一种开发肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台
技术领域
1.本发明涉及一种开发肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台，具体涉及一类通用型肿瘤新生抗原决定簇的提出、能编码和表达通用型肿瘤新生抗原多肽的环形rna制备及验证和应用。
背景技术：2.恶性肿瘤是全世界范围内引起人类死亡的主要因素之一。每年死于癌症的人数高达约1000万人。由于缺乏高效、特异性强的药物，目前人类对治愈威胁生命健康最大的占恶性肿瘤90%以上的实体瘤仍然束手无策。这一现形不仅表明了抗肿瘤药物研发的不易，而且也表明了抗肿瘤药物的研发还需要新理念、新技术和新方法。
3.近年来，人们把治愈癌症的希望寄托在了免疫治疗领域。肿瘤的免疫治疗是指通过抗体治疗、细胞治疗、疫苗治疗以及免疫检查点抑制剂（抗pd-1/pd-l1抗体）治疗等手段激活癌症患者自身的免疫系统来清除癌细胞，从而达到治愈的目的。免疫治疗与靶向治疗癌症的区别在于治疗癌症的机制。基于肿瘤外在机制治疗的免疫治疗不受肿瘤基因异质性所限，从而可以对不同癌症类型的患者进行治疗。免疫治疗的目的在于激活癌症患者体内肿瘤特异性cd8+细胞毒性t淋巴细胞（ctl）面对癌细胞的免疫应答，其途径有基于抗体的“检查点”抑制、过继t细胞治疗和治疗性疫苗接种等。临床实践需求的不断扩增促进了抗肿瘤免疫类药物研发的突破。这些突破为通过免疫途径治愈癌症奠定了基础，同时也使免疫治疗成为继手术、化疗和放疗之后的第四条癌症治疗有效途径。但是，免疫疗法目前只在一小部分癌症患者当中获得成功，究其原因是缺少能够进行预测免疫治疗疗效的广泛生物标志物。此外，癌症的免疫治疗一般受限于三个瓶颈：（i）肿瘤细胞是“非自我”的识别，（ii）外周免疫耐受，以及（iii）肿瘤微环境（tme）中的免疫抑制。到目前为止，各种免疫治疗联合其它治疗手段的临床试验结果不太乐观。因为不同治疗手段的配合治疗缺乏协同作用，同时可能诱发不可接受的毒性反应。
4.众所周知，肿瘤的发生源于患者体内基因的突变。肿瘤细胞突变会产生表位特异性抗原，其也称为肿瘤新生抗原。这些抗原只在肿瘤细胞上表达，不会引起机体的免疫耐受。已有研究表明，一些癌症患者通过以肿瘤新生抗原为靶标的疫苗免疫治疗已经获得了不错的临床治疗效果。由此可见，通过辨寻肿瘤特异性“新生抗原”，发现免疫治疗生物标记物和免疫治疗新靶点的发现，是目前提高肿瘤免疫治疗效果的有效途径之一，也是大规模实现个体化免疫治疗的前提条件之一。
5.2020 年，在新冠疫情爆发的背景下，mrna 技术在历经多年发展后得到快速突破。由于mrna疫苗具有远远高于其它传统疫苗的新冠肺炎免疫保护率，使mrna技术开始从实验室研究全面走向临床研究。此外，mrna疫苗自身具有很多常规疫苗所没有的独特优势。譬如：1）可以通过优化mrna序列来改善疫苗开发效率，且疫苗修饰方法，生产及纯化过程标准化相对其他疫苗来说比较容易，投入成本相对较低且可在相对较短时间内上市；2）mrna的自我佐剂特性可以让肿瘤坏死因子-α（tnf-α），干扰素-α（ifn-α）和免疫细胞分泌的其他细
胞因子诱发患者机体强而持久的适应性免疫反应；与此同时，mrna的体内表达不会受到蛋白质和病毒的污染，通过优化mrna序列和递送系统，就可以进行mrna的表达活性和体内半衰期调节；3）由于mrna疫苗在进入细胞核前表达靶蛋白，且mrna不仅化学组成不同于dna，而且没有cpg岛，所以mrna被整合入宿主dna基因组的可能性和诱发免疫排斥反应的可能性都低；4）mrna活性具有瞬时性特点，且可通过生理代谢途径完全降解，对宿主体内稳态的负担为零。正是基于以上mrna疫苗的这些自身独特优势和其在新冠病毒抗疫方面的卓越表现，引发了人们对其在疾病预防和癌症治疗等领域研究的高度关注。
6.虽然目前全球包括biontech、 moderna和curevac等mrna三巨头和中国斯微生物在内累计有超数十种mrna肿瘤疫苗研究管线，但大多数管线处于临床早期试验阶段。与此同时，由于抗原选择不佳及抑制性肿瘤微环境等因素，这些癌症mrna疫苗并未取得明显的令人满意的临床治疗效果，尤其在晚期疾病或治疗难治性肿瘤患者中的成功率仍然非常有限。这与疫苗抗原与机体内成熟ｔ细胞抗原识别受体结合的亲和力低，难以诱发有效的ｔ细胞应答有关。此外，由于体内rna酶很快降解mrna疫苗，对mrna疫苗的效果影响较大。目前发现具有封闭环形结构的环形mrna具有较好的rna酶水解耐受性，其相对线性mrna具有更长的半衰期。
7.因此，非常有必要建立开发新型肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台，从而进一步推动免疫疗法在肿瘤治疗中的应用。
技术实现要素：8.发明要解决的问题本发明的目的在于提供一种开发肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台。该环形rna技术平台通过通用型肿瘤新生抗原决定簇辨寻、能编码肿瘤免疫原性多肽的环形rna制备及验证来开发能有效预防和治疗肿瘤的新型免疫药物。
9.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一类通用型肿瘤新生抗原，其包括下列多肽中的任一种或多种的组合：具有seq id 1所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 2所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 3所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 4所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 5所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 6所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 7所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 8所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 9所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 10所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 11所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 12所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 14所示的序列或其保守变异型序列的多肽；
具有seq id 15所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 16所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 17所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 18所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 19所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 20所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 21所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 22所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 23所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 24所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 25所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 26所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 27所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 28所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 29所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 30所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 31所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 32所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 33所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 34所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 35所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 36所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 37所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 38所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 39所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 40所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 41所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 42所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 43所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 44所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 45所示的序列或其保守变异型序列的多肽；具有seq id 46所示的序列或其保守变异型序列的多肽；进一步的，所述保守变异型序列为原始序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入而得，其具有至少80％，81%，82％，83%，84％，85％，86%，87％，88％，89%，90％，91%，92％，93％，94%，95％，96％，97%，98％或99％的原始序列同一性的序列。
10.本发明实施例还提供了一类重组核酸分子，所述重组核酸分子能够表达本发明前述实施例所述的seq id 1
‑ꢀ
seq id 46序列或其保守变异型序列的通用型肿瘤新生抗原多肽。
