大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用。


背景技术：

2.基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)的基因组编辑技术主要通过细胞内cas9蛋白结合一条末端与目标基因20碱基互补的单链非编码rna(single guide rna，sgrna)，利用互补的20碱基引导序列(guide rna，grna)锁定目的基因，在cas9蛋白作用下切割目的基因，通过生物体内的非同源重组或同源重组机制对断裂dna进行非精确修复，从而导致目的基因发生突变。自2013年首次报道crispr/cas9基因编辑技术应用于植物之后，crispr/cas9基因编辑技术广泛地应用于不同植物目标基因的定点突变，是获得植物基因功能研究所需突变体的一种重要技术手段。
3.crispr/cas9基因编辑技术可以高效地获得目的基因的突变体，而且等位基因的双突变体在t0代就能获得，这为植物基因功能研究节省了大量的时间。crispr/cas9基因编辑技术诱导形成的突变体能在子代中稳定的遗传，可以用子代进行基因功能研究。crispr-cas9基因编辑技术同样在作物品种改良上获得了广泛的应用。wang等首次报道了在面包小麦中抗白粉病基因mlo进行突变，获得了抗白粉病的小麦株系。对油菜bnamax1基因的编辑可以有效的改善油菜株型并增加产量。li等对棉花cla基因的编辑获得了不含棉酚的棉花。pramanik等对番茄pel和mol1基因的编辑，使番茄获得了对黄化曲叶病毒和白粉病的抗性。qi等对玉米ms26基因的编辑，创制了玉米雄性不育系，使一步法实现玉米杂交育种成为现实。crispr/cas9基因编辑技术以其简单、高效、快速和费用低的特点，已成为植物以及作物的基础研究和遗传改良的必不可少的工具。
4.大豆是由四倍体进化而来的二倍体作物，基因组经历了2次复制而具有高度的重复性，约75％基因存在多个拷贝。对大豆基因功能研究，往往涉及同一家族多个基因的功能研究，因此开发多基因编辑载体，对大豆多基因编辑已成为大豆基因功能研究的一种有效手段。目前在植物中已开发了多个多基因编辑技术，利用植物体内rna核酸酶对trna的自剪切作用，xie等将多个sgrna用trna进行串联，在水稻中实现了对多个基因的编辑。利用拟南芥u6-26启动子串联表达不同sgrna，在烟草中对多个基因进行了编辑。ma等利用水稻u6和u3启动子的串联，在水稻中实现了多基因的编辑。


技术实现要素：

5.大豆约75％基因存在多个拷贝，大豆基因家族往往存在多个功能相似的基因，如本发明实施例所用的mir396基因家族包含有11个功能相似的mir396基因，因此需迫切开发多基因编辑载体对功能相似的基因进行编辑。本发明的目的之一在于提供一种可用于大豆的多基因编辑表达载体。
6.本发明提供了一种大豆多基因编辑表达载体，包括至少2个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒串联形成的多基因编辑元件；每个所述大豆u6启动子表达的sgrna表达盒依次包括大豆u6启动子、sgrna靶序列识别区和cas9蛋白结合的sgrna scaffold区；每个所述大豆u6启动子表达的sgrna表达盒中的sgrna靶序列识别区对应不同靶基因；每个所述sgrna表达盒中的大豆u6启动子不同。
7.可选地，根据上述的载体，所述大豆u6启动子为gmu6-2、gmu6-8、gmu6-10和gmu6-11中任一种。
8.可选地，根据上述的载体，所述cas9蛋白结合的sgrna scaffold区编码序列为seq id no.2的第1548-1624位所示。
9.可选地，根据上述的载体，所述多基因编辑表达载体包括4个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒串联形成的多基因编辑元件；所述4个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒串联形成的多基因编辑元件为如下四种表达盒任意组合方式串联形成：
10.1)包括大豆u6启动子gmu6-2、sgrna靶序列识别区a和cas9蛋白结合的sgrna scaffold区的sgrna表达盒；2)包括大豆u6启动子gmu6-8、sgrna靶序列识别区b和cas9蛋白结合的sgrna scaffold区的sgrna表达盒；3)包括大豆u6启动子gmu6-10、sgrna靶序列识别区c和cas9蛋白结合的sgrna scaffold区的sgrna表达盒；4)包括大豆u6启动子gmu6-11、sgrna靶序列识别区d和cas9蛋白结合的sgrna scaffold区的sgrna表达盒；
11.所述sgrna靶序列识别区a、b、c和d分别结合不同靶基因。
12.上述大豆多基因编辑表达载体还可包括cas9蛋白基因，序列如seq id no.16的第1-4132位。
13.可选地，根据上述的载体，所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列包括seq id no.14或seq id no.15所示序列。所述多基因编辑表达载体的核苷酸序列也可包括将seq id no.14或seq id no.15中的sgrna靶序列识别区替换为不同的sgrna靶序列识别区所获的序列。例如，所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列为下述实施例制备的pmir396-gmu6n-gdna载体序列、pgrf-gmu6n-gdnan载体序列和/或pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体序列。
