石斛酚对肝细胞的毒性作用及其在肝细胞毒性研究中的用途

1.本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及石斛酚对肝细胞的毒性作用及其在肝细胞毒性研究中的用途。


背景技术：

2.药物性肝损伤(drug-induced liver injury，dili)是指在各类处方或非处方的化学药物、传统中药、天然药、生物制剂、保健品、替代补充剂及其代谢产物乃至辅料等的使用过程中，因药物本身和/或其代谢产物或由于受试者的特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低所导致的肝脏损伤，亦称为药物性肝病。肝是机体生物转化的最主要器官，对于维持机体的生命活动发挥着重要作用。因此，肝损伤会对机体造成严重的伤害，轻则引发脂肪肝，持续性加重将诱导肝纤维化和肝硬化，最终导致肝衰竭或肝癌，严重危及人类的生命健康。国外相关研究学者的不同研究结果显示药物性肝损伤在欧美地区的发病率处于2.3/10万-19/1万之间(andrade rj,chalasani n,es,et al.drug-induced liver injury[j].nat rev dis primers.2019,5(1):58.)。
[0003]
药物性肝损伤临床表现不一，轻者表现为无症状性转氨酶升高，部分患者呈急性肝炎表现，严重者可发生肝衰竭而死亡，由于其临床表现多样，客观诊断及特异性治疗方法缺乏等，被认为是消化病学家面临的最具挑战性的疾病之一(chalasani np,maddur h,russo mw,et al.practice parameters committee of the american college of gastroenterology.acg clinical guideline:diagnosis and management of idiosyncratic drug-induced liver injury[j].am j gastroenterol,2021,116(5):878-898.)，相关研究表明中药或草药补充剂占所有药物性肝损伤的26.81％，此外，随着中医药在世界范围的接受度和认可度逐渐提升，药物性肝损伤的报道也呈升高趋势，因此，开展中医药治疗药物性肝损伤的基础研究对本领域而言至关重要，而基础研究很大程度上依赖于与人类肝脏疾病病理机制相似的实验细胞模型或动物模型的建立和应用。
[0004]
石斛酚(dendrophenol，又称gigantol)，是一种联苄类酚性物质，提取于石斛的根部，是石斛的药用有效成分之一。目前已发现一些证据阐明了石斛具有多种生物学活性，包括增强机体免疫力、帮助胃部消化、抗白内障、调节血糖、抗肿瘤等作用。通过对石斛酚抗白内障机理研究发现，石斛酚可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶及其特异结合位点的活性从而达到抗白内障的效果。此外，相关研究报道称石斛酚可以改善体内四氯化碳诱导的肝损伤小鼠模型中的肝细胞损伤，石斛酚可通过抑制jnk/cpla2/12-lox信号通路来部分缓解肝损伤小鼠模型的肝脏炎症(xue y,deng q,zhang q,et al.gigantol ameliorates ccl4-induced liver injury via preventing activation of jnk/cpla2/12-lox inflammatory pathway[j].sci rep.2020,10(1):22265.)。
[0005]
迄今为止，尚未见石斛酚用于药物性肝损伤研究中的相关报道。


技术实现要素：

[0006]
鉴于此，本发明的目的在于提供石斛酚对肝细胞的毒性作用及其在肝细胞毒性研究中的用途，为本领域提供一种新型的肝损伤细胞系模型、肝损伤动物模型的构建方法，以克服目前本领域存在的上述技术问题。
[0007]
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0008]
本发明的第一方面提供了石斛酚在构建肝损伤细胞系模型中的应用。
[0009]
进一步，所述石斛酚的结构式如式(i)所示：
[0010][0011]
进一步，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0012]
进一步，所述肝损伤细胞系模型的构建包括如下步骤：体外培养人正常肝细胞系，将石斛酚加入到所述人正常肝细胞系中，得到肝损伤细胞系模型；
[0013]
优选地，所述人正常肝细胞系为l-02细胞系；
[0014]
优选地，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0015]
在本发明的具体实施例中，本发明通过实验证明了石斛酚可诱导肝细胞的氧化应激损伤，促进人正常肝细胞系l-02细胞中traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8mrna的表达水平，此外，石斛酚显著诱导nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3蛋白的表达，即，石斛酚能够激活肝细胞nf-κb信号通路。随着石斛酚处理浓度的增加，细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的表达量也显著增加，进一步证明了本发明通过石斛酚处理得到的细胞系为肝损伤细胞系模型。
[0016]
进一步，本发明所述的肝损伤细胞系模型为一种药物性肝损伤细胞系模型，所述药物性肝损伤的病理机制主要包括：(1)氧化应激等反应；(2)线粒体功能障碍与内质网应激；(3)肝药酶异常及胆汁淤积；(4)免疫反应和脂质代谢紊乱。
