一种PD1抗体与白介素2融合的双功能分子

本发明属于生物医药，具体的，涉及一种pd1抗体与白介素2融合的双功能分子。

背景技术：

1、il-2细胞因子是t细胞的强效生长因子。它通过与存在于t和nk细胞表面的il-2受体(il-2r)结合发挥其活性，从而通过jak/stat5依赖性途径导致其自身磷酸化，最终触发相应细胞的活化和增殖(1)。il-2发挥其持久cr的确切机制仍有争议(2)。il-2的刺激作用已在成功产生适应性和ctl介导的抗肿瘤反应所需的多个途径中得到证实(3)。在tcr识别mhc中的抗原和共刺激分子cd28与b7结合之后，il-2被认为是t细胞克隆扩增和效应器功能所需的第三个基本信号(1,3)。同样，cd8+ctl功能也严重依赖于il-2，如它们在il-2或il-2r缺陷小鼠中的效应或细胞毒性功能降低所示(4-6)。il-2增加ctl向感染或肿瘤的淋巴外部位的运输(1,7)。il-2由th1细胞产生，以响应dc的激活，从而导致cd8激活和增殖(3)。il-2抗肿瘤活性的一个独特机制可能是通过激活自然杀伤(nk)细胞来介导的(8)。

2、多项ii期和iii期试验已在临床上证明il-2在诱导透明细胞rcc患者持久cr和pr方面的功效(9-11)。相比之下，分子靶向治疗未能诱导cr，也没有治愈癌症。在多项iii期试验中报告的il-2治疗的rr(600,000-800,000iu/kg q8h x 14为耐受)范围为20％至23.2％，而cr范围为7％-9％(9-11).在达到cr的患者中，绝大多数是持久的，中位生存期超过10年(1、15、16)。已经测试了替代方案和减少剂量的il-2，但疗效没有任何改善(10-12)。

3、肿瘤微环境(tme)通常通过增加treg的产生和/或减少t细胞生长因子或其信号传导来限制免疫治疗的效果。一个主要挑战是提供足够的细胞因子来重新激活ctl或克服treg。il-2是一种“t细胞生长因子”，是一种多效性细胞因子，在抗原激活后产生，在免疫反应中起关键作用。il-2是细胞毒性t细胞和nk细胞的有效诱导剂。因此，它是针对各种癌症的抢手疗法。然而，在抗癌免疫治疗中使用il-2存在两个主要障碍。一些t细胞，如treg，表达由cd25(il-2rα)、cd122(il-2rβ)和cd132(常见的细胞因子受体γ链)亚基组成的异源三聚体高亲和力受体。相比之下，未成熟cd8t细胞、cd4/cd8记忆t细胞和nk细胞表达亲和力较低的二聚体受体(缺乏cd25亚基(13,14).。当未成熟cd8t细胞被激活时，它们会上调cd25的表达(15)。因此，tregs可以更好地与效应t细胞竞争使用il-2。目前，il-2免疫疗法需要大剂量给药和多次注射。除了tregs的优先扩增外，高剂量的il-2会导致血管渗漏综合征，这种情况会导致血管通透性增加、低血压、肺水肿、肝细胞损伤和肾功能衰竭(16-18)。

4、两个根本上重要的策略可用于改善il-2在免疫治疗中的使用：1)如何在肿瘤组织内活跃的同时限制全身副作用；2)如何在限制tregs刺激的同时优先激活效应t细胞。对于第一个问题，许多团体希望通过使用基于抗体的il-2递送来降低il-2的毒性(19-24)。对于第二个问题，一些研究人员构建了il-2突变体，这些突变体优先降低其与cd25的结合，从而更好地扩增非tregs群体(25-27).。christopher garcia的小组构建了il-2超级因子(也称为super-2)，以消除il-2对cd25表达的功能要求，并增加了对il-2rβ的结合亲和力。与il-2相比，il-2超因子诱导细胞毒性t细胞的超强扩增，导致体内抗肿瘤反应改善，并引起treg扩增成比例地降低全身副作用(26)。

5、靶向il-2方法是否能提高疗效一直存在争议。最近的一项研究表明，与靶向il-2相比，由与人il-2融合的f8抗体组成的免疫细胞因子f8-il2可对淋巴瘤进展产生强烈且改善的抑制作用(21)。最近的另一项研究表明，抗原特异性可能对免疫细胞因子的功效和生物分布并不重要(28,29)。他们发现，治疗效果或生物分布模式不需要免疫细胞因子抗原特异性和fcγ受体相互作用，因为具有不相关特异性和/或无活性突变fc结构域的免疫细胞因子的行为与肿瘤特异性il-2相似。他们推测il-2的生物分布主要与表达il-2r的先天免疫细胞有关。我们认为这种差异的原因与肿瘤模型、抗体的靶向能力以及il-2和il-2受体之间的亲和力有关。因此有必要评估靶向效果是否更好。

