一种促进里氏木霉产纤维素酶的发酵方法与流程

本发明属于生物质能源，具体涉及一种促进里氏木霉产纤维素酶的发酵方法。

背景技术：

1、纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系；包括：葡聚糖内切酶，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；葡聚糖外切酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶；β-葡聚糖苷酶，这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。木质纤维素是自然界中分布最广、含量最多的可再生糖类资源。作物秸秆等纤维素原料中含有大量的纤维素和半纤维素多糖类物质。这些多糖类物质性质很稳定，即使经过预处理，仍要在催化剂作用下才能水解为单糖，然后再经发酵才能制备纤维素乙醇。水解最常用的催化剂是无机酸和纤维素酶制剂。酶解利用微生物酶系将天然纤维素和半纤维素降解为可发酵的单糖，与化学水解法相比，可发酵单糖得率高、副产物少、反应条件温和、能耗低、环境友好。

2、漆酶是一种含铜的氧化还原酶，能够催化氧化大多数带有自由酚基的木质素模型化合物。漆酶通过连续的单电子氧化作用，使底物形成中间产物苯氧基团，苯氧基团进一步发生非酶催化的裂解反应，使芳基与α碳原子之间的化学键断裂。由于漆酶可以降解木质纤维素中的木质素结构，因而作为一种木质素降解酶被用于木质纤维素原料的预处理过程中。邱伟华等证实经蒸汽爆破和漆酶作用后的小麦秸秆，再用纤维素酶处理时糖化能力增强，这是因为漆酶能氧化木质素中的芳香环，从而暴露了纤维素酶的作用位点;然而，有关漆酶作用于木质纤维素的效果也有报道得出了相反的结论。一些研究发现，漆酶作用于玉米秸秆底物后产生的木质素降解物抑制了纤维素酶的活性，致使纤维素酶水解糖化玉米秸秆的能力下降。

3、目前纤维素酶的生产主要采用微生物液体发酵过程，由于纤维素酶属于诱导酶，因此，在发酵过程中需要补加诱导物。纤维素酶诱导物分可溶性诱导物，如槐糖、纤维二糖、乳糖等，但由于其价格昂贵，不适合大规模工业化生产。而利用淀粉水解液等，诱导效果也有限，而且过多的葡萄糖等还原糖对产酶有抑制作用。农业废弃物，如农作物秸秆、玉米皮、大豆皮等纤维质材料是纤维素酶天然诱导物，而且其价格便宜，因此被广泛采用。

技术实现思路

1、本案发明人在研究过程中发现在里氏木霉产纤维素酶的发酵过程中，随着发酵进行，发酵体系粘度变高，需要较高的转速来维持溶氧，而过高的转速会造成菌丝体的断裂；尽管通过分批补料和流加等方式可以一定程度上降低体系的粘度，但体系粘度上升速度仍较快，这一方面是由于使用的含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆、木屑、麸皮等诱导碳源具有不溶性引起。发明人通过进一步研究发现，造成发酵效率低的原因除了以上之外，还在于发酵过程中仅有部分纤维素和半纤维素被菌体利用，大部分无法被利用的木质素会在发酵体系中积累，一方面造成粘度上升，另一方面木质素也对发酵中后期的产酶有明显的抑制，造成后期发酵困难，使发酵周期变短。

2、本发明的技术方案是基于以上发现所做出的。以解决以上技术问题。

3、本发明提供一种促进里氏木霉产纤维素酶的发酵方法，是在里氏木霉产纤维素酶的发酵过程中流加漆酶和诱导碳源，并将发酵液进行循环过膜，未过膜成分回流发酵罐。

4、进一步的，所述漆酶以溶液加入，浓度为5-50iu/ml；进一步的，漆酶溶液中还包括磷酸二氢钾0.1-10g/l，氯化钙0.01-3g/l和硫酸镁0.01-3g/l。

5、进一步的，所述的诱导碳源为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆、木屑、麸皮等的农业副产品及其预处理产品。优选地，使用中性或稀酸蒸汽爆破的方法获得的预处理产品为诱导碳源。

6、进一步的，所述诱导碳源的流加方式为：发酵开始后24-48h，当葡萄糖浓度低于0.5g/l时开始补加诱导碳源。将诱导碳源粉碎成粉末，灭菌后每6-12h补加20-40g/l。所述漆酶溶液的流加方式与诱导碳源同时加入，流加速率为每小时1/200~1/50发酵体积。