[0017]
本发明的第二方面提供了石斛酚在构建肝损伤动物模型中的应用。
[0018]
进一步，所述石斛酚的结构式如式(i)所示：
[0019][0020]
进一步，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0021]
进一步，所述肝损伤动物模型的构建包括如下步骤：给受试动物施用石斛酚得到肝损伤动物模型；
[0022]
优选地，所述受试动物包括大鼠、小鼠、兔、犬、猴、猪；
[0023]
优选地，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0024]
在本发明的具体实施例中，本发明通过实验证明了石斛酚可诱导肝细胞的氧化应激损伤，促进人正常肝细胞系l-02细胞中traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8mrna的表达水平，此外，石斛酚显著诱导nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3蛋白的表达，即，石斛酚能够激活肝细胞nf-κb信号通路。随着石斛酚处理浓度的增加，细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的表达量也显著增加，以上实验结果证明了石斛酚具有肝毒性，可导致肝损伤，进一步证明了通过将石斛酚施用于受试动物的方法可得到肝损伤动物模型。
[0025]
进一步，构建本发明所述的肝损伤动物模型的受试动物的来源并不局限于大鼠、小鼠、兔、犬、猴、猪，根据本领域技术人员的研究目的的不同可选择不同的受试动物，包括但不限于大鼠、小鼠、兔、犬、猴、猪、豚鼠、地鼠、长爪沙鼠、棉鼠、羊等，基于这些受试动物构建得到的肝损伤动物模型也均包含在本发明的保护范围内。
[0026]
进一步，本发明所述的肝损伤动物模型为药物性肝损伤动物模型。
[0027]
本发明的第三发明提供了一种肝损伤细胞系模型的构建方法。
[0028]
进一步，所述方法包括如下步骤：体外培养人正常肝细胞系，将石斛酚加入到所述人正常肝细胞系中，得到肝损伤细胞系模型。
[0029]
进一步，所述人正常肝细胞系为l-02细胞系，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0030]
本发明还提供了一种肝损伤动物模型的构建方法。
[0031]
进一步，所述方法包括如下步骤：给受试动物施用石斛酚得到肝损伤动物模型。
[0032]
进一步，所述受试动物包括大鼠、小鼠、兔、犬、猴、猪，所述石斛酚的使用浓度为25-400μm。
[0033]
本发明的第四方面提供了石斛酚在诱导肝细胞氧化应激中的应用。
[0034]
进一步，所述石斛酚诱导丙二醛和活性氧的产生，同时抑制谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的活性。
[0035]
进一步，所述肝细胞氧化应激(oxidative stress，os)是指肝细胞内的氧化水平及抗氧化水平失去平衡的一种状态，，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，氧化系统和抗氧化系统失衡会进一步导致肝组织的损伤。氧
化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素，相关研究表明氧化应激参与了多种肝脏疾病的形成与发展过程。
[0036]
进一步，所述丙二醛(malondialdehyde，mda)是膜脂过氧化最重要的产物之一，其产生还能进一步加剧膜的损伤，是一种常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(tba)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。丙二醛是评价氧化应激过程中常用的指标，是脂质与氧自由基反应形成的产物之一，其含量代表脂质过氧化的程度。
[0037]
进一步，所述活性氧(reactive oxygen species，ros)是含氧的化学反应性化学物质。实例包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧和α-氧。在生物学背景下，活性氧的形成为氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力(例如，紫外线或热暴露)期间，活性氧的水平会急剧增加。这可能会对细胞结构造成严重损害，这被称为氧化应激。活性氧的产生受植物中应激因子反应的强烈影响，这些增加活性氧产生的因素包括干旱，盐度，寒冷，营养缺乏，金属毒性和uv-b辐射。活性氧也由外源性源如电离辐射产生。
[0038]
进一步，所述谷胱甘肽(glutathione，gsh)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞，谷胱甘肽在抗氧化防御、营养代谢和细胞调节(包括基因表达、dna和蛋白质合成、细胞增殖和凋亡、信号转导、细胞因子产生和免疫反应以及蛋白质谷胱甘肽化)中发挥重要作用，谷胱甘肽的缺乏会导致氧化应激。谷胱甘肽常作为脂质过氧化损伤指标。
[0039]
进一步，所述超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，广泛分布在微生物、植物和动物体内，作为一种抗氧化金属酶，超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。超氧化物歧化酶是反映人体内自由基代谢状态的重要指标之一，其水平的高低可间接反映机体清除自由基的能力。