11.进一步的，所述的重组核酸分子，其所表达的肿瘤新生抗原多肽表达水平为肿瘤
新生抗原多肽在真核细胞中的表达水平。
12.进一步的，所述的重组核酸分子，其含有ires元件；优选地，所述的重组核酸分子所含的ires元件具有seq id 47和 seq id 48所示的任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列；优选地，所述的重组核酸分子所含的ires元件具有seq id 47和 seq id 48任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；优选地，所述的重组核酸分子所含的ires元件具有在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与seq id 47和 seq id 48所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；优选地，所述的重组核酸分子所含的ires元件具有本发明前述实施例所示的核苷酸序列具有至少80％，81%，82％，83%，84％，85％，86%，87％，88％，89%，90％，91%，92％，93％，94%，95％，96％，97%，98％或99％的序列同一性的序列。
13.进一步的，所述的重组核酸分子，其含有可以指导所述重组核酸分子进行转录的调控序列。
14.本发明实施例还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含有本发明前述实施例所述的重组核酸分子。
15.本发明实施例还提供了一种线性rna，所述线性rna包含本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述线性rna由本发明前述实施例所述的重组表达载体转录形成。
16.本发明实施例还提供了一种环形rna，所述环形rna包含本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述环形rna，由本发明前述实施例所述的重组表达载体转录后环化形成；进一步的，所述环形rna，由本发明前述实施例所述的线性rna环化形成。
17.本发明实施例还提供了一种重组宿主细胞，其包含有本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述重组宿主细胞，包含有本发明前述实施例所述的线性rna；进一步的，所述重组宿主细胞，包含有本发明前述实施例所述的环形rna。
18.本发明实施例还提供了一种在制备蛋白中应用的对象，其包含有本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述在制备蛋白中应用的对象，其包含有本发明前述实施例所述的重组表达载体；进一步的，所述在制备蛋白中应用的对象，其包含有本发明前述实施例所述的线性rna；进一步的，所述在制备蛋白中应用的对象，其包含有本发明前述实施例所述的环形rna；进一步的，所述在制备蛋白中应用的对象，其包含有本发明前述实施例所述的重组宿主细胞。
19.本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的肿瘤
新生抗原多肽；进一步的，所述的药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述的药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的重组表达载体；进一步的，所述的药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的线性rna；进一步的，所述的药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的环形rna；进一步的，所述的药物组合物，其包含有本发明前述实施例所述的重组宿主细胞。
20.本发明实施例还提供了一种制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的肿瘤新生抗原多肽表达目标蛋白的过程；进一步的，所述的制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的重组核酸分子表达目标蛋白的过程；进一步的，所述的制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的重组表达载体表达目标蛋白的过程；进一步的，所述的制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的线性rna表达目标蛋白的过程；进一步的，所述的制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的环形rna表达目标蛋白的过程；进一步的，所述的制备蛋白的方法，其包含有本发明前述实施例所述的重组宿主细胞表达目标蛋白的过程。
21.本发明实施例还提供了一种预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的肿瘤新生抗原多肽；进一步的，所述预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的重组核酸分子；进一步的，所述预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的重组表达载体；进一步的，所述预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的线性rna；进一步的，所述预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的环形rna，进一步的，所述预防或治疗肺癌的方法，其包括向受试者施用本发明前述实施例所述的重组宿主细胞。
22.本发明的积极效果如下：本发明提供了一种开发肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台。所述环形rna技术平台具有通用型肿瘤新生抗原决定簇辨寻，肿瘤新生抗原多肽制备，肿瘤新生抗原多肽t细胞激活验证，能表达通用型肿瘤新生抗原的环形mrna制备及其在293t细胞中蛋白表达的验证功能，能有效地提供肿瘤免疫类药物，有助于恶性肿瘤的预防和治疗，为病患和社会带来肿瘤的免疫治疗收益。
附图说明
23.图1为环形rna技术平台用于肿瘤免疫类药物开发的流程示意图。
具体实施方式
24.鉴于现有技术中的不足，本案发明人在长期研究和大量实践的基础上，得以提出本发明的技术方案。
25.如在权利要求和说明书中所使用的，词语“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
26.如在权利要求和说明书中所使用的，术语“多肽”在本发明中为氨基酸聚合物。所述氨基酸聚合物可以是线形或分支的。进一步地，所述氨基酸聚合物包括修饰的氨基酸或由非氨基酸隔断的形式。更进一步地，所述氨基酸聚合物包括二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或以标记组分缀合的氨基酸聚合物。
27.如本发明所使用的，术语“环形rna”是指一种呈封闭状的环形rna分子。所述环形rna分子主要由外显子、ires元件、蛋白编码区和间隔区构成。由于本发明所使用的环形rna具有蛋白翻译活性，所述环形rna又可称为“环形mrna”。
28.如本发明所使用的，术语“线性rna”是指能够环化形成环状rna的rna前体。所述线性rna一般由线形的dna分子转录形成。由于本发明所使用的线性rna具有蛋白翻译活性，所述线性rna又可称为“线性mrna”。
29.如本发明所使用的，术语“取代、缺失或插入一个或多个氨基酸”中“取代”是指用不同氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸，“缺失”是指去除占据某一位置的氨基酸，“插入”是指在邻接并且紧随占据位置的氨基酸之后添加氨基酸。
30.如本发明所使用的，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。所述保守突变包括保守置换。所述保守置换是指在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在 phe、trp、tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在leu、ile、val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在gln、asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在lys、arg、his间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在asp、glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在ser、thr间相互置换的突变；其他被视作保守置换的置换，ala向ser或thr的置换、arg向gln、his或lys的置换、asn向glu、gln、lys、his或asp的置换、asp向asn、glu或gln的置换、cys向ser或ala的置换、gln向asn、glu、lys、his、asp或arg的置换、glu向gly、asn、gln、lys或asp的置换、gly向 pro的置换、his向asn、lys、gln、arg或tyr的置换、ile向leu、met、val或phe的置换、leu向 ile、met、val或phe的置换、lys向asn、glu、gln、his或arg的置换、met向ile、leu、val或phe 的置换、phe向trp、tyr、met、ile或leu的置换、ser向thr或ala的置换、thr向ser或ala的置换、trp向phe或tyr的置换、tyr向his、phe或trp的置换、及val向met、ile或leu的置换。进一步地，所述保守突变涵盖因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
31.如本发明所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。
32.如本发明所使用的，术语“反向互补序列”是指和原始多核苷酸序列方向相反但互补的序列。
33.如本发明所使用的，术语“多核苷酸”是指能够通过标准分子生物学方法识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列，从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的。作为由核苷酸组成的聚合物，多核苷酸的形式可以是单独片段，也可以是更大的核
苷酸序列结构的一个组成部分。多核苷酸包括dna、rna、cdna序列、表达载体、多顺反子序列重组多核苷酸和重组核酸分子。
34.如本发明所使用的，术语“重组核酸分子”是指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。所述重组多核苷酸可以通过合适的载体转化为合适的重组宿主细胞，表达产生重组多肽、重组蛋白、融合蛋白等。重组核酸分子包含编码目标多肽的编码区，和连接于所述编码区上游的ires元件。