14.本发明还提供了一种制备上述载体的方法，包括采用同尾酶将上述载体中不同大豆u6启动子表达的sgrna表达盒进行串联，得到所述载体。
15.可选地，根据上述的方法，包括如下步骤：
16.1)制备表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体组，所述载体组由多个表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体组成，所述表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体依次包括限制性内切酶a酶切识别位点、大豆u6启动子表达的sgrna表达盒和限制性内切酶b酶切识别位点，所述大豆u6启动子表达的sgrna表达盒依次包括大豆u6启动子、sgrna靶序列识别区、cas9蛋白结合的sgrna scaffold区和限制性内切酶c酶切识别位点，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶c为同尾酶；
17.2)用限制性内切酶a和限制性内切酶b对所述表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体分别酶切，收集不同的大豆u6启动子表达的sgrna表达盒；
18.3)用限制性内切酶b和限制性内切酶c对1个所述表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体酶切，收集载体骨架，再2)获得的1个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒与所
述载体骨架连接，得到连接2个表达盒的载体，即为目的载体。
19.可选地，根据上述的方法，步骤3)后还包括：
20.4)用限制性内切酶b和限制性内切酶c对所述连接后的载体酶切，收集连接2个表达盒的载体骨架，再将2)获得的另一个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒与所述连接2个表达盒的载体骨架连接，得到连接3个表达盒的载体；
21.依次类推，直到获得连接多个表达盒的载体，即为目的载体。
22.所述表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体可由构建载体制备而成，其依次包括限制性内切酶a酶切识别位点、大豆u6启动子、指示基因(例如pds基因)、cas9蛋白结合的sgrna scaffold区、限制性内切酶c酶切识别位点和限制性内切酶b酶切识别位点。具体可为下述实施例制备的载体pgmu6-sgrna3.0。
23.可选地，根据上述的方法，所述同尾酶为xho i和sal i。例如，所述限制性内切酶a为xho i，且所述限制性内切酶c为sal i；或所述限制性内切酶a为sal i，且所述限制性内切酶c为xho i。
24.限制性内切酶b酶切识别位点与限制性内切酶a和限制性内切酶c酶切识别位点均不同。例如，限制性内切酶b为bamh i。
25.所述大豆u6启动子可为gmu6-2(seq id no.3)、gmu6-8(seq id no.4)、gmu6-10(seq id no.2中的第411-716位)或gmu6-11(seq id no.5)。
26.上述的大豆多基因编辑表达载体在基因编辑或制备基因编辑产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。
27.同尾酶(isocaudamer)是切割不同的dna片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。这一类的限制酶来源各异，识别位点也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的dna片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的dna片段与原来的限制性内切酶切割的dna片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。例如：bamh i和bgl ii，sal i和xho i就是常见的同尾酶。
28.大豆有11个u6启动子，不同启动子具有不同的基因编辑效率。与拟南芥u6启动子相比，大豆u6启动子驱动sgrna的表达具有更高的基因编辑效率，因此利用大豆不同u6启动子进行多基因表达载体的构建，是对大豆多基因编辑的一种有效方法。本发明利用大豆特有的不同u6启动子驱动表达sgrna，利用载体上同尾酶将不同大豆u6启动子表达的sgrna进行串联，成功构建了可以同时对大豆多个基因进行编辑的基因编辑载体。
29.本发明提供的大豆多基因编辑表达载体不仅可以补充大豆多基因编辑的方法，同时可以有效的提高编辑效率，这对遗传转化效率低效的大豆基因编辑具有重要的应用价值。
附图说明
30.图1为pgmu6-sgrna3.0载体构建以及结构示意图。
31.图2为多靶位点cas9载体构建。
32.图3为pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体结构示意图。
33.图4为实施例2pcr产物测序(a)及pcr-t7 endonuclease i酶切法(b)检测基因突
