一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”等。烟草疫病在中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区等烟草疫病发生亦相当普遍。目前黑胫病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治；其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。因此，寻找更多高效的生物农药先导化合物对烟草黑胫病的防治具有重要意义。
3.微生物农药是21世纪农药工业的新产业，代表着植物保护的方向，其最大的优势在于能克服化学农药对生态环境的污染和减少在农副产品中农药残留量，同时在示范推广微生物农药应用的过程中，农副产品的品质和价格将大幅度上升，有利地促进农村经济增长和农民增收，社会效益不可估量。此外，微生物产生的次级代谢产物化学结构类型丰富、生物活性多样，涵盖了从简单的丙烯咪(分子量为72)到结构极为复杂的colubricidin(分子量为2154)在内的有机化合物类型。这些结构多样的次生代谢产物是药物和生物农药的重要来源。
4.烟草中富含共生微生物，微生物在烟草的种植、烟叶加工等关键环节中均发挥着重要作用。如：在烟草种植过程中，微生物对于土壤成分的改良、土壤中有害成分的分解、烟株的抗病等方面都发挥了非常重要的作用；在烟叶加工过程中，烟草源微生物的功能决定其可在一定程度上改变烟草的化学组成，进而改变烟草的吸味品质。此外，烟草内源真菌中分离鉴定的化合物具有不同的药理学作用，如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗烟草花叶病毒等。因此，加强烟草内生真菌代谢产物研究，对发现活性显著的新骨架类型代谢产物具有重要的科学意义。本发明旨在提供一种从烟草内源花斑曲霉(aspergillus versicolor)真菌发酵产物中分离得到的新型吲哚生物碱类化合物，该化合物具有显著的抗烟草黑胫病活性，以期为抗烟草黑胫病的生物农药提供更多高效的候选化合物。


技术实现要素：

5.本发明从烟草中分离鉴定的花斑曲霉菌株培养液分离得到了一种具有抗烟草黑胫病活性的新型吲哚生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。
6.除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
7.本发明第一方面提供一种吲哚生物碱类化合物，所述化合物分子式为：
8.c
17h16
n2o3，其具有下述结构：
[0009][0010]
该化合物为棕色胶状物，命名为：花斑曲霉生物碱-h，英文名为：aspergilline-h。
[0011]
本发明第二方面提供第一方面所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
[0012]
a、菌株分离鉴定：
[0013]
花斑曲霉(aspergillus versicolor)的分离：将75％乙醇消毒后的烟草根茎放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000～3000rpm离心2～ 10min，吸取1～100微升上清液，涂布在bl平板上，倒置于培养箱中，25～30℃黑暗培养2～10天，反复挑取单菌落纯化培养直到获得单一内生真菌菌落，编号保存菌种，经its测序(genbank accession number mt549144， gcgggctgcctccgggcgcccaacctcccacccgtgaatacctaaca ctgttgcttcggcggggaaccccctcgggggcgagccgccggggact actgaacttcatgcctgagagtgatgcagtctgagtctgaatataaaa tcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaa gaacgcagcgaactgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtga atcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggcattccgggggg catgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccggcttgtgtgtt gggtcgtcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggca ccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgactag ggccggccgggcgccagccgacgtctccaaccatttttcttcaggttg acctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataa gcggaggaa)确定为花斑曲霉(aspergillus versicolor)，其单菌落和显微形态照片见附图1；
[0014]
b、花斑曲霉(aspergillus versicolor)菌种培养
[0015]
将步骤a分离得到的花斑曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25～30℃培养7～10天，再接种在50～500ml的三角瓶中，每个三角瓶含10～100ml马铃薯葡萄糖培养基，置于25～30℃下震荡培养5～10天得到液体发酵种。所述花斑曲霉菌株yats1111于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc no.19910；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0016]
c、菌株放大发酵
[0017]
将步骤b培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵是在100～ 1000个100～500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有400～600g大米和60～ 400ml营养液。营养液的组成为：葡萄糖5％、蛋白胨0.15％、四水合硝酸钙0.1％、硝酸钾0.6％、磷酸二氢铵0.2％、七水合硫酸镁0.4％、复合氨基酸1％，其余量为水，营养液ph值为6.8；高压灭菌后每个瓶中接种1.0～5.0ml步骤b培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养15～45天得到花斑曲霉发酵物。
[0018]
d、浸膏提取：
[0019]