35.如本发明所使用的，术语“载体”是指dna构建体。所述dna构建体含有合适的控制序列。所述控制序列可操作地连接dna序列，实现在合适的宿主中表达目的基因。
36.如在本发明所使用的，术语“重组表达载体”是指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的dna结构。所述重组表达载体包括启动子和增强子等对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合、能转录成mrna并翻译成蛋白质的结构或编码序列、能适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。所述重组表达载体可以以任何合适的方式构建。在本发明中，重组表达载体的载体可以包括质粒、病毒、噬菌体和转座子在内的任何载体。
37.如在本发明所使用的，术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。所述免疫应答是指可能涉及抗体产生和或特异性免疫细胞的活化。所述抗原包括基本上所有的蛋白质或肽在内的任何大分子。
38.如在本发明所使用的，术语“宿主细胞”是指易于用包含本发明的重组核酸分子、环状rna或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。
39.如在本发明所使用的，术语“重组宿主细胞”是指通过转化来实现的宿主细胞，包括导入重组核酸分子、环形rna或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞。所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，或能够导入本公开的重组核酸分子、环形rna或重组表达载体的细胞。
40.如在本发明所使用的，术语“转化、转染、转导”是指将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法。所述方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(capo4 )沉淀法、氯化钙(cacl2 )沉淀法、微注射。法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。
41.如在本发明所使用的，术语“治疗”是指在罹患疾病之后，使受试者在接触本发明的菌株和/或巨噬细胞或者含有其的药物组合物后，相比受试者不接触时，使受试者的该疾病症状减轻，但并不意味着必需完全抑制受试者该疾病的症状。
42.如本发明所使用的，“本发明的药物组合物”是指含有本发明的菌株和/或巨噬细胞的药物组合物。
43.如在本发明所使用的，术语“预防”是指在罹患疾病之前，通过使受试者接触本发明的药物组合物，从而与受试者不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制受试者患病。
44.如在本发明所使用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。所述哺乳动物包括但不限于，家养动物，灵长类动物，兔，以及啮齿类动物。
45.如在本发明所使用的，术语“高严格条件”是指根据标准dna印迹程序，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，在42℃处在5x sspe、0.3％sds、200微克/毫升剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2xssc、0.2％sds将
载体材料洗涤三次，每次15分钟。
46.如在本发明所使用的，术语“非常高严格条件”是指根据标准dna印迹程序，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，在42℃处在5xsspe、0.3％sds、200微克/毫升剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
47.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
48.下面的实施例是对本发明的技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
49.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
50.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
51.本发明提供了一种开发肿瘤免疫类药物的环形rna技术平台。利用该环形rna技术平台可以有效地研发和制备肿瘤免疫类药物。实施例1所述的抗原多肽是通过本发明所提供的环形rna技术平台的计算机辅助辨寻获得。同时，通过本发明所提供的环形rna技术平台的制备方法合成得到与实施例1特征多肽系列等价的多肽序列和能表达实施例1所述抗原多肽蛋白的环形rna，并进行合成物质的鉴定、t细胞激活和293t细胞中的通用型肿瘤新生抗原蛋白表达性能验证。本发明所提供的这些肿瘤新生抗原多肽其可视为环形rna技术平台开发肿瘤免疫类药物的抗原决定簇。
[0052] 实施例1通用型肿瘤新生抗原决定簇的辨寻第一步，获取符合医学伦理要求的通过illumina高通量测序平台所获得不同肿瘤患者的二代基因测序数据；第二步，对不同肿瘤的原始测序数据通过软件进行质量控制，去除接头，过滤低质量数据。得到质控过滤后的干净数据；第三步，将质控之后不同肿瘤的reads使用相关软件比对到人类参考基因组hg19上，生成bam格式的比对文件；第四步，将获得不同肿瘤的bam格式的比对文件进行进一步处理，去除重复数据、局部重新比对和碱基质量校正分析，得到过滤之后的bam文件第五步，综合分析不同肿瘤患者的遗传系突变和体细胞突变，得到包含多个突变的vcf文件；第六步，使用vep对检测得到的突变进行多种数据库的注释，其中包括基因注释；第七步，根据所获得的遗传系突变和体细胞突变信息，进行突变位点表位肽提取，并且相对应的提取正常野生型基因型的表位肽序列。表位肽提取使用滑窗模式，氨基酸长度为8-11，在突变位点上下游位置进行逐步滑窗提取包含突变氨基酸的表位肽序列，滑窗的步移长度为1；第八步，对不同肿瘤的肿瘤患者的基因突变进行mhci和mhcii分子类型鉴定；第九步，对所获得的表位肽序列和hla类型，使用软件对突变表位肽亲和力进行预测；第十步，利用打分函数计算预测的不同肿瘤新生抗原总得分值，对高亲和力突变表位肽进行排序，得分值大小和新生抗原可信度成呈正相关关系；
54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，217rpm活化2.9小时后，取活化菌液在37.1摄氏度，222rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（283.7纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（224.1纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37.1摄氏度孵育2小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化15分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（388.2纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在54.5摄氏度加热15分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（247.9纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热20分钟，随后在85摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为40次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列，说明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2.5天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到90％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为37.6纳克每毫升，48.2纳克每毫升，70.1纳克每毫升，53.4纳克每毫升，
32.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid1所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为11.2纳克每毫升，18.4纳克每毫升，24.1纳克每毫升，16.5纳克每毫升，9.3纳克每毫升）具有更出色的seqid1所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0056]
实施例5环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证 第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid3所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37摄氏度，220rpm活化3小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，221rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（273.1纳克每微升）； 第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（255.5纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育3小时，然后加入dnasei在37.1摄氏度消化25分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（358.2纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.5摄氏度加热20分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（279.7纳克每微升）； 第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37.1摄氏度加热20分钟，随后在85摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存； 第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为40次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列，