变。
34.图5为实施例2部分突变检测结果。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
37.大豆williams 82由本实验室保存，记载于sun x，hu z，chen r，et al.targeted mutagenesis in soybean using the crispr-cas9 system.sci rep.2015，10342。
38.菌株为大肠杆菌菌株trans1-t1，购买于北京全式金生物技术有限公司，发根农杆菌k599由中国农科院作科所侯文胜老师课题组惠赠，记载于cai y，chen l，liu x，et al.crispr/cas9-mediated genome editing in soybean hairy roots.plos one.2015，10(8)：e0136064.。
39.质粒pgmu6-10-sgrna2.0、pgmu6-2、pgmu6-8、pgmu6-11和pcambia3301-cas9由本实验室保存。
[0040]2×
pcr master mix、快速限制性内切酶、t4 dnaligase购于fermentas公司，2
×
transstart fastpfu pcr surpermix，trans1-t1感受态细胞购买于北京全式金生物技术有限公司，植物基因组dna提取试剂盒、快捷型植物基因组dna提取试剂盒、质粒小提中量试剂盒、普通dna纯化试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，ez-hifi无缝组装克隆试剂盒购于genstar生物技术有限公司，2xphusion超保真pcr master mix，gibson组装试剂盒购买于neb，murashige&skoog basal salt mixture购买于phyto tech。
[0041]
引物合成和测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。
[0042]
下述实施例中所涉及序列如表1。
[0043]
表1序列名称及编号
[0044]
序列名称序列编号pgmu6-10-sgrna2.0seq id no.1pgmu6-10-sgrna3.0seq id no.2gmu6-2seq id no.3gmu6-8seq id no.4gmu6-11seq id no.5mir396-gdna1seq id no.6mir396-gdna2seq id no.7mir396-gdna3seq id no.8mir396-gdna4seq id no.9
grf-gdna1seq id no.10grf-gdna2seq id no.11grf-gdna3seq id no.12grf-gdna4seq id no.13pmir396 sgrna核心序列seq id no.14pgrf sgrna核心序列seq id no.15pcambia3301-cas9seq id no.16
[0045]
下述实施例所用引物序列如表2。
[0046]
表2引物序列
[0047]
[0048]
[0049][0050]
实施例1、多基因编辑表达载体构建
[0051]
1.pgmu6-10-sgrna3.0载体构建
[0052]
在载体pgmu6-10-sgrna2.0的基础上，加入拟南芥pds基因，构建为pgmu6-10-sgrna3.0载体。具体为，将pgmu6-10-sgrna2.0载体用bsa i酶切；用引物对pds-hf/r克隆拟南芥pds基因；利用同源重组的方法将载体pgmu6-10-sgrna2.0和拟南芥pds基因连接，构建为pgmu6-10-sgrna3.0载体，pgmu6-10-sgrna3.0载体结构示意图如图1中的c所示，pgmu6-10-sgrna3.0载体序列中，第405-410位为xho i酶切识别位点，第411-716核苷酸为gmu6-10启动子，第722-1543核苷酸为pds基因，第1548-1624位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第1644-1649位为sal i酶切识别位点，第1661-1666位为bamh i酶切识别位点。
[0053]
1.1pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切
[0054]
在pcr管中加入如下试剂：
[0055]
[0056][0057]
混匀，37℃，30min。
[0058]
1.2pgmu6-10-sgrna2.0 bsa i酶切产物回收(按试剂盒说明书进行回收)
[0059]
(1)1％琼脂糖电泳30min
[0060]
(2)在紫外灯下，将目的条带从琼脂糖凝胶上切下，放入已灭菌的离心管内称重，1mg凝胶视为100μl。
[0061]
(3)向凝胶中加入1倍体积的pn溶液，65℃水浴5min左右，加热溶解中，适当的翻转几次离心管，或延长加热时间，确保凝胶充分溶解。
[0062]
(4)待溶解的凝胶降到室温时，将其转移到吸附柱上(先将吸附柱经平衡液处理)，静止2min左右，12000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放到收集管中。
[0063]
(5)向吸附管中加入700μl pw漂洗液，静止2min后，12000rpm，离心30s，摒弃废液，重复洗涤一次。掉到废液后，再12000rpm，离心2min。