[0040]
本发明的第五方面提供了石斛酚在激活肝细胞nf-κb通路中的应用。
[0041]
进一步，所述石斛酚促进肝细胞中traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8的产生。
[0042]
进一步，在本发明的具体实施例中，本发明通过验证实验进一步证明了石斛酚能够诱导nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3蛋白的表达，此外，随着石斛酚处理浓度的增加，细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的表达量也显著增加。
[0043]
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
[0044]
先前研究学者通过相关的实验研究表明石斛酚可通过抑制jnk/cpla2/12-lox信号通路来缓解肝损伤小鼠模型的肝脏炎症，而本发明首次发现并证实了石斛酚具有肝毒性，能够导致肝损伤，这一结果属于预料不到的技术效果，基于该首次发现能够为本领域提供用于药物肝损伤研究的与人类肝脏疾病病理机制相似的实验细胞系模型和动物模型，应用前景广阔。
附图说明
[0045]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0046]
图1为石斛酚的化学结构式及其对l-02细胞生长影响的结果图，其中，a图：石斛酚
的化学结构式，b图：与对照相比，随着石斛酚处理浓度的增加，l-02细胞逐渐收缩，c图：石斛酚对l-02细胞生长的半数抑制浓度为196.7μm，d图：与对照相比，石斛酚对l-02细胞的生长表现为显著浓度依赖性抑制；
[0047]
图2为不同浓度石斛酚对l-02细胞氧化应激影响的结果图，其中，a图：丙二醛(mda)，b图：超氧化物歧化酶(sod)，c图：谷胱甘肽(gsh)，d图：活性氧(ros)；
[0048]
图3为石斛酚对l-02细胞转录调控影响的结果图，其中，a图：差异表达基因结果图，b图：总体差异基因表达量分析结果图，c图：对差异基因进行功能的显著性分析结果图，d：kegg通路富集分析显示的前30个显著富集的通路；
[0049]
图4为随着石斛酚处理浓度的增加，l-02细胞中traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8的mrna相对表达水平，其中，a图：traf1，b图：nf-κb2，c图：il-1β，d图：cxcl8；
[0050]
图5为不同浓度的石斛酚或dmso处理对l-02细胞中nf-kb信号通路和细胞因子水平影响的结果图，其中，a图：western blot结果图，b图：elisa定量检测tnf-α的结果图，c图：elisa定量检测il-1β的结果图，d图：elisa定量检测il-6的结果图。
具体实施方式
[0051]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]
实施例1石斛酚对人正常肝细胞l-02细胞活力的影响
[0053]
1、实验材料
[0054]
人正常肝细胞l-02细胞系获自于中国科学院(上海，中国)，用于蛋白质印迹的抗体包括针对nf-κb p105/p50(cell signaling technology，usa)、nf-κb p100/p52(cell signaling technology，usa)、tnf受体相关因子1(traf1，abcam，uk)、traf3(abcam，英国)、cxcl8(abcam，英国)和gapdh(abcam，英国)的抗体，石斛酚的结构式如图1a所示，购自于medchemexpress，将其溶解在二甲基亚砜(dmso，sigma-aldrich)中备用。
[0055]
2、细胞培养和石斛酚的处理
[0056]
采用添加有10％胎牛血清(gibco，usa)和1％青霉素-链霉素的rpmi-1640培养基(gibco，usa)培养人正常肝细胞l-02细胞，并将其置于37℃、5％co2加湿培养箱中培养。l-02细胞用不同浓度的石斛酚(100μm、200μm和400μm)或溶剂(dmso)处理不同时间。
[0057]
3、细胞活力测定
[0058]
将l-02细胞以1
×
105个细胞/ml的密度接种于96孔板中24小时，然后分别用不同浓度的石斛酚或dmso处理12小时、24小时、36小时和48小时。其中，用dmso处理的l-02细胞作为对照组。按照制造商的要求使用cck-8细胞计数试剂盒(cck-8，dojindo molecular technologies)在相应时间点确定相应细胞的活力，记录在酶标仪(bio-rad laboratories，inc.，hercules，ca，usa)中450nm处测量得到的吸光度值。分析细胞活力结果以阐明石斛酚对l-02细胞的毒性作用。此外，采用倒置光学显微镜观察不同浓度石斛酚处理12h后细胞形态的变化。
bioinformatics resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov)被引用用于后续执行基因本体(go)富集分析和keeg通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)。
[0069]
2、实验结果
[0070]
分析经200μm石斛酚处理后的l-02细胞中的转录组变化，其中，筛选得到的p＜0.05和|log2fc|＞1的基因被认为是degs，本实施例中共鉴定出3405个degs，包括1748个上调基因和1657个下调基因(见图3a和图3b)；
[0071]