说明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2.5天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到90％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为35.2纳克每毫升，42.3纳克每毫升，66.4纳克每毫升，50.4纳克每毫升，25.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid3所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为7.8纳克每毫升，11.1纳克每毫升，18.7纳克每毫升，9.5纳克每毫升，4.3纳克每毫升）具有更出色的seqid3所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0057] 实施例6环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid5所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37.1摄氏度，218rpm活化3.2小时后，取活化菌液在37摄氏度，219rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（363.8纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37.1摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（282.1纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化21分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（477.8纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55.5摄氏度加热17分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（297.4纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液
在37摄氏度加热17分钟，随后在85摄氏度加热8秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为32次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔3天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到80％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500ng/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为125.7纳克每毫升，222.6纳克每毫升，360.9纳克每毫升，251.2纳克每毫升，107.9纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid5所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为17.2纳克每毫升，31.3纳克每毫升，48.4纳克每毫升，29.5纳克每毫升，12.7纳克每毫升）具有更出色的seqid5所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0058] 实施例7环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid7所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37.1摄氏度，222rpm活化3.7小时后，取活化菌液在37摄氏度，221rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（248.3纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（258.7纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育3小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化20分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（501.2纳克每微升）；
第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55摄氏度加热18分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（250.9纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rt prmier, 1微升 primerscript rt enzye mix i和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37.1摄氏度加热17分钟，随后在85摄氏度加热8秒，最后在4摄氏度保存； 第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为35次）； 4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示，产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。其说明：环形 rna已成功制备；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2.5天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到80％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为55.7纳克每毫升，72.4纳克每毫升，60.1纳克每毫升，53.5纳克每毫升，37.9纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seq id 7所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为10.1纳克每毫升，19.8纳克每毫升，13.5纳克每毫升，8.6纳克每毫升，3.2纳克每毫升）具有更出色的seq id 7所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0059] 实施例8 环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seq id 49），5
´
同源臂（seq id 50），3
´
内含子（seq id 51），第二外显子（seq id 52），5
´
间隔区（seq id 53），具有seq id 47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seq id 9所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seq id 54），第一外显子（seq id 55），5
´
内含子（seq id 56），3
´
同源臂（seq id 57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seq id 58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，219rpm活化3.3小时后，取活化菌液在37.1摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（344.1纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）, 50微升10
×
cutsmart buffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（252.7纳克
每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.5小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化20分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（451.8纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55摄氏度加热18分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（268.4纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37.1摄氏度加热18分钟，随后在85摄氏度加热8秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为37次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到70％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为69.6纳克每毫升，87.7纳克每毫升，78.3纳克每毫升，56.4纳克每毫升，35.5纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid9所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为13.9纳克每毫升，25.8纳克每毫升，18.2纳克每毫升，10.3纳克每毫升，6.4纳克每毫升）具有更出色的seqid9所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0060]
实施例9环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证 第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid11所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接
