一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗与流程

本发明属于病毒领域，具体地说，涉及一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗。

背景技术：

1、人偏肺病毒(human metapneumovirus，hmpv)是2001年首次分离发现的肺病毒科肺病毒亚科新成员，可感染各年龄人群，其中婴幼儿、老年人和免疫抑制人群感染率较高，血清学研究显示5岁儿童的hmpv抗体阳性率达100％。hmpv主要在冬春季节流行，目前尚未有hmpv疫苗批准上市。处于研究阶段的hmpv疫苗包括减毒活疫苗、亚单位蛋白疫苗、福尔马林灭活疫苗和cd8+t细胞(tcd8)表位疫苗。然而，减毒活疫苗在免疫功能低下者中禁用，亚单位蛋白疫苗的免疫原性低于减毒疫苗和灭活疫苗，tcd8表位疫苗并不能完全抵御病毒感染，hmpv灭活疫苗会导致抗体依赖性增强现象。

2、病毒样颗粒(virus like particle，vlp)是利用病毒蛋白的自我组装能力形成的颗粒状物质，不含病毒核酸，形态结构与病毒类似。vlp不仅安全性好，而且保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，有效地诱导机体产生体液和细胞免疫应答。因此，vlp 是具有发展潜力的新型候选疫苗，人乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒等vlp疫苗已用于临床。

3、因此，倘若能够提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒，具有良好的免疫保护作用，则具有重要的理论意义和社会意义。

4、有鉴于此特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗。本发明采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了基于hmpv f蛋白和流感病毒m1蛋白的病毒样颗粒，具有免疫原性和优良的免疫保护作用，为hmpv疫苗特别是vlp疫苗的研发提供理论数据和奠定基础。

2、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

3、本发明的第一目的是提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒(hmpv vlp)，人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装而成。

4、人偏肺病毒的融合蛋白f(hmpv f蛋白)为膜糖蛋白，介导病毒的穿入及细胞融合，是主要的病毒保护性抗原，所诱导的中和抗体可以保护机体防止不同亚型的病毒感染。流感病毒h2n2的基质蛋白m1，在流感病毒的复制中起到关键作用，从病毒进入到组装中均起作用。

5、本发明中人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装形成，在表达时结构稳定，制备效率高，制备的病毒样颗粒免疫原性好，能够达到优良的免疫保护作用。

6、进一步的方案，编码m1蛋白的核酸序列如seq id no:1所示，编码f蛋白的核酸序列如seq id no:2所示。

7、本发明中按照sf9昆虫细胞密码子偏好性对蛋白的编码序列进行了优化，更有利于采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp，能够提高表达量，更好的获得hmpv vlp。

8、本发明的第二目的是提供一种如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

9、(1)构建重组质粒：将流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列克隆到pfastbacdual载体中，得到重组质粒pfastbacdual-m1-f；

10、(2)转染：将重组质粒pfastbacdual-m1-f转染sf9昆虫细胞，获得重组sf9细胞；

11、(3)分离纯化：培养重组sf9细胞，离心纯化得到人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。

12、本发明采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp。杆状病毒昆虫细胞表达系统是当今基因工程四大表达系统之一，具有安全、高效、表达产物与天然蛋白在结构及功能上相似等特点，已经成功表达构建多种病毒样颗粒。虽然杆状病毒表达系统日渐成熟，但感染复数、感染时间和细胞密度等因素依然对杆状病毒系统大规模生产有重要影响。因此，本发明着重对影响杆状病毒系统表达的因素进行了摸索和优化。

13、进一步的方案，步骤(3)中，采用贴壁培养的方式培养重组sf9细胞，制备vlp。

14、本发明利用了sf9昆虫细胞贴壁培养和悬浮培养两种方法对hmpv f蛋白进行表达，以探索目的蛋白最佳的表达方式，最终发现通过贴壁培养sf9细胞能够更好的制备hmpvvlp。

15、进一步的方案，步骤(3)中，将重组sf9细胞进行多代扩大培养纯化；

16、优选的，至少经过p1，p2，p3，p4代扩大培养。

17、进一步的方案，扩大培养纯化方法包括：

18、(1)重组质粒转染sf9昆虫细胞后，72h后收获病变细胞上清，即为p1代重组杆状病毒；

19、(2)将p1代重组杆状病毒加入处于对数生长期的sf9昆虫细胞，27℃培养72小时，连续传代重组杆状病毒至p4代，收获病变细胞上清和细胞；

20、(3)收集p4代病变上清和细胞，经超离浓缩后进行蔗糖密度梯度超速离心，重悬于pbs，得到纯化的人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。

21、hmpv病毒样颗粒vlp在sf9细胞中表达成功，本发明的扩大培养纯化方法，能够实现hmpv vlp的大量生产，有利于进一步推广大规模生产。

22、本发明的第三目的是提供一种表达如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的重组载体，以 pfastbacdual为表达载体，插入流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列。

23、本发明的第四目的是提供一种重组细胞，所述重组细胞中包含如上所述的载体；

24、优选的，所述重组细胞为包含如上所述的载体的sf9昆虫细胞。

25、本发明的第五目的是提供一种如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒在制备预防和/或治疗人偏肺病毒药物中的应用；

26、优选的，人偏肺病毒病毒样颗粒在制备人偏肺病毒疫苗中的应用。

27、本发明的第六目的是提供一种人偏肺病毒病毒疫苗，包含如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒。

28、进一步的方案，人偏肺病毒病毒疫苗还包括药物学上可接受的辅料；

29、优选的，所述辅料包括佐剂；

30、作为一种优选的实施方式，所述的人偏肺病毒病毒疫苗包括人偏肺病毒病毒样颗粒和氢氧化铝佐剂。

31、本发明将hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答，并在 hmpv攻毒后产生较好的免疫保护作用，氢氧化铝佐剂可以增强hmpv vlp的免疫原性和免疫保护作用。

32、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

33、1、本发明的人偏肺病毒病毒样颗粒由优化的流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的 f蛋白组装而成，具有免疫原性，hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠可产生体液免疫和细胞免疫应答，具有优良的免疫保护作用。

34、2、目前国内外尚未有利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp的报道，本发明建立了杆状病毒昆虫细胞制备vlp方法，对表达条件进行探索和优化，确定最佳实验条件，获得hmpv vlp。具体的，本发明通过利用sf9细胞贴壁培养的方式，经p1、p2、p3和p4 代扩大培养，能够获得大量的hmpv vlp。

35、3、本发明的人偏肺病毒病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂组合使用，可增强免疫应答水平， hmpv病毒攻击后，vlp可以产生有效的免疫保护作用。

36、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。