将步骤c发酵得到的花斑曲霉发酵物用90wt％～99wt％乙醇超声提取2-5次，每次
30～50min，合并提取液过滤并浓缩到小体积，然后在浓缩液中加入乙酸乙酯与3wt％的酒石酸溶液的混合液(乙酸乙酯:酒石酸溶液＝1:1-1:2，体积比)充分搅拌均匀，静置分层后分出水相，水相再用na2co3调节ph至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得到生物碱萃取产物供柱层析分离。
[0020]
e、硅胶柱层析：
[0021]
将步骤d得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液浓缩后用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为8:2的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液。
[0022]
f、高效液相色谱分离
[0023]
将步骤e最终得到的第二洗脱液浓缩，并更换溶剂为甲醇，通入高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm
×
250mm，5μm的zorbaxprepht gf色谱柱，流速为20ml/min，流动相为55wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为402nm，每次进样200μl，收集每次进样后色谱峰保留时间为26.4min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物粗品。
[0024]
g、凝胶柱层析纯化
[0025]
将步骤f吲哚生物碱类化合物粗品再次用纯甲醇溶解，以甲醇为流动相进行葡聚糖凝胶柱层析分离，即可得到所述的吲哚生物碱类化合物纯品。
[0026]
优选地，所述步骤d中，乙醇的浓度优选为95wt％。
[0027]
优选地，步骤e中，所述浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用甲醇溶解后用重量比1.5～2.5倍的80～120目硅胶拌样。
[0028]
优选地，所述步骤f中，高效液相色谱法分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
[0029]
h、化合物的结构鉴定
[0030]
以上述方法制备的吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：
[0031]
外观观测发现：本发明化合物为棕色胶状物；紫外-可见吸收光谱显示其在 215、262、356、402nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有羟基(3408cm-1
)、胺基(3231cm-1
)、羰基(1698cm-1
)、芳香环(1635、1482、1380cm-1
)特征官能团；高分辨质谱 (hresims)给出准分子离子峰319.1063[m+na]
+
，可确定化合物的分子式为 c
17h16
n2o3。
[0032]
结合1h和
13
c与hsqc nmr数据，显示该化合物包括一个4,8取代的苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮结构片段(c-2～c-4、c-8～c-15、h-9、h-11～h-13和 nh)，一个
–
c(ch3)
2-n-co-(c-5,c-7,c-16,c-17,h
3-16,和h
3-17)，一个n
‑ꢀ
羟乙基结构片段(c-18、c-19，h
2-18、h
2-19)。为满足化合物的不饱和度 11,-c(ch3)
2-n-co-结构片段还应该和苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮连接形成二甲基
ꢀ‑
1,5-二氢-2h-吡咯-2-酮(c-4,c-5,c-7,c-8,c-16,c-17,h
3-16和h
3-17)环。该推断可进一步由h-9与c-4,c-7,c-8,h
3-16和h
3-17与c-8的hmbc相关得到证实。由此可推
断化合物为吲哚生物碱cpa(cyclopiamide)类型。
[0033]
表1、化合物的1hnmr和
13
cnmr数据(cdcl3)
[0034][0035]
除n-羟乙基结构片段外，本发明化合物中的其他碳和氢信号和典型的已知的吲哚生物碱cpa(cyclopiamide)类型(见phytochemistry，1990，29，639)相似，这也进一步证实了化合物为含n-羟乙基结构片段的cpa类型生物碱。此外，化合物为cpa类型还可进一步通过h-9与c-4/c-7/c-11/c-15、h-11与c-15、 h-12与c-10/c-14、h-13与c-11/c-15、h
3-16/h
3-17与c-7/c-8的hmbc 相关得到证实。
[0036]
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其hmbc 相关确定。根据h
2-18和c-5/c-7的hmbc相关，可证实n-羟乙基结构片段在n-6位，并且c-18和n-6相连接，至此，化合物的结构可得到确认。化合物命名为花斑曲霉生物碱-h，英文名为aspergilline-h。
[0037]
化合物的波谱数据：uv(甲醇),λ
max
(logε)215(4.18)、262(3.82)、356(3.36)、 402(3.08)nm；ir(溴化钾压片)ν
max 3408、3231、2958、2926、2858、1698、1635、 1482、1380、1157、1064、1026、792cm-1
；1h and 13
c nmr数据(cdcl3，500 和125mhz),表1；esims(正离子模式)m/z 319[m+na]
+
；hresims(正离子模式)m/z 319.1063[m+na]
+
(计算值319.1059，c
17h16
n2nao3)。
[0038]
i、抑制烟草疫霉菌(黑胫病病原)活性试验
[0039]
取燕麦片加水1000ml,在沸水浴上加热1小时，纱布过滤后加水补足1000 ml，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、灭菌20min，取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5mg/100ml),混匀后倾倒于平皿中，28℃培养48小时，经检查无菌后待用。
[0040]