到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，219rpm活化3.2小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，219rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（490.3纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（287.7纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育3小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化22分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（533.9纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55摄氏度加热18分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（270.5纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热18分钟，随后在85摄氏度加热8秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为35次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明说明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔3天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到70％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为39.7纳克每毫升，48.4纳克每毫升，72.5纳克每毫升，44.1纳克每毫升，26.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid11所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得
蛋白的量分别为6.7纳克每毫升，8.9纳克每毫升，15.7纳克每毫升，7.3纳克每毫升，5.2纳克每毫升）具有更出色的seqid11所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0061] 实施例10环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid12所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，219rpm活化3.4小时后，取活化菌液在37摄氏度，218rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（303.5纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（287.8纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2小时，然后加入dnasei在37.1摄氏度消化23分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（569.6纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55.5摄氏度加热20分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（284.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热19分钟，随后在85摄氏度加热9秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为39次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37
摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养；待细胞达到90％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为99.5纳克每毫升，148.6纳克每毫升，279.1纳克每毫升，144.9纳克每毫升，96.6纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid12所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为24.3纳克每毫升，36.1纳克每毫升，45.2纳克每毫升，25.4纳克每毫升，15.6纳克每毫升）具有更出色的seqid12所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0062] 实施例11环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid14所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37.1摄氏度，219rpm活化3.2小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，219rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（334.2纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（274.5纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37摄氏度孵育2.1小时，然后加入dnasei在37.1摄氏度消化21分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（523.9纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56摄氏度加热20分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（271.1纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液
在37摄氏度加热19分钟，随后在85摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存； 第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为40次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到88％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为40.9纳克每毫升，53.4纳克每毫升，77.7纳克每毫升，54.1纳克每毫升，32.5纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid14所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为6.6纳克每毫升，10.5纳克每毫升，15.3纳克每毫升，8.7纳克每毫升，5.2纳克每毫升）具有更出色的seqid14所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0063] 实施例12环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证 第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid16所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，220rpm活化3.3小时后，取活化菌液在37摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（295.3纳克每微升）； 第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（272.1纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.1小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化22分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（364.2纳克每微升）；
第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.3摄氏度加热21分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（277.6纳克每微升）； 第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rt prmier, 1微升 primerscript rt enzye mix i和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热20.5分钟，随后在85摄氏度加热12秒，最后在4摄氏度保存； 第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为36次）； 4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形 rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养；待细胞达到83％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为37.9纳克每毫升，48.4纳克每毫升，72.6纳克每毫升，52.1纳克每毫升，30.4纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seq id 16所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为5.2纳克每毫升，9.3纳克每毫升，16.4纳克每毫升， 7.6纳克每毫升，4.1纳克每毫升）具有更出色的seq id 16所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0064] 实施例13 环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seq id 49），5
´
同源臂（seq id 50），3
´
内含子（seq id 51），第二外显子（seq id 52），5
´
间隔区（seq id 53），具有seq id 48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seq id 18所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seq id 54），第一外显子（seq id 55），5
´
内含子（seq id 56），3
´
同源臂（seq id 57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seq id 58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，220rpm活化3.3小时后，取活化菌液在37摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（268.1纳克每微升）； 第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）, 50微升10