[0064]
(6)室温下静止2-5min，使多余的酒精充分挥发。加入30μl的eb洗脱缓冲液，室温静止5min，12000rpm，离心2min，收集dna溶液，即为pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物，该产物用于与pds dna进行连接构建pgmu6-10-sgrna3.0载体。
[0065]
1.3拟南芥pds基因扩增
[0066]
扩增体系如下：
[0067][0068]
反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃，30s，72℃ 30s，32个循环；72℃，5min；4℃保温。
[0069]
1.4拟南芥pds基因切胶回收
[0070]
方法同1.2pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物回收，获得pds扩增产物。
[0071]
1.5pgmu6-10-sgrna2.0和pds同源重组
[0072]
在pcr管中加入以下试剂
[0073][0074]
反应程序为：50℃ 30min，使pgmu6-10-sgrna2.0酶切产物与pds dna连接，获得连接产物。
[0075]
1.6转化和测序验证
[0076]
(1)在超净工作台内，将步骤1.5获得的连接产物加入到含有50μl冰上融化的大肠杆菌trans1-t1感受态细胞的离心管内，轻弹离心管管底混匀，冰浴30min。调节水浴锅温度至42℃。
[0077]
(2)半小时后，将完成步骤(1)的离心管置于42℃水浴锅中热激30s，随后转移入冰上冰浴2min。
[0078]
(3)在超净工作台内，向冰浴2min后的离心管内加入500μl不含抗生素的lb培养基，颠倒混匀后，在37℃，200rpm摇床上培养1h。
[0079]
(4)培养1h后，5000rpm，离心2min，去除上清液，各离心管内留200μl液体培养基为宜。用移液枪混匀后，均匀涂抹在含有kan抗生素的固体培养基上。暗条件下，37℃倒置培养至菌落出现(约12h)。
[0080]
(5)随机挑取3-5个克隆进行测序验证。
[0081]
测序结果含有正确的bste ii酶切位点，avr ii酶切位点和pds序列的克隆即为pgmu6-10-sgrna3.0阳性克隆。
[0082]
1.7pgmu6-10-sgrna3.0质粒提取
[0083]
(1)向吸附柱内加入500μl平衡液bl处理吸附柱，12000rpm，离心30s。倒掉废液，重新放回收集管上。
[0084]
(2)取10ml od
600
为2.0的pgmu6-10-sgrna3.0阳性克隆菌液分批次加入干净的离心管中，12000rpm，离心30s，去上清。
[0085]
(3)向步骤(2)收集菌体的离心管中加入500μl溶液p1(已加rnasea)，用涡旋仪涡旋使细胞沉淀悬浮起来。
[0086]
(4)再加入500μl溶液p2，缓慢反转6-8次，此过程不宜超过5min，菌液变清即可。
[0087]
(5)向步骤(4)离心管中加入700μl溶液p3，立即混匀，以免产生局部沉淀，影响提取效率。12000rpm，离心10min。
[0088]
(6)将步骤(5)收集的上清液加入经平衡液处理的吸附柱上，室温放置2min，12000rpm，离心30s。倒掉收集管内的废液，重新将吸附柱放到离心管内。
[0089]
(7)向步骤(6)吸附柱中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm，离心30s，倒掉废液。
[0090]
(8)向步骤(7)吸附柱内加入600μl漂洗液pw，洗涤2min后，12000rpm离心30s。重复此步骤一次。
[0091]
(9)将步骤(8)吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液。室温下静止5min左右，使其彻底晾干。
[0092]
(10)将步骤(9)吸附柱放入另一干净的离心管内，向吸附膜中间位置加入150μl eb洗脱缓冲液，室温下溶解5min，12000rpm离心2min收集质粒dna，-20℃保存，备用。
[0093]
电泳检测结果如图1中的a所示，其中，泳道m为dl2000，泳道1为pds pcr扩增产物电泳，泳道2为pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物电泳，泳道3为pgmu6-10-sgrna3.0bste ii和avr ii双酶切产物电泳，bste ii和avrii双酶切pgmu6-10-sgrna3.0载体验证了pds基因的连入，pgmu6-10-sgrna3.0载体和pgmu6-10-sgrna2.0载体相比，前者更容易从胶图上直接判断酶切是否成功(酶切后有两条带)，这也是pds基因连入的目的。
[0094]
2.pgmu6-2-sgrna3.0载体构建
[0095]
在pgmu6-10-sgrna3.0载体的基础上，用大豆u6启动子gmu6-2替换gmu6-10，构建pgmu6-2-sgrna3.0载体。
[0096]
以pgmu6-2-sgrna3.0载体构建具体为，将pgmu6-10-sgrna3.0载体用bste ii和xho i双酶切，去掉gmu6-10；然后用引物对gmu6-2-hf/r从pgmu6-2质粒(载体)中扩增gmu6-2；用同源重组的方式将切去gmu6-10的pgmu6-10-sgrna3.0载体骨架和gmu6-2启动子dna同源重组，构建为pgmu6-2-sgrna3.0载体。pgmu6-2-sgrna3.0载体是将pgmu6-10-sgrna3.0载体的gmu6-10(即pgmu6-10-sgrna3.0载体第411-716位核苷酸)替换为gmu6-2所获得的载体，结构示意图如图1中的c所示。
