别鉴定分子标记的研究报道，如gill等利用bsa法在中华猕猴桃中开发的smx和smy1标记(gill gp,harvey cf,gardner rc,et al.development of sex linked pcr markers for gender identification in actinidia.theoretical&appliedgenetics,1998,97(3):439-445.)，以及张琼等在山梨猕猴桃和中华猕猴桃杂交后代中利用rad-seq技术开发的ssr标记a001、a002和a003(zhang q,liu cy,liu yf,et al.high-density interspecific genetic maps of kiwifruit and the identification of sex specific markers.dna research,2015,22(5):367-375.)。由于猕猴桃种质的遗传多样性丰富以及软枣猕猴桃的倍性复杂，这些标记在软枣猕猴桃中并没有很好的通用性，难以满足软枣猕猴桃育种工作的需求。因此，开发一种通用性强、操作简单、高准确性的针对软枣猕猴桃早期性别鉴定的分子标记辅助软枣猕猴桃育种具有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记引物组合及其应用，能够快速地将雄性和雌性软枣猕猴桃植株区分开来，操作简单，重复性好，准确度高。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.申请人收集了不同地理来源的100份软枣猕猴桃种质资源作为实验材料，通过对这些样品进行全基因组重测序，比对参考基因组，snp筛选以及与性别的全基因组关联分析，得到了可能的性别关联位点，结合基因注释结果，在软枣猕猴桃雌、雄样本差异区段设计特异性引物，开发雌雄性别鉴定的特异标记。最终得到2对分子标记引物可准确鉴定出软枣猕猴桃雄性和雌性植株。
7.用于pcr扩增分子标记m1的引物序列为：
8.正向引物m1-f：5'-atggcaaagtggttctctctcc-3'(seq id no.1)和反向引物m1-r:
5'-ttaaaccaaccaagaaaacaacgtcc-3'(seq id no.2)；
9.用于pcr扩增分子标记m2的引物序列为：
10.正向引物m2-f：5'-atttgtattgctctggtgcttc-3'(seq id no.3)和反向引物m2-r：5'-ccctgctactatcacttggttt-3'(seq id no.4)。
11.利用上述分子标记引物鉴定软枣猕猴桃性别的方法，包括以下步骤：
12.(1)利用改良的ctab法提取待鉴定的软枣猕猴桃样品的dna；
13.(2)步骤(1)中提取的基因组dna为模板，分别利用分子标记m1和m2的引物对进行pcr扩增反应；
14.(3)利用1％的琼脂糖凝胶电泳技术检测pcr扩增产物；
15.(4)根据特异性带型进行软枣猕猴桃性别鉴定，在雄性样本中分子标记m1在702bp出现dna条带，分子标记m2在401bp出现dna条带，在雌性样本中两个分子标记均无条带。
16.本发明的有益效果在于：本发明提供的分子标记可将软枣猕猴桃雄性植株和雌性植株准确区分开，操作简单、重现性好、准确度高，有效克服童期用表型鉴定方法无法准确鉴定区分软枣猕猴桃性别的缺点。
附图说明
17.图1为实施例2中利用本发明提供的分子标记引物m1对软枣猕猴桃的雌雄鉴定结果图。
18.图2为实施例2中利用本发明提供的分子标记引物m2对软枣猕猴桃的雌雄鉴定结果图。
具体实施方式
19.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。
20.实施例1：用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记引物的获得
21.申请人收集了不同地理来源的100份软枣猕猴桃种质资源作为实验材料。通过对这些样品进行全基因组重测序，比对参考基因组，snp筛选以及与性别的全基因组关联分析，得到了可能的性别关联位点，结合基因注释结果，在软枣猕猴桃雌、雄样本差异区段设计特异性引物，开发雌雄性别鉴定的特异标记。最终得到2对分子标记引物可准确鉴定出软枣猕猴桃雄性和雌性植株。
22.用于pcr扩增分子标记m1的引物序列为：
23.正向引物m1-f：5'-atggcaaagtggttctctctcc-3'(seq id no.1)和反向引物m1-r:5'-ttaaaccaaccaagaaaacaacgtcc-3'(seq id no.2)。
24.用于pcr扩增分子标记m2的引物序列为：
25.正向引物m2-f：5'-atttgtattgctctggtgcttc-3'(seq id no.3)和反向引物m2-r：5'-ccctgctactatcacttggttt-3'(seq id no.4)。
26.实施例2：分子标记引物在软枣猕猴桃早期性别鉴定中的应用
27.(1)按照改良的ctab法提取软枣猕猴桃雌雄植株(各20株)的dna样品，用1％琼脂糖凝胶电泳和nanodrop分光光度计检测dna质量和浓度，将dna浓度稀释为25ng/μl备用；
28.(2)pcr反应体系按20μl计为：
29.dna模板(25ng/μl)2μl引物f(10μm)1μl引物r(10μm)1μl2
×
taq pcr mix预混液10μl无菌水6μl
30.pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58～60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存。得到的pcr产物在1％的琼脂糖凝胶电泳分离。
31.利用标记引物扩增软枣猕猴桃雄性和雌性样本的pcr产物的电泳结果如图1和图2所示。在雄性样本中分子标记m1在702bp出现dna条带，分子标记m2在401bp出现dna条带，在雌性样本中两个分子标记均无条带。
32.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。