×
cutsmart buffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（221.4纳克每微升）；
第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.1小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化22分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（318.5纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.3摄氏度加热21分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（206.9纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热20.5分钟，随后在85摄氏度加热12秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为36次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到83％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为32.5纳克每毫升，43.7纳克每毫升，55.8纳克每毫升，42.4纳克每毫升，26.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid18所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为5.9纳克每毫升，8.7纳克每毫升，14.9纳克每毫升，7.8纳克每毫升，4.6纳克每毫升）具有更出色的seqid18所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0065] 实施例14环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5’同源臂（seqid50），3’内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5’间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid20所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3’间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5’内含子（seqid56），3’同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；
第二步，将合成的穿刺菌在37.1摄氏度，220rpm活化3.3小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，218rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（303.7纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（296纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37.1摄氏度孵育2.2小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化24分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（553.1纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.1摄氏度加热23分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（270.8纳克每微升）； 第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37.1摄氏度加热20.2分钟，随后在84摄氏度加热9秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为38次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到87％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为71纳克每毫升，90.2纳克每毫升，82.7纳克每毫升，62.9纳克每毫升，30.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid20所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为9.1纳克每毫升，18.5纳克每毫升，25.7纳克每毫升，13.2纳克每毫升，7.3
纳克每毫升）具有更出色的seqid20所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0066] 实施例15环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid22所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，220rpm活化3.1小时后，取活化菌液在37摄氏度，219rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（286.7纳克每微升）； 第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（257.3纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37.1摄氏度孵育2.2小时，然后加入dnasei在37.1摄氏度消化24分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（316.6纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55.9摄氏度加热21分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（269.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热20分钟，随后在84摄氏度加热9秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为37次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t
细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到83％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为21.9纳克每毫升，37.4纳克每毫升，52.5纳克每毫升，31.3纳克每毫升，23.6纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid22所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为4.3纳克每毫升，7.7纳克每毫升，11.5纳克每毫升，8.4纳克每毫升，4.5纳克每毫升）具有更出色的seqid22所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0067] 实施例16环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid25所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37摄氏度，218rpm活化3小时后，取活化菌液在37摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（381.1纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（287.8纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37.1摄氏度孵育2.2小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化21分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（311.4纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56摄氏度加热21分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（272.5纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热20分钟，随后在85摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核
酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为39次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到86％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为32.5纳克每毫升，44.6纳克每毫升，62.4纳克每毫升，50.1纳克每毫升，25.8纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid25所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为5.7纳克每毫升，8.4纳克每毫升，14.6纳克每毫升，9.5纳克每毫升，4纳克每毫升）具有更出色的seqid25所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0068] 实施例17环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid28所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.8摄氏度，220rpm活化3.1小时后，取活化菌液在37摄氏度，222rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（311.4纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（263.6纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37摄氏度孵育2.5小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化25分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（538.9纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.2摄氏度加热20分钟。将所获得的混