取直径5mm的圆形滤纸，放入培养皿中，置于121℃高压灭菌30min，烘干后分别浸入20μm的实施例1制备得到的化合物、75％乙醇水溶液及灭菌蒸馏水中，于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2ml烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀，将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上，置28℃培养观察实验结果,测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。
[0041]
测试结果表明：本发明得到的吲哚生物碱类化合物抑菌圈直径为15.2
±
1.4 mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.8
±
1.0mm。说明本发明化合物抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。 j、防治烟草黑胫病的效果检测
[0042]
烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照：黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20μm的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10ml，共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。
[0043]
结果：本发明吲哚生物碱类化合物对烟草黑胫病防治效果为(73.1
±
3.4)％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。
[0044]
本发明的有益效果如下：
[0045]
1、本发明的化合物从烟草内生花斑曲霉菌株发酵产物中分离得到，由于内生真菌容易实现批量化发酵生产，因此，本发明的化合物原料易得；化合物的提取方法简单，容易分离得到，产业化制备容易实现。
[0046]
2、本发明得到的吲哚生物碱类化合物具有较好的抗黑胫病活性，可作为抗烟草黑胫病的先导化合物用于抗烟草黑胫病防治生物农药研发，在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明为具有植物病害防治功效的植物来源的天然产物开发提供了新的研究方向。
[0047]
3、本发明的吲哚生物碱类化合物分子结构也简单，容易实现人工合成，后续的产业化也可通过人工合成实现。
[0048]
4、本发明的制备方法采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产中化合物的品质、纯度有保障。
附图说明
[0049]
图1为花斑曲霉示意图；a为菌落形态；b为显微形态。
[0050]
图2为所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振碳谱。
[0051]
图3为所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振氢谱。
[0052]
图4为所述吲哚生物碱类化合物的主要hmbc和1h-1
hcosy相关。
具体实施方式
[0053]
下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所需要的原料均为市售。
[0054]
本发明所用原料不受培养基类型影响，下面以来源于云南的烟草中分离鉴定的花斑曲霉菌株培养基对本发明做进一步说明：
[0055]
实施例1
[0056]
将培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在500个500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有180g大米和180ml营养液，每个瓶中接种2.5ml 培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养30天得到花斑曲霉发酵物。发酵产物用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3wt％的酒石酸溶液的混合液(乙酸乙酯:酒石
酸溶液＝1:1-1:2，体积比)中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用na2co3溶液将水层ph 值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏605g。该浸膏用1.0kg的80～120目硅胶拌样，用3.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱， tlc监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次进行硅胶柱层析分离，并以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1 的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，收集8:2部分的洗脱液浓缩、并更换溶剂为甲醇，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以55％的甲醇为流动相， zorbaxprepht gf柱(21.2
×
250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20 ml/min，紫外检测器检测波长为402nm，每次进样200μl，收集26.4min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadex lh-20凝胶柱层析分离，即得本发明新化合物纯品。
[0057]
实施例2
[0058]
将培养得到的液体发酵种进行规模化发酵，规模化发酵在250个1.0l的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有360g大米和360ml营养液，每个瓶中接种5.0 ml培养得到的液体发酵种，于25～30℃培养30天得到花斑曲霉发酵物。发酵产物用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min；提取液合并，加入到乙酸乙酯与3wt％的酒石酸溶液的混合液(乙酸乙酯:酒石酸溶液＝1:1-1:2，体积比) 中充分搅拌，待混合溶液静置分层后分离出水相，水相再用na2co3溶液将水层 ph值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取；分离出乙酸乙酯相减压浓缩成浸膏，得浸膏632g。该浸膏用1.0kg的200目硅胶拌样，用3.2kg 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，tlc 监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次进行硅胶柱层析分离，并以体积配比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,1:1的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，收集8:2部分的洗脱液，浓缩并更换溶剂为甲醇，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以55％的甲醇为流动相，zorbaxprephtgf柱(21.2