6、在这里，我们设计了一种双功能分子(il2与抗t细胞表面抗原pd1抗体相连)来靶向til，因为til比其他细胞表达更多的t细胞表面抗原pd1。为了减少il2与tregs的结合，我们选择了一种il2突变体(abil2)，它大大降低了与il2rα和il2rβ的结合。我们将abil2与抗t细胞表面抗原pd1抗体连接起来(anti-pd1-abil2)，以增加其对肿瘤内cd8+t细胞的亲和力。anti-pd1-abil2显示出更好的瘤内t细胞结合和有效的抗肿瘤作用。使用此类双功能分子还可以克服pdl1治疗耐药性。

7、因此，anti-pd1-abil2双功能分子在临床上是非常具有开发潜力的肿瘤治疗新方案。

技术实现思路

1、本发明首先涉及一种双功能分子，所述的双功能分子为异源二聚体，其特征在于，

2、所述的异源二聚体包括：

3、(1)白介素2(il2)与免疫球蛋白fc单链连接而成的异源二聚体第一单体；

4、(2)抗t细胞表面分子的抗体的fab或scfv与免疫球蛋白fc单链连接而成的异源二聚体第二单体；

5、所述的第一单体与第二单体通过fc单链的二聚化连接，构成所述的异源二聚体；

6、所述的t细胞表面分子包括但不限于：pd1、tim-3、lag-3、ox40、4-1bb、icos、gitr；

7、所述的免疫球蛋白fc单链为天然免疫球蛋白fc单链或通过基因突变敲除adcc效应的免疫球蛋白fc单链；

8、优选的，所述的免疫球蛋白fc单链为天然免疫球蛋白fc单链或通过基因突变敲除adcc效应的免疫球蛋白fc单链；更优选的，所述的免疫球蛋白fc单链为人igg的fc单链。

9、所述的t细胞表面分子为pd1，所述的抗t细胞表面分子的抗体为抗pd1的抗体(apd1)；

10、所述的第二单体中，

11、所述的抗体的fab为人源化抗体的fab或全人化抗体的fab；

12、所述的抗体的scfv为人源化抗体的scfv或全人化抗体的scfv；

13、更优选的，所述的第二单体为：

14、抗t细胞表面分子的抗体的单体，所述抗体的单体包含一条轻链和一条重链；优选的，所述抗体为人源化抗体或全人抗体。

15、更优选的，所述的异源二聚体包括：

16、(1)第一单体，所述的第一单体自n端开始依次包含：

17、1)序列如seq id no.1所示的野生型il-2蛋白、或所述的野生型il-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；r38l、f42a、d20k、r38a、f42k和k43e；

18、2)必要的连接结构(g4s连接序列)，优选的，所述的连接序列如seq id no.6所示；

19、3)序列如seq id no.2所示的igg的fc单链、或如seq id no.3所示的no-adcc突变型的igg的fc、或如seq id no.4所示的knob突变型fc、或如seq id no.5所示的hole突变型fc；

20、(2)第二单体，所述的第二单体包含：

21、1)序列如seq id no.7所示的抗pd1抗体轻链vl-kcl和序列如seq id no.8所示的抗pd1抗体重链vh&ch1组成的抗pd1抗体fab区；

22、或：2)序列如seq id no.9所示的抗pd1单链抗体(scfv)：

23、和：3)序列如seq id no.2所示的igg的fc单链、或如seq id no.3所示的no-adcc突变型的igg的fc、或如seq id no.4所示的knob突变型fc、或如seq id no.5所示的hole突变型fc；

24、更优选的，所述的异源二聚体包括：

25、第一单体：其为序列如seq id no.10所示的多肽(abil2-fc)；

26、第二单体：其为：

27、(1)序列如seq id no.11所示的抗pd1抗体vh-ch1-fc(knob)和序列如seq idno.7所示的抗pd1抗体轻链vl-kcl组成的第二单体；

28、或(2)序列如seq id no.12所示的多肽(apd1scfv-fc(knob))。

29、本发明还涉及一种双功能分子，所述的双功能分子为同源二聚体，其特征在于，

30、所述的同源二聚体的单体为：

31、一分子白介素2(il2)与一分子抗pd1抗体fab通过任意方式连接构成的单体，或，

32、一分子白介素2(il2)与一分子抗pd1单链抗体(scfv)通过任意方式连接构成的单体。

33、优选的，所述的同源二聚体的单体自n端开始依次包含：

34、(1)序列如seq id no.1所示的野生型il-2蛋白、或所述的野生型il-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；r38l、f42a、d20k、r38a、f42k和k43e；

