一种苏氨酸生产菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物工程，具体涉及一种苏氨酸生产菌株及其应用。

背景技术：

1、l-苏氨酸(l-threonin)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为c4h9no3，相对分子质量为119.12，为白色斜方晶系或结晶性粉末，无臭，味微甜，253℃熔化并分解，高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml，等电点5.6，不溶于乙醇、乙醚和氯仿。

2、l-苏氨酸是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。苏氨酸在饲料添加剂领域具有重要的应用且用量增长迅速。苏氨酸常被添加至未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中添加l-苏氨酸，可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长，改善肉质，改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值，降低饲料原料成本等因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹麦等)和美洲国家，苏氨酸已广泛地应用于饲料行业。

3、谷氨酸棒状杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，其催化酶分别为天冬氨酸激酶(lysc编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrb编码)以及苏氨酸合酶(thrc编码)。目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在对苏氨酸的合成代谢路径的改造，其中包括：抗反馈抑制的hom基因和lysc基因(reinscheid d j,eikmanns b j,sahm h.analysis of a corynebacteriumglutamicum hom gene coding for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase.[j].journal of bacteriology,1991,173(10):3228-3230；eikmanns b j,eggeling l,sahm h.molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis incorynebacterium glutamicum.[j].antonie van leeuwenhoek,1993,64(2):145-163.)；以及弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glya，同时过表达苏氨酸外运蛋白thre(simic p,willuhn j,sahm h,et al.identification of glya(encoding serinehydroxymethyltransferase)and its use together with the exporter thre toincrease l-threonine accumulation by corynebacterium glutamicum[j].appliedand environmental microbiology,2002,68(7):3321-3327.)等。

4、为提高苏氨酸的发酵生产效率，降低生产成本，构建能够高效生产苏氨酸的生产菌株具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是通过增强转酮酶的活性使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种苏氨酸生产菌株及其应用。

2、苏氨酸合成过程中需要消耗还原力，但是，谷氨酸棒状杆菌中的还原力合成受到严格的调控，还原力的合成和消耗的平衡是维持谷氨酸棒状杆菌的正常生长和保证代谢产物生产的关键。本发明在苏氨酸的代谢工程研究中发现，与其它还原力合成相关基因的改造相比，强化菌株的转酮酶，能够更有效地提升苏氨酸合成过程中的还原力供应，显著提高菌株的苏氨酸合成能力。

3、为实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其转酮酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。

4、优选地，转酮酶在ncbi上的参考序列编号为np_600788.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。

5、以上所述的活性增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：

6、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

7、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

8、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

9、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

10、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

11、6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。

12、可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来增强转酮酶的活性。

13、优选地，通过以下方式增强转酮酶的活性：采用psod启动子启动染色体上原始的转酮酶编码基因的转录，同时，在染色体上增加一个拷贝的由psod启动子启动转录的转酮酶编码基因。

14、进一步地，所述微生物相比于未修饰的微生物，其6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶的活性增强和/或解除反馈抑制。

15、优选地，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶在ncbi上的参考序列编号分别为np_600669.1、fob93_04945，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。

16、进一步地，所述微生物相比于未修饰的微生物，其体内与苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强和/或解除反馈抑制；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶中的至少一种。

17、优选地，天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶在ncbi上的参考序列编号分别为wp_003855724.1、wp_003855724.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。

18、优选地，所述微生物为如下①～④中的任一种：

19、①转酮酶活性增强且天冬氨酸激酶和/或高丝氨酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；

20、②转酮酶活性增强且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；

21、③转酮酶活性增强且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；

22、④转酮酶活性增强且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物。

23、上述酶的活性增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：

24、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

25、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

26、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

27、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

28、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

29、6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。

30、优选地，所述酶活性的增强通过采用较基因的原始启动子活性更强的强启动子启动基因的转录实现，和/或，通过将基因的起始密码子突变为atg实现。

31、所述强启动子优选为启动子pcspb、psod或ptuf。其中，启动子psod、pcspb、ptuf的核苷酸序列分别如seq id no.1、2、3所示。

32、优选地，天冬氨酸激酶的活性增强通过在其起始密码子前插入启动子psod，并将其起始密码子由gtg突变为atg实现。

33、高丝氨酸脱氢酶的活性增强通过将其原始启动子替换为启动子pcspb实现。

34、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的活性增强通过在其起始密码子前插入启动子psod实现。

35、nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶优选为变异链球菌来源的nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶，其表达优选以ptuf作为启动子。

36、上述天冬氨酸激酶的解除反馈抑制通过将天冬氨酸激酶突变，使其发生t311i突变实现；高丝氨酸脱氢酶的解除反馈抑制通过将高丝氨酸脱氢酶突变，使其发生g378e突变实现。

37、优选地，本发明所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。

38、第二方面，本发明提供产苏氨酸菌株的构建方法，所述方法包括：

39、a、强化具有氨基酸生产能力的棒状杆菌中编码转酮酶的基因的表达，获得基因强化菌株；和/或

40、b、增强6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶的活性和/或将其解除反馈抑制；和/或

41、c、增强与苏氨酸合成途径相关的酶的活性和/或将其解除反馈抑制，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶中的至少一种；

42、所述活性增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

43、1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

44、2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；

45、3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；

46、4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；

47、5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；

48、6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。

49、第三方面，本发明提供一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：

50、a)培养所述微生物，以获得所述微生物的培养物；

51、b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。

52、第四方面，本发明提供本发明提供转酮酶的活性增强在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。

53、进一步地，通过强化具有氨基酸生产能力的棒状杆菌(corynebacterium)中的转酮酶的表达来提高苏氨酸的发酵产量。

54、优选地，本发明所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括atcc13032、atcc13870、atcc13869、atcc21799、atcc21831、atcc14067、atcc13287等(参见ncbi corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。

55、第五方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或按照上述方法构建得到的产苏氨酸菌株在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。

56、上述有关菌株的改造方法包括基因的强化和弱化等均为本领域技术人员可知的改造方式，参见满在伟.高产l-精氨酸钝齿棒杆菌的系统途径工程改造[d].江南大学,2016；崔毅.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产l-亮氨酸[d].天津科技大学.；徐国栋.l-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化.天津科技大学,2015.

57、本发明的有益效果在于：本发明通过对磷酸戊糖途径的转酮酶的强化表达，显著提高了苏氨酸合成过程中的还原力供应，进而提高了菌株的苏氨酸合成能力，苏氨酸产量较未经改造的菌株显著提高；结合6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、nadp依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶以及苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强，苏氨酸的产量进一步提升。上述改造可应用于苏氨酸的发酵生产中，具有较好的应用价值。