[0097]
2.1pgmu6-10-sgrna3.0bste ii和xho i双酶切
[0098]
在pcr管中加入如下试剂：
[0099][0100]
混匀，37℃，30min。
[0101]
2.2pgmu6-10-sgrna3.0酶切产物回收
[0102]
回收方法参照1.2pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物回收方法回收pgmu6-10-sgrna3.0酶切产物。
[0103]
2.3gmu6-2启动子扩增
[0104]
扩增体系如下：
[0105]
sgrna3.0bste ii和xho i双酶切产物电泳，泳道2为gmu6-2 pcr扩增产物电泳，泳道3为gmu6-8 pcr扩增电泳，泳道4为gmu6-11pcr扩增电泳。
[0125]
4.多靶位点cas9载体(多基因编辑表达载体)构建
[0126]
选取靶基因(同一基因家族不同基因)设计gdna，将pgmu6-sgrna3.0载体双酶切(切掉pds基因)，用同源重组方式与gdna连接，构建带有不同gdna和gmu6启动子的载体pgmu6-gdna，也可被称作表达大豆u6启动子表达的sgrna表达盒的载体。再将其中一个载体酶切切开，把从另外几个载体上酶切获得的不同的gmu6-gdna陆续连接到同一个载体上，最终获得多个sgrna串联表达载体p(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)-(u6-2：gdna3)-(u6-11：gdna4)(pgmu6n-gdnan)。最后将pcambia3301-cas9酶切切开，把从串联表达载体上酶切获得的pgmu6n-gdnan串联序列连接到pcambia3301-cas9载体上，最终构建获得多靶位点cas9载体(pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan)。
[0127]
4.1设计并获得gdna
[0128]
本实施例选取gma-mir396家族9个基因(mir396a/b/c/d/e/f/h/i/j)和gma-grf家族24个基因(grf1～24)作为靶基因进行定点突变。在mir396前体序列中找到成熟序列，获取成熟序列附近pam位点上游20bp序列，设计crispr/cas9的靶位点。从大豆基因组数据库中获取大豆grf基因中mir396靶位点(cgttcaagaaagcctgtggaa)中的pam位点(cct和tgg)上游20bp序列，分别设计crispr/cas9的靶位点。mir396-gdna1/2/3/4及grf-gdna1/2/3/4寡核苷酸(即grna编码基因，sgrna靶序列识别区)序列见序列表。人工合成mir396-gdna1/2/3/4及grf-gdna1/2/3/4。
[0129]
4.2多个sgrna串联表达载体构建(以mir396为例)
[0130]
(1)pgmu6-2-sgrna3.0、pgmu6-8-sgrna3.0、pgmu6-10-sgrna3.0和pgmu6-11-sgrna3.0质粒dna进行bste ii和avr ii双酶切，酶切方法同2.1pgmu6-10-sgrna3.0bste ii和xho i双酶切。酶切后琼脂糖电泳，电泳结果如图2中a所示，其中泳道m为dl2000，泳道1为pgmu6-2-sgrna3.0载体酶切产物电泳，泳道2为pgmu6-8-sgrna3.0载体酶切产物电泳，泳道3为pgmu6-10-sgrna3.0载体酶切产物电泳，泳道4为pgmu6-11-sgrna3.0载体酶切产物电泳，小片段为切掉的pds基因，大片段为载体骨架。回收目的片段(即大片段的载体骨架)，回收方法同1.2pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物回收，获得不同的pgmu6-sgrna3.0。
[0131]
(2)将不同的pgmu6-sgrna3.0分别与相对应的寡核苷酸(表3所示)进行同源重组，构建形成带有不同gdna和不同gmu6启动子的载体pgmu6-2/8/10/11-gdna1/2/3/4。将mir396-gdna和不同的pgmu6-sgrna3.0同源重组获得的载体分别命名为pmir396-gmu6-2-gdna3、pmir396-gmu6-8-gdna2、pmir396-gmu6-10-gdna1和pmir396-gmu6-11-gdna4，将grf-gdna和不同的pgmu6-sgrna3.0同源重组获得的载体分别命名为pgrf-gmu6-2-gdna3、pgrf-gmu6-8-gdna2、pgrf-gmu6-10-gdna1和pgrf-gmu6-11-gdna4。同源重组方法同1.5pgmu6-10-sgrna和pds同源重组。
[0132]
表3 pgmu6-sgrna3.0与相对应的寡核苷酸
[0133]
载体mir396-gdnagrf-gdnapgmu6-2-sgrna3.0mir396-gdna3grf-gdna3pgmu6-8-sgrna3.0mir396-gdna2grf-gdna2pgmu6-10-sgrna3.0mir396-gdna1grf-gdna1