进一步对筛选得到的degs进行基因本体富集分析，结果如图3c所示，结果包含三类：分子功能(mf)、细胞成分(cc)和生物过程(bp)，其中，筛选得到的degs的分子功能主要涉及蛋白质异二聚化活性、trna结合、dna结合、生长因子活性等，在细胞成分中，degs主要参与核小体、亚区核小体、神经元投射末端等，在生物学过程中，degs主要参与染色质沉默、核小体组装、erk1和erk2级联的负调控等；
[0072]
对degs进行了京都基因和基因组百科全书(kegg)通路富集，前30个显著富集的通路如图3d所示，包括tnf信号通路、il-17信号通路、mapk信号通路和nf-κb信号通路等。
[0073]
实施例4石斛酚处理后的l-02细胞nf-κb通路激活的验证
[0074]
1、rna提取和实时定量pcr
[0075]
将l-02细胞以1
×
105个细胞/ml的密度接种于12孔板中，并用不同浓度的石斛酚(50μm、100μm和200μm)或dmso处理24小时，然后用trizol试剂(invitrogen)提取，在无rnase的环境下通过向细胞中加入氯仿和异丙醇的方法提取细胞中的rna。提取的rna浓度用2000分光光度计(termo scientific，usa)进行检测。
[0076]
使用cdna逆转录试剂盒(takara bio，日本)将rna逆转录为cdna，并使用applied biosystems
tm
quantstudio
tm
5real-time pcr system通过qpcr sybr green master mix(yeasen biotechnology，上海，中国)进行定量检测。基因的量化被归一化为gapdh并表示为2-δδct
。每次实验至少重复三次。本实施例中使用的引物如下表1所示。
[0077]
表1引物序列
[0078][0079]
2、实验结果
[0080]
基于实施例3中转录组分析的结果，观察到tnf-α和下游nf-κb信号通路的激活，为了验证这种炎症过程，检测经浓度分别为0、50μm、100μm和200μm的石斛酚处理后的l-02细胞中的traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8的表达水平。结果显示，石斛酚促进了l-02细胞中
traf1、nf-κb2、il-1β和cxcl8 mrna的表达水平(见图4)，其中，traf1和nf-κb2的产生是由石斛酚以浓度依赖性方式诱导的(见图4a和图4b)，而诱导il-1β和cxcl8表达的最有效的石斛酚的浓度分别为200μm和400μm(见图4c和图4d)。
[0081]
实施例5石斛酚激活nf-κb通路的验证
[0082]
1、蛋白质印迹实验
[0083]
将l-02细胞以106个细胞/孔的密度接种于6孔板中过夜。当细胞达到60％-70％的汇合度时，用不同浓度的石斛酚(50μm，100μm和200μm)或dmso处理l-02细胞。处理48小时后，收集细胞上清液用于随后的酶联免疫吸附试验中(elisa)，而细胞用预冷的pbs洗涤，并用加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的预冷的ripa裂解液裂解。然后以12000rpm离心15分钟后收集细胞蛋白。使用bradford蛋白测定法测定细胞中蛋白质的浓度。
[0084]
变性后，细胞蛋白在15％sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上，在含有0.05％tween-20 tris缓冲液的5％脱脂牛奶中封闭1小时后，将膜与靶向nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3、cxcl8、和gapdh(abcam，usa)4℃过夜。第二天，将相应的二抗在室温下应用于膜上1小时。通过增强的化学发光系统(applygen technologies inc.，北京，中国)检测蛋白质条带，并用image j软件测量条带灰度值。
[0085]
2、elisa检测
[0086]
为了评价石斛酚对l-02细胞细胞因子表达的影响，本实施例检测了上述实验收集得到的细胞上清液中il-6、il-1β和tnf-α的表达水平。用于il-6、il-1β和tnf-α检测的商业elisa试剂盒均购自于r&d system。所述检测过程是根据制造商的说明书进行的。
[0087]
3、数据分析
[0088]
数据表示为从至少三个重复实验中获得的平均值
±
标准差(mean
±
sd)。应用配对t检验比较不同时间点的细胞活力与基线时的细胞活力。用student's t检验比较了石斛酚治疗组和对照组之间的基因表达水平或蛋白质表达水平。采用单因素方差分析评估不同浓度(100μm、200μm和400μm)的石斛酚处理组之间的基因表达水平或蛋白质水平。p＜0.05被认为具有统计学意义。
[0089]
4、实验结果
[0090]
为了进一步验证石斛酚对nf-κb通路激活的影响，本实施例通过蛋白质印迹实验对nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3、il-1β、tnf-α和il-6的蛋白水平进行了进一步的检测。结果显示，石斛酚显著诱导nf-κb p105/p50、nf-κb p100/p52、traf1、traf3蛋白的表达，尤其是在400μm的浓度下(见图5a)，此外，随着石斛酚处理浓度的增加，细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的表达量也显著增加(见图5b-图5d)。
[0091]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。