7、进一步的，所述的将发酵液进行循环过膜，是发酵培养开始后24-48h开始使用泵进行部分发酵液循环过膜，未过膜部分回流发酵罐，发酵液循环速率为每小时1/50-1/10发酵体积。膜材料为聚醚砜、聚砜、聚丙烯等有机膜，膜孔径为3-20kd，膜面积为100-1000cm2/l发酵液。

8、进一步的，作为更具体的实施方式，里氏木霉产纤维素酶的发酵方法具体包括以下步骤：

9、（1）制备里氏木霉孢子；

10、（2）接入里氏木霉孢子，进行种子培养；

11、（3）发酵罐中装入发酵培养基，接入里氏木霉种子，进行液体深层发酵培养，培养过程中向发酵罐中补加漆酶溶液和诱导碳源，并将发酵液进行循环过膜，未过膜的部分回流发酵罐。

12、本发明步骤（1）所述孢子的制备方法为，首先配制里氏木霉产孢培养基：麦芽浸粉10-30g/l，琼脂15-20g/l；取少量孢子接种于固体培养基平板上，于26-30℃培养5-7d后，用无菌蒸馏水洗下孢子，纱布过滤。并调整孢子数为106/ml，并置于-20℃冰箱保存。

13、本发明步骤（2）所述种子的培养方法为，首先配制里氏木霉种子培养基：葡萄糖4-10g/l，玉米浆5-15g/l；取1ml孢子液（106孢子/ml）接种于种子培养基，于26-30℃、100-200rpm培养24-48h后接种于发酵培养基。

14、本发明步骤（3）所述液体深层发酵培养，发酵过程中，使用氨水控制ph不低于4.2，调节搅拌桨转速控制发酵液中粘稠程度使之搅拌均匀，初始转速为200-400rpm，通气量为0.2-2vvm，溶氧和转速进行联动控制，和当溶氧低于10-40%时，逐步提升转速至800-1000rpm。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、（1）通过在纤维素酶生物发酵过程中补加诱导碳源的过程中流加漆酶，有效减少了发酵过程中木质素的积累，促进了纤维素酶的发酵，有效降低了纤维素酶的生产成本。

17、（2）将发酵液进行循环过膜分离，将可溶性木质素连续排出，一方面降低发酵体系粘度，一方面降低木质素对发酵的抑制作用，可以有效提高纤维素酶发酵效率，节省发酵成本。

18、本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

技术特征：

1.一种促进里氏木霉产纤维素酶的发酵方法，其特征在于，是在里氏木霉产纤维素酶的发酵过程中流加漆酶和诱导碳源，并将发酵液进行循环过膜，未过膜成分回流发酵罐。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述漆酶以溶液加入，浓度为5-50iu/ml。

3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述的诱导碳源为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆、木屑、麸皮等的农业副产品及其预处理产品。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述的诱导碳源为使用中性或稀酸蒸汽爆破的方法获得的预处理产品。

5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述诱导碳源的流加方式为：发酵开始后24-48h，当葡萄糖浓度低于0.5g/l时开始补加诱导碳源。

6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，将诱导碳源粉碎成粉末，灭菌后每6-12h补加20-40g/l。

7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述漆酶溶液的流加方式与诱导碳源同时加入，流加速率为每小时1/200~1/50发酵体积。

8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述的将发酵液进行循环过膜，是发酵培养开始后24-48h开始使用泵进行部分发酵液循环过膜，未过膜部分回流发酵罐，发酵液循环速率为每小时1/50-1/10发酵体积。

9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，膜材料为聚醚砜、聚砜、聚丙烯有机膜，膜孔径为3-20kd，膜面积为100-1000cm2/l发酵液。

10.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

技术总结
本发明提供一种促进里氏木霉产纤维素酶的发酵方法，是在里氏木霉产纤维素酶的发酵过程中流加漆酶和诱导碳源，并将发酵液进行循环过膜，未过膜成分回流发酵罐。在里氏木霉产纤维素酶的发酵过程中，随着发酵进行，发酵体系粘度变高，本发明通过在纤维素酶生物发酵过程中补加诱导碳源的过程中流加漆酶，有效减少了发酵过程中木质素的积累，将发酵液进行循环过膜分离，将可溶性木质素连续排出，一方面降低发酵体系粘度，一方面降低木质素对发酵的抑制作用，可以有效提高纤维素酶发酵效率，节省发酵成本。

技术研发人员：高慧鹏,张全,关浩,王蒙
受保护的技术使用者：中国石油化工股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14