pgmu6-11-sgrna3.0mir396-gdna4grf-gdna4
[0134]
(3)挑取克隆进行测序验证，测序正确的克隆进行质粒提取。提取方法同1.7pgmu6-10-sgrna3.0质粒提取。
[0135]
(4)将测序正确的质粒pmir396-gmu6-2-gdna3、pmir396-gmu6-8-gdna2和pmir396-gmu6-11-gdna4进行xho i和bamh i双酶切，质粒pmir396-gmu6-10-gdna1进行sal i和bamh i双酶切(如构建下述pgrf-gmu6n-gdnan，则将pgrf-gmu6-2-gdna3、pgrf-gmu6-8-gdna2和pgrf-gmu6-11-gdna4进行xho i和bamh i双酶切，pgrf-gmu6-10-gdna1进行sal i和bamh i双酶切)。xho i和bamh i双酶切质粒回收短片段(gmu6-gdna)，sal i和bamh i双酶切质粒回收长片段(载体骨架)。酶切回收方法同1.1和1.2回收相应的片段。pgmu6-gdna载体双酶切产物电泳结果见图2中的b，其中，泳道m为dl2000，泳道1为pmir396-gmu6-10-gdna1 bamh i和sal i双酶切产物电泳，泳道2～4分别为pmir396-gmu6-2-gdna3、pmir396-gmu6-8-gdna2、pmir396-gmu6-11-gdna4载体bamhi和xho i双酶切产物电泳。
[0136]
随后将回收的dna片段用t4连接酶连接，将两个gmu6-gdna连接到一起。第一轮连接中，载体骨架为pmir396-gmu6-10-gdna1 sal i和bamh i双酶切产物，gmu6-gdna为pmir396-gmu6-8-gdna2 bamh i和xho i双酶切产物，连接产物为pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)。
[0137]
在pcr管中加入以下试剂：
[0138][0139]
22℃条件下，反应30min获得连接产物。
[0140]
(5)连接产物转化至trans1-t1感受态细胞，转化方法同1.6转化和测序验证。
[0141]
(6)阳性克隆进行测序，获得质粒pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)。质粒提取，质粒提取方法同1.7pgmu6-10-sgrna3.0质粒提取。
[0142]
(7)重复(4)-(6)进行第二轮连接，载体骨架为pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)sal i和bamh i双酶切产物，gmu6-gdna为pmir396-gmu6-2-gdna3 bamh i和xho i双酶切产物，连接产物为pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)-(u6-2：gdna3)。
[0143]
重复(4)-(6)进行第三轮连接，载体骨架为pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)-(u6-2：gdna3)sal i和bamh i双酶切产物，gmu6-gdna为pmir396-gmu6-11-gdna4 bamh i和xho i双酶切产物，连接产物为pmir396-(u6-10：gdna1)-(u6-8：gdna2)-(u6-2：gdna3)-(u6-11：gdna4)(下述简称pmir396-gmu6n-gdnan)。
[0144]
pmir396-gmu6n-gdnan为gma-mir396 sgrna串联表达载体，是将pgmu6-10-sgrna3.0序列第717-1548位核苷酸替换为pmir396 sgrna核心序列获得的载体。pmir396 sgrna核心序列的第1-74位为启动子u6-10(即大豆u6启动子)，第75-94位为mir396-gdna1
(即sgrna靶序列识别区)，第95-180位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第198-517位为启动子u6-8(即大豆u6启动子)，第518-537位为mir396-gdna2(即sgrna靶序列识别区)，第538-621位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第639-897位为启动子u6-2(即大豆u6启动子)，第898-917位为mir396-gdna3(即sgrna靶序列识别区)，第918-1001位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第1019-1312位为启动子u6-11(即大豆u6启动子)，第1313-1342位为mir396-gdna4(即sgrna靶序列识别区)，第1343-1425位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区。pmir396 sgrna核心序列也可被称作4个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒串联形成的多基因编辑元件，其中，第1-180位为一个sgrna表达盒，第198-621位为一个sgrna表达盒，第639-1001位为一个sgrna表达盒，第1019-1425位为一个sgrna表达盒。
[0145]