×
250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为402nm，每次进样200μl，收集26.4min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用 sephadex lh-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物纯品。
[0059]
实施例3
[0060]
实施例1制备的吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：
[0061]
外观观测发现：本发明化合物为棕红色胶状物；紫外-可见吸收光谱显示其在215、262、356、402nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有羟基(3408cm-1
)、胺基(3231cm-1
)、羰基(1698cm-1
)、芳香环(1635、1482、1380cm-1
)特征官能团；高分辨质谱 (hresims)给出准分子离子峰319.1063[m+na]
+
，可确定化合物的分子式为 c
17h16
n2o3。
[0062]
结合1h和
13
c与hsqc nmr数据，显示该化合物包括一个4,8取代的苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮结构片段(c-2～c-4、c-8～c-15、h-9、h-11～h-13和nh)，一个
–
c(ch3)
2-n-co-(c-5,c-7,c-16,c-17,h
3-16,和h
3-17)，一个n-羟乙基结构片段(c-18、c-19，h
2-18、h
2-19)。为满足化合物的不饱和度11，-c(ch3)
2-n-co
‑ꢀ
结构片段还应该和苯并[cd]吲哚-2(1h)-酮链接形成二甲基-1,5-二氢-2h-吡咯-2
‑ꢀ
酮(c-4,c-5,c-7,c-8,c-16,c-17,h
3-16和h
3-17)环。该
推断可进一步由h-9 与c-4,c-7,c-8,h
3-16和h
3-17与c-8的hmbc相关得到证实。由此可推断化合物为cpa类型的吲哚生物碱。
[0063]
除n-羟乙基结构片段外，本发明化合物中的其他碳和氢信号和典型的已知的吲哚生物碱cpa(cyclopiamide)类型(见phytochemistry，1990，29，639)相似，这也进一步证实了化合物为含n-羟乙基结构片段的cpa类型生物碱。此外，化合物为cpa类型还可进一步通过h-9与c-4/c-7/c-11/c-15、h-11与c-15、 h-12与c-10/c-14、h-13与c-11/c-15、h
3-16/h
3-17与c-7/c-8的hmbc相关得到证实。
[0064]
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其hmbc相关确定。根据h
2-18和c-5/c-7的hmbc相关，可证实n-羟乙基结构片段结构片取代在n-6位，并且c-18和n-6向连接，至此，化合物的结构可得到确认。化合物命名为花斑曲霉生物碱-h，英文名为aspergilline-h。
[0065]
实施例4
[0066]
取实施例2制备的化合物，为棕红色胶状物。测定方法与实施例3相同，确认实施例2制备的化合物为吲哚生物碱类化合物——花斑曲霉生物碱-h。
[0067]
实施例5
[0068]
取实施例1～2制备的任一吲哚生物碱类化合物进行抗烟草疫霉菌(黑胫病病原)活性试验，试验情况如下：
[0069]
取燕麦片加水1000ml,在沸水浴上加热1小时，纱布过滤后加水补足1000 ml，然后加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min,取出冷却至45℃左右，于无菌操作台上加入氨苄青霉素(5mg/100ml),混匀后倾倒于平皿中,28℃培养48小时，经检查无菌后待用。
[0070]
取直径5mm的圆形滤纸,放入培养皿中,置于15磅高压灭菌30min,烘干后分别浸入20μm的实施例1制备的化合物、75％乙醇水溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2ml烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上。用三角玻璃涂棒涂布均匀,将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上,置28℃培养观察实验结果,测定抑菌圈大小。同时，以农用氯霉素作为阳性对照。
[0071]
测试结果表明：本发明的吲哚生物碱类化合物抑菌圈直径为15.2
±
1.4mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.8
±
1.0mm。说明本发明化合物抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑胫病活性。
[0072]
实施例6
[0073]
取实施例1～2制备的任一吲哚生物碱类化合物进行抗烟黑胫病试验，试验情况如下：
[0074]
烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10g/株，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照：黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑胫病发病前使用20μm的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10ml，共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。
[0075]
结果：本发明化合物对烟草黑胫病防治效果为(73.1
±
3.4)％，具有显著的烟草黑胫病防治效果。
[0076]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。