35、(2)必要的连接结构(g4s连接序列)，优选的，所述的连接序列如seq id no.6所示；

36、(3)抗pd1抗体的fab或scfv；所述的fab为人源化抗体的fab或全人化抗体的fab，所述的scfv为人源化抗体的scfv或全人化抗体的scfv；

37、(4)抗体的fc；所述的抗体fc为全人野生型fc或no-adcc突变型fc。

38、更优选的，所述的同源二聚体的单体为：

39、(1)seq id no.18(apd1-abil2：vl-vh(scfv)-fc-abil2)；

40、(2)seq id no.19(abil2-apd1：abil2-vl-vh(scfv)-fc)所示序列。

41、本发明还涉及另一种双功能分子，所述的双功能分子为抗pd1抗体(k)与abil2的组合成的双功能分子，所述的双功能分子为异源二聚体；

42、所述的异源二聚体包括：

43、(1)第一单体，所述的第一单体自n端开始依次包含：

44、1)序列如seq id no.1所示的野生型il-2蛋白、或所述的野生型il-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；r38l、f42a、d20k、r38a、f42k和k43e；

45、2)必要的连接结构(g4s连接序列)，优选的，所述的连接序列如seq id no.6所示；

46、3)如seq id no.2所示的igg的fc单链、或如seq id no.3所示的no-adcc突变型的igg的fc、或如seq id no.4所示的knob突变型fc、或如seq id no.5所示的hole突变型fc；

47、(2)第二单体，所述的第二单体包含：

48、1)序列如seq id no.13所示的抗pd1抗体(k)轻链vl-kcl与序列如seq id no.14所示的抗pd1抗体(k)重链vh&ch1组成的抗体fab区；

49、或：2)序列如seq id no.15所示的抗pd1单链抗体(k)(scfv)：

50、和：3)序列如seq id no.2所示的igg的fc单链、或如seq id no.3所示的no-adcc突变型的igg的fc、或如seq id no.4所示的knob突变型fc、或如seq id no.5所示的hole突变型fc；

51、更优选的，所述的异源二聚体包括：

52、第一单体：其为序列如seq id no.10所示的多肽(abil2-fc)；

53、第二单体：其为：

54、(1)序列如seq id no.16所示的多肽(apd1(k)vh-ch1-fc(knob))和序列如seq idno.13所示的抗pd1抗体(k)轻链组成的第二单体；或

55、(2)序列如seq id no.17或seq id no.22所示的多肽(apd1(k)scfv-fc(knob))。

56、本发明还涉及一种双功能分子，所述的双功能分子为同源二聚体，其特征在于，

57、所述的同源二聚体的单体为：

58、一分子白介素2(il2)与一分子抗pd1抗体(k)fab通过任意方式连接构成的单体，或，

59、一分子白介素2(il2)与一分子抗pd1单链抗体(k)(scfv)通过任意方式连接构成的单体。

60、优选的，所述的同源二聚体的单体自n端开始依次包含：

61、(1)序列如seq id no.1所示的野生型il-2蛋白、或所述的野生型il-2蛋白的突变体，所述的突变体中包含如下任一或任意组合的突变位点；r38l、f42a、d20k、r38a、f42k和k43e；

62、(2)必要的连接结构(g4s连接序列)，优选的，所述的连接序列如seq id no.6所示；

63、(3)抗pd1抗体(k)的fab或scfv；所述的fab为人源化抗体的fab或全人化抗体的fab，所述的scfv为人源化抗体的scfv或全人化抗体的scfv；

64、(4)抗体的fc；所述的抗体fc为全人野生型fc或no-adcc突变型fc。

65、更优选的，所述的同源二聚体的单体为：

66、(1)seq id no.20(apd1(k)-abil2：vl-vh(scfv)-fc-abil2)、

67、(2)seq id no.21(il2-a pd1(k)：il2-vl-vh(scfv)-fc)所示序列。

68、本发明还涉及所述的双功能分子的如下应用：

69、(1)制备抗肿瘤药物；

70、(2)制备与免疫检查点抑制剂联用的抗肿瘤药物；

71、(3)制备克服免疫检查点抑制剂耐受的抗肿瘤药物；

72、(4)制备与t细胞过继转移联用的抗肿瘤药物；

73、(5)制备克服t细胞过继转不响应的抗肿瘤药物。

74、优选的，所述的免疫检查点抑制剂为pdl1抗体；

75、优选的，所述的t细胞为抗肿瘤t细胞；更优选的，所述的t细胞为抗肿瘤car t细胞或其结构类似物。

76、本发明的有益效果在于：

77、(1)提出了il2临床应用的瓶颈和解决方案，abil2/apd1-higg1抗体在保留il2对效应细胞活化的同时降低了与瘤内treg细胞的结合，克服了il2使用过程中会导致treg扩增的不利因素，这些结果为临床使用il2提供了新思路；

78、(2)对克服免疫检查点阻断疗法耐受和t细胞过继转不响应具有重要意义。