在连接过程中，将回收的dna片段用t4连接酶连接，将两个gmu6-gdna连接到一起。同时在载体两端引入了一对同尾酶xho i和sal i，利用同尾酶连接导致酶切位点的消失，重复上面的步骤后，将不同u6启动子驱动的sgrna串联到一个载体上。
[0146]
采用上述相同的方法制备pgrf-gmu6n-gdnan。pgrf-gmu6n-gdnan为gma-grf sgrna串联表达载体，是将pgmu6-10-sgrna3.0序列第717-1548位核苷酸替换为pgrf sgrna核心序列获得的载体。pgrf sgrna核心序列的第1-74位为启动子u6-10(即大豆u6启动子)，第75-94位为pgrf-gdna1(即sgrna靶序列识别区)，第95-180位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第198-517位为启动子u6-8(即大豆u6启动子)，第518-537位为pgrf-gdna2(即sgrna靶序列识别区)，第538-621位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第639-897位为启动子u6-2(即大豆u6启动子)，第898-917位为pgrf-gdna3(即sgrna靶序列识别区)，第918-1001位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区，第1019-1312位为启动子u6-11(即大豆u6启动子)，第1313-1342位为pgrf-gdna4(即sgrna靶序列识别区)，第1343-1425位为cas9蛋白结合的sgrna scaffold区。pgrf sgrna核心序列也可被称作4个大豆u6启动子表达的sgrna表达盒串联形成的多基因编辑元件，其中，第1-180位为一个sgrna表达盒，第198-621位为一个sgrna表达盒，第639-1001位为一个sgrna表达盒，第1019-1425位为一个sgrna表达盒。
[0147]
4.3pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体构建
[0148]
上述获得的串联表达载体和pcambia3301-cas9表达载体分别进行ecor i和hind iii双酶切，酶切方法同1.1的酶切方法。酶切后琼脂糖电泳，回收相关片段，其中串联表达载体回收短片段(gmu6n-gdnan)，pcambia3301-cas9表达载体回收载体骨架大片段，回收方法同1.2pgmu6-10-sgrna2.0bsa i酶切产物回收。两回收片段用t4 dna连接酶进行连接获得连接产物，连接方法同4.2多个sgrna串联表达载体构建的连接方法。连接产物转化至transl-t1感受态细胞，挑取克隆进行测序，转化测序方法同1.6.转化和测序验证。测序正确的克隆进行质粒提取获得pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体，提取方法同1.7.pgmu6-10-sgrna3.0质粒提取。pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体用ecor i和hind iii双酶切验证连接是否成功。
[0149]
结果见图2中的c，泳道m为1kb ladder，泳道1为pcambia3301-cas9载体用ecor i和hind iii双酶切产物电泳，泳道2为pmir396-gmu6n-gdnan载体用ecor i和hind iii双酶切产物电泳，泳道3为pcambia3301-cas9-mir396-gmu6n-gdnan载体电泳，泳道4为pcambia3301-cas9-mir396-gmu6n-gdnan载体用ecor i和hind iii双酶切产物电泳，该载
体用ecor i和hind iii双酶切，产生载体骨架大片段和pmir396-gmu6n-gdnan小片段两条带，验证了pcambia3301-cas9载体gmu6n-gdnan的连入。
[0150]
pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体结构示意如图3所示，lb：t-dna左边界序列，gmu6：大豆gmu6启动子序列，gdna：guide dna序列，sgrna scaffold：cas9蛋白结合的引导序列(cas9蛋白结合的sgrna scaffold区)，camv35s：花椰菜花叶病毒35s启动子，nls：核蛋白引导序列，cas9：cas9基因，nos：胭脂碱合酶基因终止子。pcambia3301-cas9-pmir396-gmu6n-gdnan载体是将pcambia3301-cas9序列第13102-13157位核苷酸替换为pmir396 sgrna核心序列获得的载体。pcambia3301-cas9-pgrf-gmu6n-gdnan载体是将pcambia3301-cas9序列第13102-13157位核苷酸替换为pgrf sgrna核心序列获得的载体。
[0151]
实施例2、多靶位点cas9载体应用
[0152]
一、发根农杆菌转化
[0153]
(1)取50μl k599感受态细胞中加入1μl质粒dna(即上述制备的pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体)，冰浴5min；
[0154]
(2)迅速转移到液氮中冷冻5min，37℃水浴孵育5min，再冰浴5min；