合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（273.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rt prmier, 1微升 primerscript rt enzye mix i和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热20 分钟，随后在85摄氏度加热9秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为37次）； 4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形 rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到86％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为47.1纳克每毫升，65.8纳克每毫升，84.8纳克每毫升，52.4纳克每毫升，34.2纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seq id 28所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为7.6纳克每毫升，12.8纳克每毫升，19.3纳克每毫升，10.7纳克每毫升，5.4纳克每毫升）具有更出色的seq id 28所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0069] 实施例18 环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seq id 49），5’同源臂（seq id 50），3’内含子（seq id 51），第二外显子（seq id 52），5’间隔区（seq id 53），具有seq id 48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seq id 31所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3’间隔区（seq id 54），第一外显子（seq id 55），5’内含子（seq id 56），3’同源臂（seq id 57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seq id 58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，223rpm活化3.4小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（283.7纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）, 50微升10
×
cutsmart buffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37.1摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（253.1纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reaction buffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为
20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37.1摄氏度孵育2.0小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化23分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（503.4纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56.5摄氏度加热24分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（275.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热21分钟，随后在85摄氏度加热11秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为38次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到88％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为47.1纳克每毫升，65.8纳克每毫升，84.8纳克每毫升，52.4纳克每毫升，34.2纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid31所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为10.4纳克每毫升，15.6纳克每毫升，20.1纳克每毫升，13.2纳克每毫升，6.1纳克每毫升）具有更出色的seqid31所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0070] 实施例19环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid34所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37摄氏度，220rpm活化3.2小时后，取活化菌液在37摄氏度，223rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（371.4纳克每微升）；
第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（287.3纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.4小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化25分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（312.1纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56摄氏度加热25分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（252.8纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热21分钟，随后在84.9摄氏度加热13秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为35次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到88％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为52.7纳克每毫升，79.6纳克每毫升，94.1纳克每毫升，80.8纳克每毫升，44.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid34所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为12.8纳克每毫升，17.9纳克每毫升，25.5纳克每毫升，15.3纳克每毫升，8.7纳克每毫升）具有更出色的seqid34所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0071] 实施例20环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid
51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid37所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，222rpm活化3.4小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，221rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（344.7纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（284.2纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37摄氏度孵育2.4小时，然后加入dnasei在37.1摄氏度消化22分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（495.3纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55.9摄氏度加热22分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（264.8纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37.1摄氏度加热25分钟，随后在85摄氏度加热11秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为39次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37.1摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到88％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；
第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为61.2纳克每毫升，83.4纳克每毫升，100.1纳克每毫升，70.9纳克每毫升，50.3纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid37所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为13.3纳克每毫升，20.1纳克每毫升，27.9纳克每毫升，16.2纳克每毫升，9.8纳克每毫升）具有更出色的seqid37所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0072] 实施例21环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5’同源臂（seqid50），3’内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5’间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid40所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3’间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5’内含子（seqid56），3’同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37.1摄氏度，220rpm活化3.1小时后，取活化菌液在37.1摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（267.8纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（207.2纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.1小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化20分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（317.3纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56摄氏度加热25分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（224.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热23分钟，随后在85.1摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，
60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为40次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37.1摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到85％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为37.1纳克每毫升，45.3纳克每毫升，70.2纳克每毫升，50.8纳克每毫升，28.9纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid40所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为6.7纳克每毫升，10.2纳克每毫升，23.4纳克每毫升，12.3纳克每毫升，4.4纳克每毫升）具有更出色的seqid40所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0073] 实施例22环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5’同源臂（seqid50），3’内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5’间隔区（seqid53），具有seqid47所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid43所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3’间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5’内含子（seqid56），3’同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在37摄氏度，222rpm活化3.5小时后，取活化菌液在36.9摄氏度，220rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（268.8纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在36.9摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（221.2纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在37摄氏度孵育2.4小时，然后加入dnasei在36.9摄氏度消化24分钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（378.3纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在56摄氏度加热22分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖
凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（286.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rtprmier,1微升primerscriptrtenzyemixi和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在36.9摄氏度加热22分钟，随后在85摄氏度加热12秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为38次）；4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于36.9摄氏度，5％co2培养箱中培养。待细胞达到80％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500ng/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为26.7纳克每毫升，35.8纳克每毫升，50.1纳克每毫升，40.4纳克每毫升，23.2纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seqid43所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为5.5纳克每毫升，9.1纳克每毫升，13.2纳克每毫升，10.0纳克每毫升，6.5纳克每毫升）具有更出色的seqid43所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0074] 实施例23环形mrna的制备及在293t细胞的蛋白表达验证第一步，构建含有启动子（seqid49），5
´
同源臂（seqid50），3
´
内含子（seqid51），第二外显子（seqid52），5
´
间隔区（seqid53），具有seqid48所示核苷酸序列的ires元件，实施例1中具有seqid46所示氨基酸序列的抗原多肽编码区，3
´
间隔区（seqid54），第一外显子（seqid55），5
´
内含子（seqid56），3
´
同源臂（seqid57），以及可用于质粒线性化的酶切位点xbai（seqid58）的表达抗原多肽目的基因，将所得基因片段连接到puc57载体；第二步，将合成的穿刺菌在36.9摄氏度，220rpm活化3小时后，取活化菌液在37摄氏度，222rpm培养过夜。然后，抽提质粒，测定od值和质粒提取浓度（348.7纳克每微升）；第三步，将10微克质粒，5微升酶（1000units）,50微升10
×
cutsmartbuffer和若干体积无酶水混合合成的总体积为500微升的混合液在37摄氏度酶切过夜，然后回收酶切产物，进一步进行od值检测并同时用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。将达到纯化要求的线性质粒模板用于下一步的体外转录；测定质粒酶切线性化后dna浓度（278.2纳克每微升）；第四步，将1微克质粒模板，2微升10
×
reactionbuffer，2微升浓度为20毫摩尔每升的atp，2微升浓度为20毫摩尔每升的ctp，2微升浓度为20毫摩尔每升的utp，2微升浓度为20毫摩尔每升的gtp，2微升t7rnapolymerasemix,及若干体积无核酸酶水构成的总体积为20微升的混合液在36.9摄氏度孵育2.1小时，然后加入dnasei在37摄氏度消化20分
钟。将所获得的混合物采用用硅膜离心柱法进行进一步纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对rna大小进行识别；测定mrna转录纯化后rna浓度（498.1纳克每微升）；第五步，将25微克mrna溶液中，50微升20毫摩尔每升gtp溶液和若干体积由50毫摩尔每升的tris-hcl，10毫摩尔每升的mgcl2及1毫摩尔每升的dtt混合合成的缓冲液进行混合，然后把所获得的总体积为500微升的混合溶液在55.9摄氏度加热20分钟。将所获得的混合物采用使用硅膜离心柱法进行纯化。对纯化产物进行od值测定，并同时通过1％变性琼脂糖凝胶电泳对环形rna大小进行鉴定；测定mrna环化并纯化后rna浓度（274.2纳克每微升）；第六步，将1微克环化或未环化的mrna溶液，4微升rt prmier, 1微升 primerscript rt enzye mix i和若干体积无核酸酶水混合合成的总体积20微升的混合液在37摄氏度加热25 分钟，随后在85摄氏度加热10秒，最后在4摄氏度保存；第七步，将第六步所获得的1微升逆转录溶液与2微升10
×
buffer，1.6微升dntp，1微升10微摩尔每升primer-f，1微升10微摩尔每升primer-r，0.5微升taq酶，12.9微升无核酸酶水进行进一步混合。然后将混合液依次按在95摄氏度放置1分钟，95摄氏度放置30秒，60摄氏度放置30秒，72摄氏度放置30秒，72摄氏度放置7分钟（循环次数为35次）； 4摄氏度放置保存的pcr程序进行扩增。对扩增产物进行核酸电泳，切胶回收，并进一步纯化，并对纯化产物进行纯化和测序。测序结果显示产物包含连接后的第二外显子和第一外显子序列。这表明已成功制备环形 rna；第八步，先将293t接种于含有10％胎牛血清，1％双抗的dmem高糖培养基中，于37摄氏度，5％co2培养箱中培养。与此同时，将细胞每隔2天进行传代培养。转染时，先将293t细胞以1
×
105个/孔接种于24孔板中，并于37摄氏度，5％co2培养箱中培养；待细胞达到87％融合度后，使用转染试剂将所制备的mrna以500纳克/孔量转染293t细胞；第九步，通过elisa试剂盒检测所制备的环形mrna在293t表达第一天到第五天所得蛋白的量分别为50.2纳克每毫升，65.7纳克每毫升，80.9纳克每毫升，58.8纳克每毫升，34.5纳克每毫升，验证本发明所提供的环形mrna表达实施例1中具有seq id 46所示氨基酸序列的肿瘤新生抗原多肽蛋白的高效和持久性，及比相应线性mrna（第一天到第五天所得蛋白的量分别为8.2纳克每毫升，12.4纳克每毫升，17.7纳克每毫升，9.8纳克每毫升，7.2纳克每毫升）具有更出色的seq id 46所示氨基酸序列的抗原多肽蛋白的表达性能。
[0075]
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。