[0155]
(3)加入500μl lb培养基(不含抗生素)，28℃，230rpm培养3小时；
[0156]
(4)涂到lb固体培养基(含终浓度50mg/l kan和50mg/l str)中，28℃倒置培养48小时后可见农杆菌菌落长出，即为含有pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体的k599农杆菌。
[0157]
二、大豆发状根诱导
[0158]
(1)将大豆williams 82播种于混合土中(含蛭石与营养土1∶1)，置于白天28℃，晚上20℃环境中生长；
[0159]
(2)一周后大豆子叶刚展开时的幼苗用于农杆菌k599侵染。用1ml注射器挑取含有pcambia3301-cas9-gmu6n-gdnan载体的k599菌落，在大豆子叶节处扎孔侵染子叶节；
[0160]
(3)为了保持侵染部位处于高湿环境，侵染过后用塑料杯罩住，暗培养24h后正常培养一周；
[0161]
(4)将大豆转移至营养液中，待侵染部位长出发状根后(大约一周)剪去大豆主根和不在侵染位点生长的根，添加营养液；
[0162]
(5)待从侵染位点长出的发状根长到4-5cm时取根提取dna。
[0163]
三、植物基因组dna提取
[0164]
(1)取新鲜发状根100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液lp1和6μl rnase a(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。
[0165]
(2)加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1min。
[0166]
(3)12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。
[0167]
(4)加入1.5倍体积的缓冲液lp3，立即充分振荡混匀15s。
[0168]
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12,000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。
[0169]
(6)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0170]
(7)重复操作步骤6。
[0171]
(8)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0172]
(9)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液tb，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液(即植物基因组dna)收集到离心管中。
[0173]
四、突变位点检测
[0174]
突变位点的检测方法包括被编辑靶基因的pcr产物直接测序，或pcr产物t7endonuclease i酶切检测，以及单克隆测序。
[0175]
pcr扩增目的基因grf及mir396，扩增引物见表2。扩增方法同实施例1中的扩增方法。扩增条带单一的pcr产物可以直接测序，或pcr产物t7 endonuclease i酶切检测。检测阳性的pcr产物或扩增条带不单一的pcr产物连接转化后挑取单克隆测序。
[0176]
pcr产物t7酶切然后琼脂凝胶电泳检测：
[0177]
t7酶切检测程序：
[0178][0179]
95℃条件下，反应5min，再用梯度pcr降温至室温。然后每个反应中加入0.5μl t7酶，37℃条件下，反应30min，用1.5％琼脂凝胶电泳检测。
[0180]
pcr产物连接到peasy-t1克隆载体上，pcr管中加入以下试剂：
[0181][0182]
25℃条件下，反应20min。连接产物transl-t1感受态细胞，转化方法同实施例1转化方法。然后随机挑取单克隆测序
[0183]
图4中的a为目的条带单一的pcr产物直接测序，黑色标识序列为gdna，gdna附近出现重叠峰，表明基因发生了突变，图4中的b为用t7 endonuclease i酶切后电泳，泳道1-12代表不同单根dna中扩增的grf基因的酶切产物，没有突变目的条带单一，有突变的目的条带不单一(箭头标识)，泳道m为分子量marker，d2000。靶基因没有发生突变的酶切产物条带单一，发生突变的位点被t7 endonuclease i识别并切割，酶切产物条带不单一。
[0184]
在一条发状根中检测到mir396/grf基因的pcr产物测序出现重叠峰，或pcr产物-t7endonuclease i酶切产物条带不单一，说明在同一条发状根中同时有多个mir396/grf基因发生突变。再将有突变的pcr产物连接t1载体，挑取单克隆测序鉴定突变类型。部分结果如图5所示，斜体为pam位点，灰底部分为gdna，wt表示野生型对照中基因序列，396n/grfn表示发状根中mir396或grf基因的突变序列，虚线表示缺失碱基，//表示省略碱基，括号内数据表示缺失突变碱基数量。结果发现一条发状根中存在多个mir396/grf基因发生突变，
mir396的突变发生在成熟序列附近，grf突变发生在mir396靶位点附近，说明构建的大豆crispr-cas9多基因编辑载体具有多基因编辑功能。
[0185]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。